Способ выращивания колоний микробных клеток и устройство для его реализации



Способ выращивания колоний микробных клеток и устройство для его реализации
Способ выращивания колоний микробных клеток и устройство для его реализации
Способ выращивания колоний микробных клеток и устройство для его реализации
Способ выращивания колоний микробных клеток и устройство для его реализации
Способ выращивания колоний микробных клеток и устройство для его реализации
Способ выращивания колоний микробных клеток и устройство для его реализации
Способ выращивания колоний микробных клеток и устройство для его реализации
Способ выращивания колоний микробных клеток и устройство для его реализации
Способ выращивания колоний микробных клеток и устройство для его реализации
Способ выращивания колоний микробных клеток и устройство для его реализации
Способ выращивания колоний микробных клеток и устройство для его реализации
Способ выращивания колоний микробных клеток и устройство для его реализации
Способ выращивания колоний микробных клеток и устройство для его реализации
Способ выращивания колоний микробных клеток и устройство для его реализации

 


Владельцы патента RU 2522005:

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Санкт-Петербургский государственный электротехнический университет "ЛЭТИ" им. В.И. Ульянова (Ленина)" (RU)

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложен способ выращивания колоний микробных клеток на поверхности пористой пластины. Способ включает подачу питательного раствора снизу вверх через пористую пластину в зоны роста колоний микробных клеток на её верхней поверхности, подачу суспензии микробных клеток на верхнюю поверхность пористой пластины, создание контролируемых условий роста колоний, проведение наблюдения за ростом колоний, отсоединение выращенных колоний микробных клеток от зон роста и перенос их во внешние средства идентификации. Питательный раствор подают в зоны роста колоний микробных клеток путем создания перепада давления между входом и выходом отверстий. Отверстия выполнены в пластине из анодного оксида алюминия ортогонально ее большой плоскости и топологически кодированы. В них сформированы указанные зоны роста в виде пористых мембран. Пористые мембраны размещены вровень с верхней поверхностью пластины, либо с образованием лунки и не пропускают микробные клетки. После подачи питательного раствора подают суспензию микробных клеток заданной концентрации на верхнюю поверхность пластины до их равномерного распределения. На поверхности пластины между зонами роста сформирована пленка, которая препятствует прикреплению микробных клеток. Отсоединение выросших микроколоний от зон роста осуществляют путем гидроудара. Гидроудар направлен со стороны входа цилиндрических отверстий пластины и распространяется вдоль них и далее через поры пористых мембран с силой, не разрушающей микроколонии, но достаточной для их отрыва от зон роста. Также предложено устройство для выращивания колоний микробных клеток вышеуказанным способом. Техническим результатом является обеспечение условий автоматизации процессов подачи питательного раствора и процессов отделения, и переноса выросших колоний, возможность интегрирования в миниатюрные переносные приборы, и использование в лабораториях на чипе и обеспечения портативности устройства. 2 н. и 4 з.п. ф-лы, 14 ил., 4 табл., 2 пр.

 

Изобретения относятся к аналитическому приборостроению и могут быть использованы при исследовании жидких биологических и медицинских проб. Наиболее эффективно их использовать при микробиологической экспресс-диагностике, включая определение чувствительности бактерий к антибиотикам, в составе миниатюрных аналитических устройств - лабораторий на чипе для портативных систем микробиологического контроля.

Портативные системы микробиологического контроля с лабораториями на чипе могут работать в лабораторных и полевых условиях, и в соответствующих телеметрических системах. Система должна легко перенастраиваться для работы с различным клиническим материалом и поиска возбудителей различных групп инфекций: респираторных, желудочно-кишечного тракта, урогенитального тракта, внутрибольничных инфекций, оценки бактериальной обсемененности внешней среды.

Анализ микробиологических проб включает изолирование микробных клеток, накопление биомассы и идентификацию штаммов микробных клеток, определение их количества, а также определение их чувствительности к антибиотикам. Это необходимо для диагностики инфекционных бактериальных заболеваний и правильного назначения антибактериальной терапии. Данная проблема особенно актуальна в связи с ростом заболеваемости населения инфекционными бактериальными заболеваниями и увеличением числа устойчивых ко многим антибиотикам штаммов патогенных бактерий. В 2010 году число инфекционных и паразитарных заболеваний в России достигло 30069567 случаев (по данным Роспотребнадзора: /asset_publisher/N2qH/content/2). Традиционное микробиологическое исследование является трудоемким и, что более существенно, длительным (3-7 дней). Оно проводится только в специализированных учреждениях и, как правило, для стационарных больных. Создание миниатюрных мобильных устройств для экспресс-идентификации патогенов и определения их чувствительности к антибиотикам позволит правильно выбирать тактику лечения инфекционных заболеваний, повысить его эффективность, децентрализовать микробиологический анализ и сделать его доступным для всего населения, включая удаленные районы. Низкая стоимость и доступность проведения анализа позволят с его помощью улучшить лабораторную диагностику при инфекционных заболеваниях и повысить качество лечения.

Наиболее длительной (лимитирующей) стадией проведения культурального микробиологического анализа (наиболее достоверного способа диагностики при инфекционных заболеваниях) является накопление микроорганизмов на питательных средах. Именно эта стадия требует усовершенствования для повышения скорости анализа. Длительность этой стадии определяется необходимостью накопления видимых глазом колоний с явными визуальными характеристиками. После первичного инкубирования и накопления материал вручную отбирают для дальнейших исследований, а именно, идентификации, выделения и накопления чистой культуры патогена, постановки чувствительности к антибиотикам. Известны автоматические и полуавтоматические инструментальные способы микробиологического анализа, реализуемые с помощью стационарных приборов, однако они также являются длительными и требуют первичного накопления клеток. Сравнительные данные технико-эксплуатационных характеристик прибора с использованием заявляемого устройства и промышленных аналогов представлены в табл.1.

Известен полуавтоматический метод микробиологического анализа (табл.1, столбец 2), в котором используют посев биологических образцов в чашки Петри с питательной средой, инкубацию проб с целью накопления колоний микробных клеток, выделение отдельных колоний и проведение исследования их чувствительности к антибиотикам по методу Кирби-Баера. В данном методе многие операции проводятся вручную, что существенно снижает производительность метода. Применяется инкубатор высокой стоимости и габаритов, что делает метод принципиально не пригодным для работы в удаленных местах. Требуется большое количество расходных материалов. Метод не пригоден для автоматизации и не может выполнять техническую задачу, поставленную в данном изобретении.

Известный автоматический микробиологический анализатор «VITEK® 2 compact 60» (табл.1, столбец 3), разработанный фирмой bioMerieux SA (Франция), проводит автоматическую идентификацию вида патогенных микробных клеток и определение их чувствительности к антибиотикам на отдельных микробиологических карточках для каждого из этих типов анализов. Для работы требуется предварительное накопление и выделение штамма патогенной бактерии. Время анализа по данным производителя составляет до одних суток, а с учетом предварительного накопления патогенных микробных клеток двое и более суток. Прибор является стационарным и не приспособлен для работы в удаленных местах оказания помощи, в том числе в поликлиниках. Его высокая стоимость определяет необходимость размещения в крупных централизованных микробиологических лабораториях. В приборе не автоматизирована процедура предварительного накопления и сортировки микробных клеток с выделением штаммов патогенных или диагностически значимых микробных клеток. Таким образом, данный известный промышленный прибор не может достигать технических задач, поставленных в данном изобретении.

Достижения технологий микроэлектроники, микросистемной техники и принципы миниатюризации в инструментальном анализе открыли возможности развития нового поколения технических средств - микроаналитических систем, называемых также: µ-TAS, lab-on-a-chip (лаборатории на чипе), микрофлюидные системы и др. (Manz A., Graber N., Widmer Н.M. // Sensors and Actuators. 1990. B.1. P.244-248; Зимина Т.M. // Петербургский журнал электроники. 2000. №3-4. С.79). Представляя собой миниатюрные устройства, изготовленные с помощью планарных и гибридных технологий, микроаналитические системы предназначены для проведения различного рода химических анализов и биомедицинских испытаний. Такие системы позволяют повысить производительность при осуществлении биомедицинского и экологического анализа, изучении живых организмов. Разработка микроаналитических систем позволяет решать задачи снижения стоимости, материало - и энергоемкости изделий, повышать производительность анализа. Эти усовершенствования возможны благодаря формированию таких устройств с помощью микро- и нанотехнологий, позволяющих реализовывать прецизионную геометрию, обеспечивающую возможность геометрической комплементарности компонентов на молекулярном уровне, повышение скорости анализа без дополнительных затрат, управление массопереносом и автоматическое регулирование в микромасштабе стадий аналитического процесса в интегрированных функциональных модулях и подсистемах. Перенос биологических объектов в таких системах может осуществляться с помощью приемов проточного анализа, с использованием принципов микрофлюидики. Усовершенствование способов традиционного микробиологического анализа может быть осуществлено именно с использованием возможностей технологий микро- и наноэлектроники.

