Штамм бактерии lactobacillus reuteri okt, используемый для производства пробиотических препаратов для сельскохозяйственной птицы



Авторы патента:

Филипенко Максим Леонидович (RU)
Дударева Екатерина Викторовна (RU)
Маслов Олег Георгиевич (RU)
Храпов Евгений Александрович (RU)
Афонюшкин Василий Николаевич (RU)
Троменшлегер Ирина Николаевна (RU)


Штамм бактерии lactobacillus reuteri okt, используемый для производства пробиотических препаратов для сельскохозяйственной птицы (RU 2468079):


Вледельцы патента:

Общество с ограниченной ответственностью "БиоСинТек" (ООО "БиоСинТек") (RU)


Похожие патенты:
Изобретение относится к области биотехнологии

Способ количественного определения антиоксидантной активности микроорганизмов

Изобретение относится к микробиологии и клинической лабораторной диагностике

Способ очистки рекомбинантных аденовирусов млекопитающих и человека

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу очистки рекомбинантных аденовирусов млекопитающих и человека

Композиция штаммов рода lactobacillus для производства лекарственного средства

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при производстве препарата для эффективного восстановления биологического равновесия вагинальной микрофлоры
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для сокращения сроков постановки диагноза

Способ биологического производства н-бутанола

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа биологического получения н-бутанола и микроорганизма Clostridia acetobutylicum, используемого в таком способе
Изобретение относится к биотехнологии и молочной промышленности и предназначено для производства кисломолочных продуктов и бактериальных препаратов
Изобретение относится к биотехнологии и молочной промышленности
Изобретение относится к получению и применению стафилококковой анатоксин-вакцины для профилактики и лечения болезней животных стафилококковой этиологии
Изобретение относится к пищевой, биотехнологической и медицинской, косметической промышленности, в частности используется для приготовления кисломолочных, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, заквасок, гигиенических и косметических средств, биологически активных добавок и бактерийных препаратов

Бактерия escherichia coli - продуцент янтарной кислоты и способ получения янтарной кислоты

Изобретение относится к области микробиологической промышленности и касается бактерии Escherichia coli - продуцента янтарной кислоты и способа получения янтарной кислоты с использованием такой бактерии
Изобретение относится к области ветеринарии и биотехнологии и касается штамма Lactobacillus casei/paracasei, депонированного в ВГНКИ под номером 10.02.62 ДЕП

Тест-штамм yersinia pseudotuberculosis для дифференциации бактерий yersinia pseudotuberculosis генетической группы ia

Изобретение относится к медицинской микробиологии и представляет собой оригинальный штамм возбудителя псевдотуберкулеза, содержащий хромосомный ген суперантигена Y.pseudotuberculosis YPMa/YPMc (ypmA/C), ген адгезивного «острова» патогенности иерсиний YAPI (pilPQ) и используемый как тест-штамм для дифференциации бактерий Y.pseudotuberculosis генетической группы Ia

Композиция штаммов рода lactobacillus для производства лекарственного средства

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при производстве препарата для эффективного восстановления биологического равновесия вагинальной микрофлоры

Тест-штамм yersinia pseudotuberculosis для дифференциации бактерий yersinia pseudotuberculosis генетической группы i

Изобретение относится к медицинской микробиологии и представляет собой оригинальный штамм возбудителя псевдотуберкулеза, содержащий хромосомный ген суперантигена Y.pseudotuberculosis YPMa/YPMc (ypmA/C), ген адгезивного «острова» патогенности иерсиний YAPI (pilPQ), плазмиды с мол

Тест-штамм yersinia pseudotuberculosis для дифференциации бактерий yersinia pseudotuberculosis генетической группы iia

Изобретение относится к медицинской микробиологии и представляет собой оригинальный штамм возбудителя псевдотуберкулеза, содержащий хромосомный ген суперантигена Y.pseudotuberculosis YPMa/YPMc (ypmA/C) и используемый как тест-штамм для дифференциации бактерий Y.pseudotuberculosis генетической группы IIa

