Анализ антителозависимой клеточной цитотоксичности

Изобретение относится к медицине и касается способа анализа антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC). Изобретение обеспечивает простоту и безопасность по сравнению с анализом, требующим использование меченных клеток, увеличенную чувствительность в сравнении со стандартным анализом ADCC и возможность осуществления способа в реальном времени. 10 н. и 32 з.п. ф-лы, 10 ил.

 

Данная заявка притязает на приоритет предварительной заявки на патент США с порядковым номером 60/756301, поданной 4 января 2006 г.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящая заявка относится к способу анализа антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) и, в некоторых вариантах осуществления, относится к способам, которые позволяют проводить анализ ADCC в реальном времени без необходимости использования меченых клеток.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

ADCC представляет собой компонент иммунной реакции, при которой антитела IgG связываются с антигенами на поверхности патогенных или образующих опухоль клеток-мишеней, которые определяются ими для разрушения эффекторными NK-клетками. Эффекторные клетки, несущие рецептор к Fc-гамма (FcγR), распознают и связываются с Fc-областью антител, связавшихся с клеткой-мишенью. Антитела, таким образом, придают специфичность уничтожению клеток-мишеней, что опосредовано эффекторными клетками, образующими мост между двумя типами клеток и впоследствии высвобождающими литические гранулы.

Некоторые терапевтические антитела осуществляют свою биологическую активность, стимулируя ADCC. Например, герцептин^®, гуманизированное антитело, используемое для лечения рака молочной железы, активирует ADCC, связываясь с антигеном HER-2 на поверхности раковых клеток. Подобным образом, ритуксан^®, химерное антитело, используемое для лечения неходжкинской лимфомы, активирует ADCC, связываясь с антигенами CD20 на поверхности клеток лимфомы.

Технологии для определения, индуцирует ли антитело ADCC, как правило, включают в себя мечение клеток-мишеней радиоактивным веществом, таким как Cr⁵¹, или флуоресцентным красителем, таким как кальцеин AM. Меченые клетки инкубируют с антителом и эффекторными клетками, такими как NK-клетки или PBMC, и разрушение клеток-мишеней посредством ADCC обнаруживают по выходу радиоактивности или флуоресценции. Мечение клеток-мишеней в таких видах анализа требует отделения прилипающих клеток для мечения. После мечения анализ проводят с клетками-мишенями в суспензии, что не является нормальным состоянием для прилипающих клеток. Кроме того, степень опосредованного ADCC разрушения клетки, в общем случае, определяется только в один момент времени через несколько часов после смешивания клеток-мишеней с эффекторными клетками и антителом. Был разработан анализ без использования меток, в котором разрушение клеток определяли, измеряя высвобождение лактатдегидрогеназы (LDH) из цитоплазмы лизированных клеток в несодержащей клетки надосадочной жидкости. Тем не менее, способ определения LDH не является анализом в реальном времени и не различает гибель клеток-мишеней и гибель эффекторных клеток, поскольку оба типа клеток высвобождают LDH при лизисе.

Принимая во внимание терапевтические продукты антител, которые в настоящее время присутствуют на рынке или на стадии разработки, существует необходимость в анализах in vitro, которые позволяют определить ADCC активность антител. В особенности, существует необходимость в высокопроизводительном анализе ADCC без использования меток, который позволит осуществлять мониторинг ADCC в реальном времени и который не требует отделения прилипающих клеток.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящей заявке предлагаются способы анализа ADCC in vitro. В способах не используются метки, или требуется сниженное количество меток, и, таким образом, они являются более простыми и более безопасно выполняемыми, чем анализ, требующий использование меченых клеток. В некоторых вариантах осуществления способы также осуществляют с прилипающими клетками, а не с клетками в суспензии. В дополнение, способы можно осуществлять в реальном времени, позволяя отслеживать кинетику реакций ADCC так, что можно сравнивать кинетику ADCC различных антител. Предлагаемые здесь способы также более чувствительны, чем стандартный анализ ADCC, что позволяет определять незначительные различия в кинетике ADCC различных антител. Дополнительно, в некоторых вариантах осуществления простота предлагаемых здесь способов означает, что они быстрее, чем стандартный анализ ADCC, и также обладают возможностью оптимизации для высокопроизводительного скрининга активности ADCC.

Предлагаемые здесь способы включают (a) мониторинг импеданса между электродами на непроводящей подложке, которая способствует росту клеток-мишеней в среде для анализа, и (b) добавление в среду для анализа эффекторных клеток и антитела, которое связывается с клетками-мишенями. Снижение импеданса между электродами на подложке после добавления эффекторных клеток и антитела характерно для ADCC, имеющей место в среде для анализа. Увеличение или отсутствие изменения импеданса между электродами на подложке после добавления эффекторных клеток и антитела может быть характерно для отсутствия действия ADCC в среде для анализа.

В одном аспекте в настоящей заявке уделено особое место способу анализа антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC), включающему: (a) мониторинг импеданса между электродами на непроводящей подложке, которая способствует росту клеток-мишеней в среде для анализа, и (b) добавление в среду для анализа эффекторных клеток и антитела, которое связывается с клетками-мишенями; причем снижение импеданса между электродами на подложке после добавления эффекторных клеток и антитела характерно для действия ADCC, произошедшего в среде для анализа, и причем увеличение или отсутствие изменения импеданса между электродами на подложке после добавления эффекторных клеток и антитела может быть характерно для отсутствия действия ADCC в среде для анализа. Способ может включать в себя измерение импеданса через определенные промежутки времени. Способ может включать в себя определение клеточного индекса (CI), исходя из каждого измерения импеданса и определения, имеет ли место изменение клеточного индекса, где клеточный индекс получают, исходя из каждого измерения импеданса, по формуле

где R_b(f) и R_cell(f) представляют собой частотнозависимые сопротивления электродов без клеток или при наличии клеток, соответственно, и N представляет собой количество значений частот, при которых измеряют импеданс. Способ можно осуществить, используя систему RT-CES^®. Измерения импеданса можно проводить каждые 15 минут.

В способе можно дополнительно высевать клетки-мишени. Клетки-мишени можно высевать за 18-24 часа перед добавлением антитела и эффекторных клеток. Клетки-мишени могут находиться в монослое на подложке. Клетки-мишени можно высевать при плотности в диапазоне от 2 K до 100 K на лунку (например, в диапазоне от 15 K до 25 K на лунку или приблизительно 20 K на лунку). Соотношение эффекторных клеток и клеток-мишеней (E:T) может составлять 25:1. E:T может составлять более чем 10:1, более чем 50:1 или более чем 100:1.

Антитело можно добавлять в концентрации в диапазоне приблизительно от 1 до приблизительно 100 мкг/мл, в диапазоне приблизительно от 1 до приблизительно 50 мкг/мл или в диапазоне приблизительно от 2 до приблизительно 8 мкг/мл. Способ может включать в себя добавление в среду для анализа двух или более антител, которые связываются с клетками-мишенями, трех или более антител, которые связываются с клетками-мишенями, или четырех или более антител, которые связываются с клетками-мишенями. Антитело можно получить от пациента с аутоиммунным нарушением.

Клетки-мишени могут экспрессировать апикальные антигены. Способ может включать в себя предварительную стадию скрининга клеток-мишеней в отношении экспрессии апикального антигена. Клетки-мишени могут представлять собой раковые клетки или зараженные вирусом клетки. Раковые клетки могут происходить из клеточной линии. Раковые клетки могут представлять собой клетки SKBR3 или клетки MG63.

Эффекторные клетки могут включать в себя мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), естественные киллерные (NK) клетки, моноциты, цитотоксические Т-клетки или нейтрофилы. Стадия (b) способа может включать в себя добавление к клеткам-мишеням цельной крови, которую частично обогатили эффекторными клетками. Стадия (b) способа может включать в себя добавление цельной крови к эффекторным клеткам, где цельная кровь содержит эффекторные клетки.

В другом аспекте в настоящей заявке уделено особое место способу скрининга антитела-кандидата на способность индуцировать ADCC против клеток-мишеней, включающему: (a) мониторинг импеданса между электродами на непроводящей подложке, которая способствует росту клеток-мишеней в среде для анализа, и (b) добавление в среду для анализа эффекторных клеток и антитела-кандидата, которое связывается с клетками-мишенями; причем снижение импеданса между электродами на подложке после добавления эффекторных клеток и антитела характерно для способности антитела-кандидата влиять на действие ADCC против клеток-мишеней, и причем увеличение или отсутствие изменения импеданса между электродами на подложке после добавления эффекторных клеток и антитела может быть характерно для неспособности антитела-кандидата влиять на действие ADCC против клеток-мишеней.

В другом аспекте в настоящей заявке уделено особое место способу выявления пациента, страдающего заболеванием, ассоциированным с клетками-мишенями, который подходит для лечения антителом-кандидатом, способу, включающему: (a) мониторинг импеданса между электродами на непроводящей подложке, которая способствует росту клеток-мишеней, ассоциированных с заболеванием, (b) добавление выделенных у пациента PBMC и антитела-кандидата к клеткам-мишеням и (c) определение, имеет ли место изменение импеданса между электродами на подложке после добавления PBMC и антитела, причем снижение импеданса между электродами характерно для пригодности пациента для лечения при помощи антитела, и причем увеличение или отсутствие изменения импеданса между электродами на подложке после добавления PBMC и антитела характерно для непригодности пациента для лечения при помощи антитела.

В еще одном аспекте в настоящей заявке уделено особое место способу скрининга соединения-кандидата в отношении способности модулировать ADCC, включающему: (a) мониторинг импеданса между электродами на непроводящей подложке, которая способствует росту клеток-мишеней в среде для анализа, b) добавление в среду для анализа эффекторных клеток и антитела при наличии и отсутствии соединения-кандидата, причем антитело связывается с клетками-мишенями, и (c) сравнение любого изменения импеданса между электродами на подложке после добавления эффекторных клеток и антитела в присутствии соединения-кандидата с любым изменением импеданса между электродами на подложке после добавления эффекторных клеток и антитела при отсутствии соединения-кандидата, причем изменение импеданса в присутствии соединения-кандидата, которое больше, чем любое изменение импеданса при отсутствии соединения-кандидата, показывает, что соединение-кандидат обладает способностью модулировать ADCC. Соединение, для которого необходимо провести скрининг, может модулировать связанную с аутоиммунными состояниями ADCC.

В настоящей заявке особое место также уделено способу, как описано здесь, который представляет собой высокопроизводительный анализ, где непроводящая подложка состоит из двух или более лунок на микротитровальном планшете, причем каждая лунка содержит, по меньшей мере, два электрода, и мониторинг импеданса между электродами осуществляется в каждой лунке.

В другом аспекте в настоящей заявке уделено особое место анализу контроля качества антитела, включающему: (a) мониторинг импеданса между электродами на непроводящей подложке, которая способствует росту клеток-мишеней в среде для анализа, и (b) добавление эффекторных клеток и антитела в среду для анализа, причем антитело связывается с клетками-мишенями; причем снижение импеданса между электродами на подложке после добавления эффекторных клеток и антитела показывает, что антитело подходит для производства с целью применения при индукции ADCC, и где увеличение или отсутствие изменения импеданса между электродами на подложке после добавления эффекторных клеток и антитела показывает, что антитело не подходит для производства с целью применения при индукции ADCC.

В еще одном аспекте в настоящей заявке уделено особое место анализу контроля качества антитела, включающему: (a) мониторинг импеданса между электродами на непроводящей подложке, которая способствует росту клеток-мишеней в среде для анализа, (b) добавление эффекторных клеток и антитела в среду для анализа, причем антитело связывается с клетками-мишенями, и (c) сравнение любого изменения импеданса между электродами на подложке после добавления эффекторных клеток и антитела с любым изменением импеданса в контрольном образце после добавления эффекторных клеток и антитела; причем снижение импеданса между электродами на подложке после добавления эффекторных клеток и антитела, которое больше, чем любое снижение импеданса для контрольного образца после добавления эффекторных клеток и контрольного антитела, показывает, что антитело подходит для производства с целью применения при индукции ADCC, и причем отсутствие снижения импеданса после добавления эффекторных клеток и антитела, которое больше, чем любое снижение импеданса для контрольного образца после добавления эффекторных клеток и контрольного антитела, показывает, что антитело не подходит для производства с целью применения при индукции ADCC. При анализе контроля качества снижение импеданса после добавления эффекторных клеток и антитела, которое, по меньшей мере, на 25% больше, чем снижение импеданса для контрольного образца после добавления эффекторных клеток и контрольного антитела, может свидетельствовать, что антитело подходит для производства с целью применения при индукции ADCC.