Известен способ выращивания культур клеток, в котором клетки выращивают в ростовом резервуаре, содержащем питательную среду, соединенном с резервуаром для питательной среды с образованием тангенциального потока в ростовом резервуаре с помощью средств контроля потока и внешнего насоса, мембрану, расположенную также тангенциально, в виде полых волокон или рамки с фильтром, обеспечивающую стерильный барьер для клеток, узел отбора выросших клеток с возможностью его открытия и закрытия, систему обеспечения массопереноса культур с возможностью изменения направления потока среды с помощью четырехходового крана, систему фильтрации в виде «стопки тарелок» и полых волокон, для отделения твердых примесей, средство замены питательной среды, средство концентрирования клеток, путем удаления лишней жидкости (US 6022742, C12M 1/36,2000).

Данный способ не предусматривает контролируемый рост индивидуальных микроколоний, прикрепленных к зонам роста с целью сокращения времени роста идентифицируемых микроколоний клеток, и не возможен их контролируемый перенос во внешние устройства для идентификации и сортировки колоний.

Известен способ выращивания биологических клеток, реализуемый в жидкой среде на платформе в микролунках, соединенных микроканалами, по которым поступают среды, обеспечивающие рост колоний. Микролунки и каналы сформированы в виде профиля, который после покрытия покровной пластиной образует микрокамеры и капилляры. Покровная пластина имеет отверстия для доступа в камеры. Камеры и каналы сформированы радиально на диске, который имеет возможность вращения для перемещения камер через апертуру оптического регистрирующего устройства для анализа колоний без нарушения их структуры в камерах (US 6632656 B1, C12M 3/06, C12Q 1/20,2003).

Данный способ не предусматривает возможность отрыва и переноса микроколоний для идентификации во внешние устройства с целью выделения колоний бактерий и их последующего накопления для исследования чувствительности к антибактериальным средствам.

Известны способы выращивания колоний, осуществляемые с помощью миниатюрных ячеек для роста клеток, сформированных с помощью нанесения пленок из полимеров и/или оксидов и фторидов металлов толщиной 0,01-0,2 мм и, затем, формирования путем частичного удаления пленок участков заданной геометрии, и со свойствами поверхности, обеспечивающими контроль за ростом клеток (JP 1141588, C12M 3/00, 1989; JP 7075547, C08F 120/28,20/26, C12M 1/00, 3/00, 5/07, 5/0783, 1993).

В указанных способах отсутствует возможность автоматического отрыва и переноса колоний в узел идентификации и сортировки во внешних устройствах с целью выделения колоний микробных клеток и тестирования их чувствительности к антибиотикам.

Более близким к заявляемому способу является способ культивирования и анализа индивидуальных культур клеток, в котором после предварительной очистки пробы, содержащей разнообразные клетки, клетки помещают в ростовые ячейки (или площадки) для проведения одновременного их роста при заданных условиях (влажность, температура, состав жидкой среды) с получением индивидуальных микроколоний. Способ осуществляется с применением ростовых ячеек, например, сформированных с помощью микротехнологий, очень малого размера, так, чтобы обеспечить рост индивидуальных клеток, размером, сопоставимым с размером ростовой зоны. В данном способе суспензию клеток помещают в ростовые зоны после разделения суспензии на отдельные объемы, достаточно малые, чтобы в дальнейшем обеспечить рост гомогенной культуры в каждом объеме, проводят их посев и инкубирование в отдельных микролунках, имеющих цилиндрическую форму, отделенных друг от друга на расстояние не менее 1,8 мм, а поверхность между ними покрыта водоотталкивающим слоем и является общей для всех «микрокультур» или индивидуальных микроколоний, причем по время инкубирования к культурам поступают необходимые питательные вещества через мембраны с размером пор 0,1×10-7÷4×1-6 ми толщиной 0,2×10-7÷10×10-6 (EP 1425384 (A2), C12M 1/00, 1/20, 1/26, 1/34; C12N 1/00, 1/02; 2002 г.).

Однако и в данном способе не решена задача быстрого отделения индивидуальных микроколоний и их переноса во внешние устройства идентификации и сортировки. Способ является сложным и не приспособлен для экспресс-анализа, а соответствующее устройство не может использоваться в портативном приборе из-за сложной конструкции и низкой прочности дозаторов, оно не предусматривает возможность выделения и идентификации патогенных штаммов, с целью их последующего накопления и исследования чувствительности к антибактериальным препаратам.

Наиболее близким по технической сущности к заявляемому способу - прототипом является способ представленный в статье Ingham, С.J., Sprenkels, A., Bomer, J., Molenaar, D., van den Berg, A., van Hylckama Vlieg, J.E.Т., de Vos, W.M. «The micro-Petri dish, a million-well growth chip for the culture and high-throughput screening of microorganisms» 04/46/18217.full.

Способ осуществляют на пористой пластине из анодного оксида алюминия, на поверхности которой сформированы специальные зоны для роста микроорганизмов, ограниченные стенками полимерной сетки, образованной способом ламинирования с последующей фотолитографией и плазменным травлением.

При реализации такого способа выращивания колоний микробных клеток питательный раствор подают путем просачивания за счет капиллярных сил через поры пластины из пористого анодного оксида алюминия, сопряженной со слоем агара. Далее вручную подают микробные клетки, распределяя их по зонам роста. Инкубируют в анаэробных условиях при 37°C, или иных заданных условиях, наблюдая за ростом колоний до необходимого размера с помощью микроскопа. После достижения достаточного размера, колонии микробных клеток отсоединяют от зон роста вручную, используя острую стерильную зубочистку, и также вручную осуществляют их перенос во внешние средства идентификации.

Основными недостатками прототипа способа является использование ручного труда при подаче клеток в зоны роста, а также при отсоединении выросших колоний и их переносе в средства идентификации и невозможность автоматизации процесса.

Задачей заявляемого способа является разработка способа выращивания колоний микробных клеток, позволяющего получить технический результат, заключающийся в создании условий для обеспечения автоматизации процесса выращивания, отрыва и переноса микроколоний, что обеспечивает возможность использования способа в лабораториях на чипе.

Сущность заявляемого способа заключается в том, что в способе выращивания колоний микробных клеток подача питательного раствора осуществляется снизу вверх через отверстия в пластине и, расположенные в них пористые мембраны, в зоны роста колоний микробных клеток, сформированные на пористых мембранах; подача микробных клеток осуществляется на верхнюю поверхность пластины до их равномерного распределения в зонах роста; обеспечивается создание условий для роста микроорганизмов в виде колоний в условиях контроля параметров среды (температуры, влажности, парциального давления кислорода и др.); проводится наблюдение за ростом колоний; осуществляется отрыв выращенных микроколоний микробных клеток от зон роста путем гидроудара и перенос их во внешние средства идентификации в потоке.

