Способ получения ферментного препарата кислой протеазы

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик

Зависимое от авт. свидетельства №

Заявлено 17.И1.1967 (№ 1172338/28-13) с присоединением заявки №

Приоритет

Опубликовано 05Л 111.1969. Бюллетень ¹ 25

Дата опубликования описания 26.XII.1969

Кл. 6а, 22/04

МПК С 12k

УДК 577 156 1(088 8) Комитет по делом изобретений и открытий при Совете Министров

СССР

Авторы изобретения

Заявитель

Л. И. Орещенко и Н, Ф. Фролова

Всесоюзный научно-исследовательский институт ферментной и спиртовой промышленности

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА

КИСЛОЙ ПРОТЕАЗЫ

Известен способ получения ферментного препарата кислой протеазы путем культивирования ее продуцента — плесневого гриба

Asp. awamori — на питательной среде, содержащей пшеничные отруби, с получением экстракта фермента из поверхностной культуры гриба, осаждением фермента этанолом из экстракта, отделением осадка от питательной среды одним из известных способов, например центрифугированием, растворением осадка с получением раствора ферментов и высаливанием из него кислой протеазы сульфатом аммония.

Предлагаемый способ позволяет получать высокоочищенный препарат, не содержащий примеси других ферментов, а также повысить его активность. Для этого перед высаливанием из ферментного раствора удаляют амилолитические ферменты путем обработки данного раствора щавелевокислым аммонием, а после вьссаливания кислой протеазы получают осадок этого ферментного раствора в воде и обессаливают одним из известных способов, например с помощью ионообменных см ол.

Способ, получения ферментного препарата кислой,протеазы заключается в следующем.

Выращивают поверхностным способом .культуру гриба Asp. awamori, продуц ирующую кислую протеазу, на питательной среде, содержащей пшеничные отруби. Из выращенной культуры водой экстрагируют ферменты методом противоточного выщелачивания.

Полученный экстракт охлаждают до 5 С

5 и вносят охлажденный этанол до концентрации его в смеси, равной 75 — 76%, для осаждения ферментов и центрируют для отделения образовавшегося осадка. Последний растворяют в воде в соотношении 1: 15 и вновь

10 центрифугируют для удаления из него нерастворимых балластных веществ.

Доводят рН центрифугата до 4,5 и обрабатывают 0,1 н. щавелевокислым аммонием при

30 С в течение 24 час. В результате такой

15 обработки происходит почти полная инактивация амилолитических ферментов (а-амилазы, декстриназы).

Затем добавляют сульфат аммония до 0,6 насыщения от полного для высаливания кис20 лой протеазы. Полученный осадок выдерживают 11 — 12 час, отделяют и растворяют в воде, обессаливают на колонке с сефадексом

G — 25 и хроматографируют на колонке с

ДЕАЕ-целлюлозой (ацетатный буфер с рН

25 5,6 и ионной силой 0,05, элюция при возрастающей концентрации МаС1 от 0,1 до 0,5 н. в том же буфере).

Фракции,,содержащие кислую протеазу, обессаливают на колонке с сефадексом G — 25

30 и осаждают холодным ацетоном в соотноше3 нии 1: 3,5. Активность кислой протеазы в высокоочищенном препарате составляет

1035 ед/г, Ферментный препарат кислой протеазы содержит 71,5/о белка и оптимум его действия при рН, равном 2,0 — 2,5 и температуре 37 — 40 С.

Предмет изо бр етения

Способ получения ферментного препарата кислой протеазы путем культивирования ее продуцента — плесневого гриба Asap. awamori — на питателыной среде, содержащей пшеничные отруби, с получением экстракта фермента из .поверхностной культуры гриба, осаждением фермента этанолом из экстракта, 249329 отделением осадка от питательной среды одним из известных способов, например центрифугированием, растворением осадка с получе нием раствора ферментов и высалива нием

5 из него кислой протеазы сульфатом аммония, отличающийся тем, что, с целью получения высокоочищенного препарата, не содержащего примеси других ферментов, а также,повышения его активности, перед высаливанием

10 из ферментного раствора удаляют амилолитические ферменты путем обработки данного раствора щавелевокислым аммонием, а после высаливания кислой протеазы, .получают осадок этого ферменпного раствора в воде и

15 обессали вают одним из известных способов, например с помощью ионообменных смол.

Составитель Т. Полянская

Редактор В. Ф. Смирягина Техред Л. К. Малова Корректор В. И. Жолудева

Заказ 3346/6 Тираж 480 Подписное

ЦНИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССР

Москва Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2