Тест-штамм yersinia pseudotuberculosis для дифференциации бактерий yersinia pseudotuberculosis генетической группы ii

Изобретение относится к медицинской микробиологии и представляет собой оригинальный штамм возбудителя псевдотуберкулеза, содержащий хромосомный ген суперантигена Y.pseudotuberculosis YPMa/YPMc (ypmA/C), плазмиды с мол
Изобретение относится к области медицины, в частности к педиатрии и эндокринологии, и касается лечения сахарного диабета у детей в стадии декомпенсации

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм бактерий Lactobacillus reuteri okt выделен из природного материала желудочно-кишечного тракта курицы в результате целенаправленного систематического поиска, депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) под регистрационным номером ВКПМ В-10609 и может быть использован для выращивания сельскохозяйственной птицы, а также для профилактики и лечения заболеваний птицы, причем одновременно с проведением курсов антибиотикотерапии. Изобретение позволяет повысить эффективность выращивания сельскохозяйственной птицы. 1 табл., 4 пр.


 

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и может быть использовано в микробиологической промышленности при производстве пробиотических препаратов, используемых в птицеводстве для лечения и профилактики болезней сельскохозяйственной птицы.

В последние годы все большее применение в птицеводстве находят пробиотики - кормовые добавки на основе штаммов живых микроорганизмов, оказывающие при естественном способе введения позитивное воздействие на физиологические, биохимические и иммунные реакции хозяина через стабилизацию и оптимизацию функции его нормальной микрофлоры. Они применяются при дисбактериозах, для регулирования микробиологических процессов в пищеварительном тракте, профилактики и лечения некоторых расстройств пищеварения инфекционной и алиментарной этиологии, как заменители антибиотиков и т.д. По эффективности действия пробиотики не уступают некоторым антибиотикам и химиотерапевтическим средствам, но они не оказывают губительного действия на микрофлору пищеварительного тракта, не загрязняют продукты животноводства и окружающую среду, то есть являются экологически чистыми.

К настоящему времени известны различные штаммы лактобактерий, входящие в состав пробиотических препаратов, используемые для лечения и профилактики болезней сельскохозяйственной птицы.

Известен рекомбинантный штамм Lactobacillus species 8 РАЗ (pLF-SL2), экспрессирующий соматолиберин в пищеварительном тракте (заявка RU 2002111437/13, опубл. 20.06.2004). Штамм используют в составе пробиотического препарата для повышения продуктивности сельскохозяйственных животных и улучшения качества продукции. Однако достижение результата использование штамма - повышение продуктивности, достигается благодаря генной модификации штамма, обеспечивающей способность экспресировать соматолиберин в пищеварительном тракте.

Известно средство для лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта цыплят, содержащее симбиотическую систему штаммов молочнокислых бактерий Lactobacillus acidophilus Д-75 и Д-76 препарата «Витафлор», энрофлоксацин и твин-80 при следующем соотношении ингредиентов (мас. %): симбиотические микроорганизмы препарата «Витафлор» - 10-20; энрофлоксацин - 75-85; твин-80 - 1-2 (патент RU 2371190, опубл. 27.10.2009). Средство снижает падеж молодняка птиц и способствует повышению среднесуточного привеса цыплят на 10-15%.

Недостатком известного средства является риск развития антибиотикорезистентности к энрофлоксацину, так как использование этого препарата сопровождается обязательным вводом антибиотика -энрофлоксацина, при этом использование симбиотических микроорганизмов препарата «Витафлор» сопровождается одновременным применением только одного антибиотика, что сужает круг инфекционных агентов до тех, которые чувствительны только к энрофлоксацину.

