Очистка пегилированных полипептидов



Очистка пегилированных полипептидов
Очистка пегилированных полипептидов
Очистка пегилированных полипептидов
Очистка пегилированных полипептидов
Очистка пегилированных полипептидов
Очистка пегилированных полипептидов
Очистка пегилированных полипептидов

 

C07K1/18 - Пептиды (пептиды в пищевых составах A23, например получение белковых композиций для пищевых составов A23J, препараты для медицинских целей A61K; пептиды, содержащие бета-лактамовые кольца, C07D; циклические дипептиды, не содержащие в молекуле любого другого пептидного звена, кроме образующего их кольцо, например пиперазин-2,5-дионы, C07D; алкалоиды спорыньи циклического пептидного типа C07D519/02; высокомолекулярные соединения, содержащие статистически распределенные аминокислотные единицы в молекулах, т.е. при получении предусматривается не специфическая, а случайная последовательность аминокислотных единиц, гомополиамиды и блоксополиамиды, полученные из аминокислот, C08G 69/00; высокомолекулярные продукты, полученные из протеинов, C08H 1/00; получение

Владельцы патента RU 2476439:

Ф.ХОФФМАНН-ЛЯ РОШ АГ (CH)

Настоящее изобретение относится к способу очистки монопегилированного эритропоэтина, включающему две катионообменных хроматографических стадии, где на обеих катионообменных хроматографических стадиях используется один и тот же тип катионита, а также к способу получения монопегилированного эритропоэтина в форме, являющейся в существенной степени гомогенной. 2 н. и 15 з.п. ф-лы, 3 ил., 2 табл., 3 пр.

 

Настоящее изобретение относится к области способов хроматографического выделения, применимых для очистки полипептидов, в особенности пегилированного эритропоэтина.

Предпосылки к созданию изобретения

Белки играют важную роль в современном медицинском арсенале. Для применения на людях всякий терапевтический белок должен соответствовать определенным критериям. Дабы обеспечить безопасность биофармацевтических средств для людей, необходимо особо озаботиться удалением побочных продуктов, накапливающихся в ходе процесса изготовления. Для удовлетворения нормативным требованиям вслед за процессом изготовления должны следовать одна или несколько стадий очистки. Среди прочих параметров важную роль при выборе подходящего способа очистки играют чистота, производительность и выход.

Общепризнанны и широко применимы различные способы очистки белков, такие как аффинная хроматография с микробными белками (например, аффинная хроматография с А-белком или G-белком), ионообменная хроматография (например, катионообменная (сульфопропильные или карбоксиметильные смолы), анионообменная (аминоэтильные смолы) и в смешанном режиме), тиофильная адсорбционная хроматография (например, с бета-меркаптоэтанолом и другими SH-лигандами), гидрофобная хроматография или адсорбционная хроматография с ароматическими группами (например, с фенилсефарозой, аза-аренофильными смолами или м-аминофенилбороновой кислотой), металлхелатная аффинная хроматография (например, с носителем со сродством к Ni(II)- и Cu(II)), эксклюзионная хроматография и электрофоретические методы (такие как гель-электрофорез, капиллярный электрофорез) (Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102). Сообщалось о конъюгации для, например, полиэтиленгликоля (ПЭГ) и интерлейкина-6 (Европейский патент ЕР 0442724), ПЭГ и эритропоэтина (международная заявка на изобретение WO 01/02017), содержащих эндостатин химерных молекул и иммуноглобулинов (заявка на патент США US 2005/008649), гибридных белков на основе секретируемых антител (заявка на патент США US 2002/147311), содержащих альбумин гибридных полипептидов (заявка на патент США US 2005/0100991; человеческого сывороточного альбумина - патент США US 5876969), пегилированных полипептидов (заявка на патент США US 2005/0114037) и гибридных интерферонов.

Necina, R. и др. (Biotechnol. Bioeng. 60 (1998) 689-698) сообщали о захвате человеческих моноклональных антител прямо из надосадочных жидкостей клеточных культур с помощью ионообменных сред, характеризуемых высокой плотностью заряда. В международной заявке на изобретение WO 89/05157 сообщается о способе очистки получаемых иммуноглобулинов посредством непосредственной катионообменной обработки клеточной культуральной среды. Одностадийная очистка моноклональных антител IgG (иммуноглобулин G) из перитонеального выпота мышей описана в Danielsson, А., и др., J. Immun. Meth. 115 (1988), 79-88. Способ очистки полипептида с помощью ионообменной хроматографии описан в международной заявке на изобретение WO 2004/024866, в которой для отделения искомого полипептида от одного или нескольких загрязнителей применяют градиентное элюирование. В Европейском патенте ЕР 0530447 описан способ очистки моноклональных антител IgG с помощью комбинации трех хроматографических стадий. Удобный способ очистки монопегилированного антагониста рецептора интерлейкина-1 описан в Yu, G., и др., в Process Biotechnol. 42 (2007) 971-977. Wang и др. (Wang, H., и др., Peptides 26 (2005) 1213-1218) сообщают об очистке белка hTFF3, экспрессируемого кишечной палочкой E.coli, с помощью двухстадийной катионообменной хроматографии. Yun и др. (Yun, Q., и др., J. Biotechnol. 118 (2005) 67-74) сообщают об очистке пегилированного рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека rhG-CSF с помощью двух последовательных ионообменных хроматографических стадий. В международных заявках на изобретение WO 2007/039436 и WO 01/087329 описаны эритропоэтин, связанный ковалентно с полиэтиленгликолевой группой(группами), и жидкая фармацевтическая композиция, содержащая эритропоэтиновый белок.

Краткое описание изобретения

Объектом настоящего изобретения является способ очистки монопегилированного эритропоэтина, включающий стадии получения раствора, содержащего моно-, поли- и непегилированный эритропоэтин, осуществления двух последовательных катионообменных хроматографических стадий и выделения очищенного монопегилированного эритропоэтина на второй катионообменной хроматографической стадии, причем для обеих катионообменных хроматографических стадий применяется один и тот же тип катионита.

В одном из вариантов осуществления данного способа две последовательные катионообменные хроматографические стадии осуществляют с применением различных способов элюирования. В другом варианте осуществления настоящего способа две последовательные катионообменные хроматографические стадии включают следующие шаги;

а) введение забуференного водного раствора, содержащего смесь моно-, поли- и непегилированного эритропоэтина, в первую катионообменную хроматографическую колонку в условиях, пригодных для связывания упомянутого монопегилированного эритропоэтина с содержащимся в таковой колонке катионитом,

б) выделение монопегилированного эритропоэтина из первой катионообменной хроматографической колонки с помощью метода ступенчатого элюирования со ступенчатым увеличением ионной силы элюирующего буферного раствора, в результате чего содержание упомянутого монопегилированного эритропоэтина увеличивается по сравнению со смесью, задействованной на шаге а),

в) введение выделенного монопегилированного эритропоэтина во вторую катионообменную хроматографическую колонку в условиях, пригодных для связывания упомянутого монопегилированного эритропоэтина с содержащимся в таковой второй колонке катионитом, где содержащийся в упомянутой второй колонке катионит относится к тому же типу, что и катионит в первой колонке,

г) выделение очищенного монопегилированного эритропоэтина из упомянутой второй катионообменной хроматографической колонки в форме, являющейся в существенной степени гомогенной, с помощью метода непрерывного элюирования с непрерывным увеличением ионной силы элюирующего буферного раствора.

В одном из вариантов данного способа катионит является сильным катионитом. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения сильный катионит является сульфопропильным катионитом. Особенно предпочтительным является Тойоперл® SP 650 М. В другом варианте осуществления монопегилированный эритропоэтин выделяют на шаге г) в форме, являющейся в существенной степени гомогенной, с чистотой более 95% по площади хроматографического пика. Еще в одном варианте осуществления данного способа ступенчатое увеличение ионной силы на шаге б) способа является увеличением ионной силы в две ступени. Предпочтительно монопегилированный эритропоэтин выделяют на второй стадии способа ступенчатого элюирования, т.е. после второго повышения ионной силы.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения его объектом является способ получения монопегилированного эритропоэтина, включающий следующие стадии:

а) пегилирование эритропоэтина с помощью пегилирующего агента,

б) очистку пегилированного эритропоэтина с помощью двух последовательных катионообменных хроматографических стадий, где на первой и второй катионообменных хроматографических стадиях задействован один и тот же тип катионита,

в) выделение монопегилированного эритропоэтина из второй катионообменной хроматографической колонки в форме, являющейся в существенной степени гомогенной.