В настоящей заявке особое место также уделено способу скрининга соединения-кандидата в отношении применения в качестве терапевтического средства против аутоиммунного заболевания, включающему: (a) мониторинг импеданса между электродами на непроводящей подложке, которая способствует росту клеток-мишеней в среде для анализа, причем клетки-мишени представляют собой здоровые клетки, (b) добавление в среду для анализа эффекторных клеток и антитела совместно с соединением-кандидатом и без него, причем антитело связывается с клетками-мишенями, и причем эффекторные клетки представляют собой РВМС субъекта, у которого диагностировано аутоиммунное заболевание, и (c) сравнение любого изменения импеданса в присутствии соединения-кандидата с любым изменением импеданса при отсутствии соединения-кандидата, причем снижение импеданса при отсутствии соединения-кандидата, которое больше, чем любое снижение импеданса в присутствии соединения-кандидата, показывает, что соединение-кандидат подходит в качестве терапевтического средства против аутоиммунного заболевания, и причем отсутствие снижения импеданса при отсутствии соединения-кандидата, которое больше, чем любое снижение импеданса в присутствии соединения-кандидата, показывает, что соединение-кандидат не подходит в качестве терапевтического средства против аутоиммунного заболевания.

В другом аспекте в настоящей заявке уделено особое место способу определения, подходит ли антитело-кандидат для лечения субъекта, страдающего аутоиммунным заболеванием, включающему: (a) мониторинг импеданса между электродами на непроводящей подложке, которая способствует росту клеток-мишеней, ассоциированных с аутоиммунным заболеванием, и (b) добавление антитела-кандидата и выделенных у субъекта PBMC к клеткам-мишеням и (c) определение, имеет ли место изменение импеданса между электродами на подложке после добавления PBMC и антитела-кандидата, причем снижение импеданса между электродами показывает, что антитело подходит для лечения субъекта, и причем отсутствие снижения импеданса между электродами показывает, что антитело не подходит для лечения субъекта.

В еще одном аспекте в настоящей заявке уделено особое место способу определения оптимальной концентрации антитела для индукции реакции ADCC, включающему: (a) мониторинг импеданса между электродами на непроводящей подложке, которая способствует росту двух или более образцов клеток-мишеней в среде для анализа, и (b) добавление эффекторных клеток и антитела к двум или более образцам клеток-мишеней, причем антитело связывается с клетками-мишенями, и причем антитело к двум или более образцам клеток-мишеней добавляют в различных концентрациях; причем снижение импеданса между электродами на подложке после добавления эффекторных клеток и антитела характерно для действия ADCC, произошедшего в среде для анализа, и причем концентрация антитела, которая приводит к наибольшему снижению импеданса, как определяют, является оптимальной концентрацией.

В другом аспекте в настоящей заявке уделено особое место способу определения, связывается ли антитело с апикальным антигеном на клетке-мишени, включающему: (a) мониторинг импеданса между электродами на непроводящей подложке, которая способствует росту клеток-мишеней в среде для анализа, и (b) добавление эффекторных клеток и антитела к клеткам-мишеням; причем снижение импеданса между электродами на подложке после добавления эффекторных клеток и антитела показывает, что антитело связывается с апикальным антигеном на клетке-мишени.

Если не определено иным образом, все используемые здесь технические и научные термины имеют то же самое значение, как обычно понимает обычный специалист в данной области техники, к которой принадлежит данное изобретение. Хотя способы и материалы, подобные или эквивалентные описанным здесь способам и материалам, можно использовать для практического применения изобретения, подходящие способы и материалы описаны ниже. Все публикации, заявки на патенты, патенты и другие ссылки, упомянутые здесь, полностью включены в качестве ссылки. В случае спора настоящее описание изобретения, включающее в себя определения, будет использовано для урегулирования. В дополнение, материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения.

Подробности одного или нескольких вариантов осуществления изложены ниже в прилагаемых чертежах и в описании. Другие особенности, цели и преимущества изобретения будут очевидны из описания и чертежей и из формулы изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг.1 изображен график, показывающий кривую клеточного индекса с течением времени для клеток SKBR3, которые высевали при последовательных разведениях в 2 раза 40 K, 20 K, 10 K или 5 K на лунку, как указано.

На фиг.2 изображен график, показывающий кривую клеточного индекса с течением времени для высеянных клеток SKBR3, которые через 20 часов обрабатывали дополнительной свежей средой («одни только клетки») или тритоном X-100 («клетки + тритон»), чтобы индуцировать гибель клеток.

На фиг.3 изображен график, показывающий кривую клеточного индекса с течением времени для высеянных клеток SKBR3, которые через 20 часов обрабатывали дополнительной свежей средой («одни только мишени»), герцептином («мишени + герцептин») или контрольными антителами IgG («мишени + IgG»).

На фиг.4 изображен график, показывающий кривую клеточного индекса с течением времени для одних только клеток SKBR3 («мишени») или PBMC («эффекторы»).

На фиг.5 изображен график, показывающий кривую клеточного индекса с течением времени для одних только клеток SKBR3, одних только PBMC или клеток SKBR3, которые обрабатывали PBMC через 20 часов.

На фиг.6 изображен график, показывающий кривую клеточного индекса с течением времени для одних только клеток SKBR3, клеток SKBR3, обработанных PBMC через 20 часов, или клеток SKBR3, обработанных PBMC и герцептином^® через 20 часов.

На фиг.7 изображен график, показывающий зависимость от времени лизиса клеток-мишеней SKBR3 (T) посредством эффекторов PBMC (E) при соотношении E:T 50:1 или 12,5:1 в присутствии mAB герцептина^® или без него, как указано.

На фиг.8A изображен график, показывающий процент лизиса, определенный с использованием способа, как описано здесь, клеток-мишеней SKBR3, обработанных одним только PBMC, клеток-мишеней SKBR3, обработанных PBMC вдобавок с указанными концентрациями герцептина^®, или клеток-мишеней SKBR3, обработанных PBMC вдобавок с контрольным IgG. На фиг.8В изображен график, показывающий процент лизиса, определенный с использованием стандартного анализа с кальцеином AM в отношении клеток-мишеней SKBR3, обработанных одним только PBMC, клеток-мишеней SKBR3, обработанных PBMC вдобавок с указанными концентрациями герцептина^®, или клеток-мишеней SKBR3, обработанных PBMC вдобавок с контрольным IgG.

На фиг.9 изображен график, показывающий кривую клеточного индекса с течением времени для клеток SKBR3 и MG63.

На фиг.10А изображен график, показывающий кривую клеточного индекса для клеток MG63, обработанных через 18-20 часов одним только PBMC, PBMC со специфичным для мишени антителом RX1 или PMBC с контрольным антителом IgG. На фиг.10В изображен график, показывающий кривую клеточного индекса для клеток SKBR3, обработанных через 18-20 часов одним только PBMC, PBMC со специфичным для мишени антителом герцептином^® или PMBC с контрольным антителом IgG.

ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящей заявке предлагаются материалы и способы для определения ADCC посредством измерения импеданса между электродами, расположенными на поверхности, на которую высеяны клетки. Можно использовать любое подходящее устройство для измерения импеданса. В некоторых вариантах осуществления ADCC можно определить, используя устройство, имеющее непроводящую подложку, содержащую множество помещенных на нее матриц электродов, матрицы соединены с анализатором импеданса. Например, ADCC можно определить, используя устройство, содержащее матрицы электродов, помещенные на подложку в нижнем отсеке, нижний отсек отделен от верхнего отсека мембраной. Такое устройство можно также использовать для определения миграции клеток из верхнего отсека в нижний отсек, где прилипание к подложке в нижнем отсеке определяют по увеличению импеданса между электродами на матрицах в нижнем отсеке. Такие устройства описаны, например, в WO2004/010103 и WO2004/010102.

Такие устройства также можно использовать для оценки цитотоксичности соединения на находящиеся в них клетки. Например, соединение можно добавлять к клеткам, растущим на подложке, содержащей электроды, и можно контролировать влияние соединения на импеданс между электродами, при этом снижение импеданса между электродами характерно для гибели клеток. См., например, WO2005/77104 и WO2005/047482. См. также публикацию США № 2005/0112544, в которой описаны способы, которые включают в себя измерение импеданса для оценки клеточной цитотоксичности, вызванной тамоксифеном.

Ни в одной из указанных выше ссылок не описано применение описанных в них устройств для оценки ADCC. В отличие от стандартного анализа цитотоксичности, который просто включает в себя добавление соединения-кандидата к клетке-мишени, анализ ADCC включает в себя добавление (a) антитела, которое связывается с клеткой-мишенью, и (b) эффекторных клеток, которые связываются с антителом. Можно предположить, что измерения импеданса не обеспечивают точных показателей количества клеток-мишеней при анализе ADCC, поскольку можно предположить, что клетки-мишени, эффекторные клетки и антитело прилипают к подложке. Таким образом, считываемый высокий импеданс может иметь место из-за: i) прилипания к подложке клеток-мишеней, так как антитело и эффекторные клетки не индуцируют ADCC, или ii) прилипания к подложке эффекторных клеток и антитела после уничтожения клеток-мишеней посредством ADCC. Следовательно, предполагается, что устройства, такие как описанные выше устройства, не применимы при анализе ADCC.

Как ни удивительно, тем не менее, авторы изобретения обнаружили, что устройства, такие как устройства, описанные в WO2005/77104 и WO2005/047482, можно использовать при анализе ADCC. В частности, авторы изобретения обнаружили, что эффекторные клетки незначительно прилипают к содержащей электроды подложке, и что при подходящих количествах клеток-мишеней, соотношениях эффекторных клеток и клеток-мишеней (E:T) и концентрациях антитела изменения импеданса между электродами на подложке могут обеспечить точные показатели количества клеток-мишеней.

Анализ ADCC посредством определения изменений импеданса между электродами на подложке, на которой растут клетки-мишени, обладает множеством значительных преимуществ по сравнению со стандартными анализами ADCC. В отличие от большинства стандартных видов анализа ADCC в некоторых вариантах осуществления предлагаемые здесь способы не используют меток. В некоторых вариантах осуществления способы не подразумевают использования клеток, меченных радиоактивной или другой меткой, делая проведение анализа более легким и более безопасным, чем анализ, требующий использования меченных клеток. Дополнительно, как обсуждалось выше, в стандартных видах анализа ADCC прилипшие клетки отделяют от поверхности, на которой они растут, с тем, чтобы клетки можно было пометить, и анализ ADCC проводят в суспензии. Поскольку предлагаемые здесь способы не используют меток, нет необходимости в отделении клеток, посредством этого удаляя возможный источник ошибки вследствие нарушения прилипших клеток. Вместо этого анализ ADCC проводят с использованием клеток, прикрепленных к подложке.

В дополнение, в отличие от большинства стандартных видов анализа ADCC в некоторых вариантах осуществления предлагаемые здесь способы позволяют отслеживать количество клеток в реальном времени путем измерения импеданса в различные моменты времени после добавления эффекторных клеток и антитела. Предлагаемые здесь способы, таким образом, позволяют отслеживать кинетику реакции ADCC таким образом, что можно сравнивать кинетики ADCC для различных антител. В некоторых вариантах осуществления способы являются более чувствительными, чем стандартные виды анализа ADCC, позволяя определить небольшие различия в кинетиках ADCC для различных антител. В дополнение, простота предлагаемых здесь способов означает, что они намного быстрее, чем стандартные виды анализа ADCC, и обладают возможностью оптимизации для высокопроизводительного скрининга активности ADCC.

