Способ определения водорастворимых витаминов в премиксах

Изобретение относится к аналитической химии. Способ осуществляют следующим образом: навеску предварительно измельченного премикса заливают раствором соляной кислоты, помещают в светонепроницаемый футляр, который устанавливают на ультразвуковую баню. Экстракцию проводят 15-20 минут при температуре 38-42°С. Затем центрифугируют 10 минут при 8000 об/мин, доводят до метки в мерной колбе. Полученный раствор подвергают хроматографическому разделению на колонке с сорбентом Purospher. Условия хроматографирования: элюент А - 0,005 М раствор перхлората лития, pH 2,5; элюент Б - ацетонитрил; градиентный режим элюирования от 0 до 26% элюента Б за 14 мин. Техническим результатом является повышение эффективности и точности и возможность определения более широкого спектра витаминов, независимо от основы премикса. 2 ил., 5 табл.

 

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к разделам экстракции и хроматографии. Оно может быть использовано для хроматографического анализа в медицине и сельском хозяйстве.

Известен метод определения водорастворимых витаминов (см. ГОСТ Р 50929-96 «Методы определения витаминов группы В»). Сущность метода заключается в экстракции витаминов (B1, В2 и В5) из навески раствором соляной кислоты: навеска 1 г + 10 мл раствора соляной кислоты концентрации 0,01 моль/л, экстракцию проводят на магнитной мешалке с подогревом в течение 10 минут, центрифугируют при 5000-6000 об/мин в течение 3 минут, доводят в мерной колбе на 25 мл до метки с последующим хроматографическим анализом. Хроматографирование осуществляют в следующих условиях: элюент (120 мл ацетонитрила + 880 мл воды, + 2,5 мл триэтиламина, 0,5 г октилсульфоната натрия + ортофосфорная кислота до pH 7,6 по pH-метру), изократический режим элюирования, скорость элюирования 1,2 мл/мин, рабочая длина волны спектрофотометрического детектора 254 нм.

Однако известный метод позволяет определить смесь только трех витаминов - B1, В2 и В5, а использование дорогостоящего ион-парного реагента октилсульфоната натрия снижает ресурс колонки и не позволяет работать в градиентном режиме, кроме того, данный метод не применим к премиксам на минеральной основе.

Из описанных в литературе наиболее близким к изобретению является метод, предложенный Кожановой Л.А., Федоровой Г.А. и Барамом Г.И. «Определение водо- и жирорастворимых витаминов в поливитаминных препаратах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии» ЖАХ, 2002, том 57, №1, с.49-54, экстракцию проводят раствором перхлората лития в воде (0,4 моль/л, pH 2,4. Навеска 0,1-0,2 г + 20 мл смеси перхлората с 0,1% раствором бутилокситолуола (19:1 по объему), перемешивали в темноте в течение 10 минут при pH 5,5. Если значение pH не устанавливалось само, доводили раствором гидроксида лития, затем доводили pH до 2,4 и экстрагировали еще 10 минут. Добавленные объемы учитывали при расчете концентраций. Хроматографирование проводили в следующих условиях: элюент А - 0,4 М перхлората лития (LiClO₄ pH 2,4); элюент Б - ацетонитрил; градиент - 8 минут 2% Б, 17 минут линейный градиент от 5 до 18% Б; скорость потока - 0,1 мл/мин; температура 35°С; объем пробы 4-10 мкл. Регистрацию проводили на 6 длинах волн (210, 220, 250, 260, 280, 300 нм). Продолжительность разгонки 25 минут.

Однако предлагаемая методика длительна и сложна по технологии, не применима к премиксам на минеральной основе.

С развитием широкомасштабного производства и активного внедрения поливитаминных препаратов как в сельском хозяйстве, так и в медицине и пищевой промышленности ужесточается контроль их качества не только со стороны производителя, но и со стороны потребителя. Поэтому актуальным является анализ более широкого спектра витаминов.

Задачей изобретения является повышение эффективности и точности способа, определение более широкого спектра витаминов, независимо от основы премикса.

Задача решается следующим образом: навеску предварительно измельченного премикса заливают раствором 0,01 н. соляной кислоты, помещают в светонепроницаемый футляр, который устанавливают на ультразвуковую баню. Соотношение пробы и экстрагента подбирают с таким расчетом, чтобы концентрации витаминов попадали в диапазон линейности разработанной хроматографической методики. Экстракцию проводят 15-20 минут при температуре 38-42°С. Затем центрифугируют 10 минут при 8000 об/мин, доводят до метки в мерной колбе. Полученный раствор используют для хроматографического анализа. Хроматографическое разделение проводят на колонке 250×4 мм с сорбентом Purospher RP-18e (5 мкм). Условия хроматографирования: элюент А - 0,005 М раствор перхлората лития, pH 2,5; элюент Б - ацетонитрил; градиентный режим элюирования от 0 до 26% элюента Б за 14 минут. Инжектируемый объем 40 мкл. Длины волн детектирования: УФ-детектор от 0 до 8 минут 250 нм, от 8 до 10 минут 200 нм, от 10 до 12 минут 230 нм, от 12 до 18 минут 200 нм; флуоресцентный детектор при поглощении на 270 нм от 0 до 12 минут 400 нм (люминесценция), от 12 до 18 минут 495 нм (люминесценция).

