Способ культивирования клеток человека и животных

Изобретение относится к области цитологии и биотехнологии. Предложен способ культивирования клеток человека и животных на питательной среде, содержащей сыворотку крови плодов буйволиц в объемном соотношении 5-7% сыворотки и 93-95% среды, с последующим инкубированием культур при 37°C в течение 3-5 суток до формирования монослоя. Изобретение может быть использовано для культивирования клеток в культуре. 2 пр.

 

Предлагаемое изобретение относится к биотехнологии и касается культивирования клеток человека и животных, необходимых для производства вирусных вакцин, диагностикумов, получения моноклональных антител, биологически активных веществ, проведения диагностических исследований.

Необходимым компонентом питательных сред является сыворотка крови, без которой большинство культур клеток тканей человека и животных не растет in vitro. Сыворотка способствует размножению клеток, обуславливает их длительное прикрепление к субстрату, а также выполняет целый ряд регуляторных функций.

Известны способы культивирования клеток человека и животных с использованием сыворотки крови крупного рогатого скота (Общая и частная вирусология / Под редакцией В.М. Жданова. М., 1982. том 1. С.479-484; Животная клетка в культуре/ Под редакцией Л.П. Дьяконова и В.И. Ситькова. М. «Компания Спутник». 2000. С.67-88; Подчерняева Р.Я., Хижникова Т.М., Ткаченко А.В., Поликарпова С.С. Использование отечественных сывороток различных видов животных для культивирования клеточных культур. Вирусы и вирусные заболевания. 1990. №18. С.89-91). Недостатками являются нестандартность, возможная контаминация вирусами и микоплазмами, содержание различных ингибиторов, задерживающих рост клеток и репродукцию вирусов.

Кроме того, одним из сдерживающих факторов в широком применении сыворотки крови крупного рогатого скота является наличие в ней антител ко многим возбудителям вирусных инфекций и, в первую очередь, таким, как парагрипп-3, инфекционный ринотрахеит, аденовирусная инфекция, вирусная диарея-болезнь слизистых оболочек, рота- и коронавирусные энтериты крупного рогатого скота. Наличие в сыворотке крови этих антител снижает результативность исследований в направлении адаптации штамма, выделения цитопатогенного вируса из патологического материала с целью постановки диагноза и, наконец, делает малоэффективным путь промышленного изготовления диагностических и вакцинных препаратов.

Для клеточной биотехнологии также предложены: - сыворотка крови северных оленей, - плодов крупного рогатого скота (ТУ 10-07-275-85; Гуненков ВВ., Сухарев О.И., Сирота В.Ф. Свойства сыворотки крови северных оленей и результаты применения ее в вирусологии и биотехнологии. Вопросы вирусологии. 2003. №6. С.37-41; Баландин И.Г., Извекова А.В., Шторм Г.Г., Пугачева М.И. Методы получения, стерилизации и контроля сыворотки крови плодов крупного рогатого скота. Бюллетень ВИЭВ. 1983. Вып.49. С.42-45; Хаертынов К.С., Дьяконов Л.П., Винтер В.Г., Белова М.М. Фетальная сыворотка крови крупного рогатого скота. Ветеринария. 1990. №3. С.62-63).

Все эти сыворотки выпускаются в ограниченных количествах и полностью не удовлетворяют потребностей биотехнологии и вирусологии. Поэтому необходимы дальнейшие изыскания новых источников получения качественной и высокоактивной сыворотки крови для выращивания культур клеток.

Целью данного изобретения является повышение пролиферативной активности клеток за счет улучшения ростовых и адгезивных свойств питательной среды.

Пример 1. Культивирование клеток эпидермоидной карциномы гортани человека (НЕр-2).

