Способ получения бруцеллезного l-антигена

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, иммунологии, биотехнологии, а именно к технологии получения антигена для диагностики бруцеллеза. Способ получения бруцеллезного L-антигена осуществляют следующим образом. Культивируют штамм Brucella abortus 19 в L-форме на плотной питательной среде, приготовленной на основе мясо-пептонного печеночного глюкозо-глицеринового агара (1,3-1,5% агара) с добавлением 10-15% нормальной лошадиной сыворотки и стрептомицина в дозе 2,5-5,0 ЕД/мл при 37-38°C в течение 4-5 суток. Затем полученную в L-форме культуру эмульгируют 0,5% фенолизированным физиологическим раствором, инактивируют взвесь при температуре 85-90°C в течение 60 минут, центрифугируют при 3000-5000 об/мин в течение 15-20 минут и устанавливают концентрацию бруцелл 50-60 млрд м.к., полученный антиген титруют, стандартизируют по специфичности и активности. Используют для реакции агглютинации в серологической диагностике бруцеллеза. Изобретение позволяет повысить эффективность и достоверность диагностики бруцеллеза на 20-25%. Изобретение может быть использовано для диагностики бруцеллеза у животных-бруцеллоносителей с персистенцией измененных L-форм возбудителя. 4 табл., 3 пр.

 

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, иммунологии, биотехнологии, а именно к технологии получения антигена для диагностики бруцеллеза.

Бруцеллы, как и многие другие возбудители инфекционных болезней, могут существовать в природе в S-, R- и L-формах, отличающихся друг от друга по морфологическим и биологическим свойствам, степени патогенности и специфичности антигенных детерминант [1, 2, 5, 6, 10, 11].

Существующие серологические методы диагностики позволяют выявить и идентифицировать бруцеллез, вызванный персистенцией возбудителя в типичной (S-) или диссоциированной (R-) форме и при этом не выявляют животных, инфицированных измененными L-формами бруцелл.

Известен способ получения антигена для диагностики бруцеллеза [7], согласно которому вакцинный штамм В.abortus 19 выращивают на плотной питательной среде, выросшую культуру смывают цитратным буфером с pH 5,3-5,5, бактериальные клетки инактивируют нагреванием, проводят ресуспендирование взвеси 12% раствором хлорида натрия до конечной концентрации 2×1010 КОЕ/мл, добавляют краситель метиленовый голубой и консервант фенол. Полученный антиген используют в реакциях агглютинации Райта и Хеддельсона для диагностики бруцеллеза. Однако данный диагностикум не позволяет выявить животных, инфицированных измененными L-формами бруцелл.

Известен способ изготовления единого бруцеллезного антигена для РА, РСК и РДСК, включающий культивирование штамма 19, концентрирование и очистку выросшей бакмассы с использованием 0,5% фенолизированного физиологического раствора и инактивацию антигена [8]. Однако данный диагностикум также не позволяет выявлять животных, инфицированных измененными L-формами бруцелл.

Известен «Способ получения диагностической сыворотки против бруцелл в L-форме», для получения которой использовали культуры из штамма В.abortus 19 в L-форме путем трансформации исходной типичной культуры вакцинного штамма Brucella abortus 19 (S-форма) культивированием на плотной питательной среде, приготовленной на основе мясо-пептонного печеночно-глюкозо-глицеринового агара (1,3-1,5%) (МППГТА) с добавлением нормальной лошадиной сыворотки 10-15% и стрептомицина в дозе 2,5-5,0 ЕД/мл среды при 37-38°C в течение 4-5 суток, антиген получают путем инактивации полученной культуры нагреванием при температуре 85-90°C в течение 60 мин, а гипериммунизацию кроликов осуществляют путем трехкратного внутривенного введения антигена в возрастающих дозах. [9]. Однако стабильная L-культура использовалась только для получения диагностической сыворотки против бруцелл, для бактериологической диагностики бруцеллеза.

Техническим результатом изобретения является повышение специфичности диагностикумов за счет получения бруцеллезного L-антигена: в комплексе серологических исследований при диагностике бруцеллеза.