Известно пробиотическое средство для сельскохозяйственных животных и птицы, содержащее смесь суспензий штаммов бактерий и защитную среду при следующем соотношении компонентов, мас.%: сахароза 15, желатин 5,9% раствор хлорида натрия 80. В качестве смеси суспензий штаммов средство содержит суспензии следующих штаммов, мас.%: Azomonas agilisc B-2586 - 8, Azotobacter chroococcum B-3162 - 7, Azotobacter vinelandii B-2587 - 7, Bacillus subtilis B-5225 - 7, Bacillus subtilis B-4828 - 9, Bifidum bacterium globosum B-2584 - 10, Escherichia coli B-4412 - 8, Enterococcus faecium B-2898 - 7, Lactobacillus acidophilus B-3488 - 7, Lactobacillus acidophilus B-2585 - 7, Propionibacterium freudenreichii B-6561 - 7, Pseudomonas sp.B-3908 - 7, Pseudomonas sp.B-2589 - 7, Saccharomyces cerevisiae Y-365 - 2 (патент RU 2326692, опубл. 20.06.2008). Средство позволяет нормализовать микробиоценоз кишечника здоровых животных и птицы, сократить заболеваемость гнойно-воспалительного и диспепсийного характера, снизить падеж и повысить прирост массы тела у молодняка.

Недостатком известного средства является применение в составе препарата микроорганизмов, обладающих антагонистиченской в отношении друг друга активностью (например E.coli и Lactobacillus acidophilus), а также оказывающих взаимно-противоположный биологический эффект на организм, например, лактобактерии и пропионовокислые бактерии чаще подавляют воспалительные процессы, в то время как Bacillus subtilis, Escherichia coli, как правило, обладают противовоспалительной активностью и повышают реактивность иммунной системы.

Известен пробиотик лактомикроцикол для выращивания и откорма цыплят-бройлеров, содержащий микробную биомассу штаммов бактерий Lactobacillus amylovorus БТ-24/88 (ВКПМ, В-6253) и Escherichia coli S 5/98 (ВКПМ, В-8564), взятых в соотношении 1:1 при концентрации колонии образующих единиц (к.о.е.) каждого штамма в пределах 5×108-5×109 в 1 мл жидкого или 1 г сухого препарата. Лактобацилярный штамм обладает широким спектром антагонистической активности и множественной антибиотикорезистентностью, а кишечная палочка продуцирует микроцин В 5/98, подавляющий условно-патогенные и патогенные бактерии родов Escherichia и Salmonella.

Недостатком известного средства является то, что оба штамма не являются представителями нормальной микрофлоры кишечника птицы и, соответственно, не способны размножаться и накапливаться в кишечнике в течение длительного времени.

Актуальной задачей на сегодняшний день является поиск новых штаммов молочнокислых бактерий, являющихся представителями нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта птицы, обладающих устойчивостью к антибиотикам и способных сократить заболеваемость сельскохозяйственной птицы.

Наиболее перспективными для использования являются штаммы бактерий Lactobacillus reuteri, являющиеся природными обитателями желудочно-кишечного тракта животных и птиц и обладающие антибактериальной и противовоспалительной активностями. При выращивании клеток L. reuteri в анаэробных условиях в присутствии глицерина они продуцируют противомикробное вещество, известное как рейтерин (бетта-гидроксипропиональдегид). Так как у разных видов животных штаммы Lactobacillus reuteri различаются, то для лечения сельскохозяйственной птицы следует использовать штаммы, изолированные из желудочно-кишечного тракта соответствующих видов птиц (Casas I.A., Dobrogosz W.J. Lactobacillus reuteri: An overview of a new probiotic for humans and animals. Microecol Therap, 1997, 25, 221-231).

Наиболее близким к заявляемому штамму - прототипом является штамм Lactobacillus reuteri Pg4, продуцирующий β-глюконазу, использующийся в составе пробиотического препарата для цыплят (В. Yu, J.R.Liu, F.S.Hsiao and P.W.S.Chiou Animal Feed Science and Technology, V.141, Issues 1-2, 1 March 2008, P.82-91). Штамм Pg4 является рекомбинантным суперпродуцентом фермента β-глюконазы и предназначен для повышения эффективности усвоения растительных кормов, богатых некрахмалистыми полисахаридами.