Во флакон со средой Игла+199 (смесь равных количеств среды Игла и среды 199) после добавления антибиотиков, из расчета: пенициллин - 100 ед./мл, стрептомицин - 100 мкг/мл, пипеткой вносят сыворотку крови плодов буйволиц, в следующем объемном соотношении компонентов, %: среда - 95; сыворотка 5. Клетки НЕр-2 суспендируют в приготовленной таким образом среде, доводя их концентрацию до 100000 кл./мл. По 10 мл суспензии клеток пипеткой, при соблюдении условий асептики, вносят в культуральные флаконы, с рабочей поверхностью 20 см2. Флаконы помещают в термостат при 37°С. Через 3-4 суток культивирования формируется монослой клеток с типичной морфологией.

На вторые-третьи сутки культивирования клетки НЕр-2, выращиваемые с фетальной сывороткой, образовали сплошной монослой, тогда как с сывороткой крови крупного рогатого скота формирование монослоя отставало.

Процент адгезии через 4 ч при использовании питательной среды с экспериментальными сыворотками плодов буйволиц серий 1, 2 и 3 составил 8,8; 8,9 и 8,7 соответственно, в то время как в контроле он равнялся 6,3 (при посевной дозе клеток 100000 кл./мл). Высокий процент прикрепления клеток к стенке флаконов наблюдался через 14 часов культивирования: в экспериментальной сыворотке - 36,2; 38,5 и 37,7, в контрольной сыворотке - 33,8, соответственно.

Пример 2. Культивирование перевиваемой линии клеток легкого эмбриона коровы (ЛЭК).

Во флаконы с питательной средой Игла после добавления антибиотиков, из расчета: пенициллин - 100 ед./мл, стрептомицин - 100 мкг/мл, пипеткой вносят сыворотку крови плода буйволицы, в следующем объемном соотношении компонентов, об., %: среда - 93; сыворотка - 7. Клетки ЛЭК суспендируют в приготовленной таким образом среде, доводя их концентрацию до 150000 кл./мл. По 10 мл суспензии клеток пипеткой, при соблюдении условий асептики, вносят во флаконы, с рабочей поверхностью 20 см2. Флаконы помещают в термостат при 37°C. Через 2-3 суток культивирования формируется монослой клеток с типичной морфологией.

На вторые сутки культивирования клетки ЛЭК, выращиваемые в среде с сывороткой крови плодов буйволиц, размножались интенсивно и формировали крупноочаговый монослой, тогда как в среде с сывороткой крови крупного рогатого скота число делящихся клеток на одно поле зрения было меньше.

Индекс пролиферации при использовании сыворотки крови плодов буйволиц в 3 сериях составил 2,8; 3,4 и 3,6, в среднем - 3,27±0,24, по сравнению с 2,8, при использовании бифабричной сыворотки крови крупного рогатого скота (при посевной дозе 150000 кл./мл). Жизнеспособность клеток колебалась от 74 до 100%.

Питательные среды (Игла, 199), содержащие сыворотку крови плодов буйволиц, обеспечивают достаточно высокую адгезивную, митотическую и пролиферативную активность, в концентрации 5-7% перевиваемых линий клеток НЕр-2 и ЛЭК.

Предлагаемый нами способ позволяет значительно удешевить процесс культивирования клеток и обеспечить получение на клеточных субстратах различных биологически активных веществ.

Список использованной литературы

1. Баландин И.Г., Извекова А.В., Шторм Г.Г., Пугачева М.И. Методы получения, стерилизации и контроля сыворотки крови плодов крупного рогатого скота. Бюллетень ВИЭВ. 1983. Вып.49. С.42-45.

2. Бердникова З.Е., Петручук Е.М., Шалунова Н.В., Ночевный В.Т. Методические указания «Контроль сыворотки крови крупного рогатого скота на отсутствие вирусов-контаминантов и микоплазм». Утверждены Минздравом СССР 1988 г. М.: 1988. 18 с.

3. Гуненков В.В., Сухарев О.И., Сирота В.Ф. Свойства сыворотки крови северных оленей и результаты применения ее в вирусологии и биотехнологии. Вопросы вирусологии. 2003. №6. С.37-41.

