Способ получения стигмаст-4-ен-3-она из бета-ситостерола



Способ получения стигмаст-4-ен-3-она из бета-ситостерола
Способ получения стигмаст-4-ен-3-она из бета-ситостерола

 


Владельцы патента RU 2472857:

Учреждение Российской академии наук Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН (RU)

Изобретение относится к биотехнологии. Способ предусматривает биотрансформацию растительного β-ситостерола с использованием бактериальной культуры Rhodococcus erythropolis ВКПМ AC-1901 при добавлении в среду ферментации н-гексадекана и пальмитиновой кислоты в заданном соотношении. Затем в среду ферментации добавляют β-ситостерол в виде смеси с β-циклодекстрином в соотношении 1:1 в растворе Твина-80 с последующим удалением растворителя и ацилированием с получением готового продукта. Изобретение позволяет повысить степень образования стигмаст-4-ен-3-она. 2 ил., 3 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при получении лекарственного препарата на основе стигмаст-4-ен-3-она-продукта биотрансформации β-ситостерола.

Уровень техники

Известно, что продукты микробиологической трансформации стеролов растительного и животного происхождения: андрост-4-ен-3,17-дион, андроста-1,4-диен-3,17-дион - ключевые интермедиаты синтеза лекарственных стероидных препаратов (эстрогенов и анаболических стероидов, в частности). Разработаны эффективные биотехнологические способы получения данных соединений на основе стеролов при использовании высоких концентраций исходных субстратов (см. Патент РФ №2039824, 1995). В качестве продуктов биоконверсии стеролов получены также 9α-гидрокси-производные (см. US Patent 5.298.398, 1994), сложные эфиры стеролов (см. US Patent 7078544, 2006), прегнановые производные (см. US Patent 4.212.940, 1980), тестостерон и продукты его окисления (см. CN Patent 1670185, 2005). При исследовании биологической активности среди оксигенированных метаболитов стеролов выявлены вещества с противовирусным, гипохолестеринемическим и спазмолитическим действием.

Как правило, в качестве катализаторов процесса биотрансформации стеролов используют представителей рода Mycobacterium. Исследована также способность к биотрансформации стеролов бактерий родов Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Micrococcus, Nocardia, Pseudomonas, Rhodococcus. Наиболее близкими к настоящему изобретению являются работы в области исследований, касающихся сравнительной оценки продукции и особенностей каталитической активности микробной холестеролоксидазы родококков (см. Kreit J., Lefebvre G., Germain P. Extracelullar cholesterol oxidase from Rhodococcus sp. cells // J. Biotechnol. - 1992. - V.24. - P.177-188; см. Kreit J. Lefebvre G., Germain P. Membrane-bound cholesterol oxidase from Rhodococcus sp. cells II J. Biotechnol. - 1994. - V.33. - P.271-282). При этом поиск оптимальных условий направленной конверсии образования β-ситостерола в стигмаст-4-ен-3-он - продукт холестеролоксидазной реакции не описан. Вместе с тем, стигмаст-4-ен-3-он используется в качестве лекарственного средства при лечении андроген зависимых заболеваний (см. US Patent 5264428, 1993), а также проявляет гипогликемическое действие (см. Alexander-Lindol R.L., Morrison E.Y.S.A., Muraleedharan G.N. Hypoglycaemic effect of stigmast-4-еn-3-оnе and its corresponding alcohol from the bark of Anacardium occidentale (Cashew) // Phytother. Res. 2004. V.18. P.403-407).

Известен способ получения стигмаст-4-ен-3-она в качестве продукта биотрансформации 5 г/л β-ситостерола (60% чистоты), при этом его выход не превышает 40% (см. Kreit J. Lefebvre G., Germain P. Membrane-bound cholesterol oxidase from Rhodococcus erythropolis // J. Biotechnol. - 1994. - V.33. - P.271-282).