Отличительными признаками предлагаемого способа являются: экстрагируют с помощью ультразвука в течение 15-20 минут при температуре 38-42°С, центрифугируют 10 минут при 8000 об/мин, в качестве элюента используют раствор перхлората лития с концентрацией 0,005 М, градиент элюирования от 0 до 26% ацетонитрила за 14 минут.

Экстрагирование с помощью ультразвука в течение 15-20 минут при температуре 38-42°С позволяет достичь заданной полноты извлечения витаминов из премиксов на любой основе.

Центрифугирование при 8000 об/мин 10 минут позволяет добиться более полного разделения фаз.

Предложенный вариант градиента позволяет снизить время разгонки с 25 до 18 минут, при этом не ухудшая качества разделения. Установлено, что перхлорат лития с концентрацией 0,005 М, применяемый только в качестве подвижной фазы, оказывает достаточное ион-парное действие на витамины (улучшая форму хроматографического пика), позволяет добиться заданной степени разделения (критерий разделения во всех случаях больше 1) и слабо загрязняет колонку.

Предлагаемый способ определения водорастворимых витаминов позволяет расширить арсенал до 9 витаминов независимо от основы премикса, является надежным и более простым по технологии.

ПРИМЕР.

Определение витаминов осуществляется следующим образом: навеску предварительно измельченного премикса заливают раствором 0,01 н. соляной кислоты (соотношение пробы и экстрагента подбирают с таким расчетом, чтобы концентрации витаминов попадали в диапазон линейности градуировочного графика), исследуемый материал помещают в светонепроницаемый футляр, который устанавливают на ультразвуковую баню. Экстракцию проводят 15-20 минут при температуре 38-42°С. Затем центрифугируют 10 минут при 8000 об/мин, доводят до метки в мерной колбе. Полученный раствор используют для хроматографического анализа. Хроматографическое разделение проводят на колонке 250×4 мм с сорбентом Purospher RP-18e (5 мкм). Условия хроматографирования: элюент А - 0,005 М раствор перхлората лития, pH 2,5; элюент Б - ацетонитрил; градиентный режим элюирования от 0 до 26% элюента Б за 14 минут. Инжектируемый объем 40 мкл. Длины волн детектирования: УФ-детектор от 0 до 8 минут 250 нм, от 8 до 10 минут 200 нм, от 10 до 12 минут 230 нм, от 12 до 18 минут 200 нм; флуоресцентный детектор при поглощении на 270 нм от 0 до 12 минут 400 нм (люминесценция), от 12 до 18 минут 495 нм (люминесценция).

Сравнивали влияние различных способов экстрагирования на степень извлечения витаминов (на примере витамина В2)

Таблица 1.
Способы определения водорастворимых витаминов	Время экстрагирования, мин	Способы экстрагирования	Выход витамина В2, %
ГОСТ	10	Магнитная мешалка	88,1
Способ по Кожановой и соавт.	20	Перемешивание в темноте	86,6
Предлагаемый способ	15-20	В темноте, ультразвук частотой 35 кГц	96,4

Из таблицы 1 видно, что наибольший выход витамина (96,4%) достигается при использовании ультразвука, в течение 15-20 минут, аналогичные результаты получены и по другим витаминам. Механическое перемешивание и применение магнитной мешалки не позволяют достигать заданной полноты извлечения.

Сравнивали влияние температурных режимов на степень извлечения витаминов (на примере витамина В2)

Таблица 2.
Способы определения водорастворимых витаминов	Температурный режим	Выход витамина В2, %
ГОСТ	подогрев	87,3
Способ по Кожановой и соавт.	комнатная	81,4
Предлагаемый способ	38-42°С	97,2

Из таблицы 2 видно, что при подъеме температуры до 40°С выход витамина увеличивается до 97,2%, а более низкие температуры не позволяют достичь заданной полноты извлечения, при температуре выше 42°С происходит разрушение нестойких витаминов (В1 и К3), аналогичные результаты были получены и по другим витаминам, поэтому температурный режим 38-42°С является оптимальным для сохранения и более полного извлечения витаминов из премиксов.