Существенными отличиями заявляемого способа являются соизмеримость зон роста и микроколоний, что предполагает выделение сразу чистой культуры микроорганизмов, возможность контроля подачи питательной среды, возможность контроля роста колоний in situ, возможность создания условий гидроудара с применением ударного давления на входе отверстий в пористой пластине для отрыва колоний от поверхности зон роста на пористой мембране, расположенной в отверстии, с целью их автоматического перемещения без механического повреждения микроколоний во внешние устройства для их дальнейшего исследования, а также возможность осуществления способа в лаборатории на чипе. Подача питательного раствора осуществляется за счет перепада давления при подаче раствора снизу верх, что позволяет контролировать процесс подачи раствора к зонам роста, а также автоматизировать его (например, подача насосом). Подача суспензии с помощью автоматизированных средств (насоса) позволяет равномерно распределять ее по поверхности. Нанесение гидрофобной пленки на поверхность пластины с отверстиями препятствует прикреплению к ней микроорганизмов, которые будут задерживаться зонами роста с повышенной концентрацией питательных веществ, подаваемых снизу. Благодаря регулируемой подаче питательного раствора в зоны роста обеспечивается рост колоний. При достижении благодаря делению размера порядка N=100-1000 клеток в колонии, микроколонии отделяются от зон роста для перенесения во внешние средства идентификации. Отрыв микроколоний в заявляемом методе проводится с помощью гидроудара. Создание режима гидроудара позволяет автоматизировать процесс отрыва колоний для их последующего переноса.

Известно переносное устройство для выращивания колоний клеток, в котором содержится кассета, с емкостью для роста клеток, контейнер для ростовой среды, контейнер для слива отходов, узел для сбора выросших колоний, соединенные в единое устройство, не связанное с внешней средой. Устройство может сопрягаться с различными внешними устройствами, например, узлом для перемешивания клеток, процессором, термостатом, узлом массопереноса, фильтрами для регулирования состава среды и узлом отбора и концентрирования клеток. Узел массопереноса в устройстве обеспечивает подачу среды, смену направления тангенциального ростовой поверхности потока для оптимизации роста клеток и повышения выхода культуры, а также подачу стерильной ростовой среды и удаления ингибирующих веществ (US 6096532, C12M 3/02,1997).

Данное устройство обеспечивает возможность автоматизации и оптимизации процесса роста и сбора клеток, но является сложным, громоздким и не предусматривает возможность автоматического перемещения отдельных микроколоний клеток во внешние устройства для их идентификации и дальнейшего определения их чувствительности к антибиотикам, т.е. не выполняет поставленную задачу. Описанное устройство не предназначено для интегрирования в лабораторию на чипе.

Известно устройство, в котором в качестве субстрата для роста штаммов клеток используется полупроницаемая мембрана, через поры которой поступает питательный раствор. Например, устройство для выращивания культур клеток и бактерий, которое помещается в чашку Петри, содержащую жидкость или питательный раствор, представляющее собой кольцо или рамку, на котором закреплена пористая решетка, покрытая пористой мембраной, так, чтобы ее нижняя поверхность находилась в полном контакте с жидкостью, а на верхнюю плоскость мембраны помещаются клетки, бактерии или иные организмы, которые получают питание из пор мембраны (GR 1003266 (B2), C12M 1/12, 3/06, 1997). Известно также устройство для анализа клеток, в котором микролунки изготовлены с помощью фоторезистивной пленки, толщиной 15-60 мкм, образующей стенки лунок (RU 2298798, G01N 33/546).

Данные устройства не обладают потенциалом автоматизации и возможностью отбора микроколоний, т.е. не могут быть использованы для получения в короткий срок чистой культуры микроорганизмов.

Известны устройства для выращивания колоний клеток, в которых содержится узел массопереноса, фильтры для регулирования состава среды и узел отбора и концентрирования клеток. Узел массопереноса в таких устройствах обеспечивает подачу среды для оптимизации роста клеток и повышения выхода культуры, а также подачу стерильной ростовой среды и удаления ингибирующих веществ (US 6022742, C12M 1/36, 1988; US 4885087, B01D 13/00, C12N 5/00, 1986; US 6127141, C12P 1/00, 1999; US 5240854, C12M 3/00, 1991; US 6096532, C12M 3/02, 1997; US 7320889 B2, C12M 1/08, 2004). Все эти устройства, обеспечивающие возможность автоматизации и оптимизации процесса роста клеток, являются сложными, громоздкими и не предусматривают возможность автоматического перемещения индивидуальных микроколоний клеток во внешние устройства для идентификации и определения чувствительности полученных культур к антибиотикам.

Наиболее близким к заявляемому является устройство, представленное в статье Ingham, С.J., Sprenkels, A., Bomer, J., Molenaar, D., van den Berg, A., van Hylckama Vlieg, J.E.Т., de Vos, W.M. «The micro-Petri dish, a million-well growth chip for the culture and high-throughput screening of microorganisms)) .

Устройство состоит из пористой пластины из анодного оксида алюминия, на поверхности которой сформирована сетка из полимерных перегородок, образующая зоны роста колоний с характерным размером от 7 до 200 мкм. Пористая пластина располагается на слое агара с питательным раствором в чашке Петри с достижением полного жидкостного контакта устройства с поверхностью агара для смачивания нижней поверхности пористой пластины.

Основными недостатками устройства прототипа является то, что оно не обеспечивает возможность автоматизации процесса культивирования и роста клеток, при работе с ним используется ручной труд при подаче клеток в зоны роста, а также при отсоединении выросших колоний и их переносе в средства идентификации и контроля с помощью микроскопа. Устройство проводит анализ с малой скоростью, не обладает портативностью, не обеспечивает возможность интегрирования в миниатюрные переносные приборы и использования в лабораториях на чипе

Задачей заявляемого изобретения является разработка устройства для осуществления способа выращивания колоний микробных клеток, позволяющего получить технический результат, заключающийся в обеспечении условий автоматизации процессов подачи питательного раствора и процессов отделения, и переноса выросших колоний, возможность интегрирования в миниатюрные переносные приборы, и использования в лабораториях на чипе и обеспечение портативности устройства.

Сущность заявляемого устройства заключается в том, что в устройстве для выращивания колоний микробных клеток, содержащем пористую пластину из анодного оксида алюминия со сформированными на ее верхней поверхности зонами роста колоний микробных клеток, нижняя поверхность которой сопряжена со средством подачи питательного раствора, пористая пластина из анодного оксида алюминия расположена в корпусе с образованием верхней и нижней емкостей корпуса, которые снабжены входом и выходом для жидких сред, а указанная пористая пластина из анодного оксида алюминия имеет отверстия цилиндрической формы, сформированные ортогонально ее большой плоскости пластины и топологически кодированные, при этом в каждом отверстии расположены пористые мембраны с порами, не пропускающими микробные клетки, верхняя поверхность корпуса выполнена с возможностью пропускания газов, но не проницаемой для влаги и частиц внешней среды, а также с возможностью наблюдения за ростом колоний. Зоны роста могут иметь вид либо площадки, при расположении пористой мембраны вровень с поверхностью пористой пластины из анодного оксида алюминия, либо лунки - при расположении пористой мембраны ниже уровня поверхности пластины. Поверхность пористой пластины из анодного оксида алюминия между зонами роста может иметь покрытие слоем материала, препятствующего прикреплению к нему клеток, например, металла, полимера, гидрофобного материала. Пористые мембраны могут быть изготовлены, например, из анодного оксида алюминия, керамики, полимера, металла. Крышка верхней емкости может быть снабжена центральным окном, с закрепленным в нем оптическим стеклом для наблюдения за ростом колоний. Крышка верхней емкости может быть снабжена двумя окнами, закрытыми полупроницаемыми мембранами, служащими для пропускания газов, но являющимися не проницаемыми для влаги и частиц внешней среды.

Образование зон роста в отверстиях пористой пластины путем размещения пористых мембран в них и наличия покрытия между зонами роста позволяет концентрированно и быстро выращивать колонии, без специальных средств ограничения зон роста (полимерная сетка в прототипе). Пористые мембраны в отверстиях исполняют роль барьеров, задерживающих клетки в зонах роста после подачи суспензии перед ростом колоний. Отверстия в пластине выполнены в виде цилиндров с гладкими стенками ортогонально большой плоскости пористой пластины и топологически кодированы, что позволяет усовершенствовать процесс манипулирования колониями и наблюдения за ходом их роста. Топологическое кодирование отверстий обеспечивает их заданное расположение в пористой пластине. Это позволяет упростить процесс наблюдения посредством камеры. Цилиндрическая форма отверстий и их ортогональное расположение обеспечивает снижение энергетических затрат для отрыва колоний при гидроударе. Гидроудар осуществляется по принципу «гидротарана», т.е. имеет стадию приобретения потоком жидкости достаточной линейной скорости в части устройства, которая служит разгонной камерой, и стадию резкого закрытия клапана с формированием фронта ударной волны, движущегося в противоположном начальному потоку жидкости направлению. Отверстия функционально исполняют роль сопел, которые определяют скорости потока его однородность. Применение нанотехнологий позволяет регулировать размер сопла и конфигурацию пористой мембраны, поддерживающей колонии микроорганизмов. Размер пор пористой мембраны, не пропускающих микробные клетки, обеспечивает стерильность нижней емкости, что обуславливает одноразовое использование устройства.