Подробное описание изобретения

Объектом настоящего изобретения является способ очистки монопегилированного эритропоэтина, включающий две катионообменные хроматографические стадии, где на обеих катионообменных хроматографических стадиях используется катионит одинакового типа.

Термин «ионообменное вещество» (ионит), как он употребляется в настоящей заявке, означает неподвижную матрицу высокой молекулярной массы, несущую ковалентно связанные заряженные заместители, применяемую в качестве неподвижной фазы в ионообменной хроматографии. Для общей электронейтральности с ней нековалентно связаны противоионы. «Ионообменное вещество» характеризуется способностью обменивать свои нековалентно связанные противоионы на сходным образом заряженные ионы из окружающего раствора. В зависимости от заряда своих обмениваемых противоионов «ионообменная смола» относится к катионообменной смоле или к анионообменной смоле. В зависимости от природы заряженной группы (заместителя) «ионообменная смола» относится, в случае, например, катионообменных смол, к сульфокислотной смоле (S), или сульфопропильной смоле (SP), или карбоксиметильной смоле (СМ). В зависимости от химической природы заряженной группы/заместителя «ионообменная смола» может быть дополнительно классифицирована как сильная или слабая ионообменная смола, что зависит от силы ковалентно связанного заряженного заместителя. Например, сильные катионообменные смолы содержат сульфокислотную группу, предпочтительно сульфопропильную группу, в качестве заряженного заместителя, а слабые катионообменные смолы содержат карбоксильную группу, предпочтительно карбоксиметильную группу, в качестве заряженного заместителя, слабые же анионообменные смолы содержат диэтиламиноэтильную группу в качестве заряженного заместителя.

Различные типы ионообменных материалов, т.е. неподвижных фаз, доступны под разными именами от многих компаний, включая, например, катиониты Bio-Rex® (например, тип 70), Chelex® (например, тип 100), Macro-Prep® (например, тип CM, High S, 25 S), AG® (например, тип 50W, МР), предоставляемые компанией BioRad Laboratories, WCX 2 от компании Ciphergen, Dowex® MAC-3 от компании Dow Chemical Company, Mustang С и Mustang S от компании Pall Corporation, целлюлоза CM (например, тип 23, 52), hyper-D, partisphere от компании Whatman plc., Амберлит® IRC (например, тип 76, 747, 748), Амберлит® GT 73, Тойоперл® (например, тип SP, CM, 650M), предоставляемые компанией Tosoh Bioscience GmbH, CM 1500 и CM 3000 от компании BioChrom Labs, SP-сефарозаТМ, СМ-сефарозаТМ от компании GE Healthcare, смолы Poros от компании PerSeptive Biosystems, Asahipak ES (например, тип 502С), CXpak P, IEC CM (например, тип 825, 2825, 5025, LG), IEC SP (например, тип 420N, 825), IEC QA (например, тип LG, 825), предоставляемые компанией Shoko America Inc., катионообменная смола 50W от компании Eichrom Technologies Inc. Предпочтительно катионит является сильным катионитом, таким как Macro-Prep® High S или 25S, или MacroCap SP, или Тойоперл® SP 650M, или Source S, или SP сефароза, или POLYCAT А. Примерами анионитов являются Dowex® 1 от компании Dow Chemical Company, AG® (например, тип 1, 2, 4), Bio-Rex® 5, ДЭАЭ (диметиламиноэтил) Bio-Gel 1, Macro-Prep® ДЭАЭ, предоставляемые кампанией BioRad Laboratories, анионообменная смола типа 1 от компании Eichrom Technologies Inc., Source Q, ANX сефароза 4, ДЭАЭ-сефароза (например, тип CL-6B, FF), Q сефароза, Capto Q, Capto S, предоставляемые компанией GE Healthcare, AX-300 от компании PerkinElmer, Asahipak ES-502C, AXpak WA (например, тип 624, G), IEC ДЭАЭ, предоставляемые кампанией Shoko America Inc., Амберлит® IRA-96, Тойоперл® ДЭАЭ, TSKgel ДЭАЭ, предоставляемые кампанией Tosoh Bioscience GmbH, Mustang Q от компании Pall Corporation. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения катионит является сульфопропильным катионитом.

Выражение «одинаковый тип катионита» относится к двум последовательным ионообменным хроматографическим стадиям, осуществляемым с использованием идентичного катионита. Это означает, что последовательные катионообменные хроматографические стадии осуществляют либо с использованием первой порции катионита для первой катионообменной хроматографической стадии и второй порции того же самого катионита для второй катионообменной хроматографической стадии, либо с использованием одного и того же катионита для обеих катионообменных хроматографических стадий. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения второй катионит является тем же типом катионита, что и первый катионит, но не той же самой его порцией.

Термины «ступенчатое элюирование» и «метод ступенчатого элюирования», употребляемые в настоящей заявке взаимозаменяемо, обозначают способ, в котором, например, концентрацию вещества, вызывающего элюирование, т.е. растворение связанного соединения из вещества-носителя, скачкообразно повышают или понижают, т.е. непосредственно от одного значения/уровня до другого значения/уровня. При данном «ступенчатом элюировании» одно или несколько условий, например рН, ионную силу, концентрацию соли и/или скорость элюирования, скачкообразно изменяют от первой, например исходной, величины до второй, например конечной, величины, т.е. условия изменяют дискретно, т.е. ступенчато, в отличие от линейных изменений. В «методе ступенчатого элюирования» собирают новую фракцию после каждого повышения ионной силы. Эта фракция содержит соединения, выделенные из ионообменного вещества при соответствующем повышении ионной силы. После каждого повышения условия поддерживают до следующей стадии данного метода элюирования. При «ступенчатом элюировании» одно или несколько условий совместно скачкообразно изменяют от первой, например исходной, величины до второй, например конечной, величины. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения величина изменения составляет 10 или более процентов концентрации вызывающего элюирование вещества. Это означает, что в данном варианте осуществления настоящего изобретения концентрация вызывающего элюирование вещества составляет 100% на первой ступени, 110% или более на второй ступени и 120% или более на третьей ступени. В другом варианте осуществления настоящего изобретения величина изменения составляет 50 или более процентов концентрации вызывающего элюирование вещества. Еще в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения величина изменения составляет 120 или более процентов концентрации вызывающего элюирование вещества. Термин «ступенчатое элюирование» означает, что условия изменяют дискретно, т.е. ступенчато, в отличие от линейного изменения.

Термины «непрерывное элюирование» и «метод непрерывного элюирования», употребляемые в настоящей заявке взаимозаменяемо, означают способ, в котором, например, концентрацию вещества, вызывающего элюирование, т.е. растворение связанного/адсорбированного соединения из хроматографического носителя, повышают или понижают непрерывно, т.е. концентрацию изменяют последовательными малыми шагами, на каждом из которых происходит не более чем двухпроцентное, предпочтительно однопроцентное, изменение концентрации вызывающего элюирование вещества. При данном «непрерывном элюировании» одно или несколько условий, например рН, ионная сила, концентрация соли и/или скорость элюирования, могут быть изменены линейно, или экспоненциально, или асимптотически. Предпочтительно изменение осуществляется линейно.