4. Животная клетка в культуре (Методы и применение в биотехнологии) / Под редакцией Л.П. Дьяконова и В.И. Ситькова. М. «Компания Спутник». 2000. С.67-88.

5. Михайлова Г.Р., Подчерняева Р.Я. Изучение ростстимулирующей активности отечественных сывороток различных видов животных. Вопросы вирусологии. 1990. №5. С.426-429.

6. Общая и частная вирусология/ Под редакцией В.М.Жданова. М., 1982. том 1. С.479-484.

7. Подчерняева Р.Я., Хижникова Т.М., Ткаченко А.В., Поликарпова С.С. Использование отечественных сывороток различных видов животных для культивирования клеточных культур. Вирусы и вирусные заболевания. 1990. №18. С.89-91.

8. Хаертынов К.С., Дьяконов Л.П., Винтер В.Г., Белова М.М. Фетальная сыворотка крови крупного рогатого скота. Ветеринария. 1990. №3. С.62-63.

Способ культивирования клеток животных, в том числе человека, путем засева клеточной суспензии на питательную среду, дополнительно содержащую сыворотку крови животных, с последующим инкубированием культур при 37°C в течение 3-5 суток до формирования монослоя, отличающийся тем, что культивирование осуществляют в присутствии сыворотки крови плодов буйволиц, при следующем объемном соотношении компонентов, об.%:

Синтетическая питательная среда 93-95
Сыворотка крови плодов буйволиц 5-7



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области ветеринарии и клеточных технологий. Предложен способ лечения экспериментального туберкулеза легких у мышей с использованием трансплантации стволовых клеток путем введения в хвостовую вену мышей один раз в неделю суспензии стволовых клеток, выделенных из костей мышей гибридов, резистентных к туберкулезу, с генотипом "k" в области H-2E.

Настоящее изобретение относится к биохимии и представляет собой средство для стимуляции синтеза белков теплового шока HSP 70 в клетках человека и животных. Средство включает, по меньшей мере, одно фенольное соединение из группы производных коричной кислоты или смесь таких соединений и неионогенное поверхностно активное вещество или смесь таких веществ в количестве не менее 75 весовых %.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению популяции Tr1 клеток человека, направленных против пищевого антигена из обычного рациона человека, и может быть использовано в медицине.
Изобретение относится к области ветеринарной биотехнологии, в частности к получению перевиваемых линий клеток. Постоянная линия клеток получена из ткани гонад радужной форели путем длительного пассирования на среде Игла MEM на солях Эрла с 25 мМ HEPES с 10% эмбриональной сыворотки.

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу динамической оценки состояния реципиента после трансплантации трупной печени. Сущность способа состоит в том, что проводят одновременное определение в периферической крови пациента процентного содержания циркулирующих стволовых гемопоэтических клеток CD34+ (СГК) и объемного содержания лимфоцитов (Лф, млн/мл), находят их индивидуальное отношение R по формуле R=ЛФ/СГК и строят кривую степенной зависимости R (ось ординат) от СГК (ось абсцисс), используя ее затем в качестве калибровочной кривой в системе двойных логарифмических координат, а для оценки состояния реципиента в текущий момент в его периферической крови определяют ЛФ и СГК, находят их отношение Rp, положение его в калибровочной системе координат.

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ стимулирования экспансии гематопоэтических стволовых клеток (HSC) in vitro или in vivo.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для продукции фактора роста эндотелия сосудов человека - белка VEGF-A165 с тремя DED-эпитопами (3×DED-эпитопоп) на С-конце белка, которые не влияют на его биологическую активность и позволяют проводить очистку белка.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу оценки степени пролиферации лимфоцитов с помощью маркерных генов методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР РВ).