Изобретения поясняют следующие графические материалы и таблицы:

Фиг.1. Конструкция устройства.

Фиг.2. Сечение A отверстия в пластине с пористой мембраной.

Фиг.3. Пример устройства, выполненного в виде сэндвич структуры, для выращивания колоний микробных клеток.

Фиг.4. Фотографии фрагмента пористой пластины из анодного оксида алюминия и пористой мембраны.

а - с отверстиями и пористыми мембранами;

б - с колониями на пористых мембранах.

в - пористая мембрана.

Фиг.5-8. Фаза 1-Фаза 7 работы устройства.

Фиг.9. Временная диаграмма работы устройства.

Фиг.10. Сечение пластины с отверстием и пористой мембраной:

а - с микроколонией, прикрепленной к зоне роста;

б - с микроколонией в начальной стадии перемещения микроколонии во внешние устройства после отрыва от зоны роста.

Фиг.11. SEM фотография пористой мембраны из анодного оксида алюминия:

а - вид сверху, средний размер пор 105 нм, пористость φ=0,1;

б - скол;

в - вид сверху, средний размер пор 198 нм, пористость φ=0,71;

г - скол.

Фиг.12 Модель фрагмента пористой мембраны с клеткой, присоединенной к ее поверхности:

а - сечение вдоль оси пор;

б - вид сверху.

Фиг.13. Модель фрагмента пористой пластины с отверстиями и пористыми мембранами в них для гидравлического расчета.

Фиг.14. Вид Колонии Staphylococcus aureus после 2 часов роста на пористой пластине, содержащей порядка 800 колоний образующих единиц (КОЕ).

Таблица 1. Технико-эксплуатационные характеристики прибора с использованием заявляемого устройства и промышленных аналогов.

Таблица 2. Влияние концентрации микробных клеток (S.Aureus) в суспензии и размера зон роста пористой пластины на эффективность роста колоний.

Таблица 3. Влияние разбавления клинической пробы пациента с подозрением на S.Aureus на долю выросших колоний.

Таблица 4. Зависимость числа выросших (N0) и отделенных (Nd) от зон роста колоний от скорости потока (ν) в разгонной камере устройства для пластин с 400 зонами роста и различным диаметром (D) отверстий для суспензии с содержанием S.aureus 1·107 КОЕмл1.

Устройство состоит из (фиг.1) корпуса 1, разделенного перегородкой 2 с образованием двух емкостей 3 и 4. Корпус емкости 3 имеет отверстие 5, предназначенное для подачи питательного раствора, и сопряженный с ним обратный клапан 6, предназначенный для защиты насоса, присоединяемого к этому отверстию, от обратного потока питательной среды. Корпус емкости 4 имеет отверстие 7, предназначенное для подачи бактерий, снабженное клапаном 8. Верхняя поверхность корпуса 1, являющаяся крышкой емкости 4, снабжена двумя окнами 9, закрытыми полупроницаемыми мембранами 10 для доступа кислорода или иной газообразной среды, а также центральным окном 11, с закрепленным в нем оптическим стеклом 12 для наблюдения за ростом колоний микробных клеток. Наблюдение может проводиться с помощью видеокамеры, объектив 13 которой располагают над окном 11 с оптическим стеклом 12. В емкости 4 выполнено второе отверстие 14 для выхода выращенных колоний, в котором установлен клапан 15. В емкости 3 выполнено второе отверстие 16, в котором установлен клапан 17.

Перегородка 2 имеет центральное отверстие 18, в котором закреплена пластина 19 из пористого оксида алюминия, толщиной H. Пластина 19 имеет отверстия 20 (фиг.2), диаметром D, в каждом из которых расположены пористые мембраны 21, толщиной h. Отверстия 20 цилиндрической формы сформированы ортогонально большой плоскости пластины и являются топологически кодированными и могут быть химически модифицированными. Пористые мембраны 21, расположенные в отверстиях 20, имеют поры 22.

Возможно различное расположение пористых мембран 21 в отверстиях 20 пластины, например, на фиг.2 показано расположение ниже уровня поверхности пластины 19 с образованием в каждом отверстии лунки 23, глубиной a.

Поверхность пластины 19 между выходами отверстий покрыта слоем 24 из материала, препятствующего прикреплению к нему клеток.

Пример реализации конструкции устройства на основе толстопленочных технологий показан на фиг.3, где устройство представляет собой сэндвич-структуру. На базе 1-а, изготовленной из полимерной пластины, размещен слой 1-b, содержащий емкость 3 и сопряженные с ней отверстия 5(b) и 16(b), являющиеся входом и выходом для питательного раствора, выполненные методом лазерной абляции, на слое 1-b размещен слой 2, содержащий отверстие 18, радиус которого соответствует радиусу пористой пластины 19, изготовленной из анодного оксида алюминия, и отверстия 5 и 16, сопряженные с отверстиями 5(b) и 16(b), являющиеся входом и выходом для питательного раствора, соответственно. На слое 2 с пластиной 19 размещен слой 1(c), содержащий отверстие 4, образующее емкость 4 (фиг.1) с сопряженными с ним каналами, соединяющими отверстие 4 с отверстиями 5(c) и 16(c), для подачи суспензии микроорганизмов и вывода выросших колоний во внешние устройства, соответственно. На слое 1(c) расположен слой 1(d), содержащий отверстия 5(d) и 16(d), сопряженные с отверстиями 5, 5(b, с) и 16, 16(b, с), соответственно, образующие канал для подачи питательного раствора в емкость 3 и ее вывода, отверстия 7(d) и 14(d), сопряженные с отверстиями 7(c) b 14(c), соответственно, предназначенные для подачи суспензии микробных клеток в емкость 4 и выводу колоний во внешние устройства, а также отверстие с оптическим окном 11, 12. На слое 1(d) расположены клапаны 6 и 17, сопряженные с отверстиями 5(d) и 14(d), предназначенные для регулирования подачи питательного раствора, и клапаны 8 и 15, сопряженные с отверстиями 7(d) и 14(d), предназначенные для регулирования подачи суспензии микробных клеток и вывода выросших колоний. Пористая пластина 19, толщиной 80 мкм изготовлена из анодного оксида алюминия с образованием цилиндрических отверстий и расположенных в них пористых мембран, методом обратной фотолитографии и анодирования. Слой 2 устройства толщиной 80 мкм изготовлен из лавсановой пленки методом лазерной обработки. Слои 1(b) и 1(c) изготовлены из полихлорвиниловой пленки толщиной 400 мкм, методом лазерной обработки. Слои 1(a) и 1(d) изготовлены из экструзионной акриловой пленки толщиной 1 мм. Отверстия диаметром 1 мм выполнены механической обработкой. Клапаны 6 и 17 изготовлены с помощью прецизионного литья, а клапаны 8 и 15 изготовлены с помощью механической обработки поликарбоната. Герметизацию устройства осуществляли сжатием болтами в специально изготовленной рамке.

Пористая пластина 19 имеет топологически кодированные отверстия 20 (фиг.4-а), в которых расположены пористые мембраны 21 (фиг.4-б). Диапазон диаметров отверстий в пористой пластине составляет от 2 мкм до 20 мкм. На фиг.4-а представлена пористая пластина с диаметром отверстий 6 мкм. Колонии 24 растут на пористых мембранах 21 из анодного оксида алюминия, расположенных в отверстиях 20 (фиг.4-в). Пористые мембраны 21, сформированные из анодного оксида алюминия (фиг.4-в), характеризуются значениями пористости φ=Sмем/Sпор=0,1÷0,7, где Sмем - площадь мембраны, Sпор - площадь пор на поверхности мембраны.

Работа устройства состоит в следующем и имеет фазы:

Фаза 1, см. фиг.5-а.