Термин «введение» и его грамматические эквиваленты, как он употребляется в настоящей заявке, означает подстадию способа очистки, на которой содержащий искомое вещество раствор вводят в контакт с неподвижной фазой. Это означает, что а) раствор вводят в хроматографическое устройство, в котором находится неподвижная фаза, или б) неподвижную фазу добавляют к раствору. В случае а) раствор, содержащий подвергаемое очистке искомое вещество, проходит через неподвижную фазу, обеспечивая взаимодействие между неподвижной фазой и веществами в растворе. В зависимости от условий, таких как, например, рН, проводимость, концентрация соли, температура и/или скорость элюирования, некоторые вещества из раствора связываются с неподвижной фазой и таким образом удаляются из раствора. Другие вещества остаются в растворе. Остающиеся в растворе вещества могут быть обнаружены в проточной фракции. Термин «проточная фракция» означает раствор, получаемый после прохождения хроматографического устройства, который может быть как введенным раствором, содержащим искомое вещество, так и буферным раствором, используемым для промывания колонки или элюирования одного или нескольких связанных с неподвижной фазой веществ. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения хроматографическое устройство является колонкой или кассетой. Искомое вещество может быть выделено из раствора после стадии очистки с помощью известных специалисту в соответствующей области способов, таких как, например, осаждение, высаливание, ультрафильтрация, диафильтрация, лиофилизация, аффинная хроматография или снижение объема растворителя, с целью получения искомого вещества в форме, являющейся в существенной степени гомогенной. В случае б) к раствору, содержащему подвергаемое очистке искомое вещество, добавляют неподвижную фазу, например твердое вещество, обеспечивая взаимодействие между неподвижной фазой и веществами в растворе. После взаимодействия неподвижную фазу удаляют, например, посредством фильтрования, а искомое вещество либо оказывается связано с неподвижной фазой и удалено вместе с ней из раствора, либо не связывается с неподвижной фазой и остается в растворе.

Выражение «в пригодных для связывания условиях» и его грамматические эквиваленты, как оно употребляется в настоящей заявке, означает, что искомое вещество, например пегилированный эритропоэтин, связывается с неподвижной фазой при введении во взаимодействие с ней, например с ионообменным веществом. Это не обязательно означает, что связываются все 100% искомого вещества, но 100% искомого вещества связываются в существенном количестве, т.е. с неподвижной фазой связывается хотя бы 50% искомого вещества, связывается хотя бы 75% искомого вещества, связывается хотя бы 85% искомого вещества или связывается более 95% искомого вещества.

Термин «забуференный», как он употребляется в настоящей заявке, означает раствор, в котором изменения рН вследствие добавления или высвобождения кислотных или основных веществ выравниваются с помощью буферного вещества. Может быть задействовано любое буферное вещество, приводящее к такому эффекту. Предпочтительно используют фармацевтически приемлемые буферные вещества, такие как, например, фосфорная кислота или ее соли, уксусная кислота или ее соли, лимонная кислота или ее соли морфолин, 2-(N-морфолино)этансульфокислота или ее соли, гистидин или его соли, глицин или его соли или трис(гидроксиметил)аминометан (Трис) или его соли. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения в качестве буферного вещества используют фосфорную кислоту или ее соли, или уксусную кислоту или ее соли, или лимонную кислоту или ее соли, или гистидин или его соли. Буферный раствор может необязательно содержать дополнительную соль, такую как хлорид натрия, сульфат натрия, хлорид калия, сульфат калия, цитрат натрия или цитрат калия.

Общие методы хроматографии и их применение известны специалисту в соответствующей области. См., например, Chromatography (Хроматография), 5-е издание, часть A: Fundamentals and Techniques (Основы и методы), под ред. Heftmann, E., Elsevier Science Publishing Company, New York, (1992); Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences (Продвинутые хроматографические и электромиграционные методы в биологических науках), под ред. Deyl, Z., Elsevier Science BV, Amsterdam, The Netherlands, (1998); Chromatography Today (Хроматография сегодня), Poole, С.F., и Poole, S.K., Elsevier Science Publishing Company, New York, (1991); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice (Очистка белков: принципы и практика) (1982); под ред. Sambrook, J., и др., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Молекулярное клонирование: лабораторное руководство), 2-е издание. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; или Current Protocols in Molecular Biology (Современные методики в молекулярной биологии), под ред. Ausubel, F.М., и др., John Wiley & Sons, Inc., New York.

Пегилирование эритропоэтина приводит, как правило, к смеси различных соединений, таких как полипегилированный эритропоэтин, монопегилированный эритропоэтин, непегилированный эритропоэтин, продукты гидролиза активированного сложного эфира эритропоэтина, например пегилированная кислота в свободном виде, равно как и продукты гидролиза самого эритропоэтина. С целью получения монопегилированного эритропоэтина в форме, являющейся существенно гомогенной, эти соединения должны быть разделены, а искомое соединение должно быть очищено.

В связи с этим, объектом настоящего изобретения является способ получения монопегилированного эритропоэтина в форме, являющейся в существенной степени гомогенной, включающий следующие стадии:

а) пегилирование эритропоэтина с помощью активированного пегилирующего реагента с молекулярной массой от 20 кДа до 40 кДа,

б) очистку получаемого на стадии а) пегилированного эритропоэтина с помощью двух последовательных катионообменных хроматографических стадий, где на первой и второй катионообменных хроматографических стадиях задействован катионит одного и того же типа,

в) выделение монопегилированного эритропоэтина из второй катионообменной хроматографической колонки в форме, являющейся в существенной степени гомогенной.

Этот способ особенно полезен для очистки пегилированных рекомбинантных полипептидов, являющихся гликозилированными, т.е. выработанных в клетках млекопитающих, предпочтительно в клетке яичников китайского хомячка (СНО), человеческой эмбриональной клетке почек (HEK293), клетке почек детеныша хомячка (BHK), клетке линии Per.С6® или раковой клетке HeLa, и впоследствии пегилированных химически.

На первой стадии способа эритропоэтин пегилируют. Полимерные молекулы полиэтиленгликоля (ПЭГ), применяемые в реакции пегилирования, характеризуются молекулярной массой приблизительно от 20 кДа до 40 кДа (под термином «молекулярная масса», как он здесь употребляется, следует понимать среднюю молекулярную массу ПЭГ, поскольку ПЭГ, являющийся полимерным соединением, нельзя получить с определенной молекулярной массой, на самом же деле он характеризуется молекулярно-массовым распределением. Термин «приблизительно» указывает на то, что в подобных образцах ПЭГ некоторые молекулы будут иметь большую, а некоторые меньшую массу по сравнению с указанной молекулярной массой, т.е. термин «приблизительно» относится к молекулярно-массовому распределению, в котором 95% молекул ПЭГ характеризуются молекулярной массой в пределах +/- 10% от указанной молекулярной массы. Например, молекулярная масса 30 кДа означает диапазон от 27 кДа до 33 кДа).

Термин «эритропоэтин» относится к белку, характеризуемому последовательностью за номером 1 или за номером 2 из приведенного ниже описания последовательностей, или к в существенной степени ему гомологичному белку или полипептиду, биологические свойства которого относятся к стимуляции выработки красных кровяных клеток и к стимуляции деления и дифференцировки коммитированных эритроидных клеток-предшественников в костном мозге. Рекомбинантный эритропоэтин может быть получен посредством экспрессии в эукариотических клетках, например в клетках СНО, или клетках ВНK, или клетках HeLa, с помощью технологии, основанной на рекомбинантной ДНК, или посредством эндогенной активации гена. Например, эритропоэтиновый гликопротеид экспрессируется посредством эндогенной активации гена, как это сообщается в Патентах США US 5733761, US 5641670, US 5733746 и международных заявках на изобретение WO 93/09222, WO 94/12650, WO 95/31560, WO 90/11354, WO 91/06667 и WO 91/09955. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения эритропоэтин согласно настоящему изобретению основан на последовательности человеческого эритропоэтина (ЭПО). В другом варианте осуществления настоящего изобретения человеческий эритропоэтин характеризуется аминокислотной последовательностью, представленной в приведенном ниже описании под номером 1 или под номером 2, предпочтительно человеческий эритропоэтин характеризуется аминокислотной последовательностью, представленной в приведенном ниже описании под номером 1. Термин «эритропоэтин» также относится к таким вариантам белка согласно последовательностям под номером 1 или под номером 2, в которых один или несколько аминокислотных остатков заменены, удалены или вставлены и которые обладают той же биологической активностью, что и немодифицированный белок, как это, например, описано в Европейском патенте ЕР 1064951 или в патенте США US 6583272. Вариант может характеризоваться аминокислотной последовательностью человеческого эритропоэтина, содержащей от одного до шести дополнительных сайтов для гликозилирования. Специфическая активность пегилированного эритропоэтина может быть определена с помощью различных анализов, известных в соответствующей области. Биологическая активность очищенного пегилированного эритропоэтина по настоящему изобретению такова, что введение белка посредством инъекции пациентам-людям приводит к увеличению выработки клетками костного мозга ретикулоцитов и красных кровяных клеток по сравнению с не подвергнутыми инъекции или контрольными группами пациентов. Биологическая активность пегилированного эритропоэтина, полученного и очищенного в соответствии с настоящим изобретением, может быть исследована с помощью способов согласно Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio 1997(2).