Недостатком известного штамма является то, что он не предназначен для использования одновременно с проведением курсов антибиотикотерапии и профилактики, а также то, что этот штамм является генно-модифицированным, что ограничивает его применение.

Технической задачей изобретения является получение бактериального штамма, являющегося природным обитателем желудочно-кишечного тракта сельскохозяйственной птицы и обладающего устойчивостью к антибиотикам.

Поставленная техническая задача достигается получением штамма Lactobacillus reuteri okt, обладающего устойчивостью к широкому спектру антибиотиков, в частности к колистину, энрофлоксацину, норфлоксацину, тетрациклину, фуразолидону, а также продуцирующего фермент эстеразу.

Предлагаемый штамм выделен из природного материала желудочно-кишечного тракта курицы в результате целенаправленного систематического поиска.

Полученный штамм Lactobacillus reuteri okt депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов (ГосНИИгенетика) под регистрационным номером ВКПМ В-10609.

Штамм Lactobacillus reuteri okt ВКПМ В-10609 характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки: грамм положительные короткие палочки и/или коккобактерии растут на среде MRS. Колонии серовато-белые с ровной поверхностью ровным краем.

Физиолого-биохимические признаки: факультативный анаэроб, для сельскохозяйственной птицы и лабораторных животных непатогенен. Токсигенность при инокуляции суточной культуры внутрибрюшинно белым мышам в концентрации 1×106 кое/мл не обнаружена. Штамм продуцирует в культуральную среду фермент эстеразу, устойчивую к нагреванию при температуре 90°С в течение 10 минут.

Штамм характеризуется резистентностью к терапевтическим концентрациям колистина, энрофлоксацина, норфлоксацина, тетрациклина, фуразолидона. Чувствителен к амоксициллину, левомицетину, рифампицину.

Штамм идентифицирован на основе анализа морфологических и биохимических свойств по определителю [Определитель бактерий Берджи. / Под ред. Дж.Хоулта и др.: (9-е издание в 2 томах: Пер. с англ. под ред. акад. РАН Г.А.Заварзина). - М., 1997], а также на основе секвенирования фрагмента гена 16S рибосомальной РНК.

Хранение штамма осуществляют в лиофильно высушенном состоянии или в растворе 30% глицерина при температуре -60°С.

Для культивирования штамма применяют среду МРС (Ман, Рогоза, Шарп) следующего состава (г/л): гидролизат обезжиренного молока ферментативного сухого (ГОМ) в виде мелкодисперсного гигроскопического порошка бело-серого цвета 33,0; марганец сернокислый 0,1; магний сернокислый 0,4; калий фосфорнокислый двузамещенный 4,0; цистеин 0,4; глюкоза 40,0; пептон 20,0;

дрожжевой гидролизат 0,01; натрий уксуснокислый 10,0; аммоний лимоннокислый двузамещенный 4,0; агар микробиологический 2,0. Выход биомассы составляет 5 г/л среды.

Определяющим отличием предлагаемого штамма от штамма-прототипа является его устойчивость к антибиотикам - тетрациклину, колистину, энрофлоксацину, фуразолидону, а также способность продуцировать в культуральную жидкость термостабильную эстеразу, устойчивую к нагреву до 90С в течение 10 минут и способную гидролизовать субстрат - флюоресцеина диацетат с образованием флюоресцеина, что позволяет использовать этот признак в качестве штамм-специфического, а также использовать эстеразную активность для контроля стабильности характеристик культуры при производстве и хранении.

Поскольку предлагаемый штамм получен впервые и он характеризуется уникальным спектром устойчивости к антибиотикам, можно сделать вывод о соответствии предлагаемого штамма критериям изобретения «новизна» и «изобретательский уровень».