- заполнение емкости 3 и через отверстия пластины из пористого анодного оксида алюминия 19 емкости 4 жидкой средой, например, питательным раствором с вытеснением воздуха из емкостей и пор. Насос Н1 создает поток питательной среды с объемной скоростью Q1, обратный клапан 6 и клапан 15 открыты, клапаны 8 и 17 закрыты;

Фаза 2, см. фиг.5-б.

- заполнение емкости 4 суспензией микробных клеток, клапаны 8 и 17 открыты, обратный клапан 6 и клапан 15 закрыты. Насос Н2 подает в емкость 4 поток суспензии микробных клеток с объемной скоростью Q2;

Фаза 3, см. фиг.6-а.

- промывка полости 3, обратный клапан 6 и клапан 17 открыты, клапаны 8 и 15 закрыты, насос H1 подает поток промывочного раствора в емкость 3 с высокой объемной скоростью потока Q3;

Фаза 4, см. фиг.6-б.

- рост колоний микробных клеток, обратный клапан 6 открыт, а клапаны 8, 15, 17 закрыты, насос H1 создает поток питательной среды в емкость 3 с малой объемной скоростью Q4, обеспечивающей подпитку зон роста в емкости 4;

Фаза 5, см. фиг.7-а.

- создание условий для возникновения гидроудара, обратный клапан 6 открыт, клапаны 15 и 17 открыты, клапан 8 закрыт, насос H1 создает поток питательной среды в емкости 3 с высокой объемной скоростью Q5;

Фаза 6, см. фиг.7-6.

- создание гидроудара, обратный клапан 6, клапаны 8 и 17 закрыты, клапан 15 открыт, ударная волна, создающая дополнительное давление Руд, проходя через питательную среду в емкости 3 и через отверстия и поры в пластине, отрывает выросшие колонии из зон роста.

Фаза 7, см фиг.8

- перенос выросших колоний микробных клеток во внешние устройства, обратный клапан 6 и клапаны 8 и 17 закрыты, насосы H1 и Н2 создают поток питательной среды с объемной скоростью Q6, обеспечивающей перенос выросших колоний микробных клеток во внешние устройства через клапан 15.

Временная диаграмма, представленная на фиг.9, иллюстрирует работу устройства, а именно состояние клапанов (закрыт - «0» или открыт - «1») 6, 8, 15 и 17, зависимость объемных скоростей потоков, создаваемых насосами H1 и Н2, состояние датчика (видеокамеры), зависимость давления Р в емкости 3 в режиме гидроудара от времени. На оси абсцисс выделены временные промежутки, соответствующие фазам работы устройства, Фаза 1-Фаза 7. На диаграмме (фиг.9) приняты следующие обозначения: Q1 - объемная скорость, создаваемая внешним насосом H1, обеспечивающим поток питательной среды для промывки емкостей 3 и 4, и переноса выросших колоний микробных клеток. Q2 - объемная скорость, создаваемая внешним насосом Н2, обеспечивающим поток суспензии микроорганизмов. Q3 - высокая объемная скорость потока, создаваемая насосом H1, обеспечивающим промывание камеры 3 и гидроудар. Q4 - малая объемная скорость, создаваемая насосом H1, обеспечивающим смачивание зон роста. Двк - датчик (видеокамера, см. фиг.1), обеспечивающий сигнал для начала работы насоса H1 в режиме гидроудара (ГУ) для отрыва выросших колоний. Р - давление в емкости 3.

Способ выращивания колоний микробных клеток осуществляют следующим образом. Для заполнения устройства питательной средой во время Фазы 1 (фиг.5-а) в емкость 3 подают питательный раствор с объемной скоростью потока Q1 с помощью, например, внешнего насоса H1. Насос Н1 обеспечивает давление, достаточное для протекания питательной среды через отверстия 20 пластины 19 и поры 22 мембраны 21, смачивания и дегазации емкостей 3 и 4. Во время Фазы 2 (фиг.5-б) подают суспензию микробных клеток определенной концентрации в емкость 4 с объемной скоростью Q2, например, с помощью внешнего насоса Н2, микрошприца или автоматической пипетки. Суспензию подают до ее равномерного распределения по поверхности пластины 19 (при необходимости удаления воздушного пузыря используют полупроницаемые мембраны 10 (фиг.1) или клапан 15, который временно открывают. За распределением питательного раствора ведут наблюдение через окно 11, с закрепленным в нем оптическим стеклом 12, над которым расположен объектив 13 видеокамеры. Затем перед началом роста в Фазе 3 (фиг.6-а) состав питательной среды в емкости 3 приводят в стандартное состояние промыванием с помощью насоса Н1 при скорости Q3. Начинается Фаза 4 (фиг.6-б) роста колоний, во время которой обеспечиваются необходимые условия для деления микроорганизмов: питание, температура, влажность, (путем размещения устройства в инкубаторе либо путем установки датчиков режимов и обеспечения поддержания параметров). Необходимые условия для роста аэробных клеток обеспечивает наличие окон 9 с полупроницаемыми мембранами 10, которые проницаемы для газов, но не проницаемы для влаги и частиц внешней среды. Питательный раствор поступает из полости 3 через отверстия 20 в пластине 19 и поры 21 с помощью внешнего насоса Н1, обеспечивающего объемную скорость. Наблюдение за ростом колоний ведут через окно 11 с закрепленным в нем оптическим стеклом 12, над которым расположен объектив 13 видеокамеры. После достижения достаточного размера (порядка N=100÷1000 клеток в колонии), который фиксируется либо с помощью видеокамеры Двк, выполняющей роль датчика, с подачей соответствующего управляющего сигнала, либо по времени, определенному экспериментально, колонии микробных клеток отсоединяют от зон роста гидроударом. Для этого в Фазе 5 внешний насос Н1 переводят в режим высокой объемной скорости Q5 (фиг.7-а). После установления в емкости 3 заданной объемной скорости потока Q5 резко закрывают на время t клапаны 17 и 6 (Фаза 6). В емкости 3 у клапана 17 нарастает ударное давление и возникает ударная волна, направленная от клапана 17 (фиг.7-б). Ударная волна распространяется в отверстия 20 и поры 22, обеспечивая скачок давления без существенного перемещения жидкости, в результате чего колонии отсоединяются от зон роста.

Благодаря прохождению в зоне роста ударной волны, обладающей повышенным давлением, выросшие микроколонии отрываются от зон роста (снимаются с площадок или выталкиваются из лунок). Затем поток с объемной скоростью Q6 переносит колонии во внешние устройства, например, идентификации (фиг.8).

Выросшие во время Фазы 4 колонии микробных клеток закрепляются в зонах роста, в лунках (фиг.10-а), так как остальная поверхность пластины 19 покрыта слоем материала, препятствующего прикреплению к нему клеток. При реализации фазы 6 колонии 24 отсоединяются от зон роста, как показано на фиг.10-б.

Для уточнения параметров работы устройства необходимо оценить следующие технические характеристики:

1) Характерную энергию и силу связи бактерии (и, соответственно, колонии) с поверхностью зоны роста.

2) Величину давления Pуд, необходимого для отрыва бактерии (справедливо для колоний).

3) Параметры гидроудара (скорость в разгонной камере, скорость закрытия клапана 17), обеспечивающие давление Руд.

4) Параметры потока, обеспечивающего перенос колоний во внешние устройства.

Рассмотрим перечисленные выше технические характеристики 1-4 работы устройства.

1) Рассмотрим пористую мембрану из анодного оксида алюминия (фиг.11), на поверхности которой расположена микробная клетка в виде диска диаметром Dм.кл=10-6 м (предположим, что клетка принимает форму диска на поверхности). Из фиг.11 видно, что поры пористой мембраны расположены достаточно регулярно (фиг.11-а, -в), характеризуются узким распределением по размерам и, в зависимости от условий анодирования, могут иметь поры заданного среднего диаметра, например dср=105 нм (фиг.10-а) или dcp=208 нм (фиг.10-в). Более того, из фиг.11-б, -г видно, что поры характеризуются высоким аспектным отношением и формой, близкой к цилиндрической. Поэтому для оценки силы сцепления микробных клеток с поверхностью мембраны используем модель в виде пластины с цилиндрическими порами, как показано на фиг.12-а, -б. Тогда, если площадь контакта Sконт бактерии на сплошной плоской поверхности составляет:

Sконт=πDм.кл2/4=3,14(10-6 м)2/4=7,8 10-13 м2,

а площадь поперечного сечения поры пористой мембраны Sпоры (фиг.12-б) диаметра d=2·10-7 м:

Sпоры=πd2/4=3,14(2·10-7 м)2/4=3,14·10-14 м2,

что, в свою очередь, для четырех пор, которые перекрывает типичная бактерия (фиг.12-а, -б), составляет площадь S:

S=4·3,14·10-14 м2=1,26·10-13 м2,

то площадь контакта бактерии на пористой поверхности составит:

Sконт/пор=7,8 10-13 м2-1,26·10-13 м2=6,54·10-13 м2.