Заявленный технический результат достигается тем, что бруцеллезный антиген получают следующим образом: штамм Brucella abortus 19 в L-форме культивируют на плотной питательной среде, приготовленной на основе мясо-пептонного печеночного глюкозо-глицеринового агара (1,3-1,5%) с добавлением 10-15% нормальной лошадиной сыворотки и стрептомицина в дозе 2,5-5,0 ЕД/мл, при 37-38°C в течение 4-5 суток, полученную в L-форме культуру эмульгируют 0,5% фенолизированным физиологическим раствором, инактивируют при 85-90°C в течение 60 минут, взвесь центрифугируют при 3000-5000 об/мин в течение 15-20 минут и устанавливают концентрацию бруцелл 50-60 млрд м.к., полученный антиген титруют, стандартизуют по специфичности и активности и используют для реакции агглютинации в серологической диагностике бруцеллеза.

Отличительным признаком предложенного способа является то, что в основе приготовления антигена лежит использование стабильной культуры Brucella abortus 19 в L-форме, для серологической диагностики бруцеллеза.

Предлагаемый бруцеллезный L-антиген обладает строгой специфичностью в отношении S, R, N-сывороток, диагностической активностью, может найти применение в комплексе серологических исследований при диагностике бруцеллеза.

Пример 1. Для получения бруцеллезного L-антигена используют стабильную культуру из штамма В.abortus 19 в L-форме, полученную путем трансформации исходной, типичной культуры вакцинного штамма В. abortus 19 (S-форма) за счет культивирования на плотной питательной среде, приготовленной на основе мясо-пептонного печеночного глюкозо-глицеринового агара (1,3-1,5% агара) (МППГТА) с добавлением нормальной лошадиной сыворотки 10-15% и стрептомицина в дозе 2,5-5,0 ЕД/мл при 37-38°C в течение 4-5 суток. В результате неоднократно проведенных исследований установлено, что образование L-форм происходит при воздействии на исходную клетку (S-форма) бруцелл стрептомицина в дозе 2,5-5,0 ЕД/мл среды. Меньшая концентрация антибиотика не вызывала образование L-форм бруцелл, а большая приводила к задержке роста и нередко к гибели культуры [1].

Таблица 1.
Получение L-культуры бруцелл в стабильном состоянии в опытах in vitro
Изучаемый штамм Доза стрептомицина (ЕД/мл среды)
0,1 0,25 0,5 1,0 2,5 5,0 10,0 20,0 40,0
В. abortus 19 S S S S L L O O O
Примечание: S - типичные S-формы возбудителя;
L - измененные L формы возбудителя;
О - отсутствие роста.

При высеве полученной L-культуры на плотных питательных средах образуются колонии округлой формы, уплощенные, гладкие с ровными краями, беловато-серого цвета. На бульоне рост сопровождается равномерным помутнением среды, с последующим просветлением и образованием на дне пробирки обильного рыхлого осадка белого цвета.

При микроскопии нативных мазков полученная L-культура представляла собой грамположительные гигантские клетки эллипсоидной формы (овоиды) размером 2,5-3,0×5,0-6,0 мкм.

L-форма В. abortus 19 в значительной степени утрачивает ригидную клеточную стенку. Она агглютинируется L- и не агглютинируется S- и R-бруцеллезными сыворотками. Дает положительную реакцию термоагглютинации и пробу с трипафлавином. Не выделяет сероводород. Хорошо растет на средах с тионином и фуксином. Характеризуется слабовирулентными свойствами [9].

Способ получения бруцеллезного L-антигена, осуществляется следующим образом: берут культуру из штамма Brucella abortus 19 в L-форме, культивируют на мясо-пептонный печеночного глюкозо-глицериновый агар (1,3-1,5% агара) с добавляем нормальной лошадиной сыворотки 10-15% и стрептомицина в дозе 2,5-5,0 ЕД/мл среды при 37-38°C в течение 4-5 суток. Выросшую бакмассу смывают с плотной питательной среды и эмульгируют 0,5% фенолизированным физраствором, для получения однородной консистенции, которую инактивируют при температуре 85-90°C в течение 60 минут, затем центрифугируют при 3000-5000 об/мин в течение 15-20 минут. Полученная концентрация микробных клеток высокая, и ее доводят до концентрации 50-60 млрд м.к. (по стандарту мутности ГИСКа им.Л.А.Тарасовича) в 0,5% фенолизированным физраствором.

Полученный антиген титруют в разведениях 1:10, 1:20, 1:40, 1:60, 1:75. Антиген признается годным для диагностических целей в разведении 1:20, который отрабатывали на гомологичных и гетерологичных сыворотках. Используют полученный антиген для реакции агглютинации в серологической диагностике бруцеллеза.