Изобретение иллюстрируется примерами конкретного выполнения.

Пример 1. Выращивание штамма Lactobacillus reuteri okt и выделение фермента эстеразы.

Для получения биомассы клетки штамма-продуцента переносили на агаризованную среду МРС в чашку Петри и инкубировали в течение ночи при 37°С. Свежевыращенные колонии переносили стерильной бактериологической петлей в колбы, содержащие жидкую питательную среду МРС и культивировали при 37°С до достижения стационарной фазы роста. Выход биомассы составил 5 г/л среды. Выделение и очистку фермента производили следующим образом: 1 г сырой биомассы ресуспендировали в 50 мл 50 мМ ТрисHCl буфера рН 7.2-7.4, содержащего 20 мМ ЭДТА. Суспензию клеток охлаждали на льду и разрушали ультразвуком в течение 3 минут с частотой 20 кГц. Полученную суспензию центрифугировали со скоростью 9 тыс.об/мин, в течение 15 минут при +5°С. Надосадочную жидкость переносили в другие пробирки, а осадок выбрасывали. Липиды и жирорастворимые компоненты удаляли путем добавления к экстракту холодного хлороформа в соотношении 1:5, пробирку с экстрактом тщательно встряхивали и оставляли на 3 часа при +5°С. Пробирку центрифугировали со скоростью 9 тыс.об/мин, в течение 15 минут при +5°С, водную фазу переносили в другую пробирку. К раствору белков добавляли аммоний сернокислый до 70% насыщения и инкубировали при +5°С в течение 16 часов. Высалившиеся белки осаждали центрифугированием со скоростью 9 тыс.об/мин, в течение 15 минут при +5°С. Надосадочную жидкость переносили в диализный мешок и удаляли аммоний сернокислый диализом при +5°С против 10 кратного объема 50 мМ ТрисНСl буфера рН 7.2-7.4, содержащего 20 мМ ЭДТА в течение 3 часов на магнитной мешалке. Процедуру диализа повторяли три раза, меняя буферный раствор. Для удаления белков крупнее 20 кДа препарат фермента подвергали ультрафильтрации через мембрану с пропускной способностью более 20 кДа. Полученный препарат фермента тестировали на активность с субстратом к щелочной фосфатазе и эстеразе. Выход фермента составил не менее 1000 ед. на 1 мл.

Пример 2. Изучение устойчивости к антибиотикам штамма Lactobacillus reuteri okt.

Антибиотикорезистентность заявляемого штамма лактобактерии определяли диско-диффузионным методом на кровяном агаре с селективной добавкой для выделения лактобактерии фирмы «Biolot». Для этого на поверхность кровяного агара сплошным газоном рассевали культуру лактобактерии. На агар помещали диски с различными антибиотиками. Учет проводили по зонам отсутствия или подавления роста антибиотика вокруг диска с клетками штамма. Результаты приведены в табл.1.

Таблица 1
Наименование антибиотика результат теста, мм
ампициллин 0
польодоксин 0
метронидазол 0
амоксиклав 32
доксициклин 30
левомицетин 30
рифампицин 22
офлоксацин 0
энрофлоксацин 0
тетрациклин 0
спектиномицин 16
энроколи 20
фуразолидон 10
левомицетин 24
пенициллин 10
эритромицин 28
флорфеникол 35
колистин 0
клиндамицин 0
флубактин 0
гентамицин 14

Из таблицы 1 видно, что новый штамм Lactobacillus reuteri okt ВКПМ В-10609 проявляет устойчивость в отношении широкого спектра антибиотиков: тетрациклину, колистину, энрофлоксацину, фуразолидону.

Пример 3. Исследование токсичности штамма бактерий Lactobacillus reuteri okt.