Для оценки силы сцепления бактерии с поверхностью зон роста (фиг.10, фиг.12) предположим, что средняя плотность связей составляет три связи на 1·10-18 м2. Тогда число связей Nсв на всю площадь контакта бактерии составит: Nсв=3·(6,54·10-13/10-18)=2·106 связей.

Максимальная энергия одной связи Ван-дер-Ваальсова (В-д-В) типа (которые преобладают при условиях реализации метода) по литературным данным (Каплан И.Г. Введение в теорию межмолекулярных взаимодействий. - М.: Наука. Главная редакция физико-математической литературы, 1982. 312 с.) составляет, ЕВ-д-В (max)=1,36·10-23 Дж (табл.2), а суммарная энергия В-д-В связей на всю бактерию составит Е=NсвEВ-д-В=(1,36·10-23)·(2·106)=3·10-17 Дж.

Тогда силу связи всей бактерии F1 (приняв Ван-дер-Ваальсово взаимодействие за основное) можно оценить как:

F1=E/RВ-д-В=3·10-17/0,6·10-9=5·10-8 H.

Здесь RВ-д-В=0,6·10-9 м - характерная длина В-д-В связи.

2) Величину давления, необходимого для отрыва бактерии от зоны роста, можно получить, поделив F1 на площадь S из примера 1, получаем Ротр=F1/S=5·10-8 H/1,26·10-13 м2=3,9·10-5 Па.

В общем случае для бактерии (колонии) произвольной формы можно вывести следующий критерий определения величины давления, необходимого для их отсоединения от зон роста:

Р о т р ( 1 ϕ ) ϕ n В д В F в д в ( 1 )

Здесь φ=0,6 - величина пористости участков мембраны, содержащих поры, определяемая как отношение площади сечения цилиндрических пор к площади мембраны.

Поскольку давление, необходимое для отрыва бактерий (при максимальной оценке) имеет достаточно высокое значение - 3,9 атм., то целесообразно использовать для отрыва колоний (фиг.10-б) от зон роста гидравлический удар, или скачок давления, вызванный быстрым изменением скорости потока жидкости за очень малый промежуток времени (Калицун В.И., Дроздов Е.В., Комаров А.С., Чижик К.И. Основы гидравлики и аэродинамики, «Стройиздат», 2002 г.). Применение гидроудара позволит при использовании миниатюрных насосов низкого давления, наиболее подходящих для портативной диагностической аппаратуры, достигать в короткие промежутки времени достаточно высоких значений ударного давления, необходимых для осуществления заявленной функции устройства - отрыва и перемещения колоний.

В ряде работ проводили численное исследование распространения ударной волны в тонком капилляре. Например, в работе М.С.Иванова, Г.В.Шоева, Е.А.Бондаря, Д.В.Хотяновского, А.Н.Кудрявцева «Моделирование распространения ударной волны в микроканале, с учетом эффектов вязкости» (Междунар. конф. «Современные проблемы прикладной математики и механики: теория, эксперимент и практика», Новосибирск, Россия, 30 мая - 4 июня 2011 г. 90/fulltext/47499/47500/Ivanov_full_paper.pdf). проводили численное моделирование процессов входа и распространения ударной волны в тонкий капилляр для газовой среды с учетом вязкости с использованием, в том числе, околоконтинуального подхода. Для последнего случая, в численном эксперименте получено незначительное затухание ударной волны по мере движения в капилляре. Таким образом, можно предположить, что ударная волна, сформированная при резком перекрывании клапана 17, входя в отверстия 20 и поры 21, распространяется к выходу, постепенно затухая. В данной статье эксперимент проводится для газа при Re=400. Используя принцип подобия по числу Рейнольдса, получим, что для достижения условий, подобных численному эксперименту для газа, в предлагаемом устройстве поток жидкости в емкости 3, выполняющей функцию разгонной камеры, должен приобретать скорость порядка 4 м·с-1, что соответствует диапазону допустимых скоростей функционирования устройства. Тогда использование данных, полученных в указанной выше статье, правомерно. В этом случае можно предположить, что при распространении в отверстиях 20 и порах 22 (фиг.13) ударная волна постепенно затухает, теряя, самое большее 30% энергии. Таким образом, с учетом затухания, на входе в отверстия необходимо развить давление не менее 5,57 атм для получения на выходе из капилляра давления Р≥Ротр.

3) Увеличение давления при прямом гидравлическом ударе, т.е. таком, при котором фаза удара T короче времени закрытия (τ) клапана 17, определяется в идеальном случае для жестких стенок камеры и низкой сжимаемости жидкости по формуле 2:

Р у д = ρ ( ν 0 ν 1 ) c ( 2 )

где Руд - увеличение давления в Па, ρ - плотность жидкости в кг/м3, ν0 и ν1 - средние скорости потока жидкости в канале до и после закрытия клапана 17 (фиг.6-а, -б) в м·с-1, c - скорость распространения ударной волны в жидкости в м·с-1.

Для оценки величины ν0, необходимой для получения давления Руд≥Ротр=5,57·10-5 Па, обеспечивающего отрыв бактерии, будем считать скорость звука в емкости устройства равной скорости звука в неограниченной водной среде cвода=1,348·103 м.с-1, а скорость ν1=0.

Оценим характер гидроудара, т.е. соотношение фазы ударной волны и времени закрытия клапана. Характерный размер разгонной камеры l в заявляемом устройстве примем равным 2 мм, тогда фаза удара T составит 2,5·10-5 c. Если время закрытия (τ) клапана 17, τ<2,5·10-5, то осуществляется прямой гидроудар, рассчитываемый по формуле (1). Тогда, подставляя в формулу (1) в качестве Pуд соответствующую величину, получаем:

ν0=Pуд/(ρcвода)=5,57·105/(103·1,348·103)=4,13·10-1 м·с-1

Если τ>2,5·10-5, то гидроудар называется непрямым и применяется формула

Р у д = 2 ρ ν 0 l τ ( 3 )

Тогда, при τ=10-3 c, l=2·10-2 м, получим ν0=Pудτ/(2ρl)=3,9·105·10-3/(2·103·2·10-2)=10 м·с-1, а при τ=10-4 с, ν0=1 м·с-1.

В общем случае из выражений 1 и 3 для непрямого гидроудара можно получить формулу:

ν 0 ( 1 ϕ ) ϕ n В д В F В д В τ 2 ρ l ( 4 )

Таким образом, для применения в лабораториях на чипе, где величины объемной подачи рабочих жидкостей ограничены миниатюрностью насосов и гидравлическим сопротивлением труб малого диаметра (капилляров), практические соображения требуют применения гидравлического удара (как прямого, так и не прямого). В любом случае для реализации такого гидроудара потребуется применение скоростных запирающих микроклапанов, наподобие описанных в известном патенте (US 20110073788, F16K 31/12, F16K 31/02, 2011).

Для более точного расчета критической скорости ν0 необходимо учитывать зависимость скорости с распространения ударной волны в жидкости от размеров и характеристик материалов разгонной камеры.

При мгновенном срабатывании клапана критическую скорость ν0 можно найти, используя формулы 1 и 2. Из условия Руд≥Ротр при ν1=0, получаем

ρ ν 0 c ( 1 ϕ ) ϕ n В д В F В д В ( 5 )

ν 0 ( 1 ϕ ) ϕ 1 ρ c n В д В F В д В , ( 6 )

где:

c = 1 ρ ( 1 E в о д а + a в н у т р b E к о р п у с ) ( 7 )

Тогда для скорости в разгонной камере ν0 получаем:

ν 0 ( 1 ϕ ) ϕ 1 ρ c n В д В F В д В ( 1 E в о д а + a в н у т р b E к о р п у с ) ρ ( 8 )

где: a внутр - диаметр разгонной камеры - 1 мм;

b - толщина стенок разгонной камеры (толщина тонкой стенки - пластины с отверстиями - 100 мкм, другие стенки толстые - 2÷5 мм);

Евода - модуль упругости воды 2·109 н·м-2;

Екорпус - модуль упругости материала корпуса (например, для анодного оксида алюминия - 0,6·1011 н·м-2, для алюминия - 0,71·1011 н.м-2, для полимера - 0,032·1011 н·м-2).

