Способ определения тетраэтилтиурамдисульфида в крови



Способ определения тетраэтилтиурамдисульфида в крови
Способ определения тетраэтилтиурамдисульфида в крови

 


Владельцы патента RU 2417372:

Шорманов Владимир Камбулатович (RU)
Просветова Анастасия Петровна (RU)
Дурицын Евгений Петрович (RU)
Горбачёва Надежда Александровна (RU)

Изобретение относится к биологии и токсикологической химии и касается способа определения тетраэтилтиурамдисульфида в крови. Сущность способа заключается в том, что к анализируемой пробе прибавляют фторид натрия в количестве, составляющем 10% от массы биологического объекта, дважды по 45 минут настаивают с порциями этилацетата, масса каждой из которых в два раза превышает массу биологического материала, отдельные извлечения объединяют, фильтруют через безводный сульфат натрия, растворитель из фильтрата испаряют при температуре 50-60°С, остаток растворяют в смеси растворителей гексан-диоксан-пропанол-2, хроматографируют в колонке с силикагелем L 40/100 µ с применением подвижной фазы гексан-диоксан-пропанол-2. Фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют, остаток растворяют в смеси растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 и проводят определение анализируемого соединения методом ВЭЖХ в колонке размерами 64×2 мм, заполненной сорбентом «Силасорб 600» с использованием подвижной фазы гексан-диоксан-пропанол-2 и УФ-детектора. Изобретение позволяет сократить продолжительность определения тетраэтилтиурамдисульфида в крови и повысить его чувствительность. 3 табл.

 

Изобретение относится к биологии и токсикологической химии, а именно к способам определения тетраэтилтиурамдисульфида в крови, и может быть использовано в практике химико-токсикологических и клинических лабораторий. Способ относится к числу массовых.

Известен способ определения тетраэтилтиурамдисульфида в биологическом материале (тканях внутренних органов), заключающийся в обработке биологической пробы примерно равным по массе количеством смеси гексана и хлороформа, взятых в объемном отношении 6:4, в течение двух часов, отделении полученного извлечения, хроматографировании в колонке, заполненной безводным сульфатом натрия и силикагелем, с использованием подвижной фазы гексан-хлороформ (6:4 по объему), упаривании всего объема элюата до сухого остатка, обработки остатка в сернокислой среде раствором гидрохинона, а затем раствором ацетата меди с последующим измерением оптической плотности образующегося окрашенного раствора в области длин волн 400-420 нм (Мужановський Э.Б., Фартушний А.Ф., Седов A.I., Бейкiн С.Г. Визначення тетураму i тiураму в бiологичному матерiалi // Фармацевтичний журнал. - 1979. - №2. - С.54-57).

Способ характеризуется недостаточно высокой чувствительностью, малой селективностью, относительно низкой точностью определения.

Известен способ определения тетраэтилтиурамдисульфида в крови путем настаивания анализируемой пробы в течение 12 часов с двадцатикратным (по объему) количеством смеси растворителей этанол-эфир, взятых в объемном отношении 1:1, отделения полученного извлечения от биоматериала фильтрованием, упаривания фильтрата досуха в вакуумном дистилляторе, растворения остатка в тетрахлорметане, обработки раствором йодида меди в течение получаса при встряхивании, центрифугирования реакционной смеси с последующим спектрофотометрическим определением при длине волны 430 нм (Гадаскина И.Д., Филов В.А. Превращения и определение промышленных органических ядов в организме. - Л.: Химия, 1971. - С.225-226).

Способ характеризуется длительностью выполнения, недостаточно высокими селективностью и чувствительностью.

Наиболее близким является способ определения тетраэтилтиурамдисульфида в крови, основанный на том, что анализируемую пробу настаивают в течение 12 часов с двадцатикратным (по объему) количеством смеси растворителей этанол-эфир, взятых в объемном отношении 1:1, полученное извлечение отделяют от биоматериала фильтрованием, растворитель из фильтрата испаряют при температуре не выше 60°С до получения сухого остатка, остаток растворяют в хлороформе, хлороформный раствор наносят на пластину с тонким слоем сорбента, хроматографируют, используя подвижную фазу хлороформ-тетрахлорметан (3:1), хроматограммы проявляют путем обработки поверхности сорбента 10% раствором сульфата меди с последующим определением анализируемого вещества в виде его окрашенного комплекса с ионами меди денситометрическим методом (Егорова Н.М. Денситометрическое определение тетурама в крови // Материалы конференции молодых ученых 1 ММИ (1-го Московского медицинского института им. И.М.Сеченова). - М., 1972. - Ч.1. - С.87-88).