Острую и хроническую токсичность штамма бактерий Lactobacillus reuteri okt ВКПМ В-10609 изучали на белых мышах массой 20-22 г согласно утвержденной методике (Л.П.Маланин и др. «Методические указания по определению токсических свойств препаратов, применяемых в ветеринарии и животноводстве», М., 1988). Для определения острой токсичности было сформировано 6 групп животных по 6 голов в каждой. Перед началом эксперимента мышей выдерживали на карантине в течение 14 дней. Для испытания использовали культуру клеток заявляемого штамма в виде суспензии клеток с концентрацией бактерий не ниже 1×106 кое/мл. Испытуемую культуру вводили непосредственно в желудок с помощью шприца с тупой иглой, на конце которой наплавлено олово в количестве 0,8-2 мл на животное. Наблюдение за животными вели в течение 14 дней, отмечая признаки интоксикации и количество погибших животных.

Для изучения хронической токсичности заявляемого штамма были сформированы 4 группы белых мышей по 10 голов в каждой с живой массой 20-22 г. Мыши содержались на обычном рационе питания в виварии. Каждый день на протяжении 2,5 месяцев в питьевую воду мышам добавляли испытуемую культуру: в первой группе - в дозе 0,5 мл на голову, во второй группе - 0,8 мл; в третьей - 1,0 мл. Четвертая группа служила контролем, мышам давали питьевую воду без добавок. В ходе эксперимента учитывали следующие показатели: внешний вид и поведение животных, состояние шерстного покрова и видимых слизистых оболочек, подвижность, отношение к корму, гибель.

Для изучения отдаленных последствий влияния заявляемого штамма бактерий Lactobacillus reuteri okt ВКПМ В-10609 были сформировапны две группы белых мышей с живой массой 22-25 г по 6 голов в каждой группе (4 самки и 2 самца). В опытной группе на протяжении 2 месяцев ежедневно в питьевую воду мышам добавляли испытуемую культуру в дозах по 0,5 мл на животное. Вторая группа служила контролем и содержалась на обычном рационе вивария. Наблюдение вели в течение 2 месяцев. Учитывали общее состояние, число самок, давших потомство, число мышат в помете, их подвижность, время отлипания ушей, появление шерсти, пропорциональность развития тела и хвоста, отклонения в развитии и поведении. За полученным потомством наблюдали в течение месяца. Каких либо статистически достоверных различий между опытной и контрольной группами обнаружено не было, что свидетельствует об отсутствии токсичности штамма бактерий Lactobacillus reuteri okt.

Пример 4. Использование нового штамма для выращивания и откорма бройлерных цыплят.

Штамм бактерий Lactobacillus reuteri okt ВКПМ В-10609 в виде суспензии клеток с концентрацией бактерий 2×106 кое/мл выпаивали цыплятам бройлерам опытной группы (40000 голов) из расчета 0,5 мл на голову в день в течение 5 дней, начиная с десятидневного возраста, одновременно с введением антибиотика энрофлоксацина в дозировках, рекомендуемых наставлением по применению. Контрольная группа получала тот же антибиотик, но не получала культуру L.reuteri okt. Среднесуточный привес у цыплят-бройлеров опытной группы в возрасте 35 дней составил 53,7 г., а в контрольной группе 51,4 г.В течение 35 дней в опытной группе погибло 4% цыплят, а в контрольной группе погибло 7% цыплят. Таким образом, применение нового штамма бактерий Lactobacillus reuteri okt ВКПМ В-10609 одновременно с антибиотиком позволило повысить среднесуточный привес и снизить гибель цыплят в процессе выращивания.

Использование предлагаемого штамма бактерий Lactobacillus reuteri okt ВКПМ В-10609 позволит повысить эффективность выращивания сельскохозяйственной птицы, а также применять последний одновременно с проведением курсов антибиотикотерапии и профилактики заболеваний птиц.

Штамм бактерии Lactobacillus reuteri okt, депонированный под регистрационным номером ВКПМ В-10609, используемый для производства пробиотических препаратов для сельскохозяйственной птицы.


 

Наверх