Термин «ПЭГ» или «ПЭГ-группа» согласно настоящему изобретению означает остаток, содержащий полиэтиленгликоль в качестве своей основной части. Подобный ПЭГ может содержать другие химические группы, необходимые для реакций связывания, т.е. конъюгации, образующиеся в результате химического синтеза молекулы или являющиеся спейсером для оптимального расстояния между частями молекулы. Эти дополнительные химические группы не учитываются при расчете молекулярной массы полимерной молекулы ПЭГ. Кроме того, подобный ПЭГ может включать одну или несколько боковых цепей ПЭГ, связанных друг с другом. Варианты ПЭГ с более чем одной цепью ПЭГ называются многолучевыми или разветвленными ПЭГ. Разветвленные ПЭГ могут быть получены, например, посредством добавления полиэтиленоксида к различным полиолам, включая глицерин, пентаэритрит и сорбит. Разветвленные ПЭГ описаны, например, в Европейском патенте ЕР 0473084 и Патенте США US 5932462. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения в качестве ПЭГ с молекулярной массой 20-35 кДа используют линейные молекулы ПЭГ, а в качестве полимеров ПЭГ с молекулярной массой свыше 35 кДа, в особенности 40 кДа, используют разветвленные варианты ПЭГ. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения в качестве ПЭГ с массой 40 кДа используют ПЭГ с двумя цепями.

Термин «пегилирование» означает ковалентное связывание полиэтиленгликолевого остатка по N-концу полипептида и/или внутреннему лизиновому остатку. Пегилирование белков широко известно в соответствующей области, обзор ему дан, например, в Veronese, F.M., Biomaterials 22 (2001) 405-417. ПЭГ может быть присоединен с помощью различных функциональных групп и полиэтиленгликолей различной молекулярной массы, линейных и разветвленных вариантов ПЭГ, равно как и различных соединительных групп (см. также Francis, G.E., и др., Int. J. Hematol. 68 (1998) 1-18; Delgado, С., и др., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Systems 9 (1992) 249-304). Пегилирование эритропоэтина может быть осуществлено в одном растворе с помощью пегилирующих реагентов, как это описано, например, в международной заявке на изобретение WO 00/44785, в одном из вариантов осуществления - с использованием активированных N-гидроксисукцинимидом (НГС) линейных или разветвленных молекул ПЭГ с молекулярной массой между 5 кДа и 40 кДа. Пегилирование также может быть осуществлено в твердой фазе согласно Lu, Y., и др., Reactive Polymers 22 (1994) 221-229. Нередко пегилированные по N-концу белки могут быть также получены согласно международной заявке на изобретение WO 94/01451.

Подобные способы приводят к эритропоэтину, пегилированному по одной или нескольким ε-аминогруппам лизиновых остатков и/или по N-концевой аминогруппе. Селективное пегилирование по N-концевой аминокислоте может быть осуществлено согласно Felix, A.M., и др., ACS Symp. Ser. 680 (полиэтиленгликоль) (1997) 218-238. Селективное пегилирование по N-концу может быть достигнуто в ходе твердофазного синтеза посредством сочетания Nα-пегилированного аминокислотного производного c N-1 концевой аминокислотой пептидной цепи. Пегилирование в виде боковой цепи может быть осуществлено в ходе твердофазного синтеза посредством сочетания Nε-пегилированных производных лизина с растущей цепью. Комбинированное пегилирование по N-концу и с образованием боковой цепи осуществимо или как это описано выше в ходе твердофазного синтеза, или посредством синтеза в растворе, подвергая пептид со снятой защитой аминогруппы действию активированных пегилирующих реагентов.

Подходящими производными ПЭГ являются активированные молекулы ПЭГ со средней молекулярной массой от приблизительно 5 до приблизительно 40 кДа, а в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения от приблизительно 20 до приблизительно 40 кДа, предпочтительно от приблизительно 30 кДа до приблизительно 35 кДа. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения пегилированное производное является линейным или разветвленным ПЭГ. Большое разнообразие производных ПЭГ, подходящих для применения в получении ПЭГ-белковых и ПЭГ-пептидных конъюгатов, может быть получено от компании (Huntsville, AL, U.S.A.; www.nektar.com).

Активированные производные ПЭГ известны в соответствующей области и описаны, например, в Morpurgo, М., и др., J. Bioconjug. Chem. 7 (1996) 363-368, для случая ПЭГ-винилсульфона. Линейные и разветвленные виды ПЭГ пригодны для получения пегилированных фрагментов. Примерами реакционноспособных реагентов ПЭГ являются иодацетилметокси-ПЭГ или метокси-ПЭГ-винилсульфон (m предпочтительно является целым числом от приблизительно 450 до приблизительно 900, a R является (С16)алкилом, линейным или разветвленным и содержащим от одного до шести атомов углерода, таким как метил, этил, изопропил и т.п. В соответствии с этим, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения R является метилом):

или

Применение этих активированных иодом веществ известно в соответствующей области и описано, например, Hermanson, G. Т., в Bioconjugate Techniques (Методики биоконъюгатов), Academic Press, San Diego (1996), стр.147-148.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения ПЭГ является активированным сложным эфиром ПЭГ, например N-гидроксисукцинимидилпропионатом, или N-гидроксисукцинимидилбутаноатом, или N-гидроксисукцинимидинами, такими как ПЭГ-НГС (Monfardini, С., и др., Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62-69). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения сложный эфир N-гидроксисукцинимида является

или

с использованием алкокси-ПЭГ-N-гидроксисукцинимида, такого как метокси-ПЭГ-N-гидроксисукцинимид (MW 30000; Shearwater Polymers, Inc.), где R и m отвечают вышеприведенному определению. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения ПЭГ является сложным N-гидроксисукцинимидиловым эфиром метоксиполиэтиленгликольмасляной кислоты. Термин «алкоксигруппа» относится к группе простого алкилового эфира, где термин «алкил» означает неразветвленную или разветвленную алкильную группу, содержащую не более четырех атомов углерода, такую как метоксигруппа, этоксигруппа, н-пропоксигруппа и им подобные, предпочтительно метоксигруппа.

Выражение «в существенной степени гомогенная форма», как оно употребляется в настоящей заявке, означает, что полученный, содержащийся или применяющийся пегилированный эритропоэтин содержит определенное количество присоединенных групп ПЭГ. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения пегилированный эритропоэтин является монопегилированным эритропоэтином. Препарат может содержать непрореагировавший (т.е. не несущий группы ПЭГ) эритропоэтин, полипегилированный эритропоэтин, равно как и фрагменты полипептида, образованны в ходе реакции пегилирования. Термин «в существенной степени гомогенная форма» означает, что препарат монопегилированного эритропоэтина содержит в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения хотя бы 50% (масс./масс.) монопегилированного эритропоэтина, хотя бы 75% монопегилированного эритропоэтина, хотя бы 90% монопегилированного эритропоэтина или более 95% монопегилированного эритропоэтина. Величины в процентах основаны на проценте площади хроматограммы, отвечающей результатам катионообменной хроматографической очистки, после которой получают монопегилированный эритропоэтин.

Объектом настоящего изобретения является способ очистки монопегилированного эритропоэтина, имеющий целью получение монопегилированного эритропоэтина в форме, являющейся в существенной степени гомогенной. Было неожиданно обнаружено, что сочетание двух последовательных катионообменных хроматографических стадий, использующих одинаковый тип катионита, приводит к монопегилированному эритропоэтину в форме, являющейся в существенной степени гомогенной. Таким образом, объектом настоящего изобретения является способ очистки монопегилированного эритропоэтина, включающий стадии получения раствора, содержащего моно-, поли- и непегилированный эритропоэтин, осуществления двух последовательных катионообменных хроматографических стадий и выделения очищенного монопегилированного эритропоэтина на второй катионообменной хроматографической стадии, причем на обеих катионообменных хроматографических стадиях используется одинаковый тип катионита. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения выделение на первой катионообменной хроматографической стадии осуществляют с помощью другого способа элюирования, нежели выделение на второй катионообменной хроматографической стадии. В другом варианте осуществления настоящего изобретения катионообменную хроматографическую колонку регенерируют после первой катионообменной хроматографической стадии и после второй катионообменной хроматографической стадии.