Способ отличается значительными затратами времени на проведение процесса определения и недостаточно высокой чувствительностью.

Задачей изобретения является сокращение продолжительности определения и повышение его чувствительности.

Поставленная задача достигается с помощью предлагаемого способа, который заключается в том, что к анализируемой пробе прибавляют фторид натрия в количестве, составляющем 10% от массы биологического объекта, смесь дважды по 45 минут настаивают с порциями этилацетата, каждая из которых в два раза по массе превышает массу биологического материала, отдельные извлечения объединяют, фильтруют через безводный сульфат натрия, растворитель из фильтрата испаряют при температуре 50-60°C, остаток растворяют в смеси растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (40:5:1 по объему), хроматографируют в колонке с силикагелем L 40/100 µ с применением подвижной фазы гексан-диоксан-пропанол-2 (40:5:1 по объему), фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют, остаток растворяют в смеси растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (15:5:1 по объему) и проводят определение анализируемого соединения методом ВЭЖХ в колонке размерами 64×2 мм, заполненной сорбентом «Силасорб 600» с использованием подвижной фазы гексан-диоксан-пропанол-2 (15:5:1 по объему) и УФ- детектора.

Способ осуществляется следующим образом: к биологической пробе, содержащей тетраэтилтиурамдисульфид, прибавляют фторид натрия, масса которого составляет 10% от массы биологического объекта, дважды по 45 минут настаивают с порциями этилацетата, масса каждой из которых в два раза превышает массу биологического материала, отдельные извлечения объединяют, фильтруют через безводный сульфат натрия, растворитель испаряют из фильтрата при температуре 50-60°C, остаток растворяют в смеси растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (40:5:1 по объему), вносят в колонку с силикагелем L 40/100 µ, хроматографируют с применением подвижной фазы гексан-диоксан-пропанол-2 (40:5:1 по объему), фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют, остаток растворяют в смеси растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (15:5:1 по объему) и проводят определение анализируемого соединения методом ВЭЖХ в колонке размерами 64×2 мм, заполненной сорбентом «Силасорб 600» с использованием подвижной фазы гексан-диоксан-пропанол-2 (15:5:1 по объему) и УФ-детектора.

Пример 1

Определение тетраэтилтиурамдисульфида в неконсервированной крови человека

В 10 г неконсервированной крови человека вносят 10 мг тетраэтилтиурамдисульфида, тщательно перемешивают биологическую жидкость с веществом и оставляют на 1,5 часа при температуре 18-20°C. По истечении указанного времени к биологическому объекту, содержащему анализируемое вещество, прибавляют 1 г фторида натрия, образующуюся смесь перемешивают в течение 2 минут, после чего заливают 20 г этилацетата и выдерживают 45 минут при периодическом перемешивании. Извлечение отделяют от биологического материала, а операцию настаивания повторяют в указанных условиях. Отдельные вытяжки объединяют, фильтруют через стеклянный фильтр диаметром 4 см со слоем безводного сульфата натрия высотой 1-1,5 см. Фильтр дополнительно промывают 10 г этилацетата. Фильтрат и промывную жидкость объединяют, упаривают до сухого остатка в токе воздуха в условиях нагревания на водяной бане при температуре 50-60°C. Остаток растворяют в 2-3 мл системы растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (40:5:1 по объему). Полученный раствор вносят в колонку размерами 490×11 мм, заполненную 10 г силикагеля L 40/100 µ. После полного вхождения раствора в слой сорбента в колонку прибавляют элюент - систему растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (40:5:1 по объему).

Выходящий из колонки элюат собирают отдельными фракциями по 2 мл каждая. Фракции с 9 по 16 включительно объединяют в выпарительной чашке, элюент испаряют в токе воздуха в условиях нагревания при 50-60°C на водяной бане, остаток растворяют в 10-15 мл диоксана, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят содержимое колбы диоксаном до метки (раствор А). 2,5 мл раствора А вносят в мерную колбу вместимостью 25 мл, туда же прибавляют 2,5 мл диоксана, 1 мл пропанола-2, 15 мл гексана и доводят содержимое колбы до метки смесью растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (15:5:1 по объему) (раствор Б). 8 мкл раствора Б вводят в хроматограф типа «Милихром».

Хроматографируют методом ВЭЖХ. Процесс хроматографирования осуществляют в колонке размерами 64×2 мм, заполненной нормальнофазовым сорбентом «Силасорб 600» с применением подвижной фазы гексан-диоксан-пропанол-2 (15:5:1 - по объему) и УФ-детектора.

Скорость подачи элюента составляет 100 мкл/мин, масштаб регистрации 0,8 единиц оптической плотности, время измерения 0,6 сек. Оптическую плотность регистрируют при длине волны 276 нм.