Пример 2. Специфичность L-антигена, проверяли в соответствующих серологических реакциях с применением S- и R-бруцеллезных сывороток из коммерческих диагностических наборов и негативной (N-) сыворотки крови здоровых животных. Антиген для реакции агглютинации (РА) из бруцелл в L-форме дает положительную реакцию только с L-бруцеллезными сыворотками (табл.2, 3, 4).

Таблица 2
Результаты реакции агглютинации (РА) L-бруцеллезного антигена с бруцеллезными (S-,R-) и негативной (N-) сыворотками
Разведение L-бруцеллезного антигена Наименования и разведения бруцеллезных сывороток
S- (1:10) R- (1:10) N- (1:10) L- (1:10)
1:10 отр отр отр ++++
1:20 отр отр отр ++++
1:40 отр отр отр ++++
1:60 отр отр отр ++
1:75 отр отр отр -

Из таблицы видно, что в перекрестных реакциях с гетерологичными (S- и R-) сыворотками получены отрицательные, а с гомологичными (L-) сыворотками - положительные результаты.

Таким образом, предлагаемый бруцеллезный L-антиген, обладает строгой специфичностью в отношении S, R и N сывороток и диагностической активностью. Рабочая концентрация микробных клеток L-антигена 50-60 млрд.

Пример 3. Производственное испытание бруцеллезного L-антигена проводили на поголовье северных оленей в стадах с различной эпизоотической характеристикой по бруцеллезу общей численностью 8232, в том числе в неблагополучных по бруцеллезу -1944 головы.

Специфичность L-антигена определяли на поголовье северных оленей, благополучных по бруцеллезу (табл.3).

Приведенные данные подтверждают, что антиген, полученный из L-культур, обладает специфичностью и проявляют диагностической активности в реакции агглютинации (РА) с сыворотками, не содержащими S, R, - L-антитела.

В очагах бруцеллезной инфекции находятся, как показали наши предыдущие бактериологические исследования [3, 4], животные - носители не только S, -R-, но и L-форм возбудителя, которые не регистрируются известными S, -R-антигенными диагностикумами, а дополнительно выявляются предлагаемым L-антигеном (табл.4).

Из таблицы видно, что из 1944 исследованных голов выявлено положительно реагирующих - 134 головы, что составило 6,9% от общего числа исследованных животных, в том числе известным S-антигеном выявлено 79,1% животных (106 голов), а предлагаемый L-антиген позволил дополнительно выявить 20,9% (28 голов) животных-бруцеллонисителей с персистенцией возбудителя в L-форме.

Таким образом, предлагаемый бруцеллезный L-антиген, используемый в реакции агглютинации (РА), обладает строгой специфичностью в отношении S-, R- и N сывороток, диагностической активностью, повышает эффективность и достоверность диагностики бруцеллеза на 20-25%. Может быть использован для диагностики бруцеллеза у животных-бруцеллоносителей с персистенцией измененных L-форм возбудителя.

Литератур

1. Базиков И.А., Бондаренко А.Н. Ультраструктурная организация L-форм бруцелл и культур ревертантов // ЖМЭИ. - 1991. №1. - С.17-20.

2. Бакулов И.А., Зеленцова Т.Я. Проблема L-форм бактерий в ветеринарии // Ветеринария. - 1980. №10. - С.23.

3. Гордиенко Л.Н., Братцев А.Ю., Бронников В.С, Попова Т.Г. Изменчивость возбудителя бруцеллеза в организме крупного рогатого скота // Актуальные вопросы ветеринарной медицины в современных условиях: Матер. Всероссийской науч. - практич. конф. - Пенза, 2003. - С.15-17.

4. Гордиенко Л.Н. Свойства измененных форм бруцелл. изолированных от северных оленей // Сельское хозяйство Севера на рубеже тысячелетий: Сб. науч. тр. ч.1. - Магадан, 2004. С.236-239.

5. Зыкин Л.Ф., Васильев Д.А. L-формы возбудителей зооантропонозов. - Ульяновск, 2000. 68 с.

6. Качесова Л.М. Результаты исследования на нестабильный (реверсивный) L-бруцеллезный бактериоз крупного рогатого скота в зонах благополучных и неблагополучных по бруцеллезу // Сб. науч. тр. ЛВИ, 1982. Вып. №72. - 56-60.

7. Патент RU 2133470 С, G01N 33/569, A61K 39/10, опубл. 20.07.1999.

8. Патент RU 2085212 C, A61K 39/10, G01N 33/569, C12N 1/20, опубл. 20.07.1999.