Предлагаемые здесь способы можно осуществить, используя устройство, описанное в WO2004/010102, WO2004/010103, WO2005/077104 или WO2005/047482, или устройство, основанное на данных конструкциях. В некоторых вариантах осуществления предлагаемые здесь способы можно осуществить, используя систему RT-CES^®, производимую ACEA Biosciences (Сан-Диего, Калифорния). Система ACEA RT-CES^® состоит из трех компонентов: электронного сенсорного анализатора, станции устройства и 16-луночного титровального микропланшета. Очевидно, что незначительные рабочие варианты данной системы находятся в пределах знаний специалиста в данной области техники. Например, устройство может содержать 96-луночный титровальный микропланшет или 256-луночный титровальный микропланшет, а не 16-луночный титровальный микропланшет, чтобы позволить проводить большее количество анализов одновременно.

Сенсорные матрицы с микроэлектродами можно изготовить на стеклянных пластинах, используя литографические микротехнологические способы, и содержащие электроды пластины можно собирать в пластмассовые кассеты, чтобы сформировать содержащие электроды лунки.

Станция устройства может принимать титровальный микропланшет (например, 16-луночный, 256-луночный или 96-луночный титровальный микропланшет) и может допускать электронное переключение любой из лунок в сенсорном анализаторе для измерения импеданса. В процессе работы устройство с культивируемыми клетками в лунках можно соединить со станцией устройства и поместить в инкубатор. Электрические провода могут соединять станцию устройства с сенсорным анализатором. Используя управляющее программное обеспечение RT-CES^®, сенсорный анализатор может автоматически выбирать лунки для измерения и может непрерывно проводить измерения импеданса. Данные измерения импеданса из анализатора можно переносить на компьютер, анализировать и обрабатывать при помощи интегрированного программного обеспечения.

Импеданс, измеряемый между электродами в отдельной лунке, обычно зависит от геометрии электрода, ионной концентрации в лунке и от того, прикреплены ли клетки к электродам. В отсутствие клеток импеданс электродов определяется, главным образом, ионной средой на границе электрод/раствор и в основном объеме раствора. В присутствии клеток клетки, прикрепленные к поверхностям электродного датчика, могут изменять локальную ионную среду на границе электрод/раствор, приводя к увеличению импеданса. Чем больше клеток присутствует на электродах, тем больше увеличение импеданса клетка-электрод.

Для того, чтобы определять количество клеток на основе измеряемого импеданса клетка-электрод, параметр, называемый клеточным индексом (CI), получают согласно формуле:

где R_b(f) представляет собой частотнозависимое сопротивление электродов (компонент импеданса) без клеток, R_cell(f) представляет собой частотнозависимое сопротивление электродов при наличии клеток и N представляет собой количество значений частот, при которых измеряют импеданс.

Таким образом, клеточный индекс представляет собой количественную меру клеток в содержащей электроды лунке. При одних и тех же физиологических условиях большее количество клеток, прикрепленных к электродам, приводит к большему значению R_cell(f), приводя к большему значению клеточного индекса.

Предлагаемые здесь способы могут включать в себя измерение импеданса через определенные промежутки времени и определение клеточного индекса из данных измерений импеданса согласно приведенной выше формуле, позволяя таким образом отслеживать реакцию ADCC. Интервалы, при которых проводят измерения импеданса, могут зависеть от того, насколько подробно необходимо отслеживать кинетику реакций. Например, короткие интервалы могут быть предпочтительны, если необходимо отслеживать кинетику ADCC для антитела, которое, как уже известно, индуцирует ADCC, тогда как более длительные интервалы могут быть удовлетворительными, если изначальная цель проведения анализа состоит в том, чтобы установить, может ли данное антитело вообще индуцировать ADCC. Способы могут включать в себя проведение измерений импеданса в моменты времени, такие как, например, каждые 30 минут, каждые 15 минут, каждые 10 минут, каждые 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 или 2 минуты, каждую минуту или чаще, чем каждую минуту.

Описанные здесь способы могут дополнительно включать высевание клеток-мишеней на подложку перед добавлением эффекторных клеток и антитела. Например, клетки-мишени можно высевать на подложку и позволять им расти в течение периода времени перед добавлением эффекторных клеток и антитела. Высевание клеток-мишеней перед добавлением антитела и эффекторных клеток может позволить клеткам-мишеням прикрепиться к подложке и расти, приводя в результате к увеличению импеданса, которое может способствовать определению снижения импеданса после добавления эффекторных клеток и антитела. Тем не менее, клетки-мишени, как правило, не должны перерастать, поскольку клетки-мишени, прикрепленные к подложке, могут стать недоступными для антитела из-за клеток, растущих над ними. В таком случае отсутствовала бы возможность обнаружить ADCC. Необходимо отметить, что проведение экспериментов для определения оптимальной продолжительности времени, за которое клетки-мишени следует высевать перед добавлением эффекторных клеток и антитела, находится в рамках способностей квалифицированного человека. В некоторых вариантах осуществления клетки-мишени можно высевать на подложку за 10-30 часов перед добавлением эффекторных клеток и антитела. Например, клетки-мишени можно высевать на подложку за 18-24 часа (например, 19-21 час) перед добавлением эффекторных клеток и антитела.

Плотность, при которой высевают клетки-мишени, может зависеть от размера клеток и скорости, с которой они растут. Система детектирования типично обладает максимальным порогом, выше которого невозможно определить дальнейший рост клеток. Клетки-мишени, таким образом, следует высевать при плотности, которая находится ниже такого порога, чтобы иметь возможность для определения изменения импеданса, происходящего вследствие гибели клеток. Тем не менее, клетки-мишени также следует высевать при плотности, которая достаточно высока, чтобы позволить клеткам влиять на импеданс во время первоначального периода роста, так чтобы можно было определить любое снижение импеданса после добавления эффекторных клеток и антитела. В некоторых вариантах осуществления клетки-мишени можно высевать при плотности в диапазоне от 2 K до 100 K в стандартную лунку площадью 19,6 мм² (например, при плотности в диапазоне от 10 K до 60 K в стандартную лунку площадью 19,6 мм², при плотности в диапазоне от 15 K до 25 K в стандартную лунку площадью 19,6 мм² или при плотности приблизительно 20 K в стандартную лунку площадью 19,6 мм²).

Продолжительность времени, за которое проводят измерения импеданса, то есть продолжительность анализа, может изменяться в зависимости от периода времени между высеванием клеток-мишеней и добавлением эффекторных клеток и антитела. Снижение импеданса вследствие ADCC, обычно, можно определять в пределах нескольких часов после добавления антитела и эффекторных клеток. В некоторых случаях, тем не менее, может быть необходимым продолжать наблюдать за импедансом в течение периода времени после начала уничтожения клеток посредством ADCC, чтобы определить степень гибели клеток и выяснить, имеет ли место и когда произошел какой-либо повторный рост клеток. Предлагаемые здесь способы, таким образом, могут включать в себя проведение измерений импеданса в течение, без ограничения, 24 часов, 36 часов, 48 часов, 72 часов, 100 часов, 200 часов или более чем 200 часов после высевания клеток-мишеней.

В предлагаемых здесь способах можно использовать любое количество эффекторных клеток и любое количество клеток-мишеней при условии, как обсуждалось выше, что количество клеток-мишеней не настольно высоко, чтобы предотвратить точное определение ADCC. В способах можно использовать большее количество эффекторных клеток, чем клеток-мишеней. Соотношение эффекторных клеток и клеток-мишеней (E:T) может составлять, например, более чем 10:1, более чем 20:1, более чем 50:1, более чем 100:1 или приблизительно 25:1.

Антитело можно добавлять к клеткам-мишеням при любой концентрации. Например, антитело можно добавлять к высеянным клеткам-мишеням при концентрации, например, в диапазоне приблизительно от 1 до приблизительно 1000 мкг/мл, в диапазоне приблизительно от 1 до приблизительно 500 мкг/мл, в диапазоне приблизительно от 1 до приблизительно 100 мкг/мл, в диапазоне приблизительно от 1 до приблизительно 75 мкг/мл, в диапазоне приблизительно от 1 до приблизительно 50 мкг/мл, в диапазоне приблизительно от 1 до приблизительно 25 мкг/мл, в диапазоне приблизительно от 1 до приблизительно 10 мкг/мл, в диапазоне приблизительно от 2 до приблизительно 8 мкг/мл или в диапазоне приблизительно от 4 до приблизительно 6 мкг/мл.

В некоторых вариантах осуществления описанные здесь способы можно использовать для определения оптимальной концентрации антитела, которое индуцирует реакцию ADCC, сравнивая реакцию ADCC, полученную при использовании различных концентраций антитела. Например, способ может включать в себя (a) мониторинг импеданса между электродами на непроводящей подложке, которая способствует росту двух или более (например, двух, трех, четырех, пяти или более чем пяти) образцов клеток-мишеней в среде для анализа, и (b) добавление эффекторных клеток и антитела к двум или более образцам клеток-мишеней, при этом антитело связывается с клетками-мишенями, и причем антитело добавляют в различных концентрациях к двум или более образцам клеток-мишеней; причем снижение импеданса между электродами на подложке после добавления эффекторных клеток и антитела характерно для действия ADCC, произошедшего в среде для анализа, и причем концентрация антитела, которая приводит к наибольшему снижению импеданса, как определяют, является оптимальной концентрацией.

Эффекторные клетки и антитело можно добавлять в среду с клетками-мишенями в одно и то же время или раздельно. Например, эффекторные клетки можно добавить в среду перед антителом или антитело можно добавить до добавления эффекторных клеток. В описанных здесь способах можно применять любую комбинацию клеток-мишеней, эффекторных клеток и антител, и выбор клеток-мишеней, эффекторных клеток и антител, используемых в способах, может зависеть от цели анализа. Примеры подходящих клеток-мишеней, эффекторных клеток и антител, используемых в предлагаемых здесь способах, обсуждаются ниже в качестве возможных применений анализа, использующего данные клетки-мишени, эффекторные клетки и антитела.

В некоторых вариантах осуществления клетки-мишени представляют собой прилипающие клетки. В некоторых вариантах осуществления клетки-мишени экспрессируют апикальные антигены. Множество клеток поляризовано и экспрессирует различные антигены на своих апикальных и базолатеральных поверхностях (Nelson et al. (2003) Nature 422:766-774). Например, эпителиальные клетки экспрессируют различные апикальные и базолатеральные антигены. Когда проводят стандартный анализ ADCC в суспензии, антитело может связываться как с апикальными, так и базолатеральными антигенами. Тем не менее, в предлагаемых здесь способах, когда клетки прилипают к подложке, антитело может связываться только с апикальными антигенами. Способность антитела индуцировать ADCC, таким образом, демонстрирует, что антитело связывается с апикальным антигеном на клетках-мишенях. Предлагаемые здесь способы, таким образом, можно использовать для того, чтобы определить, связывается ли определенное антитело с апикальным антигеном на клетках-мишенях. Например, способ может включать в себя: (a) мониторинг импеданса между электродами на непроводящей подложке, которая способствует росту клеток-мишеней в среде для анализа, и (b) добавление эффекторных клеток и антитела к клеткам-мишеням; причем снижение импеданса между электродами на подложке после добавления эффекторных клеток и антитела показывает, что антитело связывается с апикальным антигеном на клетках-мишенях. Только некоторые терапевтические антитела способны достичь апикальных антигенов in vivo. Например, только некоторые антитела способны достичь и связаться с апикальными антигенами, экспрессированными на поверхности опухолей. Способность антитела индуцировать ADCC, связываясь с апикальными антигенами, может, таким образом, служить индикатором терапевтической эффективности антитела in vivo.

Предлагаемые здесь способы могут включать в себя предварительную стадию скрининга клеток-мишеней в отношении экспрессии апикальных антигенов. Такая предварительная стадия может использовать, например, RT-PCR или FACS для того, чтобы определить клетки-мишени, экспрессирующие апикальные антигены, которые могут подходить для использования в предлагаемых здесь способах.