4) Оценим объемные скорости потока, проходящего через пористую мембрану при постоянном перепаде давления ΔP=105 Па, создаваемом насосом H1 в Фазе 1 и Фазе 7. Например, в Фазе 7 поток Q6 будет определяться количеством (N), радиусам (r) и длиной (h) пор (фиг.13), т.к. они будут создавать наибольшее гидродинамическое сопротивление проходящей жидкости. Расчет объемной скорости Q в одной поре можно произвести с помощью формулы (2) Пуазейля (Л.Г.Лойцянский. Механика жидкости и газа. - Л., 1950. - 676 с.):

Q = π r 4 8 η h Δ P , ( 9 )

где η - динамическая вязкость жидкости. Для воды при температуре T=20°C, η=10-3 Па·с. При ΔP=105 Па, r=10-7 м, h=10-5 м. Подставляя эти величины в формулу (9), получаем:

Q = 3,14 ( 10 7 ) 4 8 10 3 10 5 10 5 4 10 16 м 3 с 1

Оценим общее количество пор пористых мембран на всей пористой пластине. Для оценки плотности пор на поверхности (ns) можно воспользоваться следующим выражением:

nS=φ/(π·r2)=0,6/(3,14·(10-7)2)=1,91·1013 м-2.

Площадь поверхности, покрытую порами, можно оценить по формуле

S=N1·π·R2=1,6·103·3,14·(5·10-6)2=1,26·10-7 м2, где N1=1,6·103 - количество отверстий на пластине, R=5·10-6 м - радиус отверстия.

Тогда общее количество пор пористых мембран на всей пористой пластине можно рассчитать по формуле

N=nS·S=2,4·106.

Полный поток через поры пористых мембран на всей пористой пластине будет равен:

Q6=N·Q=2,4·106·4·10-16≅10-9 м3·с-1.

Рассчитаем линейную скорость (νn) переноса микробных клеток в Фазе 7 под действием потока Q6. Для этого необходимо оценить линейную скорость потока в емкости 4 и сопряженных коммуникациях с внешними устройствами (фиг.8), при объемном потоке Q6. При размере разгонной камеры 10-4 м×10-3 м (площадь сечения s=10-7 м2), средняя линейная скорость потока νn определится выражением:

νn=Q/s=3·10-9/10-7=3·10-2 м·с-1

Данная величина скорости Q6 достаточна для поддержания колоний в потоке и компенсации седиментации на пористую пластину, а также для переноса колоний во внешнее устройство. Для дополнительного регулирования потока во внешние устройства может также использоваться насос Н2 в режиме Q2.

ПРИМЕР 1

Готовили суспензию штамма микробных клеток в концентрации 107 КОЕ.мл-1 (КОЕ - колоний образующих единиц) и последовательно разбавляли до концентраций 1·102, 1·103 1·104 1·105 1·106 КОЕ.мл-1, с получением шести образцов суспензии S.aureus. Для заполнения устройства жидкой средой (Фаза 1, фиг.5-а в емкость 3 подавали физиологический раствор с объемной скоростью потока Q1=10 мкл·с-1 с помощью шприцевого насоса H1 . Таким образом, обеспечивали смачивание и дегазацию емкостей 3 и 4. Затем суспензию микробных клеток каждого из образцов объемом 20 мкл подавали в емкость 4 с помощью микрошприца с объемной скоростью Q2=2 мкл·с-1 (Фаза 2, фиг.5-б), до ее равномерного распределения по поверхности пористой пластины 19. За распределением суспензии наблюдали в окно 11 с помощью внешней видеокамеры. Затем перед началом роста состав питательной среды в емкости 3 приводили в стандартное состояние промыванием с помощью насоса H1 при скорости Q3=10 мкл·с-1 (Фаза 3). Затем начинали фазу инкубирования и роста колоний микробных клеток. Питательный раствор подавали с помощью насоса H1 с объемной скоростью Q1=0,16 пл·с-1 и установили температурный режим для роста 37°C с помощью внешнего термостата (Фаза 4). Использовали пористую пластину, содержащую 400 зон роста диаметром 20 мкм, диаметром пор 200 нм и пористостью φ=0,6. После инкубирования в течение 3 часов (Фаза 4) исследовали пористую пластину с отверстиями с помощью микроскопа. Микроскопическое исследование показало, что, в зависимости от концентрации исходной суспензии, на части зон роста (от 0,5% до 60%) наблюдаются выросшие колонии S.Aureus, как на фиг.14. Исследовали влияние исходной концентрации S.aureus на долю зон роста, в которых происходил рост колоний, наблюдая результаты проведения инкубирования с помощью микроскопа. Результаты наблюдений приведены в табл.2, столбец 7.

Опыт повторяли с пластинами, имеющими по 400 ростовых зон с размером отверстий 2 мкм, 7 мкм и 10 мкм, средним диаметром пор 200 нм и пористостью φ=0,6. Результаты приведены в табл.2, столбцах 4, 5, 6.

Затем проводили отсоединение и перенос выросших колоний микроорганизмов во внешние устройства для пластин с отверстиями 7 мкм, 10 мкм и 20 мкм. Перенос осуществляли гидравлическим способом с помощью гидроудара. Для осуществления гидроудара внешний насос H1 переводили в режим высокой объемной скорости Q5=0,8·10-6 м·с-1 (Фаза 5), что соответствовало линейной скорости 1 м·с-1 (площадь сечения разгонной камеры 3 на фиг.3 составляет 0,8-10-6 м2), затем перекрывали на время t клапаны 6 и 17 (фиг.3) в соответствии с Фазой 6 работы устройства. В результате чего в емкости 3 возникала ударная волна, распространяющаяся в направлении ростовой пластины 19. Затем клапан 8 открывали и насос H1 переводили в режим Q6=1·109 м3·с-1 и наблюдали с помощью микроскопа в канале 14 устройства и проводили их подсчет. Данные приведены в табл.3, столбце 3.

Далее эксперимент повторяли для пластин с отверстиями диаметром 7 мкм и 10 мкм. Данные приведены в таблице 3 колонках 5 и 7, соответственно.

Из таблицы 3 видно, что при скоростях ниже 1 м·с-1 наблюдается существенное снижение доли перемещенных в канал 14 колоний. При превышении скорости 5 м·с-1 наблюдается разрушение пористой пластины с отверстиями.

ПРИМЕР 2

Проводили посев в предлагаемом устройстве (см. Пример 1) микроорганизмов пробы пациента с подозрением на поражение носоглотки S.aureus. Приготовляли мазок слизи носоглотки пациента и путем смыва пробы слизи с ватного тампона в физиологический раствор объемом 1 мл и осаждения волокон и частиц седиментацией в течение 5 мин готовили суспензию популяции микроорганизмов. Приготовили образцы суспензии разных концентраций путем ступенчатого десятикратного разбавления, получив разбавления в 10, 100 и 1000 раз. Перенесли 20 мкл суспензии из каждого образца в устройство как в примере 1. Использовали пластину, содержащую 400 отверстий, диаметром 10 мкм. После проведения фаз 1-3 процесса инкубации при условиях, как в примере 1, исследовали результат с помощью микроскопа. Общее заполнение ростовых зон устройства составило 10-40%, причем по данным визуальной экспертной оценки наблюдались колонии четырех типов: S.Aureus, Neisseria meningitidis, S.pneumoniae, Enteroccocus. Результаты приведены в табл.4.