Выделение очищенного монопегилированного эритропоэтина на второй катионообменной хроматографической стадии осуществляют посредством элюирования монопегилированного эритропоэтина из задействованного на второй хроматографической стадии катионита. В одном из вариантов осуществлении способа согласно настоящему изобретению две катионообменные хроматографические стадии различаются задействуемым способом элюирования. В этом варианте осуществления первую катионообменную хроматографическую стадию осуществляют с помощью способа ступенчатого элюирования, т.е. ионную силу используемого буфера повышают ступенчато, т.е. скачкообразно, от одной величины ионной силы до следующей величины ионной силы, предпочтительно, посредством изменения на 10% или более. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения способ ступенчатого элюирования осуществляют в виде трехступенчатого элюирования. На первой ступени из катионообменной хроматографической колонки преимущественно элюируется полипегилированный эритропоэтин. При втором увеличении ионной силы в основном элюируется монопегилированный эритропоэтин с чистотой более 60% исходя из площади соответствующей эксклюзионной хроматограммы (% площади). При третьем повышении ионной силы из колонки преимущественно элюируется остающийся непегилированный эритропоэтин.

Вторую катионообменную хроматографическую стадию проводят в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения с помощью способа непрерывного элюирования, т.е. ионная сила буфера повышается непрерывно, предпочтительно, посредством изменения на менее чем 5%. Элюируемые фракции, содержащие монопегилированный эритропоэтин, объединяют с целью получения монопегилированного эритропоэтин в форме, являющейся в существенной степени гомогенной, и содержащего, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения, менее 0,5% форм с низкой молекулярной массой по данным площадей пиков на соответствующей хроматограмме. Буфер предпочтительно присутствует в концентрации от 10 мМ до 250 мМ, а в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения от 50 мМ до 150 мМ, в другом же варианте осуществления настоящего изобретения - приблизительно 100 мМ. Таким образом, в способе согласно настоящему изобретению две последовательные катионообменные хроматографические стадии представляют собой следующую последовательность шагов:

а) введение забуференного водного раствора, содержащего смесь моно-, поли- и непегилированного эритропоэтина, а также форм с низкой молекулярной массой, в первую катионообменную хроматографическую колонку в условиях, подходящих для связывания упомянутого монопегилированного эритропоэтина с катионитом, содержащимся в указанной первой колонке,

б) выделение монопегилированного эритропоэтина из первой катионообменной хроматографической колонки с помощью способа ступенчатого элюирования со ступенчатым повышением ионной силы проточного буфера, где относительное содержание монопегилированного эритропоэтина в выделенном растворе повышено по сравнению со смесью, введенной на стадии а),

в) введение выделенного монопегилированного эритропоэтина со стадии б) во вторую катионообменную хроматографическую колонку в условиях, подходящих для связывания упомянутого монопегилированного эритропоэтина с катионитом, содержащимся в указанной второй колонке, причем катионит, содержащийся в таковой второй колонке, того же типа, что и катионит в первой колонке,

г) выделение очищенного монопегилированного эритропоэтина в форме, являющейся в существенной степени гомогенной, из упомянутой второй катионообменной хроматографической колонки с помощью способа непрерывного элюирования с непрерывным повышением ионной силы проточного буфера.

Пегилирование полипептида не приводит, как правило, к продукту пегилирования в гомогенной форме. Более того, его получают в виде смеси монопегилированного, полипегилированного и непегилированного продукта. Поэтому раствор пегилированного эритропоэтина, вводимый на стадии а) способа, является смесью моно-, поли- и непегилированного эритропоэтина, а также форм или фрагментов с низкой молекулярной массой в водном буферном растворе. Относительное содержание различных веществ определяют с помощью эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ЭВЭЖХ). Пример хроматограммы показан на фигуре 1. Сумма площадей отнесенных пиков, т.е. площадь под пиками, на фигуре 1 является общей площадью эксклюзионной хроматограммы. Доля отдельного пика дается в виде процента от площади, т.е. относительной доли площади от общей площади хроматограммы.

Общие хроматографические методы, их применение и относящиеся к ним термины известны специалисту в соответствующей области. См., например, Chromatography (Хроматография), 5-е издание, Part A: Fundamentals and Techniques (Часть А: Основы и методы), под ред. Heftmann, E., Elsevier Science Publishing Company, New York, (1992) и другие относящиеся сюда учебники. В продолжение хрматографирования через катионообменную хроматографическую колонку протекает буфер. Этот «проточный буфер» подбирают в соответствии с требованиями стадий хроматографической процедуры. Он переносит искомое вещество к хроматографической неподвижной фазе (введение) и из нее (элюирование).

На первой катионообменной хроматографической стадии смесь монопегилированного, полипегилированного и непегилированного эритропоэтина вводят при концентрации белка от 0,7 до 1,5 мг/мл, предпочтительно около 1 мг/мл, в первую катионообменную хроматографическую колонку в забуференном водном растворе. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения забуференный водный раствор содержит около 100 мМ фосфата калия при рН около 3,0. Термин «около» («приблизительно»), как он употребляется в настоящей заявке, означает десятипроцентный диапазон вокруг указанной величины, т.е. ±10%. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения первую колонку промывают до и после введения одним и тем же буферным раствором. Для первой ступени в способе ступенчатого элюирования буфер заменяют на буфер, содержащий около 100 мМ фосфата калия и около 90 мМ хлорида натрия при рН около 3,0. Под действием этого буфера из катионообменной хроматографической колонки элюируются гидролизованный активированный реагент ПЭГ, т.е. соответствующая пегилированная карбоновая кислота, непрореагировавший агент для сочетания и полипегилированный эритропоэтин. Для второй ступени в способе трехступенчатого элюирования буферный раствор заменяют буфером, содержащим около 100 мМ фосфата калия и около 250 мМ хлорида натрия при рН около 3,0. На данной ступени из первой катионообменной хроматографической колонки выделяют монопегилированный эритропоэтин. Собранный проточный буфер с данной стадии элюирования разбавляют в соотношении приблизительно от 1:5 (об./об.) до 1:8 (об./об.), предпочтительно 1:5 (об./об.), очищенной водой. Пример первой катионообменной хроматографической стадии представлен на фигуре 2. Для третьей ступени в трехступенчатом способе элюирования буфер заменяют на буфер, содержащий около 100 мМ фосфата калия и около 750 мМ хлорида натрия при рН около 3,0. На данной стадии из первой катионообменной хроматографической колонки выделяют непегилированный эритропоэтин.

Собранный проточный буфер со второй ступени первой катионообменной хроматографической стадии содержит монопегилированный эритропоэтин с повышенным относительным содержанием, т.е. массовая доля или процент от площади (хроматограммы эксклюзионной хроматографии собранного проточного буфера со второй ступени) монопегилированного эритропоэтина увеличились по сравнению с состоянием, предшествовавшим первой катионообменной хроматографической стадии. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения относительное содержание монопегилированного эритропоэтина составляет не менее 60% по площади. В другом варианте осуществления настоящего изобретения относительное содержание монопегилированного эритропоэтина составляет не менее 80% по площади.

Для дальнейшей очистки монопегилированного эритропоэтина осуществляют вторую катионообменную хроматографическую стадию. На второй катионообменной хроматографической стадии собранный и разбавленный проточный буфер со второй ступени элюирования приводят к концентрации фосфата калия около 100 мМ и рН около 3,0 и вводят его во вторую катионообменную хроматографическую колонку, содержащую катионит того же типа, что и первая катионообменная хроматографическая колонка. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения вторая катионообменная колонка и содержащийся в ней катионит являются теми же самыми, что и на первой катионообменной хроматографической стадии. Монопегилированный эритропоэтин выделяют из второй катионообменной хроматографической колонки посредством приложения линейного градиента, начиная от калий-фосфатного буфера с концентрацией около 100 мМ, содержащего около 50 мМ хлорида натрия при рН около 3,0, и заканчивая калий-фосфатным буфером с концентрацией около 100 мМ, содержащим около 500 мМ хлорида натрия при рН около 3,0. Концентрация хлорида натрия изменяется линейно в продолжение пропускания объема элюента, равного десяти объемам колонки. Проточный буфер разделяют на фракции и разбавляют каждую фракцию 1 М раствором моногидрофосфата калия с целью повышения величины рН до приблизительно 6-8. Пример хроматограммы представлен на фигуре 3.