Относительно невысокий выход стигмаст-4-ен-3-она из β-ситостерола обусловлен снижением уровня каталитической активности холестеролоксидазы в отношении β-ситостерола по сравнению с холестеролом, а также низкой растворимостью β-ситостерола в водной среде.

Раскрытие изобретения

Задача, на решение которой направлено изобретение, заключается в разработке эффективного биотехнологического способа получения стигмаст-4-ен-3-она из β-ситостерола.

Технический результат, который может быть получен при осуществлении изобретения, заключается в проведении селективной конверсии β-ситостерола в стигмаст-4-ен-3-он; увеличении степени образования стигмаст-4-ен-3-она при использовании высоких концентраций β-ситостерола; возможности масштабирования процесса.

Для достижения технического результата предлагается заявляемый способ получения стигмаст-4-ен-3-она, предусматривающий биотрансформацию β-ситостерола с помощью штамма Rhodococcus erythropolis ВКПМ AC-1901 в среде ферментации, содержащей н-гексадекан и пальмитиновую кислоту, при этом β-ситостерол вносят в среду ферментации в виде смеси с β-циклодекстрином 1:1 в растворе Твина-80. Штамм хранится в Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов ИЭГМ УрО РАН (акроним ИЭГМ, номер во Всемирной федерации коллекций культур 768, www.iegm.ru/iegmcol). В результате осуществления заявляемого способа достигается максимальная степень образования стигмаст-4-ен-3-она. Общий выход целевого продукта после выделения составляет 89,2% от теоретического. Такие показатели возможны в связи с тем, что технология способа допускает использование высоких концентраций β-ситостерола, а также в связи с тем, что субстрат находится в среде в виде смеси с β-циклодекстрином в растворе Твина.

Осуществление изобретения

Предлагаемый способ получения стигмаст-4-ен-3-она заключается в следующем: β-ситостерол трансформируют при участии штамма R. erythropolis ВКПМ АС-1901 в условиях добавления 0,15 г/л пальмитиновой кислоты и 2,5 г/л н-гексадекана. При этом β-ситостерол добавляют в среду ферментации в виде смеси с β-циклодекстрином и Твином-80. Разработанный способ позволяет существенно повысить уровень конверсии β-ситостерола в стигмаст-4-ен-3-он (свыше 90%) и концентрацию трансформируемого стерола.

Продукты биотрансформации β-ситостерола экстрагируют 3-х-кратным объемом этилацетата, объединенные этилацетатные вытяжки выдерживают над обезвоженным Na2SO4. Образование стигмаст-4-ен-3-она регистрируют методом тонкослойной хроматографии (ТСХ). При анализе методом ТСХ аликвоты экстракта (5-20 мкл) наносят на ТСХ-пластины с флуоресцентной добавкой "Merck" (Германия) 4×8 см на расстоянии 10 мм от края. После нанесения пластины помещают в хроматографическую камеру, содержащую смесь петролейный эфир (60-80°C): этилацетат (объемное соотношение 7:3). После прохождения фронта растворителя пластину вынимают, подсушивают на воздухе. Присутствие продуктов биотрансформации оценивают путем сравнения хроматографической подвижности (Rf) с образцами стандартов, при этом образование стигмаст-4-ен-3-она определяют с помощью УФ облучателя LG/58 (Россия), остаточный β-ситостерол регистрируют после опрыскивания 5% H2SO4 и последующего прогревания пластины при 95-100°C в течение 2-3 мин. Качественное и количественное содержание продуктов реакции определяют с помощью метода хромато-масс-спектрометрии (ХМС) на газовом хроматографе Agilent 6890N фирмы "Agilent technology" (США) и кварцевой капиллярной колонки RTX-5MS "United Instruments" (Австралия) с внутренним диаметром 0,25 мм и длиной 30 м с предколонкой 5 м (неподвижная фаза - 5% фенилполисилфениленсилоксан; газ-носитель - гелий), при этом в качестве детектора используют квадрупольный масс-спектрометр Agilent MSD 5973N производства фирмы "Agilent technology" (США). ХМС анализ 1 мкл 0,1% раствора смеси продуктов биотрансформации в этилацетате проводят при температуре испарителя и интерфейса 280°C; начальной температуре термостата 50°С, с выдержкой в изотермическом режиме 5 мин, с последующим нагреванием до 280°C со скоростью 15 град/мин и выдержкой в изотермическом режиме в течение 25 мин; объемная скорость газа-носителя - 1,0 мл/мин. Содержание стигмаст-4-ен-3-она в г/л определяют с помощью калибровочной кривой, для получения которой используют растворы в этилацетате 0,25; 0,5; 1,0; 1,25; 1,5; 2,0 мг/мл стигмаст-4-ен-3-она. В связи с тем, что молекулярная масса исходного субстрата и продукта отличаются незначительно (412,7 и 414,7 соответственно), уровень биоконверсии β-ситостерола в стигмаст-4-ен-3-он в экспериментах по подбору оптимальных условий образования 4-ен-3-онового соединения выражают в процентах от суммарного веса продуктов биотрансформации стерола. В экспериментах по выделению стигмаст-4-ен-3-она выход целевого продукта рассчитывают в процентах, исходя из молярного соотношения β-ситостерола и стигмаст-4-ен-3-она в сумме продуктов реакции, при этом учитывают 85,7%-ную чистоту исходного β-ситостерола.

