Способ выделения чистой культуры стафилококков
Владельцы патента RU 2458990:
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Курская государственная сельскохозяйственная академия имени профессора И.И. Иванова Министерства сельского хозяйства Российской Федерации (RU)
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам выделения чистой культуры микроорганизмов из патологического биоматериала, и может быть использовано в ветеринарной медицине и животноводстве. Способ предусматривает измельчение патологического биоматериала с последующей его гомогенизацией и приготовлением из него суспензии. В полученную суспензию вносят 3-5% лимонной кислоты из расчета ее содержания в суспензии. Выдерживают в течение 20-30 минут при 10-20°C, добавляют 3-4% янтарной кислоты и выдерживают в течение 20-30 минут при 10-20°C с последующей нейтрализацией суспензии 5-10% раствором аммиака и доведением pH до 7,5-7,6. Нейтрализованную суспензию отстаивают в течение 20-30 минут, декантируют надосадочную жидкость и содержимое осадка высевают на питательную среду, содержащую в 1 л дистиллированной воды 8,0 г лимонной кислоты, 2,0 г цитрата аммония, 3,0 г янтарной кислоты, 2,0 г аспарагина или глицина, 5,0 г фосфорнокислого калия двухзамещенного, 0,5 г сернокислого магния, 0,3 г сернокислого цинка, 3,0 г фосфорнокислого натрия двухзамещенного, 5,0-6,0 г хлористого натрия, 0,1 г сернокислого железа и 40-50 мл глицерина при pH 7,5-7,6. Для получения плотной агаровой питательной среды в жидкую среду, разведенную дистиллированной водой 1:1, добавляют 2,5 г агара на 100 мл жидкой среды и доводят содержание хлористого натрия до 5-6%. Изобретение позволяет сократить сроки выделения стафилококков. 1 табл., 1 пр.
Изобретение относится к микробиологии, в частности к способам выделения чистой культуры микроорганизмов из патологического материала.
Известен способ выделения чистой культуры стафилококков путем высева содержимого патологического биоматериала (гной, кровь и т.п.) на чашку Петри с мясопептонным молочно-солевым агаром с 7,5% раствором поваренной соли и 10% молочной сыворотки (Матвеев К.И. Руководство по микробиологической диагностике инфекционных болезней. М.: Медицина, 1973. - С.354-355.).
В упомянутом способе отсутствует предварительная обработка патологического материала для уничтожения посторонней микрофлоры (протея, синегнойной и кишечной палочек, стрептококков и т.п.), которая в определенных условиях может подавлять рост и развитие стафилококков и загрязнять культуру.
Известен способ выделения чистой культуры стафилококков на скошенный в пробирках или в чашках Петри мясопептонный или молочно-солевой агар с добавлением 5% кроличьей крови, обеспечивающий прорастание стафилококков на поверхности агара (Коротяев А.И., Бабичев С.И. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. Учебник для вузов. - СПб, 1998. - с.334-335).
Недостатком способа является отсутствие средств подавления посторонней микрофлоры, необходимость трудоемкого и затратного приготовления и использования мясопептонного или молочно-солевого агара с добавлением 5% кроличьей крови, неравномерный и слабый рост стафилококков и прорастание на поверхности агара посторонней микрофлоры.
Целью предлагаемого изобретения является ускоренное выделение чистой культуры стафилококков.
Предлагается способ выделения чистой культуры стафилококков путем обработки суспензии патологического биоматериала, обсемененного стафилококками и другими микроорганизмами, сначала 3-5%-ной лимонной кислотой в течение 20-30 минут при 10-20°C, затем 3%-ной янтарной кислотой для подавления посторонней микрофлоры в течение 20-30 минут при 10-20°C с последующей нейтрализацией суспензии 5-10%-ным раствором аммиака до pH 7,5-7,6, отстаиванием в течение 20-30 минут, декантацией надосадочной жидкости и высевом содержимого осадка в жидкую питательную среду или на агаровую среду с pH 7,5-7,6.
Технический результат способа - обильный рост чистой культуры стафилококков через 24-36 часов в жидкой питательной среде или на всей поверхности агаровой среды и отсутствие роста посторонней микрофлоры.