Можно использовать любую подходящую клетку-мишень. Примеры клеток, которые экспрессируют апикальные антигены, включают в себя без ограничения клетки опухоли и эпителиальные клетки, такие как клетки, известные в данной области техники. Например, муциновые гликопротеины, такие как антиген DF3 и MUC1, экспрессируются на апикальной поверхности эпителиальных клеток и чрезмерно экспрессируются на апикальной поверхности эпителиальных опухолей (Snijdewint et al. (2001) Int. J. Cancer 93:97-106 и Hayes et al. (1990) J. Immunol. 145:962-970). В дополнение, целый ряд опухолевых клеток экспрессируют рецептор на поверхности клетки с высокой аффинностью к фолиевой кислоте на их апикальных поверхностях (Lu et al. (2002) Cancer Immunol. Immunother. 51:153-162).

Клетки-мишени могут представлять собой больные клетки, такие как, например, раковые клетки или зараженные вирусом клетки. Такие клетки-мишени могут представлять собой клеточные линии, полученные из банков клеточных линий. Альтернативно, клетки можно получить от индивидуума, страдающего заболеванием или нарушением. Например, клетки-мишени можно получить при биопсии опухоли у ракового пациента.

Раковые клетки, которые можно использовать в качестве клеток-мишеней, включают в себя в качестве неограничивающих примеров клетки, ассоциированные с болезнью Ходжкина, неходжкинскими В-клеточными лимфомами, Т-клеточными лимфомами, злокачественной лимфомой, лимфосаркомой, лейкозом, хроническим лимфолейкозом, множественной миеломой, хроническим миелолейкозом, хроническим миеломоноцитарным лейкозом, миелодиспластическим синдромом, миелопролиферативными нарушениями, гиперэозинофильным синдромом, эозинофильным лейкозом, множественной миеломой, сцепленными с Х-хромосомой лимфопролиферативными заболеваниями, раком пищевода, раком желудка, раком толстой кишки, колоректальным раком, раком поджелудочной железы и раком желчного пузыря, раком коры надпочечников, продуцирующей АКТГ опухолью, раком мочевого пузыря, раком мозга (например, нейробластомами и глиомами), саркомой Юинга, раком головы и шеи (например, раком ротовой полости и раком гортани), раком почек (например, почечно-клеточным раком), раком печени, раком легких (например, мелкоклеточным и немелкоклеточным раками легких), злокачественным перитонеальным выпотом, злокачественным плевральным выпотом, раками кожи (например, злокачественной меланомой, прогрессированием опухоли кератиноцитов кожи человека, карциномой эпителиальной клетки, плоскоклеточной карциномой, базально-клеточной карциномой), мезотелиомой, саркомой Капоши, раком кости (например, остеомами и саркомами, такими как фибросаркома и остеосаркома), раками женских половых путей (например, раком матки, раком эндометрия, раком яичников и раком шейки матки), раком молочной железы, раком простаты, ретинобластомой, раком яичка и раком щитовидной железы.

Раковые клеточные линии, которые можно использовать в качестве клеток-мишеней, могут представлять собой любые бессмертные линии прилипающих клеток, полученные, например, из банка клеток. Примеры подходящих прилипающих бессмертных клеточных линий включают в себя в качестве неограничивающих примеров: SKBR3, MG63, CCD-1070Sk, hTERT-HMEl [ME16C], BJ, ATRFLOX [Mutatect], KEL FIB, HT-1197, LL 97A (AlMy), NCI-H510A [H510A; NCI-H510], HT-29, SW756, 293, IMR-90 [IMR90], HIAE-55 [часть специальной коллекции Уистера], SW1417 [SW-1417], Hs 737.T, NCI-H661 [H661], CCD 841 CoN, Hs 792(C).M, Per Sel, NCI-H810 [H810], Panс 05.04, ZR-75-30, T-47D, WISH, HBE135-E6E7, ARPE-19/HPV-16, 10.014 pRSV-T, GH354, MDA-MB-436, T98G [T98-G], Calu-6, BEAS-2B, G-292, клоне A141B1, Detroit 539, MNNG/HOS Cl #5 [R-1059-D], BT-549, NCI-H1915 [H1915], Hs 181.Sk, Hs 839.T, RD, SK-N-MC, 20B8, NCI-H292 [H292], Hs 863.T, Hs 181.Tes, Malme-3M, Hs 617.Mg, JAR, Hs 144.We, Hs 742.Sk, Hs 875.T, TE 161.T, Hs 738.St/Int, Hs 895.T, RWPE-I, TE 130.T, TE 84.T, HCC1008, Hs 894(E).Lu, SK-LMS-1, HFF-1, MRC-5 [MRC5], IRR-MRC-5 [ATCC X-55; ATCC X55; облученная MRC-5], WI-38 [WI 38], HeLa, HEK001, FHs 74 Int, Detroit 548, Detroit 573, SW-13, 293T/17, C 211, Amdur II, IMR-32, HeLa [печень Chang], CHP 3 (M.W.), CHP 4, LL 47 (MaDo), HEL 299, Detroit 562, CCD-11Lu, KB, A549 [A-549], MDA-MB-134-VI, HLF-a, TE 354.T, HeLa 229, HeLa S3, COLO 320DM, клон 1-5c-4 [производный Wong-Kilbourne (D) от конъюктивы Chang], CCD-13Lu, CCD-8Lu, CCD-19Lu, CCD-16Lu, AV3, Hs888Lu, CCD-25Lu, COLO 320HSR [COLO 320 HSR], DLD-1, COLO 205, COLO 201, HCT-15, SW837 [SW-837], LoVo, SW48 [SW-48], SW1463 [SW 1463; SW-1463], SW 1353 [SW 1353; SW-1353], 1205Lu [часть специальной коллекции Уистера], HCT-8 [HRT-18], AGS, HCT 116, T84, SNU-C2B, SNU-C2A, NCI-H716 [H716], NCI-H747 [H747], NCI-H498 [H498], LS123, NCI-H1688 [H1688], CFPAC-1, L-132, TE 353.Sk, кишечную 407, FL, Detroit 525, Detroit 510, C32, WI-38 VA-13 сублиния 2RA [часть специальной коллекции Уистера], цитруллинемию, Cri du Chat, WI-26 VA4 [часть специальной коллекции Уистера], BeWo, WM35 [часть специальной коллекции Уистера], MSTO-211H, WRL 68, NCI-H295 [H295], MCF 10A, MCF 10F, RWPE2-W99, SV-HUC-1, HCC202, C3A [HepG2/C3A; производная от Hep G2 (ATCC HB-8065)], MCF-10-2A, 293 cl8, F.thy 62891, Lei Cap, Sal Mat, HCE-2 [50.B1], A2058, RWPE-2, Am Ric, Lo Ren, Ron Har, H69AR, hFOB 1.19, Mar Vin, SCC-4, Be Sal, Hs27, B-3, Lu Vin, Ma San, El Don, SK-N-AS, NCI-H1734 [H-1734; H1734], LNZTA3WT4 [LNZTA3p53WT4; WT4], LNZTA3WT11 [LNZTA3p53WT11; WT11], Lo Wen, NCI-H2227 [H2227], COLO 829, HKB-11, Ce Ar, 90.74, HRT-18G, Be Ar, Em Ar, Win Mec, Ce Geg, TOV-21G, TOV-112D, OV-90, Ja Bos, Fe Bos, La Bel, Bo Gin, HS-5, Le Ana, Mel Neg, La Bel II, HEP G2/2.2.1, ProPakA.6 [PPA.6; ProPak-A.6], LNCaP клон FGC [LNCaP.FGC], HCN-1A, HX [HT1080 ксено], HP [HT1080 поли], 2A, Ne Loc, Jay Sen, Bi Fin и Ray Hot.

Зараженные вирусом клетки, которые можно использовать в качестве клеток-мишеней, включают в себя, например, клетки, инфицированные вирусом Эпштейна-Барра, ВИЧ, вирусом гриппа, вирусом полиомиелита, вирусом гепатита A, вирусом гепатита B, вирусом гепатита C, вирусом ветряной оспы, вирусом краснухи, вирусом кори, вирусом простого герпеса, вирусом денге, вирусом папилломы, респираторно-синцитиальным вирусом или вирусом бешенства.

Клетки-мишени, используемые в предлагаемых здесь способах, также могут представлять собой здоровые клетки. ADCC может вовлекаться в процесс уничтожения здоровых клеток у пациентов с аутоиммунными заболеваниями, такими как аутоиммунные нарушения щитовидной железы, тяжелая миастения, ревматоидный артрит, системная красная волчанка, иммунная гемолитическая анемия (вызываемая пенициллином), аутоиммунный гепатит (AIH), офтальмопатия Грейвса, ВИЧ [истощение CD4], аутоиммунная энтеропатия, глютеиновая болезнь, тяжелая миастения (MG), болезнь Бехчета, офтальмопатия, ассоциированная с щитовидной железой, аутоиммунный тиреоидит, вирусный миокардит, аутоиммунное заболевание сердца, воспалительное заболевание кишечника, язвенный колит, болезнь Шагаса, витилиго, болезнь Крона, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, аутоиммунная нейтропения, детская эпилепсия, синдром Кавасаки, аутоиммунный хронический активный гепатит, сахарный диабет, рассеянный склероз, нефрит с антителами к базальной мембране клубочка (GBM), хроническое активное заболевание печени (CALD), гломерулонефрит (из-за иммунных комплексов), тромботическая тромбогемолитическая пурпура (TTP), необъяснимое мужское бесплодие и отторжение трансплантата. Использование здоровых клеток в качестве клеток-мишеней в предлагаемых здесь способах, таким образом, может быть применимо в исследованиях того, как антитела и эффекторные клетки уничтожают здоровые клетки посредством ADCC при аутоиммунном заболевании или отторжении трансплантата. В случае если клетки-мишени представляют собой здоровые клетки, они могут представлять собой, например, клеточные линии, полученные из банков клеток, или клетки, полученные из ткани индивидуума, страдающего аутоиммунным заболеванием.

В некоторых случаях можно использовать комбинацию более чем одного типа клеток-мишеней, например, для более близкого воспроизведения ситуации in vivo, когда антитело может быть нацелено на органы и ткани, включающие несколько типов клеток. Клетки-мишени, таким образом, могут включать в себя более чем одну клеточную линию или могут включать в себя клетки из более чем одной ткани. В некоторых вариантах осуществления клетки-мишени включают в себя два или более или три или более типов клеток.

Описанные здесь способы можно использовать для скрининга любого антитела в отношении способности индуцировать реакцию ADCC. В настоящей заявке, таким образом, предлагаются способы скрининга антитела-кандидата в отношении способности индуцировать реакцию ADCC против клеток-мишеней. Способы включают (a) мониторинг импеданса между электродами на непроводящей подложке, которая способствует росту клеток-мишеней в среде для анализа, и (b) добавление в среду для анализа эффекторных клеток и антитела-кандидата (например, антитело, которое связывается с клетками-мишенями); причем снижение импеданса между электродами на подложке после добавления эффекторных клеток и антитела указывает на способность антитела-кандидата влиять на ADCC против клеток-мишеней.

Используемое здесь выражение «снижение импеданса» обозначает снижение импеданса между электродами на подложке, содержащей высеянные на ней клетки-мишени. Снижение импеданса может, например, представлять собой уменьшение импеданса приблизительно на 1% или более, приблизительно на 5% или более, приблизительно на 10% или более, приблизительно на 15% или более, приблизительно на 20% или более, приблизительно на 25% или более, приблизительно на 40% или более, приблизительно на 50% или более, приблизительно на 60% или более, приблизительно на 75% или более, приблизительно на 80% или более, приблизительно на 90% или более или приблизительно на 100% по сравнению с ранее определенным импедансом.

Антитело или антитело-кандидат, используемое в предлагаемых здесь способах, может представлять собой, например, моноклональное антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело или человеческое антитело. Антитела, которые можно использовать в описанных здесь способах, также включают в себя антитела, которые идентифицировали как обладающие терапевтическим потенциалом (например, антитела, которые уже подвергались клиническим испытаниям).

Используемый здесь термин «антитело» обозначает интактные молекулы, а также и их фрагменты, такие как Fab, F(ab')2 и Fv, которые способны связываться с клетками-мишенями. Фразой «связывание с клетками-мишенями» обозначают, что антитело иммуноспецифично для антигена клеток-мишеней, например, для апикального антигена на клетках-мишенях.