Способ иллюстрируют 3 примера.

Пример 1.

Процесс биоконверсии β-ситостерола в стигмаст-4-ен-3-он проводят с использованием культуры R. erythropolis ВКПМ АС-1901 в течение 5 сут. в среде следующего состава: (г/л): KNO3 - 1,0; KH2PO4 - 1,0; K2HPO4 - 1,0; NaCl - 1,0; MgSO4 - 0,2; CaCl2 - 0,02 в колбах Эрленмейера объемом 250 мл, содержащих 100 мл среды, на качалке (150 об/мин) при 28°C в течение 5 сут. В ростовую среду дополнительно вносят 0,15 г/л пальмитиновой кислоты и 2,5 г/л н-гексадекана. β-Ситостерол (0,5; 1,0; 1,5 или 2,0 г/л) добавляют в виде растворов в 5, 10, 15, или 20 мл изопропанола или Твина-80, соответственно. Максимальная (47-49,5%) степень образования стигмаст-4-ен-3-она достигается в присутствии Твина-80 в условиях добавления 1,5-2,0 г/л β-ситостерола.

Пример 2.

Способ осуществляют по примеру 1. β-Ситостерол вносят в концентрациях от 4,0 до 10 г/л в виде смеси с β-циклодекстрином (1:1) в 80-200 мл 1,2% водного раствора Твина-80. При добавлении в ростовую среду 6,0 г/л β-ситостерола достигается максимальный уровень конверсии стерола, при этом содержание стигмаст-4-ен-3-она в смеси продуктов реакции составляет 89,5-93,4%.

Пример 3.

Способ осуществляют по примеру 2. β-Ситостерол вносят в концентрации 6,0 г/л. После удаления растворителя из этилацетатного экстракта, сумму продуктов биотрансформации β-ситостерола ацилируют. Для этого 6 г смеси продуктов биотрансформации растворяют в 10,0 мл пиридина и 2,5 мл уксусного ангидрида и выдерживают в течение 20 ч при комнатной температуре. Далее реакционную смесь растворяют в 350 мл этилацетата, переносят в делительную воронку и последовательно обрабатывают: 600 мл воды, 300 мл 10% раствором HCl, 300 мл насыщенными растворами NaHCO3 и NaCl. Полученный этилацетатный экстракт сушат над Na2SO4 (безвод.). Колоночную хроматографию под давлением проводят с использованием круглодонной колбы с отводом (250 мл) и воронки Шотта ВФ - 2-40 пор. 100 19/26 ТС (Россия) высотой 4,7 см, диаметром 4,6 см, диаметром фильтра 3,4 см со 100 г силикагеля "Merck" (Германия) диаметром частиц 0,06-0,2 мМ. На слой силикагеля наносят ацилированную смесь продуктов реакции в виде сухого порошка, который получают добавлением к этилацетатному раствору ацилированной смеси продуктов биотрансформации 3,0 г силикагеля, с последующим удалением растворителя. Далее силикагель промывают 300 мл петролейного эфира (60-80°C), порционно 200 мл 2%-го раствора этилацетата в петролейном эфире и 300 мл этилацетата. Полученные порции анализируют методом ТСХ. После удаления растворителя фракций получают 4,8 г технического продукта, содержащего 92% чистого стигмаст-4-ен-3-она. Выход стигмаст-4-ен-3-она после выделения составляет 89,2%.