9. Патент RU №2268748, C2, A61K 39/40, C12N 1/20, G01N 33/531, опубл. 27.01.2006.

10. Ременцова М.М., Нифантьев В.М. Значение L-форм бруцелл в эпизоотическом процессе // Актуальные вопросы профилактики бруцеллеза и организация мед. помощи больным: тез. докл. Всесоюзной конференции. - Москва. 1989. - С.93-94.

11. Триленко П.А. МВБ и L-формы бруцелл // ЛВИ. - 19 71. Вып. №32. - С.35.

Способ получения бруцеллезного L-антигена, включающий культивирование штамма Brucella abortus 19 в L-форме на плотной питательной среде, приготовленной на основе мясо-пептонного печеночного глюкозо-глицеринового агара (1,3-1,5% агара) с добавлением 10-15% нормальной лошадиной сыворотки и стрептомицина в дозе 2,5-5,0 ЕД/мл при 37-38°C в течение 4-5 суток, инактивации при температуре 85-90°C в течение 60 мин, отличающийся тем, что полученную в L-форме культуру эмульгируют 0,5%-ным фенолизированным физиологическим раствором, центрифугируют при 3000-5000 об/мин в течение 15-20 мин и устанавливают концентрацию бруцелл 50-60 млрд м.к., полученный антиген титруют, стандартизируют по специфичности и активности и используют для реакции агглютинации в серологической диагностике бруцеллеза.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области медицины, в частности к микробиологии и иммунологии, и касается способа повышения иммуногенности антигенов возбудителя мелиоидоза - Burkholderia pseudomallei.

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии, а именно к способу получения липополисахарида (ЛПС) возбудителя чумы. .

Изобретение относится к областям микробиологии и иммунологии. .
Изобретение относится к медицине и касается универсальной вакцины для лечения и профилактики болезни Лайма для применения в ветеринарии, на основе цельноклеточной бактериальной вакцины или бактериальных лизатов или очищенных препаратов, включающая три наиболее патогенных геновида Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii и Borrelia garinii, каждый из которых содержит одновременно оба иммуногенных протективных белка наружной мембраны OspA и OspC.

Изобретение относится к вакцинным кандидатам Shigella из всех 4 основных серотипов, чьими первичными ослабляющими признаками являются делеция гена virG(icsA) и дополнительные делеции в двух или более генах setAB(shET1), senA(shET2), senB(shET2-2), stxAB и msbB2.

Изобретение относится к области биохимии. .

Изобретение относится к области биотехнологии и касается технологии получения иммуногенных сибиреязвенных антигенов - протективного антигена и белка ЕА1

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа получения препарата на основе вакцинного штамма чумного микроба. Представленное изобретение предусматривает изготовление посевной нативной культуры чумного микроба, концентрирование микробной суспензии, приготовление вакцинной взвеси и получение сухой формы препарата, при этом приготовление посевной культуры включает культивирование микробов в жидкой питательной среде в бутылях в течение 48 ч при температуре 26…28˚С и непрерывной аэрации не менее 10 л·мин-1 пассированной стабилизированной стартовой культурой, полученной в результате трех последовательных пассажей через организм морских свинок и смешанной в соотношении 2:1 со стабилизирующей глицерино-лактозо-полиглюкиновой жидкостью, при приготовлении вакцинной взвеси используют оптимизированную по компонентному составу защитную среду высушивания, а лиофилизацию проводят соблюдая определенный режим. Представленное решение позволяет получить продукт с повышенной активностью при сокращении продолжительности процесса его изготовления. 3 ил., 6 табл.
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения термолабильного энтеротоксина (ЛТ-энтеротоксина) и анатоксина Hafnia alvei при производстве вакцин. Штамм депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздравсоцразвития России под номером 294. Штамм обладает высокой способностью продуцировать термолабильный ЛТ-энтеротоксин. 1 табл., 2 пр.