Термин «иммуноспецифический» обозначает, что антитело обладает существенно большей аффинностью в отношении антигена на клетке-мишени, чем аффинностью в отношении других белков (например, других родственных белков).

«Существенно большая аффинность» обозначает, что антитело обладает пригодной для измерения более высокой аффинностью в отношении антигена на клетке-мишени по сравнению с афинностью в отношении известных молекул распознавания на клеточной поверхности, содержащих иммуноглобулиновый домен. Например, аффинность может быть, по меньшей мере, в 1,5 раза, 2 раза, 5 раз, 10 раз, 100 раз, 10³ раз, 10⁴ раз, 10⁵ раз или 10⁶ раз выше в отношении антигена на клетке-мишени, чем в отношении известных молекул распознавания на клеточной поверхности, содержащих иммуноглобулиновый домен.

Предлагаемые здесь способы также можно использовать в качестве анализов высвобождения и стабильности с целью контроля качества (QC). Например, описанные здесь способы можно использовать для проверки серий продукции антитела, где наличие активности ADCC или уровень активности ADCC используют для сертификации продукта антитела как соответствующего основополагающим принципам контроля качества (например, в GMP (правилах организации производства и контроля качества лекарственных средств) или других стандартах). В некоторых случаях простое наличие активности ADCC можно использовать как качественное определение того, что антитело соответствует основополагающим принципам контроля качества и подходит для производства. Подобные способы, таким образом, не могут нуждаться ни в каком толковании сверх определения того, что импеданс снижается в присутствии исследуемого антитела. В некоторых вариантах осуществления образец из серии антител с ADCC, который необходимо сертифицировать, можно преднамеренно ухудшить и использовать в качестве отрицательного контроля при сравнении с серией антитела для производства. Кривую считывания данных по ADCC в реальном времени для двух образцов можно сравнивать и можно установить качественное или количественное отсечение для сертификации контроля качества. Точные зависимые от концентрации реакции и параметры анализа можно определять способом проб и ошибок.

Сходным образом описанные здесь способы можно использовать для сертификации небольшой молекулы или других ингибиторов активности ADCC с целью QC и стабильности, наблюдая за снижением сигнала ADCC в реальном времени в ответ на их добавление к клеткам-мишеням.

Примеры доступных антител, которые могут действовать посредством ADCC, включают в себя, без ограничения, антитела для лечения аллергии и астмы, такие как даклизумаб (Protein Design Labs/Roche) и CAT-354 (Cambridge Antibody Technology); антитела для лечения аутоиммунных нарушений, такие как MDX-H210 (Medarex/Novartis), кэмпас* алемтузумаб (ILEX Oncology) и даклизумаб (Protein Design Labs/Roche); антитела для лечения рака, такие как кэмпас^® (ILEX Oncology), R1550 (huHMFG1, Therex, Antisome/Roche), герцептин^® (Genentech), омнитарг (Genentech), трастузумаб-DMI1 (Genentech/Immunogen), MDX-010 (Medarex), авастин^® (Genentech), Mab-17-I (эдреколомаб-IGN101, Igeneon, EDR или панорекс-GSK), лабетузумаб (IMMU 105) (Immunomedics), тарвацин (Peregrine), терагин, теревекс (пемтумомаб) (Antisoma/Roche), TheraCIM hR3 (YM Biosciences/Oncoscience), HuMax-EGFr(Genmab), SGN-40 (Seattle Genetics), SGN-30 (Seattle Genetics), ритуксан^® (ритузан^® Genentech/BiogenIdec), HuMax-CD4 (Genmab), MDX-060 (Medarex), сиплизумаб (MedImmune), AME-133 (Applied Molecular Evolution/Lilly), галиксимаб (Anti-CD80 Mab BiogenIdec), HuMax-DC20 (HuMax cd20) (Genmab), LymphoCide™ (эпратузумаб, Immunomedics), MDX-010 + пептид gp 100 (Medarex), MDX-010 +/- химиотерапия (Medarex), MDX-010 + пептиды меланомы (Medarex), AHM (Roche/Chugai), оварекс (AltaRex/Unither Pharmaceuticals), J59I (Biovation/Millennium), ренкарекс (WX-G250) (Wilex/Centocor/Johnson & Johnson), WX-G250 + IL-2/IFN (Wilex), TRAIL-R1mAb (HGS-ETR1 Cambridge Antibody Technology/Human Genome Sciences), TRAIL-R2mAb (HGS-ETR2 Cambridge Antibody Technology/Human Genome Sciences), витаксин (MEDI-522 MedImmune), WX-K931 (Wilex), MT201 (Micromet/Serano), MDX-214 (Medarex), эрбитукс (цетуксимаб, IMC-C255 Imclone, Bristol-Myers Squibb), MEDI-507 (Medimmune), TRU-015 (производное антитела, Trubion), матузумаб (EMD-72000, EMD Pharmaceuticals/Merck KGaA), Mab ICR62, CHIR-12.12 (Chiron/XOMA), huG1-M195 (NCI) MOR102 (MorphoSys), Remitogen (1D10, против MHC класса II, Protein Design Labs) и IGN312 (Igeneon); антитела для лечения сердечно-сосудистых заболеваний, такие как ABC-48 (AERES); антитела для лечения инфекционных заболеваний, такие как MDX-010 (Medarex); антитела для лечения воспалительных заболеваний, такие как хумира™ (Cambridge Antibody Technology/Abbott), MAb против CD11a (Biovation), MLN02 (Millennium/Genentech/Roche), даклизумаб (Protein Design Labs), энбрел (объединение рецептора к TNF и IgG1 (Amgen/Wyeth)), ремикейд (Centocor) и TRU-016 (производное антитела, Trubion); антитела для лечения заболевания почек, такие как хумира™ (Cambridge Antibody Technology/Abbott) и ритуксан^® (Genentech/BiogenIdec); и другие антитела, такие как AMG162 (Amgen) в отношении остеопороза, эрбитукс - C255, BTI-322, этанерцепт и инфликсимаб.

В тех случаях, когда предлагаемые здесь способы используют для исследования реакций ADCC при аутоиммунных заболеваниях, антитело может представлять собой, например, аутоантитело, полученное от индивидуума, страдающего аутоиммунным заболеванием. Такие антитела можно получить, используя, например, способы, известные специалистам в данной области техники (например, аффинной очисткой).

В некоторых случаях может возникнуть потребность в добавлении более чем одно антитела к среде для анализа для того, чтобы определить, например, действуют ли антитела синергически или они служат помехой друг другу в отношении способности индуцировать ADCC. Предлагаемые здесь способы, таким образом, могут включать в себя добавление двух, трех, четырех, пяти или более чем пять антител в среду для анализа.

Эффекторные клетки, используемые в предлагаемых здесь способах, обычно представляют собой клетки, которые экспрессируют один или более Fcγ-рецепторов. Подходящие эффекторные клетки включают в себя в качестве неограничивающих примеров мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), естественные киллерные (NK) клетки, моноциты, цитотоксические Т-клетки и нейтрофилы.

Существует несколько семейств Fcγ-рецепторов, и различные эффекторные клетки экспрессируют различные Fc-рецепторы. Например, нейтрофилы, как правило, экспрессируют FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) и встроенную в липидный слой изоформу FcγRIII (CD16), тогда как естественные киллерные (NK) клетки экспрессируют только трансмембранную изоформу FcγRIII. Более того, существует полиморфизм среди Fc-рецепторов. Например, FcγRIII на NK-клетках содержит полиморфизм Phe/Val в положении 158, который, как было показано, влияет на связывание IgG. Эффекторные клетки, используемые в описанных здесь способах, можно выбрать на основе Fc-рецепторов, которые они экспрессируют, и в некоторых вариантах осуществления - на основе полиморфных форм Fc-рецептора, которые они экспрессируют. Описанные здесь способы, таким образом, можно применять для того, чтобы определить, способна ли определенная комбинация антитела и эффекторной клетки, экспрессирующей известный Fcγ-рецептор (например, с определенным полиморфизмом), к уничтожению клетки-мишени посредством ADCC. Такие исследования могут быть применимы в общем исследовании механизма связывания IgG Fc-рецепторами и могут позволить идентифицировать остатки как в Fc-рецепторах, так и в Fc-области IgG, которые являются ключевыми при связывании. В свою очередь, такие исследования могут способствовать разработке терапевтических антител, содержащих последовательности Fc-области, которые демонстрируют оптимальное связывание с Fc-рецепторами эффекторных клеток, таким образом усиливая до максимума ADCC. Такие исследования также могут быть применимы для того, чтобы определить оптимальный генотип эффекторных клеток для существующего терапевтического антитела, которое способно индуцировать реакцию ADCC таким образом, чтобы предполагаемого пациента можно было проверить на наличие Fc-рецепторов с оптимальным генотипом.

В некоторых вариантах осуществления эффекторные клетки, используемые в описанных здесь способах, представляют собой PBMC. PBMC представляют собой смесь моноцитов и лимфоцитов, которые можно выделить из цельной крови, используя, например, стандартные экспериментальные протоколы, описанные в данной области техники и нижеприведенных примерах. Разнообразие клеток, обнаруженное в PBMC, как ожидалось бы, могло привести к неопределенности считываний импеданса из-за неспецифического прилипания к подложке. Как это ни удивительно, тем не менее, авторами изобретения было обнаружено, что изменение импеданса или клеточного индекса после добавления антитела и PBMC представляет собой точный показатель ADCC против клеток-мишеней. Цельная кровь или кровь, которую, по меньшей мере, частично очистили, так что ее обогатили или частично обогатили в отношении эффекторных клеток (например, PBMC), также можно применять в предлагаемых здесь способах.

Предлагаемые здесь способы обладают широким спектром клинических применений. Как обсуждалось выше, среди Fc-рецепторов человека существуют полиморфизмы, которые влияют на способность эффекторных клеток связываться с антителом и которые таким образом могут влиять на способность эффекторных клеток опосредовать ADCC. Способность эффекторных клеток у индивидуума связываться с терапевтическим антителом может обладать значительным воздействием на клиническую эффективность антитела. Например, антитело IgG ритуксан^® против CD20, используемое при лечении B-лимфопролиферативных злокачественных новообразований, может привести к лучшему исходу болезни у пациентов, гомозиготных по генотипу FcγRIII158V, чем у пациентов, гомозиготных по генотипу FcγRIII158F, возможно вследствие того факта, что NK-клетки, несущие FcγRIII158V, связываются более эффективно с Fc-областью ритуксана^®.

Возможность использовать PBMC индивидуумов (например, пациентов) в качестве эффекторных клеток означает, что предлагаемые здесь способы можно использовать для того, чтобы определить, подходит ли определенное терапевтическое антитело для лечения определенного пациента, страдающего заболеванием или нарушением, ассоциированным с клетками-мишенями. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления эффекторные клетки могут представлять собой PBMC, полученные от пациента, страдающего заболеванием, ассоциированным с клетками-мишенями, и антитело может представлять собой терапевтическое антитело-кандидат для лечения этого пациента. В данной заявке, таким образом, предлагаются способы выявления субъектов, страдающих заболеванием, ассоциированным с клетками-мишенями, для которых подходит лечение антителом-кандидатом. Способы могут включать (a) мониторинг импеданса между электродами на непроводящей подложке, которая способствует росту клеток-мишеней, ассоциированных с заболеванием, (b) добавление выделенных у субъекта PBMC и антитела-кандидата к клеткам-мишеням и (c) определение, имеет ли место изменение импеданса между электродами на подложке после добавления PBMC и антитела, причем снижение импеданса между электродами характерно для ADCC и, таким образом, для пригодности пациента в отношении лечения антителом.

В некоторых вариантах осуществления клетки-мишени могут представлять собой клетки, ассоциированные с B-лимфопролиферативным злокачественным новообразованием, и антитело-кандидат может представлять собой ритуксан^®. Согласно таким вариантам осуществления способы, как предлагается здесь, можно использовать для того, чтобы определить, подходит ли для пациента, страдающего B-лимфопролиферативным злокачественным новообразованием, лечение ритуксаном^®. Способ можно, конечно, осуществлять с PBMC, полученного от определенного пациента, в комбинации с любым из других описанных здесь антител и клеток-мишеней, чтобы определить оптимальное антитело для лечения этого пациента. Дополнительно, когда PBMC идентифицируют в качестве способных индуцировать ADCC в комбинации с определенным антителом, можно определить генотип PBMC и можно проверять PBMC других индивидуумов, используя стандартные способы генотипирования, чтобы выяснить, подходит ли для них лечение таким антителом.