Пик на хроматограмме с временем удерживанием 4,42 мин (объемом удерживания 442 мкл) соответствует тетраэтилтиурамдисульфиду.

Количественное содержание тетраэтилтиурамдисульфида определяют исходя из площади хроматографического пика по уравнению калибровочного графика и пересчитывают на навеску вещества, внесенную в неконсервированную кровь.

Построение калибровочного графика.

В ряд мерных колб вместимостью 10 мл вносят 0,25; 0,5; 1,0; 2,0; 4,0; 5,0 мл 0,01% раствора тетраэтилтиурамдисульфида в смеси растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (15:5:1 по объему) и доводят до метки смесью растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (15:5:1 по объему). 8 мкл каждого из полученных растворов вводят в хроматограф. Хроматографирование осуществляют в колонке размером 64×2 мл, заполненной сорбентом «Силасорб 600», используя подвижную фазу гексан-диоксан-пропанол-2 (15:5:1 по объему) и УФ-детектор. Скорость подачи элюента составляет 100 мкл/мин.

Масштаб регистрации 0,8 единиц оптической плотности, время измерения 0,6 сек. Оптическую плотность регистрируют при длине волны 276 нм.

По результатам измерений на хроматографе строят график зависимости площади хроматографического пика от концентрации определяемого вещества. График линеен в интервале концентраций 0,02-0,40 мкг.

Методом наименьших квадратов рассчитывают уравнение калибровочного графика, которое в данном случае имеет вид:

S=10,61051·C+0,03288,

где S - площадь хроматографического пика, C - концентрация определяемого вещества в хроматографируемой пробе, мкг.

Результаты количественного определения тетраэтилтиурамдисульфида представлены в таблице 1.

Пример 2

Определение тетраэтилтиурамдисульфида в крови человека, консервированной фаглюцидом

В 10 г крови человека, консервированной фаглюцидом, вносят 10 мг тетраэтилтиурамдисульфида, тщательно перемешивают биологическую жидкость с веществом и оставляют на 1,5 часа при температуре 18-20°С. По истечении указанного времени к биологическому объекту, содержащему анализируемое вещество, прибавляют 1 г фторида натрия, образующуюся смесь перемешивают в течение 2 минут, после чего заливают 20 г этилацетата и выдерживают 45 минут при периодическом перемешивании. Извлечение отделяют от биологического материала, а операцию настаивания повторяют в указанных условиях. Отдельные вытяжки объединяют, фильтруют через стеклянный фильтр диаметром 4 см со слоем безводного сульфата натрия высотой 1-1,5 см. Фильтр дополнительно промывают 10 г этилацетата. Фильтрат и промывную жидкость объединяют, упаривают до сухого остатка в токе воздуха в условиях нагревания на водяной бане при температуре 50-60°C. Остаток растворяют в 2-3 мл системы растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (40:5:1 по объему). Полученный раствор вносят в колонку размерами 490×11 мм, заполненную 10 г силикагеля L 40/100 µ. После полного вхождения раствора в слой сорбента в колонку прибавляют элюент - систему растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (40:5:1 по объему). Выходящий из колонки элюат собирают отдельными фракциями по 2 мл каждая. Фракции с 9 по 16 включительно объединяют в выпарительной чашке, элюент испаряют в токе воздуха в условиях нагревания при 50-60°C на водяной бане, остаток растворяют в 10-15 мл диоксана, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят содержимое колбы диоксаном до метки (раствор А). 2,5 мл раствора А вносят в мерную колбу вместимостью 25 мл, туда же прибавляют 2,5 мл диоксана, 1 мл пропанола-2, 15 мл гексана и доводят содержимое колбы до метки смесью растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (15:5:1 по объему) (раствор Б). 8 мкл раствора Б вводят в хроматограф типа «Милихром».

Хроматографируют методом ВЭЖХ. Процесс хроматографирования осуществляют в колонке размерами 64×2 мм, заполненной нормальнофазовым сорбентом «Силасорб 600» с применением подвижной фазы гексан-диоксан-пропанол-2 (15:5:1 - по объему) и УФ-детектора.

Скорость подачи элюента составляет 100 мкл/мин, масштаб регистрации 0,8 единиц оптической плотности, время измерения 0,6 сек. Оптическую плотность регистрируют при длине волны 276 нм.

Пик на хроматограмме с временем удерживанием 4,42 мин (объемом удерживания 442 мкл) соответствует тетраэтилтиурамдисульфиду.

Количественное содержание тетраэтилтиурамдисульфида определяют исходя из площади хроматографического пика по уравнению калибровочного графика и пересчитывают на навеску вещества, внесенную в кровь, консервированную фаглюцидом.