Изобретение относится к ветеринарии и может быть использовано для профилактики инфекционного конъюнктиво-кератита крупного рогатого скота. Способ профилактики инфекционного конъюнктиво-кератита крупного рогатого скота включает вакцинацию вакциной ассоциированной против инфекционного конъюнктиво-кератита крупного рогатого скота на основе антигенов бактерий Moraxella bovis и герпесвируса типа I, при этом за 29-31 день до вакцинации животным вводят подкожно в область верхней трети шеи в дозе 0,045-0,055 мл/кг живой массы иммуностимулирующий препарат «Кероконвитин», полученный на основе цитотоксической сыворотки из крови лошадей-доноров путем гипериммунизации их антигеном, приготовленным из тканей глаз - конъюнктивы и роговицы крупного рогатого скота, переболевшего инфекционным конъюнктиво-кератитом. Ткани глаз крупного рогатого скота получают при забое животных. Изобретение позволяет на 40% по сравнению с использованием одной вакцины повысить эффективность профилактики инфекционного конъюнктиво-кератита крупного рогатого скота, обеспечивает более высокий иммунный статус организма животных. 3 табл., 1 пр., 2 ил.
Группа изобретений относится к медицине, а именно к ветеринарии, и может быть использована для применения композиции для защиты от инфекции, вызываемой Lawsonia intracellularis. Для этого применяют неживую композиции, содержащую углевод, который также обнаруживается в живых клетках Lawsonia intracellularis в ассоциации с наружной клеточной мембраной указанных клеток. Вакцина находится в форме, подходящей для внутримышечного введения, и включает в себя адъювант типа «масло в воде», содержащей капли масла со средним размером около 400 нм. Использованием данной неживой композиции приводит к эффективной иммунизации при внутримышечном введении с применением небольших капель адъюванта типа «масло в воде», что обеспечивает защиту животных от Lawsonia intracellularis. 2 н. и 5 з.п. ф-лы, 9 табл., 4 пр.
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при заживлении раневых повреждений кожного покрова. Ранозаживляющее средство представляет собой концентрат культуральной жидкости штамма Trichoderma harzianum Rifai, депонированного во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под № ВКПМ: F-180, в качестве продуцента L-лизин-альфа-оксидазы и может быть применен как ранозаживляющее средство при повреждении кожного покрова. Изобретение позволяет расширить арсенал средств, обеспечивающих заживление раневых повреждений кожи. 1 табл., 2 пр.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к выделенному полипептиду, который является биологической мишенью для ингибирования клетки-метанопродуцента, а также к выделенному полинуклеотиду, который кодирует этот полипептид. Раскрыты вектор экспрессии и клонирующий вектор, содержащие этот полинуклеотид, и клетки-хозяева, содержащие указанный вектор экспрессии. Описаны молекула-конъюгат или слитая молекула для ингибирования клетки-метанопродуцента, а также антитело или его функциональный фрагмент, которое связывается с вышеуказанным полипептидом. Изобретение также охватывает фармацевтическую композицию и способы ингибирования и идентификации клетки-метанопродуцента с использованием описанных молекулы-конъюгата или слитой молекулы и антитела или его фрагмента. Изобретение позволяет эффективно ингибировать клетки-метанопродуценты. 13 н. и 6 з.п. ф-лы, 9 ил., 6 пр.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к химерным или гибридным белкам для индуцирования иммунного ответа против Р. gingivalis. Раскрыта композиция для индуцирования иммунного ответа против Р. gingivalis, содержащая эффективное количество одного из вышеуказанных химерных или гибридных белков, способ профилактики состояния или заболевания, связанного с Р. Gingivalis, и способ снижения частоты или тяжести состояния или заболевания, связанного с Р. gingivalis с их использованием. Также раскрыто применение вышеуказанных химерных или гибридных белков для определения антител к Р. gingivalis в биологическом образце. Изобретение позволяет эффективно индуцировать иммунный ответ против Р. gingivalis. 7 н. и 9 з.п. ф-лы, 7 ил., 4 табл., 22 пр.
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к технологии получения антигена для диагностики бруцеллеза. Способ получения бруцеллезного L-антигена осуществляют следующим образом. Культивируют штамм Brucella abortus 19 в L-форме на плотной питательной среде, приготовленной на основе мясо-пептонного печеночного глюкозо-глицеринового агара (1,3-1,5%) с добавлением 10-15% нормальной лошадиной сыворотки при 20-22°C в течение 2-3 суток. Полученную в L-форме культуру эмульгируют 0,5% фенолизированным физиологическим раствором, инактивируют при 85-90°C в течение 60 минут. Взвесь центрифугируют при 3000-5000 об/мин в течение 15-20 минут и устанавливают концентрацию бруцелл 50-60 млрд. м.к. Полученный антиген титруют, стандартизируют по специфичности и активности. Используют для реакции агглютинации в серологической диагностике бруцеллеза. Изобретение позволяет в сократить сроки приготовления антигена и увеличить выход бактериальной массы. 4 табл., 3 пр.

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, иммунологии, биотехнологии, а именно к технологии получения антигена для диагностики бруцеллеза

Наверх