В тех случаях, когда PBMC, полученный от индивидуума, используют в качестве эффекторных клеток, клетки-мишени также могут представлять собой клетки индивидуума (например, раковые клетки, полученные при биопсии), так что способ представляет собой персонифицированный способ определения, способно ли определенное антитело-кандидат в комбинации с PBMC субъекта уничтожить клетки-мишени у этого пациента посредством ADCC. Поскольку становится доступным большее количество продуктов антител, предлагаемые здесь способы позволяют отобрать лучший продукт антитела, чтобы оптимизировать клинические результаты у определенного пациента.

Предлагаемые здесь способы также можно адаптировать для скрининга соединений в отношении способности увеличивать или уменьшать ADCC, индуцируемую различными комбинациями эффекторных клеток и антител. Соответственно, в данной заявке предлагаются способы скрининга соединений в отношении способности модулировать ADCC. Способы могут включать (a) мониторинг импеданса между электродами на непроводящей подложке, которая способствует росту клеток-мишеней в среде для анализа, (b) добавление соединения, эффекторных клеток и антитела, которое связывается с клетками-мишенями, в среду для анализа и (c) определение, модулирует ли соединение ADCC, посредством сравнения любого изменения импеданса между электродами на подложке после добавления эффекторных клеток и антитела в присутствии соединения с любым изменением импеданса между электродами на подложке после добавления эффекторных клеток и антитела при отсутствии соединения.

Как обсуждалось здесь, снижение импеданса после добавления эффекторных клеток и антитела характерно для осуществления ADCC в среде для анализа. Дополнительное снижение импеданса, наблюдаемое в присутствии соединения при скрининге, может свидетельствовать, что соединение увеличивает ADCC. Напротив, увеличение импеданса в присутствии соединения может свидетельствовать, что соединение снижает ADCC. В некоторых ситуациях может быть желательным выявить соединения, которые увеличивают ADCC. Например, способы можно использовать для того, чтобы выявить соединения, которые увеличивают реакцию ADCC, индуцируемую терапевтическим антителом и PBMC против раковых клеток. В других ситуациях может быть желательным выявить соединения, которые снижают ADCC. Например, способы можно использовать для того, чтобы выявить соединения, которые снижают реакцию ADCC, индуцируемую антителами и PBMC пациента с аутоиммунным заболеванием, против здоровых клеток-мишеней. Полученные данные, свидетельствующие о том, что соединение не действует в качестве модулятора ADCC, также можно применять в некоторых ситуациях, поскольку это показывает, что соединение (которое само по себе может служить для другой терапевтической цели) не влияет на способность определенной комбинации эффекторная клетка-антитело индуцировать ADCC.

В таких способах можно применять любые клетки-мишени, эффекторные клетки и антитела, описанные здесь. В некоторых вариантах осуществления используемая комбинация эффекторная клетка-антитело может представлять собой комбинацию, которая уже была определена в качестве способной индуцировать реакцию ADCC против исследуемой клетки-мишени. Соединение, предназначенное для скрининга, можно добавлять к клеткам-мишеням в одно и то же время с эффекторными клетками и антителом. Альтернативно, соединение, предназначенное для скрининга, можно добавлять к клеткам-мишеням перед эффекторными клетками и антителом или после эффекторных клеток и антитела.

Соединения, которые можно отбирать в процессе скрининга в отношении способности модулировать ADCC в предлагаемых здесь способах, включают в себя в качестве неограничивающих примеров пептиды, пептоиды, белки, липиды, металлы, небольшие органические молекулы, аптамеры РНК, антибиотики и другие известные фармацевтические препараты, полиамины и их комбинации и производные. Небольшие органические молекулы обычно обладают молекулярным весом, равным приблизительно от 50 дальтон до приблизительно 2500 дальтон (например, приблизительно от 300 до приблизительно 800 дальтон). Соединения-кандидаты можно получить из больших библиотек синтетических и природных соединений. Например, библиотеки синтетических соединений коммерчески доступны в MayBridge Chemical Co. (Revillet, Cornwall, UK) или Aldrich (Milwaukee, WI). Альтернативно, можно использовать библиотеки природных соединений в виде бактериальных, грибковых, растительных и животных экстрактов. Дополнительно, соединения-кандидаты можно получить синтетическим способом, используя комбинаторную химию либо в виде отдельных соединений, либо в виде смесей.

В некоторых вариантах осуществления соединение, предназначенное для скрининга, может представлять собой соединение, которое уже было использовано для лечения заболевания, с которым ассоциированы клетки-мишени, и антитело может представлять собой антитело, полученное для лечения такого заболевания. Например, когда клетки-мишени представляют собой раковые клетки, соединение для скрининга может представлять собой химиотерапевтическое средство, и антитело может представлять собой терапевтическое антитело, полученное для лечения рака. Способы, как предлагается здесь, таким образом, можно использовать для того, чтобы определить, увеличивает или уменьшает химиотерапевтическое средство уничтожение клеток-мишеней антителом посредством ADCC. Схожим образом, соединение, предназначенное для скрининга, может представлять собой соединение, которое модулирует ADCC у пациента с аутоиммунным нарушением. В таких случаях добавляемое антитело может представлять собой антитело, которое вызывает аутоиммунную активность посредством ADCC у индивидуума с аутоиммунным заболеванием.

В некоторых вариантах осуществления описанные здесь способы могут представлять собой высокопроизводительные способы, при помощи которых одновременно оценивают способность многочисленных комбинаций антител, эффекторных клеток и клеток-мишеней осуществлять реакцию ADCC, необязательно в присутствии соединений, которые могут модулировать реакцию ADCC. В таких вариантах осуществления клетки-мишени можно высевать на непроводящую подложку, содержащую две или более лунок, причем каждая лунка содержит, по меньшей мере, два электрода, и способ может включать в себя мониторинг любого изменения импеданса между электродами в каждой отдельной лунке. Описанные здесь систему RT-CES^® и соответствующее программное обеспечение адаптируют для использования в высокопроизводительных анализах.

В некоторых вариантах осуществления клетки-мишени, антитела и эффекторные клетки, добавляемые в каждую лунку, могут быть теми же самыми или различными в зависимости от целей анализа. В некоторых вариантах осуществления, например, способ можно использовать для одновременной проверки способности многочисленных терапевтических антител-кандидатов индуцировать ADCC против различных клеток-мишеней в присутствии PBMC от одного пациента или PBMC от нескольких пациентов. Такие высокопроизводительные способы также можно использовать для одновременной проверки способности одного антитела-кандидата индуцировать ADCC против одной и той же клетки-мишени или множества различных клеток-мишеней в присутствии одних и тех же эффекторных клеток при различных концентрациях антитела. В добавление, такие высокопроизводительные способы можно использовать для одновременного сравнения кинетики ADCC множества различных антител. Высокопроизводительные анализы также можно использовать для скрининга соединений в отношении их способности модулировать реакции ADCC, как обсуждалось выше.

Дополнительно, использование способов, как описано здесь, в качестве части высокопроизводительного способа позволяет проводить контрольные эксперименты параллельно с описанным выше способом анализа активности ADCC. Например, подходящий контрольный анализ может включать в себя высевание и выращивание клеток-мишеней и мониторинг импеданса в отсутствие эффекторных клеток и антитела. Дополнительные контрольные эксперименты могут включать в себя добавление одних только эффекторных клеток или добавление одного только антитела к высеянным клеткам-мишеням.

Изобретение будет дополнительно описано в следующем ниже примере, который не ограничивает объем изобретения, описанный в формуле изобретения.

ПРИМЕР

1. Введение

В системе RT-CES^® (электронный датчик для клеток в реальном времени) ACEA Biosciences (Сан-Диего, Калифорния) используется электронное считывание импеданса для неинвазивного количественного определения клеточного статуса в реальном времени. Клетки высевают в титровальные микропланшеты E-Plate (ACEA Biosciences), которые объединены с матрицами микроэлектронных датчиков. Взаимодействие клеток с поверхностью микроэлектродов приводит к возникновению ответного импеданса клетка-электрод, которое отражает статус клеток, исходя из морфологии, качества адгезии и количества.

Систему ACEA использовали для разработки анализа ADCC в реальном времени для прилипающих клеток. Использовали две клеточные линии: SKBR3 (клеточную линию аденокарциномы молочной железы) и MG63 (остеобластическую клеточную линию). SKBR3 представляет собой линию прилипающих клеток, которые обладают повышенной экспрессией антигена HER-2. Герцептин^®, гуманизированное антитело против HER-2, опосредует гибель клеток SKBR3 посредством ADCC в присутствии эффекторных клеток. MG63 представляет собой линию прилипающих клеток, которые обладают повышенной экспрессией M-SCF. Chir-RX1, гуманизированное антитело класса IgG1 против M-CSF, опосредует ADCC против клеток MG63 в присутствии эффекторных клеток.

Эксперименты проводили для того, чтобы определить, можно ли использовать систему ACEA для мониторинга уничтожения клеток-мишеней SKBR3 и MG63 в реальном времени посредством ADCC, обусловленной эффекторными клетками PBMC и либо Герцептином^®, либо RX-1.

2. Подготовка клетки-мишени, антитела и PBMC

Клетки SKBR3 (ATCC, Манассас, Вирджиния; #HTB-30 каталога) культивировали в среде DME-15.

Гуманизированное антитело герцептин^® (Genentech Corporation, Южный Сан-Франциско, Калифорния; торговое наименование трастузумаб) восстанавливали водой, чтобы получить 21 мг/мл маточного раствора перед использованием. Герцептин^® устойчив в течение 30 дней после восстановления.

PBMC человека готовили из свежей крови человека, полученной от здоровых доноров-добровольцев. Образцы венозной крови человека (8,5 мл) собирали в пробирки с желтыми крышками с цитратом аммония (ACD-A). Пробирки переворачивали 10-15 раз и цельную кровь удаляли из каждой пробирки с желтой крышкой и переносили в одну коническую пробирку объемом 50 мл. Кровь разводили в соотношении 1:3 PBS в 2% FBS. Двенадцать мл фиколл-гипак (Amersham Biosciences, Пискатавей, Нью-Джерси; #17-1440-02 каталога) медленно распределяли под смесью кровь/PBS. Образцы центрифугировали при комнатной температуре при 2350 об/мин в течение 30 минут перед удалением верхнего слоя (плазма/PBS) отсасыванием. Лейкоцитарную пленку собирали стерильными пипетками и объединяли в конической пробирке объемом 50 мл. Если оставались видимые скопления WBC под лейкоцитарной пленкой, собирали весь материал WBC, стараясь не удалять излишек фиколл-гипак. Добавляли стерильный PBS-2% FBS, чтобы довести объем до 30 мл и смесь перемешивали, переворачивая пробирку. Разбавленную суспензию PBMC центрифугировали при 250×g (1046 об/мин для ротора Beckman GH3.8) при комнатной температуре в течение 17 минут и собирали клеточный осадок. Осадок PBMC суспендировали в 2,5 мл среды R-2 (среда RPMI-1640 с 2% инактивированной нагреванием FBS), тщательно перемешивали и переносили в коническую пробирку объемом 15 мл. PBMC один раз промывали средой R-2 и количество жизнеспособных клеток проверяли при диагностике путем исключения, используя трипановый синий (Invitrogen #15250-061 в каталоге или эквивалентный).

3. Анализ ADCC гибели клеток SKBR3 с использованием герцептина ^® и PBMC

Перед проведением анализа ADCC провели несколько экспериментов, чтобы оценить влияние одних только клеток SKBR3, с антителом герцептин^® или с эффекторными клетками PBMC на клеточный индекс, считываемый системой RT-CES^®.