Описание чертежей

Сущность изобретения поясняется чертежами, на которых изображено:

На Фиг.1. Степень образования стигмаст-4-ен-3-она из β-ситостерола под действием R. erythropolis ВКПМ АС-1901 в присутствии н-гексадекана (2,5 г/л), пальмитиновой кислоты (0,15 г/л), в условиях добавления 0,5-2,0 г/л β-ситостерола в виде раствора в изопропаноле (черные столбцы) или Твина-80 (заштрихованные столбцы).

На Фиг.2. Степень образования стигмаст-4-ен-3-она из β-ситостерола под действием R. erythropolis ВКПМ АС-1901 в присутствии н-гексадекана (2,5 г/л) и пальмитиновой кислоты (0,15 г/л) в условиях добавления смеси 4-10 г/л β-ситостерола в виде смеси с β-циклодекстрином (1:1) в 80-200 мл 1,2% водного раствора Твина-80.

Способ получения стигмаст-4-ен-3-она, предусматривающий биотрансформацию β-ситостерола с помощью штамма Rhodococcus erythropolis ВКПМ AC-1901 в среде ферментации, содержащей н-гексадекан и пальмитиновую кислоту, при этом β-ситостерол вносят в среду ферментации в виде смеси с β-циклодекстрином 1:1 в растворе Твина-80.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к биотехнологии. .
Изобретение относится к биотехнологии и медицине (а именно, к онкологии) и может быть использовано для создания современной технологии получения противоопухолевого средства и для химиотерапии злокачественных новообразований.
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению водных растворов акриламида. .
Изобретение относится к биотехнологии. .

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения метанола. .

Изобретение относится к области биотехнологии и касается нового соединения мумбайстатина, его фармацевтически приемлемых солей или сложных и простых эфиров. .

Изобретение относится к тонкому органическому синтезу, в частности к расщеплению рацемического (1SR, 2RS, 5SR, 6RS)-6H4rooio(3.3.0)oKTaH диола ф-лы I НО гас-1 с получением (IS, 2R, 5S, 6R)-2,6-flH- ацетокси-бицикло(3.3.0)октана ф-лы II н3с-(о)с-о н II н о-с(о)-сн3 и (1R, 2S, 5R, 63)-дицикло(3.3.0)-октан-2-диола ф-лы III, нон III н он которые могут быть использованы для синтеза оптически активных простагландинов и их производных.
Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к производству антибиотиков. .
Изобретение относится к биотехнологии

Изобретение относится к области биохимии. Предложен способ ферментации газообразного субстрата. Способ включает подачу газообразного субстрата, содержащего монооксид углерода и водород, в водной среде в биореактор. Водная среда включает анаэробные ацетогенные микроорганизмы. Осуществляют перемешивание водной среды, измерение конверсии СО, измерение конверсии Н2, увеличение потока газообразного субстрата. При этом после увеличения потока конверсия СО превышает первую конверсию СО на величину в интервале от 25% до 95%, конверсия Н2 превышает первую конверсию Н2 на величину в интервале от 25% до 95%, а разность между конверсией СО и конверсией Н2 находится в интервале от 0 до 25%. Изобретение обеспечивает повышение плотности клеток при микробиологической ферментации газообразного субстрата. 2 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл., 4 пр.
Наверх