После второй катионообменной хроматографической стадии монопегилированный эритропоэтин получают в форме, являющейся в существенной степени гомогенной, причем в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения - с чистотой не менее 95% по площади.

Специалист в соответствующей области должен быть знаком с методологией ионообменной хроматографии. На стадии выделения полипептида, связанного с катионитом, ионную силу, т.е. проводимость, буфера/раствора, протекающего через ионообменную колонку, повышают. Это может быть осуществлено либо с помощью увеличения концентрации буферной соли, либо посредством добавления других солей, так называемых элюирующих солей, к буферному раствору. В зависимости от способа элюирования концентрацию буфера/соли повышают скачкообразно (способ ступенчатого элюирования) или непрерывно (способ непрерывного элюирования) посредством добавления частями концентрированного буфера или раствора элюирующей соли. Предпочтительными элюирующими солями являются цитрат натрия, хлорид натрия, сульфат натрия, фосфат натрия, хлорид калия, сульфат калия, фосфат калия, или иные соли лимонной кислоты или фосфорной кислоты, или любые смеси этих компонентов. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения элюирующая соль является цитратом натрия, хлоридом натрия, хлоридом калия или их смесями.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения катионит является сильным катионитом, таким как, предпочтительно, Тойоперл® SP 650 М. Концентрация вызывающей элюирование соли находится, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения, в пределах от 5 мМ до 500 мМ, предпочтительно в пределах от 5 мМ до 400 мМ, более предпочтительно в пределах от 5 мМ до 250 мМ. В другом варианте осуществления настоящего изобретения вызывающая элюирование соль используется в то же самое время и в качестве буферного вещества, как-то, например, лимонная кислота или ее соли или фосфорная кислота или ее соли.

Монопегилированный эритропоэтин может применяться в пригодных для инъекций фармацевтических композициях с фармацевтически приемлемым носителем или основой с помощью известных в соответствующей области способов. Например, подходящие композиции описаны в международных заявках на изобретение WO 97/09996, WO 97/40850, WO 98/58660 и WO 99/07401. Среди предпочтительных фармацевтически приемлемых носителей для изготовления препаратов продуктов по настоящему изобретению можно упомянуть человеческий сывороточный альбумин, белки плазмы крови человека и т.п. Соединения по настоящему изобретению могут быть введены в препарат в 10 мМ калий/натрий-фосфатного буфера при рН 7, содержащего средство для поддержания тоничности, например 132 мМ хлорида натрия. Фармацевтическая композиция может необязательно содержать консервант. Фармацевтическая композиция может содержать различные количества монопегилированного эритропоэтина, например 10-1000 мкг/мл, например 50 мкг или 400 мкг.

Введение эритропоэтиновых гликопротеидных продуктов по настоящему изобретению приводит к выработке у людей красных кровяных клеток. Так, введение монопегилированного эритропоэтинового гликопротеидного продукта пополняет количество данного эритропоэтинового белка, что является существенным для выработки красных кровяных клеток. Фармацевтические композиции, содержащие монопегилированные эритропоэтиновые гликопротеидные продукты, могут быть задействованы в препаратах с такой активностью, которая была бы эффективна при введении различными способами пациенту-человеку, страдающему гематологическими расстройствами, характеризуемыми низкой или нарушенной выработкой красных кровяных клеток, как самой по себе, так и в качестве составляющей состояния или заболевания. Фармацевтические композиции могут быть введены посредством инъекции, такой как подкожная или внутривенная инъекция. Средние количества монопегилированного эритропоэтинового гликопротеидного продукта могут варьироваться. Точное количество конъюгата является вопросом предпочтений, зависящих от таких факторов, как точный тип подвергаемого лечению состояния, состояние подвергаемого лечению пациента, а также другие составляющие композиции. Например, может вводиться, например, раз в неделю от 0,01 до 10 мкг на килограмм массы тела, предпочтительно от 0,1 до 1 мкг на килограмм массы тела.

Нижеследующие примеры, описания последовательностей и фигуры приводятся в качестве вспомогательного материала для понимания настоящего изобретения, истинный объем которого изложен далее в прилагаемой формуле изобретения. Следует понимать, что в описанные далее методики могут быть внесены модификации без отхода от духа изобретения.

Описание фигур

Фигура 1. ЭВЭЖХ смеси различным образом пегилированных производных эритропоэтина, включая отнесение пиков к веществам.

Фигура 2. Пример хроматограммы способа ступенчатого элюирования.

Фигура 3. Пример хроматограммы способа непрерывного элюирования.

Материалы и методы

ЭВЭЖХ

ЭВЭЖХ разделяет белки в соответствии с их средней молекулярной массой. Таким образом, данный метод способен обнаружить присутствие монопегилированного эритропоэтина, форм и фрагментов с низкой молекулярной массой, полипегилированных форм и высших агрегатов эритропоэтина. Установка ВЭЖХ оснащена детектором для длины волны 220 нм и колонкой Супероза 6 HR (размеры 10×300 мм, Pharmacia Biotech, номер по каталогу: 17-0537-01) или колонкой Супероза 6 10/300 GL (Pharmacia Biotech, номер по каталогу: 17-5172-01). Колонка работает в изократических условиях при комнатной температуре при объемной скорости элюирования около 0,4 мл/мин. Буфер подвижной фазы является 50 мМ натрий-фосфатным буфером, содержащим 300 мМ хлорида натрия при рН 6,8. В зависимости от используемой системы ВЭЖХ исследование данным методом может быть осуществлено при объеме вводимого образца 100 мкл или 500 мкл. Образцы разбавляют буфером подвижной фазы до концентрации белка около 0,5 мг/мл (загрузка 100 мкл) или 0,1 мг/мл (загрузка 500 мкл). Образцы с концентрацией белка менее 0,1 мг/мл могут использоваться в неразбавленном виде. Элюируемые белки регистрируются при длине волны детектора 220 нм.

Пример 1

Ферментация и очистка эритропоэтина

Эритропоэтин может быть получен согласно, например, международной заявке на изобретение WO 01/87329, а очищен так, как это описано в международной заявке на изобретение WO 96/135718.

Пример 2

Пегилирование эритропоэтина бифункциональными реагентами

а) Активация эритропоэтина

Указанные количества реагента, содержащего заблокированную тиольную группу, SATA (сукцинимидил-S-ацетилтиоацетат) или SATP (сукцинимидил-3(ацетилтио)пропионат), (растворенного в диметилсульфоксиде (ДМСО) при концентрации 10 мг/мл), добавляют к раствору бензил-защищенного эритропоэтина до 1 мл раствора белка концентрации 5 мг/мл в 10 мМ калий-фосфатном буфере с добавкой 50 мМ хлорида натрия при рН 7,3. Реакционную смесь перемешивают в течение около 30 минут (при температуре 25°С) и останавливают реакцию посредством добавления 1 М раствора лизина до конечной концентрации 10 мМ. Избытки SATA и SATP удаляют посредством диализа против 10 мМ калий-фосфатного буфера, содержащего 50 мМ хлорида натрия и 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТК) при рН 6,2. Ацетильную защитную группу удаляют с помощью гидроксиламина.

б) Пегилирование активированного эритропоэтина

380 мг метокси-ПЭГ-малеимида (молекулярная масса 30,000; Shearwater Polymers, Inc., Huntsville (Alabama, USA)) растворяют в растворе, содержащем 95 мг активированного эритропоэтина (4,5 мг/мл в 10 мМ калий-фосфатного буфера, содержащего 50 мМ хлорида натрия и 2 мМ ЭДТК, рН 6,2). Получаемое таким образом мольное соотношение между активированным эритропоэтином и метокси-ПЭГ-малеимидом в растворе составляет от 1:2 до 1:4. Посредством добавления к вышеописанному раствору 1 М водного раствора гидроксиламина до конечной концентрации 30 мМ (рН 6,2) приводит к деблокированию ковалентно связанных заблокированных тиольных групп в активированном эритропоэтине. Получаемый таким образом в реакционной смеси раствора активированный эритропоэтин содержит свободные тиольные группы (-SH). После деблокирования тиольных групп немедленно осуществляют реакцию сочетания между активированным эритропоэтином, содержащим теперь свободные тиольные группы (-SH), и метокси-ПЭГ-малеимидом в течение 90 минут (при перемешивании, при температуре 25°С). Реакцию сочетания останавливают посредством добавления к реакционной смеси 0,2 М водного раствора цистеина до конечной концентрации 2 мМ. По прошествии 30 минут избыток свободных тиольных групп непрореагировавшего с метокси-ПЭГ-малеимидом активированного эритропоэтина блокируют посредством добавления 0,5 М раствора N-метилмалеимида в ДМСО до достижения конечной концентрации 5 мМ. По прошествии 30 минут получаемая таким образом реакционная смесь, содержащая теперь пегилированный эритропоэтин, может быть подвергнута очистке.