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению популяции Tr1-клеток, направленных против антигена, ассоциированного с рассеянным склерозом, и может быть использовано в медицине.
Изобретение относится к области биотехнологии и ветеринарной вирусологии. Предложен способ получения эпителиоподобных клеток легкого плода буйволицы путем длительного беспересевного культивирования, обладающих высокой чувствительностью к вирусу инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, парагриппа-3, вирусной диареи - болезни слизистых оболочек и аденовирусной инфекции. Изобретение может быть использовано при диагностике вирусных инфекций. 4 пр.
Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ выделения стволовых клеток, включающий центрифугирование гепаринизированного костного мозга с гидроксиэтилкрахмалом в соотношении исходных ингредиентов 1:2 со скоростью 700g в течение 15 мин в замкнутой системе трех гематологических контейнеров, соединенных между собой трубками, с последующим удалением примесей жира и плазмы в контейнер №1, перевод мононуклеарной фракции костного мозга, части супернатанта и эритроцитов, примыкающих к линии разделения двух сред, в контейнер №2, при этом в основном контейнере остаются сладжированные эритроциты и костные фрагменты, центрифугирование полученного образца со скоростью 900g в течение 15 мин в контейнере №2 для получения клеточного материала для внутрисосудистого введения, при этом после упомянутого центрифугирования удаляют часть супернатанта в контейнер №1 без разгерметизации системы. Благодаря получению паракринного эффекта мононуклеаров костного мозга и обеспечению безопасности способ может быть использован в медицине для внутрисосудистого введения полученного клеточного материала, а также в регенераторной терапии в области кардиологии, в частности, с целью внутрисосудистого введения для регенерации органа. 1 табл., 2 пр.

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к экспериментальной иммунологии, и может быть использовано в медицине. Способ модификации моноцитов периферической крови включает выделение фракции периферических мононуклеарных клеток (МНК) из венозной крови, которое проводят с использованием двойного градиента плотности перколла: 1,064 г/мл и 1,032 г/мл соответственно, при комнатной температуре +20°C. После этого выделенные моноциты помещают в полную питательную культуральную среду для адгезии к пластику. Затем по истечении 2 часов осуществляют замену полной питательной культуральной среды с добавлением 20 нг/мл IL4 и 20 нг/мл GM-CSF. При этом модификацию моноцитов осуществляют путем стимуляции негидролизируемым аналогом аденозина NECA (5'-N-этилкарбоксамидоаденозина) в концентрации 100 µМ при инкубации клеток в CO2-инкубаторе во влажной атмосфере 5% CO2 при +37°C в течение 72 часов. Изобретение позволяет провести модификацию клеток периферической крови с целью повышения их репаративного потенциала при аутологической трансплантации. 8 ил., 1 пр.

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложены пептиды, представляющие собой Т-клеточные эпитопы эндотелиального маркера опухоли (ТЕМ8), которые способны индуцировать цитотоксические Т-лимфоциты (CTL) в присутствии антиген-презентирующих клеток или экзосом, несущих или содержащих HLA-A*0201. Предложена фармацевтическая композиция для уничтожения клеток, экспрессирующих ТЕМ8, выделенные экзосома и антиген-презентирующая клетка, несущие комплекс, содержащий пептид по изобретению с молекулой HLA-A*0201. Рассмотрены способы индукции антиген-презентирующей клетки, которые могут индуцировать CTL, которые уничтожают клетки, экспрессирующие ТЕМ8, и индукции цитотоксических клеток. Предложенное изобретение может найти дальнейшее применение в лечении рака. 8 н. и 2 з.п. ф-лы, 5 ил., 3 табл.

Настоящее изобретение относится к медицине и касается способа культивирования клеток пульпы зуба без нарушения функции, присущей клеткам пульпы зуба в живом организме, и способа транспортировки удаленного зуба для хранения. Способ забора клеток пульпы зуба включает: нанесение прямолинейной риски на поверхность удаленного зуба, раскол удаленного зуба по риске, и обнажение пульпы зуба, и замачивание удаленного зуба в среде, и перенос замоченного зуба при поддержании при подходящей для хранения клеток температуре. Изобретение обеспечивает транспортировку удаленного зуба для культивирования и консервации клеток пульпы зуба. 5 з.п. ф-лы, 1 пр., 5 ил., 2 табл.