Клетки SKBR3 высевали при плотности 40 K, 20 K, 10 K или 5 K на лунку и помещали в считыватель RT-CES^®. Свежую среду добавляли через 20 часов и осуществляли мониторинг клеточного индекса в течение 100 часов. Как показано на фиг.1, клеточный индекс увеличивался по мере того, как пролиферировали клетки. Клеточный индекс обладал максимальным пределом обнаружения от 60 K до 160 K клеток на лунку.

В последующих экспериментах клетки SKBR3 высевали при плотности 40 K на лунку. Через 20 часов добавляли свежие среды к одной группе лунок, а PBS, содержащий тритон X-100, добавляли ко второй группе лунок и планшет возвращали в считыватель. Как показано на фиг.2, снижение клеточного индекса следовало после добавления тритона X-100, указывая на клеточную гибель.

В дополнительных экспериментах клетки SKBR3 высевали при плотности 20 K на лунку и через 20 часов добавляли только среды, герцептин^® или контрольное антитело IgG. Добавление либо только герцептина^®, либо IgG значительно не изменяло клеточный индекс по сравнению с клеточным индексом, когда не добавляли никакого антитела (фиг.3).

Клеточный индекс клеток SKBR3, высеянных при плотности 20 K на лунку, затем сравнивали с клеточным индексом для одних только PBMC, добавленных к среде в конечном количестве 5×10⁵ клеток на лунку. К удивлению, PBMC не обладало значительным влиянием на клеточный индекс (фиг.4), указывая, что использование PBMC в качестве эффекторных клеток при анализе ADCC не помешало бы точному определению гибели клеток SKBR3. Когда PBMC добавляли к лункам, содержащим клетки SKBR3, высеянным при плотности 20 K на лунку, клеточный индекс снижался (фиг.5), указывая, что одни только эффекторы PBMC обладают NK-киллерным эффектом на клетки-мишени SKBR3.

Затем проводили анализ на определение гибели клеток SKBR3 в результате ADCC с использованием целевого антитела герцептин^® в присутствии эффекторов PBMC. Клетки-мишени высевали при плотности 20 K на лунку за 20 часов до начала анализа ADCC. В начале анализа ADCC планшет временно удаляли из системы ACEA для добавления антитела и эффекторных клеток.

Эффекторные клетки PBMC добавляли в клеткам-мишеням SKBR3 при соотношении эффектор:мишень 25:1 вместе с антителом герцептин^® в конечной концентрации 5 мкг/мл. Планшет клеток затем возвращали в систему ACEA для непрерывного мониторинга клеточного индекса в течение последующих 48 часов. На фиг.6 показано сравнение клеточного индекса одних только клеток SKBR3, клеток SKBR3 с PBMC и клеток SKBR3 с антителом герцептин^® и PBMC. Значительное снижение клеточного индекса зарегистрировали после добавления PBMC и герцептина^®, отражающего уничтожение клеток SKBR3 посредством ADCC.

Эксперимент повторяли, используя клетки SKBR3 с эффекторами PBMC при соотношении E:T 50:1 или 12,5:1 с герцептином^® или без него в концентрации 5 мкг/мл. На фиг.7 показана зависимость от времени уничтожения посредством ADCC в данных экспериментах, исходя из процента лизиса клеток, который вычисляли согласно следующему ниже уравнению:

Результаты на фиг.7 демонстрируют значительное увеличение лизиса клеток в присутствии герцептина^® и PBMC в результате ADCC.

4. Сравнение анализа ADCC в реальном времени с анализом ADCC по высвобождению кальцеина AM

Эксперименты проводили для сравнения % лизиса, определяемого при использовании анализа ADCC в реальном времени, с % лизиса, определяемого при использовании стандартного анализа ADCC по высвобождению кальцеина АМ.

Анализ с кальцеином АМ проводили, используя следующий ниже протокол. Пузырек с кальцеином AM (Molecular Probes, Юджин, Орегон; #C-3099 в каталоге) при концентрации 1 мг/мл раствора в сухом DMSO оттаивали и осторожно перемешивали пипетированием.

Для того, чтобы пометить клетки SKBR3, среду удаляли и монослой промывали 10 мл одного только PBS (без фетальной бычьей сыворотки (FBS)). Монослой отделяли, добавляя 5 мл EDTA/PBS и инкубируя вплоть до 10 минут при 37°C. Добавляли десять мл свежей R10 (среда RPMI-1640 с 10% инактивированной нагреванием FBS, Pen/Strep (конечная концентрация 100 мкг/мл) и L-глютамин (конечная концентрация 2 мM)). Клетки собирали, центрифугировали и подсчитывали, и 2,5×10⁶ клеток переносили в чистые пробирки объемом 15 мл. Клетки суспендировали в 2,5 мл R-10 в конической пробирке объемом 15 мл и в каждую пробирку добавляли 12,5 мкл кальцеина AM (конечная концентрация 5 мкM). Пробирки инкубировали в течение 30 минут при 37°C в увлажненной атмосфере 5% CO₂, убедившись, что крышка открыта. Клетки осторожно перемешивали каждые 10 минут, чтобы избежать выпадения в осадок. Меченные клетки дважды промывали 10 мл R-2 (среда RPMI-1640 с 2% инактивированной нагреванием FBS). Клетки суспендировали средой R-10, чтобы получить 5×10⁵ клеток/мл.

Клетки-мишени SKBR3 высевали при плотности 20 K на лунку для анализа ADCC. В начале анализа ADCC эффекторные клетки PBMC добавляли к клеткам-мишеням при соотношении 25:1 вместе с контрольным антителом IgG или герцептином^® в концентрациях, показанных на фиг.8. Для смесей клеток-мишеней, эффекторных клеток и антител обеспечивали инкубирование при 37°C в течение четырех часов. При окончании инкубирования клетки осаждали центрифугированием и высвобождение кальцеина AM определяли в надосадочной жидкости.

Среднее значение контроля фоновой среды для каждой мишени вычитали из каждой отдельной линии клеток-мишеней до анализа и процентное отношение минимума к максимуму вычисляли, используя следующее ниже уравнение:

Анализ считали недостоверным, если процентное соотношение минимального высвобождения к максимальному высвобождению составляло более чем 37%. Процент специфического лизиса вычисляли, исходя из среднего значения для трех повторных точек, используя следующее ниже уравнение:

Процент лизиса, определенный с использованием анализа с кальцеином AM, показан на фиг.8B. На фиг.8A показан процент лизиса, определенный в параллельном анализе, проведенном с использованием системы RT-CES^®. Клетки-мишени SKBR3 высевали за 18-20 часов до добавления эффекторных клеток PBMC и антител IgG или герцептина^® в тех же самых соотношениях и концентрациях, как и в анализе с кальцеином AM. Процент лизиса, определенный с использованием системы RT-CES, приблизительно в 2 раза выше, чем процент лизиса, определенный с использованием мечения кальцеином AM. Такое может происходить вследствие того факта, что при анализе с кальцеином AM необходимы клетки, находящиеся в суспензии, тогда как в анализе с RT-CES клетки прикреплены к подложке.

5. Анализ гибели клеток MG63 посредством ADCC при использовании моноклонального антитела RX-1 и PBMC

Клетки MG63 и SKBR3 высевали при плотности 20 K на лунку и осуществляли мониторинг клеточного индекса в течение 24 часов. Рост клеток SKBR3 показал линейную взаимосвязь с клеточным индексом, тогда как рост клеток MG63, в основном, такого не показал (фиг.9). Тем не менее, в диапазоне приблизительно от 7 часов до приблизительно 17 часов клеточный рост MG63 представлял приблизительно линейную взаимосвязь с клеточным индексом, что приводит к предположению о том, что анализ ADCC для клеток MG63 следует проводить в рамках данного периода времени.

Анализ ADCC проводили с клетками-мишенями MG63, высеянными при плотности 20 K на лунку. Клеточный индекс для одних только клеток MG63 сравнивали с клеточным индексом для клеток MG63, к которым через 18-20 часов добавляли PBMC, PBMC и контрольное антитело IgG или PBMC и антитело RX1. Соотношение эффектора PBMC и клетки-мишени MG63 в каждом эксперименте составляло 50:1, и антитело добавляли при концентрации 5 мкг/мл. Как показано на фиг.10A, клеточный индекс снижался после добавления PBMC и RX1 в результате ADCC против клеток MG63. Кинетика ADCC, тем не менее, отличалась от кинетики, наблюдаемой, когда тот же самый эксперимент повторяли с клетками SKBR3 в присутствии PBMC, PBMC и IgG или PBMC и герцептина^® (фиг.10B). Данные результаты демонстрируют применимость анализа ADCC в реальном времени для получения подробной информации о кинетике ADCC.

6. Заключение

Описанные здесь анализы ADCC обеспечивают усовершенствование современных способов для анализа ADCC. В отличие от стандартных видов анализа виды анализа, основанные на RT-CES^®, можно использовать для отслеживания гибели при ADCC в реальном времени, что позволяет тщательно отслеживать кинетику ADCC. Эти виды анализа являются более чувствительными, чем другие виды анализа ADCC, которые доступны в настоящее время, и более быстрыми и обладают возможностью оптимизации для высокопроизводительного скрининга. В дополнение, эти виды анализа не требуют использования метки и нерадиоактивны, или требуют уменьшенной концентрации метки, что делает их более безопасными, чем, например, анализы, включающие в себя радиоактивное мечение. Поскольку анализы можно поводить с прилипающими клетками, не отделяя их от планшета, они позволяют проводить более точную оценку ADCC на клетках in vivo. Таким образом, описанные здесь анализы ADCC улучшат способность анализировать терапевтические антитела-кандидаты в отношении активности ADCC.

Более того, предлагаемые здесь виды анализа ADCC можно использовать, чтобы выявить популяции пациентов, подходящих для лечения определенным антителом. Как обсуждалось выше, эти виды анализа можно проводить, используя PBMC в качестве эффекторных клеток. Существуют полиморфизмы среди Fc-рецепторов на эффекторных клетках PBMC, которые могут влиять на способность эффекторных клеток связываться с комплексом мишень-специфическое антитело и, таким образом, опосредовать ADCC. Предлагаемые здесь виды анализа ADCC представляют собой быстрые и простые виды анализа, которые можно использовать для того, чтобы определить, способны ли PBMC от определенного пациента в комбинации с терапевтическим антителом опосредовать ADCC для клеток-мишеней.

В заключение, предлагаемые здесь способы анализа ADCC обладают возможностью менять способ, посредством которого измеряют ADCC, как в отрасли разработки лекарственного средства, так и при фундаментальных исследованиях по изучению иммунного ответа, опосредованного антителами.

ДРУГИЕ ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Необходимо понимать, что несмотря на то, что изобретение было описано в сочетании с его подробным описанием, предшествующее описание предназначено для иллюстрации и не ограничивает объем изобретения, который определен объемом прилагаемой формулы изобретения. Другие аспекты, преимущества и модификации находятся в объеме следующей ниже формулы изобретения.

1. Способ анализа антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC), включающий:
(a) мониторинг импеданса между электродами на непроводящей подложке, которая способствует росту клеток-мишеней в среде для анализа; и
(b) добавление в среду для анализа эффекторных клеток и антитела, которое связывается с клетками-мишенями;
причем снижение импеданса между электродами на подложке после добавления эффекторных клеток и антитела характерно для действия ADCC, произошедшего в среде для анализа, и причем увеличение или отсутствие изменения импеданса между электродами на подложке после добавления эффекторных клеток и антитела характерно для отсутствия действия ADCC в среде для анализа;
эффекторные клетки включают в себя мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС);
этап добавления включает
добавление к клеткам-мишеням цельной крови или цельной крови, которую частично обогатили эффекторными клетками.

2. Способ по п.1, включающий измерение импеданса через определенные промежутки времени.

3. Способ по п.2, включающий получение клеточного индекса (CI), исходя из каждого измерения импеданса, и определение, имело ли место изменение клеточного индекса, причем клеточный индекс получают, исходя из каждого измерения импеданса, используя формулу

где R_b(f) и R_cell(f) представляют собой частотнозависимые сопротивления электродов без клеток или при наличии клеток соответственно, и N представляет собой количество значений частот, при которых измеряют импеданс.

