Способ количественного определения дихлорбромметана в крови


 

G01N33/50 - химический анализ биологических материалов, например крови, мочи; испытания, основанные на способах связывания биоспецифических лигандов; иммунологические испытания (способы измерения или испытания с использованием ферментов или микроорганизмов иные, чем иммунологические, составы или индикаторная бумага для них, способы образования подобных составов, управление режимами микробиологических и ферментативных процессов C12Q)

Владельцы патента RU 2416798:

Федеральное государственное учреждение науки "Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФГУН "ФНЦ МПТ УРЗН" РОСПОТРЕБНАДЗОРА) (RU)

Изобретение относится к медицинским токсикологическим исследованиям, в частности к санитарной токсикологии, и может быть использовано для количественного определения дихлорбромметана в биологических жидкостях - в крови. Предложенный способ характеризуется тем, что вначале осуществляют подщелачивание пробы крови 10%-ным раствором гидроксида натрия до рН 8-10, производят извлечение дихлорбромметана из пробы путем экстракции его гексаном, отделяют экстракт центрифугированием при 7000-7500 об/мин, производят его исследование газохроматографическим анализом на газовом хроматографе с детектором электронного захвата, а количество дихлорбромметана устанавливают по калибровочному графику. Изобретение обеспечивает высокую чувствительность и точность способа определения дихлорбромметана в крови. 5 табл.

 

Изобретение относится к медицинским токсикологическим исследованиям, в частности к санитарной токсикологии, и может быть использовано для количественного определения дихлорбромметана в биологических жидкостях - в крови.

Известен микродиффузионный метод, пригодный для определения хлорированных углеводородов в различных биосубстратах - кровь, моча в интервале 5-35 мг%. Количественное определение осуществляется спектрофотометрически по интенсивности окраски. Ошибка определения составляет ±5% [1].

Для концентрирования и извлечения хлорированных углеводородов из биологических жидкостей используется метод газохроматографического анализа равновесной паровой фазы 1,2-дихлорэтана [2]. Недостатком способа является невысокая чувствительность: граница обнаружения 10 мкг. Погрешность определения составляет 5-10%.

Также известен способ газохроматографического определения галогенсодержащих веществ в воде, в частности, дихлорбромметана [3]. Измерение его концентрации осуществляют методом газовой хроматографии с использованием электронно-захватного детектора. Концентрирование дихлорбромметана из воды осуществляют газовой экстракцией при нагревании до температуры 80°С в замкнутом объеме. В дальнейшем собравшийся газ вводят в испаритель хроматографа, а количество дихлорбромметана устанавливают по градуировочному графику. Однако указанный способ не применим для определения дихлорбромметана в крови, т.к. при ряде операций требуется нагрев до температуры, при которой произойдет свертывание крови.

Еще одним известным способом газохроматографического определения галогензамещенных метана в воде является способ, согласно которому производят парофазное извлечение присутствующих в воде летучих компонентов, концентрирование их на сорбенте, термическую десорбцию и разделение на колонке с сорбентом, на входе которой размещен слой сульфокатионита, с последующим детектированием разделенных компонентов детектором по захвату электронов [4].

Однако указанным известным способом невозможно проводить определение галогензамещенных метана, в частности дихлорбромметана, в крови, т.к. в нем присутствует такая операция, как термическая десорбция.

Технический результат, достигаемый предлагаемым изобретением, заключается в обеспечении одновременно высокой чувствительности и точности способа определения дихлорбромметана в крови.

Поставленный технический результат достигается предлагаемым способом количественного определения дихлорбромметана в крови, характеризующимся тем, что вначале осуществляют подщелачивание пробы крови 10%-ным раствором гидроксида натрия до рН 8-10, производят извлечение дихлорбромметана из пробы путем экстракции его гексаном, отделяют экстракт центрифугированием, производят его исследование газохроматографическим анализом, а количество дихлорбромметана устанавливают по калибровочному графику.

Указанный технический результат достигается за счет следующего.

Введение в пробу крови 10%-ного раствора гидроксида натрия обусловлено тем, что этот реагент не мешает определению и не вызывает погрешности.

Доведение водородного показателя в пробе крови до рН 8-10 объясняется тем, что только при таком рН обеспечивается высокая степень экстракции дихлорбромметана, и одновременно обеспечивается денатурация низкомолекулярных белков, что повышает точность определения.

Использование в качестве экстрагирующего растворителя гексана обеспечивает высокую чувствительность заявляемого способа.

Благодаря операции центрифугирования происходит с одной стороны удаление белков, определяющих сложный состав матрицы пробы, отрицательно влияющих на точность и чувствительность способа, а с другой стороны - производится отделение экстракта. Режим центрифугирования рекомендован от 7000 об/мин до 7500 об/мин. При использовании режимов менее 7000 об/мин происходит неполное отделение экстракта от биопробы, при режимах центрифугирования более 7500 об/мин под действием центробежного ускорения происходит, кроме осаждения белков, необходимого для анализа, осаждение соединений, молекулярная масса которых больше, чем у исследуемого соединения, что приводит к завышенным результатам. И только при использовании указанных пределов центрифугирования гарантируется получение качественного результата анализа (высокая чувствительность и точность).