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Предложен способ оценки морфофункционального состояния индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) больных паркинсонизмом путем проведения их дифференцировки в дофаминергические нейроны, для чего воздействуют на ИПСК факторами, индуцирующими их дифференцировку в дофаминергические нейроны, а затем высаживают их на мультиэлектродную матрицу, обработанную опорным субстратом матригель/фибронектин, после чего, начиная с 3-5 дня вплоть до 8-10 дня, проводят динамическую регистрацию сетевой спонтанной биоэлектрической активности и при наличие к 3-5 дню сетевой спонтанной биоэлектрической активности в виде одиночных спайков, а к 8-10 дню упорядоченной пачечной спайковой активности на сформированном на микроэлектродах монослое оценивают морфофункциональное состояние как нейрональную направленность дифференцировки ИПСК в дофаминергические нейроны. Изобретение может быть использовано для характеристики репрограммированных клеточных линий больных паркинсонизмом и проверки их способности дифференцироваться в определенный фенотип нейронов в целях транспланталогии и при тестировании лекарств. 1 з.п. ф-лы, 4 ил, 1 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии и генной инженерии. Предложен способ получения вектора экспрессии, кодирующего адаптированную рекомбиназу. Указанная адаптированная рекомбиназа рекомбинирует асимметричные участки-мишени в LTR провирусной ДНК ретровируса, встроенного в геном клетки-хозяина, и пригодна в качестве средства для вырезания провируса из генома клетки-хозяина. Настоящее изобретение дополнительно относится к способу оптимизации лечения ретровирусной инфекции у индивида in vitro и к использованию адаптированных рекомбиназ для получения фармацевтических композиций для снижения вирусной нагрузки у индивида, инфицированного ретровирусом. 11 н. и 10 з.п. ф-лы, 11 ил., 1 табл., 4 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению вакцин против рака, и может быть использовано в медицине. Выделенный пептид, обладающий способностью индуцировать цитотоксический Т-лимфоцит (ЦТЛ) в присутствии антигенпрезентирующей клетки, несущей HLA-A*2402, используют для получения антигенпрезентирующих клеток и соответственно ЦТЛ. Полученные ЦТЛ используют для специфичного действия против раковых клеток, экспрессирующих CDCA1. Изобретение позволяет разработать эффективную вакцину для индукции противоопухолевого иммунитета у субъекта, у которого антиген HLA представляет собой HLA-A*2402. 13 н. и 3 з.п. ф-лы, 4 ил., 1 табл., 1 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии, биологии и медицины. Предложена клеточная линия huFSHIK - продуцент рекомбинантного человеческого фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), секретируемого в культуральную жидкость. В суспензионной культуре линия секретирует ФСГ в концентрации 18 МЕ/106 клеток в день. Настоящее изобретение оптимизирует систему экспрессии ФСГ, что приводит к увеличению его продукции и повышению эффективности и экономичности производства ФСГ в медицинских целях. 4 ил., 7 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложена композиция, применяемая для клеточной терапии. Композиция содержит плюрипотентные клетки млекопитающего и фармацевтически приемлемый носитель. Также раскрыт способ генерации перепрограммированной соматической клетки. Предложенная группа изобретений может быть использована в области клеточной терапии. 3 н. и 21 з.п. ф-лы, 5 ил., 6 табл., 3 пр.

Изобретение относится к области цитологии и биотехнологии. Предложен способ культивирования клеток человека и животных на питательной среде, содержащей сыворотку крови плодов буйволиц в объемном соотношении 5-7 сыворотки и 93-95 среды, с последующим инкубированием культур при 37°C в течение 3-5 суток до формирования монослоя. Изобретение может быть использовано для культивирования клеток в культуре. 2 пр.

Наверх