Построение калибровочного графика и его уравнение приводятся выше в примере 1.

Предлагаемый способ по сравнению с прототипом в 3 раза сокращает время проведения анализа, в 250 раз повышает чувствительность определения в хроматографируемой пробе и в 2,5 раза в крови. Сравнительная характеристика предлагаемого и известного способов представлена в таблице 3.

Таблица 3
Сравнительная характеристика предлагаемого и известного способов (на примере исследования неконсервированной крови человека)
Показатель Предлагаемый способ Известный способ
1. Продолжительность определения 4-4,5 часов 13-14 часов
2.Чувствительность (открываемый минимум):
а) в хроматографируемой пробе 0,02 мкг 5 мкг
б) в 100 г биоматериала 0,2 мг 0,5 мг
3. Интервал линейности калибровочного графика 0,02-0,40 мкг 5-60 мкг
4. Степень извлечения анализируемого соединения из биологического материала 92,93% Около 80%

Способ определения тетраэтилтиурамдисульфида в крови, заключающийся в том, что анализируемую пробу настаивают с органическим экстрагентом, полученное извлечение отделяют от биологического материала, упаривают при температуре не выше 60°С до получения сухого остатка, остаток растворяют в органическом растворителе, хроматографируют и определяют анализируемое вещество физико-химическим методом, отличающийся тем, что анализируемую пробу перед проведением настаивания обрабатывают фторидом натрия, масса которого составляет 10% от массы биологического объекта, настаивание пробы ведут двукратно по 45 мин порциями этилацетата, масса каждой из которых в два раза превышает массу биологического объекта, полученное извлечение перед упариванием фильтруют через слой безводного сульфата натрия, сухой остаток, полученный после упаривания фильтрата, растворяют в смеси растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (40:5:1 по объему), хроматографируют в колонке с силикагелем L 40/100 µ с применением подвижной фазы гексан-диоксан-пропанол-2 (40:5:1 по объему), фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют, остаток растворяют в смеси растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (15:5:1 по объему) и проводят определение анализируемого вещества методом ВЭЖХ в колонке размерами 64×2, заполненной сорбентом «Силасорб 600» с применением подвижной фазы гексан-диоксан-пропанол-2 (15:5:1 по объему) и УФ-детектора.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к области медицины, в частности к офтальмологии, и касается способа диагностики глаукомы у лиц с прогрессирующей близорукостью. .
Изобретение относится к области медицины, в частности к гастроэнтерологии, и может быть использовано для диагностики хронического вирусного гепатита С, обусловленного опийной наркоманией.
Изобретение относится к области медицины, а именно к диагностике злокачественных процессов в организме человека. .

Изобретение относится к области медицины, в частности гепатологии и инфекционным болезням. .

Изобретение относится к области медицины, а именно к генетике человека. .

Изобретение относится к области медицины, а именно к стоматологии, и касается способа диагностики хронического генерализованного пародонтита с агрессивным течением.

Изобретение относится к биологии, экологии, токсикологический и санитарной химии, а именно к способам определения тетраметилтиурамдисульфида в биологическом материале.
Изобретение относится к области медицины, в частности к офтальмологии, и может использоваться при подготовке клеток конъюнктивы к цитологическому исследованию. .
Изобретение относится к медицине и ветеринарии, а именно к лабораторным методам исследования функционально-метаболической активности нейтрофилов периферической крови, и касается способа определения функциональной активности нейтрофилов по реакции восстановления нитросинего тетразолия.
Изобретение относится к области ветеринарии. .

Изобретение относится к биологии, экологии, токсикологический и санитарной химии, а именно к способам определения тетраметилтиурамдисульфида в биологическом материале.

Изобретение относится к аналитической химии органических соединений и может быть рекомендовано для аналитического контроля содержания химических соединений в очищенных сточных водах производств лекарственных средств и химической промышленности.

Изобретение относится к анализу количества примесей в углекислом газе в процессе производства и/или очистки. .

Изобретение относится к аналитической химии. .

Изобретение относится к приборам, используемым в нефтегазовой отрасли. .

Изобретение относится к устройствам для разделения веществ методами жидкостной хроматографии с использованием с сверхкритических флюидов (СКФ). .
Изобретение относится к области экологии и аналитической химии применительно к оценке загрязнения водных сред нефтепродуктами. .

Изобретение относится к газохроматографическому анализу различных химических соединений и может быть использовано в контроле качества спиртных напитков. .
Изобретение относится к газохроматографическому анализу различных химических соединений и может быть использовано в медицине, биологии, экологии и допинговом контроле
Наверх