Пример осуществления способа
Суспензию из гомогенизированного патологического биоматериала (измельченных кусочков пораженных органов, гноя, крови), полученного от больных животных, инфицированных стафилококками, в объеме 100 мл помещают в стеклянную емкость, вносят лимонную кислоту из расчета 3-5% ее содержания в суспензии, выдерживают в течение 20-30 минут при 10-20°C, затем добавляют 3-4% янтарной кислоты и выдерживают в течение 20-30 минут при температуре 10-20°C. После обработки суспензии кислотами ее нейтрализуют 5-10%-ным раствором аммиака, доводят pH до 7,5-7,6, отстаивают суспензию в течение 20-30 минут, декантируют надосадочную жидкость. Содержимое осадка высевают в жидкую питательную среду, содержащую в 1 л дистиллированной воды 8,0 г лимонной кислоты, 2,0 г цитрата аммония, 3,0 г янтарной кислоты, 2,0 г аспарагина или глицина, 5,0 г фосфорнокислого калия двухзамещенного, 0,5 г сернокислого магния, 0,3 г сернокислого цинка, 3,0 г фосфорнокислого натрия двухзамещенного, 5,0-6,0 г хлористого натрия, 0,1 г сернокислого железа и 40-50 мл глицерина. Реакция среды доводится 5-10%-ным раствором аммиака до pH 7,5-7,6. Питательная среда после приготовления подвергается автоклавированию. Содержимое осадка также можно высевать на поверхность агаровой питательной среды, приготовленной на основе приведенного состава жидкой среды. В жидкую питательную среду упомянутого состава, разведенную в соотношении 1:1 дистиллированной водой, добавляют 2,5 г агара на 100 мл жидкой питательной среды и доводят содержание хлористого натрия до 5-6%. Перед высевом питательную среду подвергают автоклавированию. Присутствие в питательной среде наряду с янтарной кислотой хлористого натрия создает условия, благоприятные для культуры стафилококков, и подавляет рост посторонней микрофлоры. Обильный рост стафилококков проявляется через 24-36 часов в толще жидкой питательной среды и на всей поверхности агаровой среды.
В научно-технической и патентной литературе не обнаружено технических решений, аналогичных заявляемому способу, поэтому способ удовлетворяет условию патентоспособности «новизна».
Технический результат получен благодаря разработанному режиму предварительной обработки патологического биоматериала, а также составу питательной среды для высева стафилококков, полученной как в жидком виде, так и с добавлением агара, сочетание заявляемых признаков удовлетворяет условию патентоспособности «изобретательский уровень».
Предлагаемый способ выделения чистой культуры стафилококков может применяться в ветеринарной медицине и животноводстве в целях диагностики инфекционных болезней животных, вызываемых стафилококками, а также для получения вакцин для профилактики и лечения этих болезней, то есть способ удовлетворяет условию патентоспособности «промышленная применимость».
| Таблица | ||||
| Результаты исследования способа выделения чистой культуры стафилококков | ||||
| № п/п | Способ и средства подавления посторонней микрофлоры в суспензии патологического материала | Рост микроорганизмов при высеве на агаровую питательную среду с глицерином и 5-6% хлористого натрия | ||
| Сальмонеллы, 100 тыс. в 1 мл суспензии | Кишечная палочка, 100 тыс. в 1 мл суспензии | Стафилококки, 100 тыс. в 1 мл суспензии | ||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 1. | 3%-ная лимонная кислота в течение 20-30 минут, а затем 3%-ная янтарная кислота 20-30 минут | Рост отсутствует | Рост отсутствует | Обильный рост на поверхности агара через 24-36 часов |
| 2. | 5%-ная лимонная кислота в течение 20-30 минут, а затем 4%-ная янтарная кислота | Рост отсутствует | Рост отсутствует | Обильный рост на поверхности агара через 24-36 часов |
Способ выделения чистой культуры стафилококков, включающий посев суспензии гомогенизированного патологического биоматериала, обсемененного стафилококками и другими микроорганизмами на питательную среду, отличающийся тем, что перед посевом проводят обработку суспензии вначале 3-5%-ной лимонной кислотой в течение 20-30 мин при температуре 10-20°C, затем 3-4%-ной янтарной кислотой в течение 20-30 мин при температуре 10-20°C, нейтрализуют суспензию 5-10%-ным раствором аммиака до pH 7,5-7,6, после отстаивания в течение 20-30 мин проводят декантацию надосадочной жидкости, а содержимое осадка высевают в жидкую питательную среду, содержащую в 1 л дистиллированной воды 8,0 г лимонной кислоты, 2,0 г цитрата аммония, 3,0 г янтарной кислоты, 2,0 г аспарагина или глицина, 5,0 г фосфорнокислого калия двухзамещенного 0,5 г сернокислого магния, 0,3 г сернокислого цинка, 3,0 г фосфорнокислого натрия двухзамещенного, 5,0-6,0 г хлористого натрия, 0,1 г сернокислого железа и 40-50 мл глицерина при pH 7,5-7,6, или на поверхность агаровой питательной среды, полученной добавлением 2,5% агара в жидкую среду, разведенную дистиллированной водой 1:1, и доведением содержания хлористого натрия до 5-6%.