Совокупность и последовательность указанных операций, их режимы и позволили достичь высокой степени точности и чувствительности предлагаемого способа.

Предлагаемый способ реализуется следующим образом.

Пример. Пробу крови в количестве 1 см3, содержащей дихлорбромметан, подщелачивают 10% раствором гидроксида натрия до рН 8-10. Далее производят экстрагирование 1 см3 гексана путем встряхивания в течение 1-2 мин. Затем смесь центрифугируют при 7500 об/мин в течение 2 мин. После удаления белков центрифугированием и отделением экстракта, последний сливают в пробирку и хроматографируют на хроматографе "Кристалл-2000" с детектором электронного захвата. Проводят количественное определение дихлорбромметана в подготовленных пробах газохроматографическим методом по калибровочному графику.

Калибровочный график строится следующим образом. Пробы крови, отобранные у контрольной группы детей, объемом 1 см3, содержащие заданные концентрации дихлорбромметана, подщелачивают 10% раствором гидроксида натрия до рН 8-10 и экстрагируют 1 см3 гексана. Полученные экстракты - стандартные растворы - хроматографируют на газохроматографе «Кристалл-2000М» с детектором электронного захвата.

Отработка оптимальных газохроматографических параметров для определения дихлорбромметана в крови осуществлялась с использованием аппаратно-программного комплекса на базе газового хроматографа "Кристалл-2000" с детектором электронного захвата. Полнота выделения дихлорбромметана достигнута на капиллярной колонке Optima-5 - 25m*0,32mm*5,0µm при температурном режиме: колонка - от 50°С; испаритель - 200°С; детектор - 250°С; расход газа-носителя 1 (азот) - 20 см3/мин; расход газа-носителя - 30 см3/мин. При таких же параметрах хроматографа определяется и количественное содержание дихлорбромметана в крови.

В ходе лабораторных испытаний изучена зависимость степени экстракции дихлорбромметана от рН среды и природы органических растворителей. Результаты приведены в таблице 1.

Таблица 1
Зависимость степени экстракции дихлорбромметана из пробы крови от рН среды и природы органических растворителей
Определяемый ингредиент Органический растворитель Диапазон рН начала экстракции Степень экстракции, %
Дихлорбромметан в крови гептан 2-3 42
4-6 37,7
8-10 39
диэтиловый эфир 2-3 58
4-6 70
8-10 85
гексан 2-3 86
4-6 89
8-10 97

Данные таблицы 1 показывают, что наиболее эффективным экстрагентом для экстракции дихлорбромметана является гексан при рН 8-10.

Для денатурации низкомолекулярных белков и повышения степени экстракции анализируемые пробы крови подщелачивают 10% раствором гидроксида натрия до рН 8-10.

Еще одним доказательством вышесказанного являются результаты, представленные в таблице 2, по экстракции дихлорбромметана из крови органическими растворителями при выбранных оптимальных условиях экстрагирования (рН=8-10).

Таблица 2
Средние значения степени экстракции дихлорбромметана из пробы крови органическими растворителями при n=5 и р=0,95
Растворитель Содержание дихлорбромметана, мкг
Введено Найдено Степень экстракции, %
Гептан 0,012 0,0047 39
Диэтиловый эфир 0,012 0,0102 85
Гексан 0,012 0,0116 97
Примечание: n - количество определений; р - вероятность

В результате проведенного эксперимента еще раз подтверждено, что наиболее полное извлечение дихлорбромметана из крови происходит при экстракции гексаном в щелочной среде (рН 8-10).

Для определения чувствительности, далее анализировали пробы крови у детей методом добавок с различным содержанием в них дихлорбромметана. Пробы крови, содержащие заданные концентрации дихлорбромметана, подщелачивают 10% раствором гидроксида натрия до рН 8-10 и экстрагируют 1 см3 гексана в течение 1-2 мин. После отделения экстракта и удаления белков центрифугированием при 7000-7500 об/мин в течение 2 мин анализируемые экстракты хроматографируют не менее 5 раз на хроматографе «Кристалл 2000М» с детектором электронного захвата.

По калибровочному графику определяют содержание компонента в пробах. Полученные результаты приведены в таблице 3.

Таблица 3
№ пробы крови Содержание определяемого дихлорбромметана, мкг/см3
1 0,002
2 0,004
3 0,008
4 0,012
5 0,016

При этом чувствительность определения для дихлорбромметана составила 0,002 мкг/см3. Возможно определение дихлорбромметана 0,004 мкг в анализируемом объеме пробы.

Также в ходе испытаний было установлено, что погрешность определения для дихлорбромметана предлагаемым способом составляет 24,01%. Данные приведены в таблице 4.

Таблица 4
Диапазон измерений значения показателей точности, повторяемости, воспроизводимости
Наименование определяемого компонента и диапазон измерений, мкг/см3 Показатель повторяемости (относительное среднеквадратическое отклонение повторяемости), σr, % Показатель воспроизводимости (относительное среднеквадратическое отклонение воспроизводимости) σR, % Показатель точности (границы относительной погрешности при вероятности Р=0,95), ±δ, %
Дихлорбромметан, от 0,002 до 0,01 вкл. 2,91 9,92

Также в ходе лабораторных испытаний определяли пределы повторяемости и воспроизводимости определения дихлорбромметана предлагаемым способом, которые характеризуют точность результатов измерений. Данные об этих показателях приведены в таблице 5.