Пример 3

Очистка монопегилированного эритропоэтина

а) Первая хроматографическая стадия на SP Тойоперл 650 М

Первую хроматографическую стадию очистки продукта осуществляют на сульфопропильной (СП) колонке, заполненной СП Тойоперл 650 М. Колонка функционирует при комнатной температуре. Максимальная емкость первой колонки определена как 1,5 г белка на литр колоночного объема. Колонку приводят в равновесие с 100 мМ калий-фосфатного буфера с рН от 2,9 до 3,1 (буфер СП-А). После стадии загрузки колонку промывают и осуществляют элюирование с помощью последовательности калий-фосфатных буферов, содержащих увеличивающиеся количества NaCl. Гидролизованный реагент ПЭГ и полипегилированные формы удаляют в проточной фракции, а также на следующем шаге промывания буфером СП-А и 100 мМ калий-фосфатным буфером, рН от 2,9 до 3,1, содержащим 90 мМ хлорида натрия (буфер СП-Б), соответственно.

Монопегилированный эритропоэтин элюируют с помощью 100 мМ калий-фосфатного буфера, рН от 2,9 до 3,1, содержащего 250 мМ хлорида натрия (буфер СП-В), собирают в сосуд и непосредственно разбавляют очищенной водой в соотношении 1:5. Этот собранный элюат именуют «СП элюатным пулом I».

После этого колонку промывают 100 мМ калий-фосфатного буфера, рН от 2,9 до 3,1, содержащего 750 нМ хлорида натрия (буфер СП-Г), с целью удаления непрореагировавшего эритропоэтина и регенерации колонки.

б) Вторая хроматографическая стадия на СП Тойоперл 650 М

Вторая колонка функционирует при комнатной температуре. После приведения ее в равновесие с буфером СП-А в колонку вводят СП элюатный пул I, после чего колонку промывают буфером СП-А. Монопегилированный эритропоэтин элюируют под действием линейного градиента с наклоном приблизительно от 50 до 500 мМ хлорида натрия на десять объемов колонки, забуференного 100 мМ калий-фосфатного буфера при рН от 2,9 до 3,1. Пик продукта разделяют на отдельные фракции числом до восьми и непосредственно разбавляют каждую фракцию 1 М раствором моногидрофосфата калия с целью увеличения рН до 6-8.

По окончании элюирования монопегилированного эритропоэтина наклон градиента может быть увеличен, что приводит к немедленному промыванию колонки 100 мМ калий-фосфатного буфера с рН от 2,9 до 3,1 содержащего 500 мМ хлорида натрия.

в) Регенерация колонок SP Тойоперл 650 М

Смолу из обеих колонок регенерируют с помощью семистадийной последовательности. Колонки промывают очищенной водой, а затем 0,5 М раствором гидроксида натрия. Щелочной раствор вытесняют очищенной водой, а затем осуществляют кислотное промывание (0,5 М дигидрофосфата натрия, 1 М фосфорной кислоты). После еще одной стадии с очищенной водой колонки депирогенизируют 0,5 М раствором гидроксида натрия в течение ≥4 часов. После щелочной регенерации колонки снова промывают очищенной водой. Сводка параметров колонок дана в таблице 1 и таблице 2.

Таблица 1
Параметры колонки на первой хроматографической стадии
Стадия Буферный раствор Объемов колонки Объемная скорость [л/мин]
Приведение в равновесие 100 ммоль/л фосфата калия, рН 2,9-3,1 (Буфер СП-А) ≥6 1,6-2,1
Загрузка колонки Разбавленная СП-А реакционная смесь (1:5) н.о. 1,6-2,1
Промывание СП-А 100 ммоль/л фосфата калия, рН 2,9-3,1 (Буфер СП-А) 2 1,6-2,1
Промывание СП-Б 100 ммоль/л фосфата калия, рН 2,9-3,1, 90 ммоль/л NaCl (Буфер СП-Б) 2-3 1,6-2,1
Элюирование СП-В 100 ммоль/л фосфата калия, рН 2,9-3,1, 250 ммоль/л NaCl (Буфер СП-В) 2-3 1,6-2,1
Промывание СП-Г 100 ммоль/л фосфата калия, рН 2,9-3,1, 750 ммоль/л NaCl (Буфер СП-Г) 2-3 1,6-2,1
Промывка Очищенная вода III ≥2 1,6-2,1
Щелочная регенерация колонки I 0,5 моль/л NaOH ≥2 1,6-2,1
Промывка Очищенная вода III ≥2 1,6-2,1
Кислотная регенерация колонки 1 моль/л фосфорной кислоты, 0,5 моль/л дигидрофосфата натрия ≥3 1,6-2,1
Промывка Очищенная вода III ≥2 1,6-2,1
Щелочная регенерация колонки II 0,5 моль/л NaOH ≥3 н.о.
Промывка Очищенная вода III ≥2 1,6-2,1
Таблица 2
Параметры колонки на второй хроматографической стадии
Стадия Буферный раствор Объемов колонки Объемная скорость [л/мин]
Приведение в равновесие 100 ммоль/л фосфата калия, рН 2,9-3,1 (Буфер СП-А) ≥6 1,6-2,1
Загрузка колонки СП элюатный пул I, разбавленный очищенной водой III (1:5) н.о. 1,6-2,1
Промывание СП-А 100 ммоль/л фосфата калия, рН 2,9-3,1 (Буфер СП-А) 2-3 1,6-2,1
Градиент и элюирование Градиент с наклоном 50-500 ммоль/л NaCl на десять объемов колонки от буфера СП-А к 100 ммоль/л фосфата калия и 500 ммоль/л NaCl, рН 2,9-3,1 (буфер SP-Д) 10 1,6-2,1
Промывка Очищенная вода III ≥2 1,6-2,1
Щелочная регенерация колонки I 0,5 моль/л NaOH ≥2 1,6-2,1
Промывка Очищенная вода III ≥2 1,6-2,1
Кислотная регенерация колонки 1 моль/л фосфорной кислоты, 0,5 моль/л дигидрофосфата натрия ≥3 1,6-2,1
Промывка Очищенная вода III ≥2 1,6-2,1
Щелочная регенерация колонки II 0,5 моль/л NaOH ≥3 н.о.
Промывка Очищенная вода III ≥2 1,6-2,1
н.о.: не определено

1. Способ очистки монопегилированного эритропоэтина, включающий стадии получения раствора, содержащего моно-, поли- и непегилированный эритропоэтин, осуществления двух последовательных катионообменных хроматографических стадий и выделения очищенного монопегилированного эритропоэтина на второй катионообменной хроматографической стадии, отличающийся тем, что на обеих катионообменных хроматографических стадиях используется одинаковый тип катионита, и тем, что две последовательные катионообменные хроматографические стадии осуществляют с использованием различных способов элюирования, в соответствии с которым две последовательные катионообменные хроматографические стадии включают следующие этапы:
а) введение забуференного водного раствора, содержащего смесь моно-, поли- и непегилированного эритропоэтина, а также форм с низкой молекулярной массой, в первую катионообменную хроматографическую колонку в условиях, подходящих для связывания упомянутого монопегилированного эритропоэтина с катионитом, содержащимся в указанной первой колонке,
б) выделение монопегилированного эритропоэтина из первой катионообменной хроматографической колонки с помощью способа ступенчатого элюирования со ступенчатым повышением ионной силы проточного буфера, где относительное содержание монопегилированного эритропоэтина в выделенном растворе повышено по сравнению с исходно введенной смесью,
в) введение выделенного монопегилированного эритропоэтина со стадии б) во вторую катионообменную хроматографическую колонку в условиях, подходящих для связывания упомянутого монопегилированного эритропоэтина с катионитом, содержащимся в указанной второй колонке, где катионит, содержащийся в таковой второй колонке, того же типа, что и катионит в первой колонке,
г) выделение очищенного монопегилированного эритропоэтина в форме, являющейся в существенной степени гомогенной, из упомянутой второй катионообменной хроматографической колонки с помощью способа непрерывного элюирования с непрерывным повышением ионной силы проточного буфера.