Разделение осадка и надосадочной жидкости проводят путем центрифугирования. Было установлено, что режим, предложенный в ГОСТе: 5000-6000 об/мин в течение 3 минут, не позволяет добиться полного разделения фаз, предлагаемый режим 8000 об/мин в течение 10 минут является оптимальным, так как достигается более полное разделение фаз.

На модельных растворах экспериментальным путем были подобраны условия хроматографического разделения витаминов концентрация перхлората лития (0,4, 0,1, 0,05, 0,005 М) и градиент элюирования таким образом, что за одну аналитическую процедуру в образце удается разделить следующие витамины: С, B1, В2, В3, В5, В6, Н, В12, К3 - критерии разделения двух рядом стоящих пиков во всех случаях больше 1. Некоторые характеристики хроматографического разделения витаминов приведены в таблице 3.

Таблица 3
Характеристики хроматографического разделения витаминов
Витамин	Время удерживания, мин (n=5, Р=0,95)	Длина волны детектирования, нм	Критерий разделения
С УФ-детектором
С	3,18±0,10
В5	4,35±0,09	250	4,8
В1	6,59±0,07	250	5,0
В3	8,56±0,06	200	6,3
К3	10,59±0,09	230	6,3
В12	11,74±0,14	230	2,0
Н	12,93±0,10	200	2,4
с флуоресцентным детектором, при поглощении на 270 нм
В6	7,42±0,06	400 (люминесценция)
В2	12,70±0,09	495 (люминесценция)	10,4

Из таблицы 3 и хроматограммы на фиг.1 видно, что концентрация перхлората лития 0,005 М и градиент от 0 до 26% ацетонитрила являются оптимальными для определения более широкого спектра витаминов (9).

В выбранных условиях установлен диапазон линейной зависимости аналитического сигнала - площади хроматографического пика - от концентрации витаминов в растворе. Для витамина В1 он составил 0,5-20 мкг/мл, для В5 - 0,5-100 мкг/мл, для остальных витаминов - 0,5-50 мкг/мл.

На модельных растворах оценена правильность и прецизионность определения витаминов в смеси по разработанной методике. Расчет концентраций вели по градуировочному графику. Соотношение концентраций витаминов в модельном растворе было близко их соотношению по рецептурам премиксов. Результаты представлены в таблице 4.

Таблица 4.
Витамин	Введено, мкг/мл	Найдено, мкг/мл	δотн, %	W, %
B1	3,00	2,98±0,29	-0,67	4,0
В2	10,00	10,38±0,36	3,80	1,4
В3	20,00	20,14±0,60	0,70	1,2
В5	60,00	59,91±0,56	-0,15	0,6
В6	5,00	4,98±0,34	-0,40	2,7
К3	20,00	19,59±0,48	-2,05	0,9
Н	10,00	10,27±0,92	2,70	3,9

Из таблицы 4 видно, что предлагаемая методика повышает эффективность и точность определения витаминов, так как относительная погрешность количественного определения (δ) не более 5% (по модулю), коэффициент вариации - не более 4%. Разработанная методика применена к анализу премиксов. Хроматограмма 1% премикса на основе цеолита приведена на фиг.2.

Таблица 5.
Результаты анализа премикса на минеральной основе (n=3, Р=0,95)
Витамин	Задано по рецептуре, мкг/г	Найдено, мкг/г	W, %	Δ, %*
В1	500	462±25	2,17	-7,60
В2	2000	1892±43	0,98	-5,45
В3	4350	4356±103	0,96	0,14
В5	15000	15394±615	1,61	2,63
В6	1500	1629±58	1,34	8,57
К3	1500	1602±96	2,32	6,73
* - расхождение между паспортными данными и полученными результатами.

Из фиг.2 и таблицы 5 видно, что предлагаемый способ определения водорастворимых витаминов позволяет расширить спектр определяемых витаминов из премиксов на любой основе, при этом коэффициент вариации менее 3%, расхождение между паспортными данными и полученными результатами не более 9% (допустимое расхождение 15% по ГОСТ Р 50929-96 «Премиксы. Методы определения витаминов группы В»).

Таким образом, предлагаемый способ определения водорастворимых витаминов в премиксах повышает точность и позволяет расширить спектр определяемых витаминов до девяти.

Способ определения водорастворимых витаминов в премиксах, включающий измельчение, взятие навески, экстрагирование соляной кислотой, центрифугирование, помещение полученного раствора в мерную колбу, хроматографирование в обращенно-фазовом варианте с использованием градиентного режима элюирования, в качестве элюентов используют раствор перхлората лития и ацетонитрила, отличающийся тем, что экстрагирование проводят с помощью ультразвука в течение 15-20 мин при температуре 38-42°С, центрифугируют 10 мин при 8000 об/мин, раствор перхлората лития используют в концентрации 0,005 М, градиент элюирования от 0 до 26% ацетонитрила за 14 мин.