Таблица 5
Значения пределов повторяемости и воспроизводимости определения дихлорбромметана предлагаемым способом при доверительной вероятности р=0,95
Наименование определяемого компонента и диапазон измерений, мкг/см3 Предел повторяемости (относительное значение допускаемого расхождения между двумя результатами параллельных определений), rn, % Предел внутрилабораторной воспроизводимости (относительное значение допускаемого расхождения между двумя результатами измерений, полученными в одной лаборатории, но в разных условиях), , %
Дихлорбромметан, от 0,002 до 0,01 вкл. 8,06 2,75

Результаты лабораторных исследований показали, что заявляемый способ действительно характеризуется высокой чувствительностью (от 0,002 мкг/см3), высокой точностью определения (24,01%) и обеспечивает высокие пределы повторяемости и воспроизводимости. Это позволяет рекомендовать его для использования в специализированных медицинских лабораториях.

Источники информации

1. Гадаскина И.Д., Филов В.А. Превращение и определение органических ядов в организме. "Медицина", 1971 г.

2. Методические указания об обнаружении и определении 1,2-дихлорэтана в биологическом материале методом газожидкостной хроматографии. М.: Минздрав СССР, 1978 г.

3. Методические указания по газохроматографическому определению галогенсодержащих веществ в воде. МУК 4.1.646-96. Утверждены Госкомсанэпиднадзором России 31.10.1996 г.

Способ количественного определения дихлорбромметана в крови, характеризующийся тем, что вначале осуществляют подщелачивание пробы крови 10%-ным раствором гидроксида натрия до рН 8-10, производят извлечение дихлорбромметана из пробы путем экстракции его гексаном, отделяют экстракт центрифугированием при 7000-7500 об/мин, производят его исследование газохроматографическим анализом на газовом хроматографе с детектором электронного захвата, а количество дихлорбромметана устанавливают по калибровочному графику.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к способу и набору для исследования in vitro действия иммуномодулирующих, а также индуцирующих апоптоз или некроз соединений в процессах in vivo, а также к способу и набору для идентификации in vitro иммуномодулирующих соединений и/или обнаружения действия иммуномодулирующих соединений, а также идентификации вызывающих апоптоз и/или некроз соединений при помощи иммунной системы в процессах in vivo.

Изобретение относится к области медицины, а именно к ортопедии. .
Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для дифференциальной диагностики типа гипоксии при различных патологических состояниях в кардиологии, акушерстве и гинекологии, дерматологии и других областях медицины.
Изобретение относится к медицине, а именно к биохимическим исследованиям в онкологии. .

Изобретение относится к области иммунологической диагностики. .
Изобретение относится к медицине, а именно к диагностическим методам в стоматологии, и касается способа прогнозирования развития кариеса у детей на ранней стадии. .
Изобретение относится к области медицины, а именно к диагностическим методам в стоматологии, и касается способа прогнозирования развития кариеса у детей на ранней стадии.

Изобретение относится к медицине и касается способа анализа антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC). .
Изобретение относится к области медицины и касается способа прогнозирования эффективности включения инфликсимаба в общепринятую терапию пациентов с ревматоидным артритом (РА)
Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для контроля эффективности лечения детей с нейробластомами

Изобретение относится к области медицины, а именно к офтальмологии, и касается способа определения коллагенолитической активности слезной жидкости (СЖ)

Изобретение относится к ветеринарной медицине, в частности к способам экспресс-оценки иммуногенности вакцинных штаммов бруцелл
Изобретение относится к области медицины, а именно гинекологии
Изобретение относится к области медицины и фармакологии и может быть использовано для оценки антиоксидантных свойств природных материальных объектов

Изобретение относится к области медицины и касается способа ранней диагностики нарушений адаптации у детей в условиях воздействия вредных химических факторов среды обитания
Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и неонатологии

Изобретение относится к области медицины, а именно к гастроэнтерологии

Изобретение относится к медицинским токсикологическим исследованиям, в частности к санитарной токсикологии, и описывает способ количественного определения уксусной, пропионовой, изо-масляной, масляной, валериановой, изо-капроновой и капроновой кислот в крови методом газохроматографического анализа, в котором пробу крови подкисляют 1%-ным раствором серной кислоты до рН 2-3, осуществляют экстракцию определяемых кислот изобутиловым спиртом, объем которого соотносится с объемом пробы крови как 1:1, проводят центрифурирование для отделения белков, добавляют 2-3 капли 0,4%-ного раствора щелочи и экстракт выпаривают досуха, далее к сухому осадку последовательно добавляют 1%-ный раствор серной кислоты и изобутиловый спирт и осуществляют газохроматографическое разделение смеси кислот на капиллярной колонке с пламенно-ионизационным детектором, а количество каждой кислоты устанавливают по калибровочному графику
Наверх