4. Способ по любому из пп.1-3, в котором способ проводят, используя систему RT-CES^®.

5. Способ по любому из пп.1-3, в котором измерения импеданса проводят каждые 15 мин.

6. Способ по любому из пп.1-3, в котором способ дополнительно включает высевание клеток-мишеней.

7. Способ по п.6, в котором клетки-мишени высевают за от 18 до 24 ч перед добавлением антитела и эффекторных клеток.

8. Способ по любому из пп.1-3, в котором клетки-мишени представляют собой монослой на подложке.

9. Способ по любому из пп.1-3, в котором клетки-мишени высевают при плотности в диапазоне от 2 К до 100 К на лунку.

10. Способ по любому из пп.1-3, в котором клетки-мишени высевают при плотности в диапазоне от 15 К до 25 К на лунку.

11. Способ по любому из пп.1-3, в котором клетки-мишени высевают при плотности приблизительно 20 К на лунку.

12. Способ по любому из пп.1-3, в котором соотношение эффекторных клеток и клеток-мишеней (Е:Т) составляет 25:1.

13. Способ по любому из пп.1-3, в котором Е:Т более чем 10:1.

14. Способ по любому из пп.1-3, в котором Е:Т более чем 50:1.

15. Способ по любому из пп.1-3, в котором Е:Т более чем 100:1.

16. Способ по любому из пп.1-3, в котором антитело добавляют при концентрации в диапазоне от приблизительно 1 до приблизительно 100 мкг/мл.

17. Способ по любому из пп.1-3, в котором антитело добавляют при концентрации в диапазоне от приблизительно 1 до приблизительно 50 мкг/мл.

18. Способ по любому из пп.1-3, в котором антитело добавляют при концентрации в диапазоне от приблизительно 2 до приблизительно 8 мкг/мл.

19. Способ по любому из пп.1-3, включающий добавление в среду для анализа двух или более антител, которые связываются с клетками-мишенями.

20. Способ по любому из пп.1-3, включающий добавление в среду для анализа трех или более антител, которые связываются с клетками-мишенями.

21. Способ по любому из пп.1-3, включающий добавление в среду для анализа четырех или более антител, которые связываются с клетками-мишенями.

22. Способ по любому из пп.1-3, в котором клетки-мишени экспрессируют апикальные антигены.

23. Способ по п.22, включающий предварительную стадию скрининга клеток-мишеней в отношении экспрессии апикального антигена.

24. Способ по любому из пп.1-3, в котором клетки-мишени представляют собой раковые клетки или зараженные вирусом клетки.

25. Способ по п.24, в котором клетки-мишени представляют собой раковые клетки.

26. Способ по п.25, в котором раковые клетки происходят из клеточной линии.

27. Способ по п.26, в котором раковые клетки представляют собой клетки SKBR3 или клетки MG63.

28. Способ по любому одному из пп.1-3, в котором эффекторные клетки включают в себя мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС), естественные киллерные (NK) клетки, моноциты, цитотоксические Т-клетки или нейтрофилы.

29. Способ по п.28, в котором эффекторные клетки представляют собой РВМС.

30. Способ по любому из пп.1-3, который представляет собой высокопроизводительный анализ, и в котором непроводящая подложка содержит две или более лунок титровального микропланшета, причем каждая лунка содержит, по меньшей мере, два электрода и включает в себя мониторинг импеданса между электродами в каждой лунке.

31. Способ по п.1, в котором антитело получают от пациента с аутоиммунным нарушением.

32. Способ скрининга антитела-кандидата в отношении способности индуцировать ADCC против клеток-мишеней, включающий:
(a) мониторинг импеданса между электродами на непроводящей подложке, которая способствует росту клеток-мишеней в среде для анализа; и
(b) добавление эффекторных клеток и антитела-кандидата, которое связывается с клетками-мишенями, в среду для анализа;
причем снижение импеданса между электродами на подложке после добавления эффекторных клеток и антитела характерно для способности антитела-кандидата влиять на действие ADCC против клеток-мишеней, и причем увеличение или отсутствие изменения импеданса между электродами на подложке после добавления эффекторных клеток и антитела может быть характерно для неспособности антитела-кандидата влиять на действие ADCC против клеток-мишеней;
эффекторные клетки включают в себя мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС);
этап добавления включает
добавление к клеткам-мишеням цельной крови или цельной крови, которую частично обогатили эффекторными клетками.

33. Способ выявления пациента, страдающего заболеванием, ассоциированным с клетками-мишенями, который подходит для лечения антителом-кандидатом, способ, включающий:
(a) мониторинг импеданса между электродами на непроводящей подложке, которая способствует росту клеток-мишеней, ассоциированных с заболеванием;
(b) добавление выделенных у пациента РВМС и антитела-кандидата к клеткам-мишеням и
(c) определение, имеет ли место изменение импеданса между электродами на подложке после добавления РВМС и антитела, причем снижение импеданса между электродами характерно для пригодности пациента для лечения при помощи антитела, и причем увеличение или отсутствие изменения импеданса между электродами на подложке после добавления РВМС и антитела характерно для непригодности пациента для лечения при помощи антитела,
причем этап добавления включает
добавление к клеткам-мишеням цельной крови или цельной крови, которую частично обогатили РВМС.

34. Способ скрининга соединения-кандидата в отношении способности модулировать ADCC, включающий:
(а) мониторинг импеданса между электродами на непроводящей подложке, которая способствует росту клеток-мишеней в среде для анализа;
b) добавление в среду для анализа эффекторных клеток и антитела в присутствии и при отсутствии соединения-кандидата, причем антитело связывается с клетками-мишенями; и
(с) сравнение любого изменения импеданса между электродами на подложке после добавления эффекторных клеток и антитела в присутствии соединения-кандидата с любым изменением импеданса между электродами на подложке после добавления эффекторных клеток и антитела при отсутствии соединения-кандидата, где изменение импеданса в присутствии соединения-кандидата, которое больше, чем любое изменение импеданса при отсутствии соединения-кандидата, показывает, что соединение-кандидат обладает способностью модулировать ADCC,
причем эффекторные клетки включают в себя мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС);
этап добавления включает
добавление к клеткам-мишеням цельной крови или цельной крови, которую частично обогатили эффекторными клетками.

35. Способ скрининга по п.32, в котором соединение для скрининга модулирует связанную с аутоиммунными состояниями ADCC.

36. Анализ для контроля качества антитела, включающий:
(a) мониторинг импеданса между электродами на непроводящей подложке, которая способствует росту клеток-мишеней в среде для анализа; и
(b) добавление эффекторных клеток и антитела в среду для анализа, причем антитело связывается с клетками-мишенями;
причем снижение импеданса между электродами на подложке после добавления эффекторных клеток и антитела показывает, что антитело подходит для производства с целью применения при индукции ADCC, и причем увеличение или отсутствие изменения импеданса после добавления эффекторных клеток и антитела показывает, что антитело не подходит для производства с целью применения при индукции ADCC;
эффекторные клетки включают в себя мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС);
этап добавления включает
добавление к клеткам-мишеням цельной крови или цельной крови, которую частично обогатили эффекторными клетками.

37. Анализ для контроля качества антитела, включающий:
(a) мониторинг импеданса между электродами на непроводящей подложке, которая способствует росту клеток-мишеней в среде для анализа;
(b) добавление эффекторных клеток и антитела в среду для анализа, причем антитело связывается с клетками-мишенями; и
(c) сравнение любого изменения импеданса между электродами на подложке после добавления эффекторных клеток и антитела с любым изменением импеданса для контрольного образца после добавления эффекторных клеток и контрольного антитела;
причем снижение импеданса между электродами на подложке после добавления эффекторных клеток и антитела, которое больше, чем любое снижение импеданса для контрольного образца после добавления эффекторных клеток и контрольного антитела, показывает, что антитело подходит для производства с целью применения при индукции ADCC, и причем отсутствие снижения импеданса после добавления эффекторных клеток и антитела, которое больше, чем любое снижение импеданса для контрольного образца после добавления эффекторных клеток и контрольного антитела, показывает, что антитело не подходит для производства с целью применения при индукции ADCC;
эффекторные клетки включают в себя мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС); и
этап добавления включает
добавление к клеткам-мишеням цельной крови или цельной крови, которую частично обогатили эффекторными клетками.

38. Анализ для контроля качества по п.37, в котором снижение импеданса после добавления эффекторных клеток и антитела, которое, по меньшей мере, на 25% больше, чем снижение импеданса для контрольного образца после добавления эффекторных клеток и контрольного антитела, показывает, что антитело подходит для производства с целью применения при индукции ADCC.

39. Способ скрининга соединения-кандидата для применения в качестве терапевтического средства против аутоиммунного заболевания, включающий:
(a) мониторинг импеданса между электродами на непроводящей подложке, которая способствует росту клеток-мишеней в среде для анализа, причем клетки-мишени представляют собой здоровые клетки;
(b) добавление в среду для анализа эффекторных клеток и антитела в присутствии и отсутствии соединения-кандидата, причем антитело связывается с клетками-мишенями, и причем эффекторные клетки представляют собой РВМС субъекта с диагнозом аутоиммунного заболевания; и
(c) сравнение любого изменения импеданса в присутствии соединения-кандидата с любым изменением импеданса при отсутствии соединения-кандидата, причем снижение импеданса при отсутствии соединения-кандидата, которое больше, чем любое снижение импеданса в присутствии соединения-кандидата, показывает, что соединение-кандидат подходит в качестве терапевтического средства против аутоиммунного заболевания, и причем отсутствие снижения импеданса при отсутствии соединения-кандидата, которое больше, чем любое снижение импеданса в присутствии соединения-кандидата, показывает, что соединение-кандидат не подходит в качестве терапевтического средства против аутоиммунного заболевания; и
этап добавления включает
добавление к клеткам-мишеням цельной крови или цельной крови, которую частично обогатили эффекторными клетками.

40. Способ определения, подходит ли антитело-кандидат для лечения субъекта, страдающего аутоиммунным заболеванием, включающий:
(а) мониторинг импеданса между электродами на непроводящей подложке, которая способствует росту клеток-мишеней, ассоциированных с аутоиммунным заболеванием; и
(b) добавление антитела-кандидата и выделенных у субъекта РВМС к клеткам-мишеням; и
(c) определение, имеет ли место изменение импеданса между электродами на подложке после добавления РВМС и антитела-кандидата, причем снижение импеданса между электродами показывает, что антитело подходит для лечения субъекта, и причем отсутствие снижения импеданса между электродами показывает, что антитело не подходит для лечения субъекта,
этап добавления включает
добавление к клеткам-мишеням цельной крови, или цельной крови, которую частично обогатили РВМС.

41. Способ определения оптимальной концентрации антитела для индукции реакции ADCC, включающий:
(a) мониторинг импеданса между электродами на непроводящей подложке, которая способствует росту двух или более образцов клеток-мишеней в среде для анализа; и
(b) добавление эффекторных клеток и антитела к двум или более образцам клеток-мишеней, причем антитело связывается с клетками-мишенями, и причем антитело добавляют к двум или более образцам клеток-мишеней в различных концентрациях;
причем снижение импеданса между электродами на подложке после добавления эффекторных клеток и антитела характерно для действия ADCC, произошедшего в среде для анализа, и причем концентрация антитела, которая приводит к наибольшему снижению импеданса, как определяют, является оптимальной концентрацией;
эффекторные клетки включают в себя мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС); и
этап добавления включает
добавление к клеткам-мишеням цельной крови или цельной крови, которую частично обогатили эффекторными клетками.

42. Способ определения, связывается ли антитело с апикальным антигеном на клетке-мишени, включающий:
(a) мониторинг импеданса между электродами на непроводящей подложке, которая способствует росту клеток-мишеней в среде для анализа; и
(b) добавление эффекторных клеток и антитела к клеткам-мишеням;
причем снижение импеданса между электродами на подложке после добавления эффекторных клеток и антитела показывает, что антитело связывается с апикальным антигеном на клетках-мишенях;
эффекторные клетки включают в себя мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС); и
этап добавления включает
добавление к клеткам-мишеням цельной крови или цельной крови, которую частично обогатили эффекторными клетками.