2. Способ согласно п.1, отличающийся тем, что упомянутый катионит является сульфопропильным катионитом.

3. Способ согласно п.1, отличающийся тем, что упомянутое ступенчатое повышение ионной силы на стадии б) способа является трехступенчатым повышением ионной силы.

4. Способ согласно п.3, отличающийся тем, что выделенный на стадии б) монопегилированный эритропоэтин выделяют на второй ступени способа ступенчатого элюирования.

5. Способ согласно п.4, отличающийся тем, что на упомянутой стадии б) полипегилированный эритропоэтин выделяют после первого повышения ионной силы проточного буфера, монопегилированный эритропоэтин выделяют после второго повышения ионной силы проточного буфера, а непегилированный эритропоэтин выделяют после третьего повышения ионной силы проточного буфера.

6. Способ согласно любому из пп.1-5, отличающийся тем, что разница концентраций, вызывающей элюирование соли на стадии б) способа ступенчатого элюирования, составляет 120% или более на каждой из ступеней способа ступенчатого элюирования.

7. Способ согласно любому из пп.1-5, отличающийся тем, что упомянутый забуференный водный раствор содержит фосфорную кислоту или ее соли, или лимонную кислоту или ее соли, или гистидин или его соли в качестве буферного вещества.

8. Способ согласно любому из пп.1-5, отличающийся тем, что на упомянутой стадии г) монопегилированный эритропоэтин выделяют из второй катионообменной хроматографической колонки под действием линейного градиента, начиная от калий-фосфатного буфера с концентрацией около 100 мМ, содержащего около 50 мМ хлорида натрия при рН около 3,0, и заканчивая калий-фосфатным буфером с концентрацией около 100 мМ, содержащего около 500 мМ хлорида натрия при рН около 3,0, где изменение концентрации хлорида натрия линейно в течение времени пропускания объема элюента, равного десяти объемам колонки.

9. Способ получения монопегилированного эритропоэтина, включающий следующие стадии:
а) пегилирование эритропоэтина,
б) очистку монопегилированного эритропоэтина с помощью двух последовательных катионообменных хроматографических стадий, где на первой и второй катионообменных хроматографических стадиях используется одинаковый тип катионита, эти последовательные стадии осуществляются с использованием различных способов элюирования и включают следующие этапы:
i) введение забуференного водного раствора, содержащего смесь моно-, поли- и непегилированного эритропоэтина, а также форм с низкой молекулярной массой в первую катионообменную хроматографическую колонку в условиях, подходящих для связывания упомянутого монопегилированного эритропоэтина с катионитом, содержащимся в указанной первой колонке,
ii) выделение монопегилированного эритропоэтина из первой катионообменной хроматографической колонки с помощью способа ступенчатого элюирования со ступенчатым повышением ионной силы проточного буфера, где относительное содержание монопегилированного эритропоэтина в выделенном растворе повышено по сравнению с исходно введенной смесью,
iii) введение выделенного монопегилированного эритропоэтина со стадии ii) во вторую катионообменную хроматографическую колонку в условиях, подходящих для связывания упомянутого монопегилированного эритропоэтина с катионитом, содержащимся в указанной второй колонке, где катионит, содержащийся в таковой второй колонке, того же типа, что и катионит в первой колонке,
в) выделение монопегилированного эритропоэтина из второй катионообменной хроматографической колонки в форме, являющейся в существенной степени гомогенной, с помощью способа непрерывного элюирования с непрерывным повышением ионной силы проточного буфера.

10. Способ согласно любому из пп.1-5 и 9, отличающийся тем, что второй катионит принадлежит к тому же типу, что и первый катионит, но не является той же самой его фракцией.

11. Способ согласно любому из пп.1-5 и 9, отличающийся тем, что упомянутый остаток ПЭГ характеризуется молекулярной массой 20-35 кДа в случае линейного ПЭГ и 40 кДа в случае разветвленного ПЭГ.

12. Способ согласно любому из пп.1-5 и 9, отличающийся тем, что упомянутый монопегилированный эритропоэтин получают в форме, являющейся в существенной степени гомогенной, содержащей более 95% по площади монопегилированного эритропоэтина по данным эксклюзионной ВЭЖХ.

13. Способ согласно любому из пп.1-5 и 9, отличающийся тем, что упомянутый монопегилированный эритропоэтин выделяют на первой катионообменной хроматографической стадии с чистотой более 60% по площади по данным эксклюзионной ВЭЖХ.

14. Способ согласно любому из пп.3-5 и 9, отличающийся тем, что упомянутый забуференный водный раствор содержит около 100 мМ калий-фосфатного буфера и характеризуется рН около 3,0.

15. Способ согласно любому из пп.1-5 и 9, отличающийся тем, что величина рН растворов на упомянутых хроматографических стадиях составляет около 3,0.

16. Способ согласно любому из пп.1-5 и 9, отличающийся тем, что соль, вызывающая элюирование пегилированного эритропоэтина из катионообменных хроматографических колонок, является цитратом натрия, или хлоридом натрия, или хлоридом калия.

17. Способ согласно любому из пп.1-5 и 9, отличающийся тем, что упомянутый эритропоэтин характеризуется аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1 или номером 2.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к биотехнологии и иммунологии и касается получения моноклональных антител (МкАт) к рекомбинантному эритропоэтину (ЭПО) человека с помощью гибридных культивируемых клеток (гибридом) животных.

Изобретение относится к биотехнологии и к иммунологии. .

Изобретение относится к области медицины и касается Fc-эритропоэтин слитого белка с улучшенной фармакокинетикой. .

Изобретение относится к биоорганической химии и касается нового конъюгата эритропоэтина, способа его получения и фармацевтической композиции на его основе. .

Изобретение относится к молекулярной биологии и может быть использовано в медицине. .

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения слитого белка с увеличенной эритропоэтиновой активностью. .

Изобретение относится к конъюгату гликопротеина эритропоэтина, который имеет по меньшей мере одну свободную аминогруппу и обладает биологической активностью in vivo, обусловливающей увеличение производства ретикулоцитов и эритроцитов клетками костного мозга, и который выбирают из группы, включающей человеческий эритропоэтин и его аналоги, которые имеют последовательность человеческого эритропоэтина, модифицированную добавлением от 1 до 6 сайтов гликозилирования или перегруппировкой по меньшей мере одного сайта гликозилирования.

Изобретение относится к слитому белку, обладающему in vivo повышенной активностью эритропоэтина. .

Изобретение относится к способам очистки белков. .

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу получения и очистки рекомбинантного гормона роста человека (рГРЧ). .

Изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии. .

Изобретение относится к области биохимии. .

Изобретение относится к области хроматографической очистки полипептидов. .

Изобретение относится к способу очистки циклического или нециклического пептида, выбранного из группы пептидов, включающей эптифибатид, эксенатид, атозибан и незиритид или их комбинацию, из смеси, содержащей по меньшей мере одну примесь, включающему контактирование указанной смеси с матрицей для ОФ-ВЭЖХ и матрицей для ионообменной хроматографии и получение очищенного пептидного продукта с чистотой по меньшей мере 96% и, предпочтительно, составляет, по меньшей мере, около 99%.

Изобретение относится к способу очистки циклического или нециклического пептида, выбранного из группы пептидов, включающей эптифибатид, эксенатид, атозибан и незиритид или их комбинацию, из смеси, содержащей по меньшей мере одну примесь, включающему контактирование указанной смеси с матрицей для ОФ-ВЭЖХ и матрицей для ионообменной хроматографии и получение очищенного пептидного продукта с чистотой по меньшей мере 96% и, предпочтительно, составляет, по меньшей мере, около 99%.
Наверх