Затем проводили отсоединение и перенос выросших колоний микроорганизмов во внешние устройства (канал 14) для пластин с отверстиями 7 мкм, 10 мкм и 20 мкм. Перенос осуществляли гидравлическим способом с помощью гидроудара. Для осуществления гидроудара внешний насос H1 переводили в режим высокой объемной скорости Q5=0,8·10-6 м3·с-1 (Фаза 5), что соответствовало линейной скорости 1 м.с-1 (площадь сечения разгонной камеры 3 на фиг.3 составляет 0,8·10-6 м2), затем перекрывали на время t клапаны 6 и 17 (фиг.3) в соответствии с Фазой 6 работы устройства. В результате чего в емкости 3 возникала ударная волна, распространяющаяся в направлении ростовой пластины 19. Затем клапан 8 открывали и насос Н1 переводили в режим Q6=1·10-9 м·с-1 и наблюдали с помощью микроскопа в канале 14 устройства и проводили их подсчет. Данные приведены в табл.3, столбце 3.

Таблица 1
Технико-эксплуатационные характеристики прибора с использованием заявляемого устройства и промышленных аналогов
Техническое решение
Характеристика прибора
Способ Кирби-Бауэра Автоматический прибор VITEK® 2 compact 60 (Biomerieur, Франция) Лаборатория на чипе, в которой могут быть использованы предлагаемые способ и устройство
1 2 3 4
Состав прибора Чашки Петри с питательной средой, наборы дисков, импрегнированных антибиотиками, инкубатор микробиологический с охлаждением КВ-23 (Binder, Германия), биологический микроскоп. Считывающий прибор, одноразовые карточки для анализа микробных клеток, персональный компьютер. Портативный автоматический считывающий прибор, одноразовые лаборатории на чипе, содержащий модули: пробоподготовки, инкубирования и роста бактерий, идентификации, определения жизнеспособности, микрокомпьютер на борту, модуль навигации, связи.
Условия эксплуатации Специализированная лаборатория (ГОСТ Р ИСО/МЭК 17025-2000) Специализированная лаборатория (ГОСТ Р ИСО/МЭК 17025-2000) Не требуется аккредитация по ГОСТ Р ИСО/МЭК 17025-2000, автономные условия.
Назначение Исследование чувствительности микроорганизмов к антибиотикам. Идентификация бактерий и дрожжей. Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам. Обработка проб, создание условий для роста микроорганизмов, дифференциация и учет количества микроорганизмов, определение чувствительности микроорганизмов к антибиотическим препаратам.
Способ считывания информации по идентификации Отсутствует Колориметрия Распознавание образов по трем и более признаков.
1 2 3 4
Способ считывания информации по чувствительности к антибиотикам Ручной способ измерения просвета вокруг дисков, импрегнированных антибиотиками с помощью линейки. Турбидиметрия Микротурбидиметрия, положение границы в микроканале: видеокамера, распознавание образов.
Габаритные размеры, мм 433×516×618 590×715×6725 <150×200×200
Вес, кг 44 75 <3
Мощность, Вт 340 1025 30
Количество модулей 3 2 (к одному компьютеру) 1
Уровень автоматизации Низкий Высокий Высокий
Производительность: образцов в сутки 40 60 20
Время 1 анализа, час 48-72 26-34 6-8
Идентификация Не производится До вида До вида
1 2 3 4
Количество антибиотиков 6 (на одну чашку Петри) 20 20
Достоверность, % 95 90 91
Гибкость в переналадке Да Нет Да
Эксплуатационные расходы на 1 пробу,
руб.
1000 1000 350
Цена, млн. руб 0,175 (импорт в РФ) 6,0 (импорт в РФ) 0,03.
Таблица 2
Влияние концентрации микробных клеток (S.Aureus) в суспензии и размера зон роста пористой пластины на эффективность роста колоний
Концентрация микробных клеток S.aureus в суспензии, КОЕ мл-1 Количество микробных клеток S.aureus в пробе Размер зон роста пористой пластины, мкм
2 7 10 20
1 2 3 4 5 6 7
Доля выросших колоний в зонах роста, % 1·102 2 0 0 0,25 0,5
1·103 20 0,25 1,2 1,5 4,5
1·104 2·102 0,5 4 6,25 12,5
1·105 2·103 2,5 10 25 35
1·106 2·104 15 20 32 45
1·107 2·105 20 25 45 60
Таблица 3
Зависимость числа выросших (N0) и отделенных (Nd) от зон роста колоний от скорости потока (ν) в разгонной камере устройства для пластин с 400 зонами роста и различным диаметром (D) отверстий для суспензии с содержанием S.aureus 1·107 КОЕ мл-1.
Скорость потока ν м·с-1 Число выросших N0 и перемещенных в канал 14 (фиг.3-б) (Nd) колоний
d=20 мкм d=10 мкм d=1 мкм
N0 Nd N0 Nd N0 Nd
1 2 3 4 5 6 1
0,01 220 10 178 10 97 10
0,1 235 50 179 100 105 19
1 250 150 189 160 104 25
2 245 210 185 183 99 70
3 256 225 190 180 100 80
4 239 230 176 175 101 99
5 241 240 180 195 95 94

Таблица 4

Влияние разбавления клинической пробы пациента с подозрением на S.Aureus на долю выросших в зонах роста колоний N0 и доля перемещенных к канал 14 колоний Nd
Разбавление клинической пробы Вид микробных клеток
S.aureus, % Neisseria meningitidis, % S.pneumoniae, % Enteroccocus, %
N0 Nd N0 Nd N0 Nd N0 Nd
1 2 3 4 5 6 7 8 9
1:106 0 0 0 0 0 0 0 0
1:105 0 0 0 0 0 0 0 0
1:104 0 0 0 0 0 0 0 0
1:103 3 3 0 0 0 0 1 1
1:102 8 8 0 0 2 2 3 3
1:10 50 48 2 2 10 9 15 15

1. Способ выращивания колоний микробных клеток на поверхности пористой пластины, включающий подачу питательного раствора снизу вверх через пористую пластину в зоны роста колоний микробных клеток, сформированные на ее верхней поверхности, подачу суспензии микробных клеток на верхнюю поверхность пористой пластины, создание контролируемых условий роста колоний, проведение наблюдения за ростом колоний, отсоединение выращенных колоний микробных клеток от зон роста и перенос их во внешние средства идентификации, отличающийся тем, что , питательный раствор подают в зоны роста колоний микробных клеток путем создания перепада давления между входом и выходом отверстий, выполненных в пластине из анодного оксида алюминия ортогонально ее большой плоскости и топологически кодированных, в которых сформированы указанные зоны роста в виде пористых мембран, при этом пористые мембраны, размещенные либо вровень с верхней поверхностью пластины, либо с образованием лунки, не пропускают микробные клетки, далее подают суспензию микробных клеток заданной концентрации на верхнюю поверхность пластины до их равномерного распределения, при этом на поверхности пластины между зонами роста сформирована пленка, препятствующая прикреплению микробных клеток, а отсоединение выросших микроколоний от зон роста осуществляют путем гидроудара, направленного со стороны входа цилиндрических отверстий пластины и распространяющегося вдоль них и далее через поры пористых мембран с силой, не разрушающей микроколонии, но достаточной для их отрыва от зон роста, при этом в зоне гидроудара давление
, где:
- величина пористости пористой мембраны
n - количество связей микробной клетки и поверхности мембраны на единицу площади поверхности;
F - средняя сила единичной связи Ван-дер-Ваальсова типа между поверхностью микробной клетки и поверхностью мембраны.

2. Устройство для выращивания колоний микробных клеток способом по п. 1, содержащее пористую пластину из анодного оксида алюминия со сформированными на ее верхней поверхности зонами роста колоний микробных клеток, отличающееся тем, что пористая пластина из анодного оксида алюминия расположена в корпусе с образованием верхней и нижней емкостей корпуса, которые снабжены входом и выходом с клапанами для жидких сред, при этом нижняя емкость снабжена входом и выходом для питательной среды микробных клеток, а ее вход предназначен для соединения с внешним насосом, верхняя емкость снабжена входом для суспензии микробных клеток и выходом для выросших микроколоний, а верхняя поверхность корпуса выполнена проницаемой для газов, но непроницаемой для влаги и частиц внешней среды, нижняя емкость предназначена для формирования гидроудара, с силой, достаточной для отрыва колоний от зон роста, но не разрушающей колонии, при этом пористая пластина из анодного оксида алюминия имеет отверстия цилиндрической формы, сформированные ортогонально большой плоскости пластины и топологически кодированные, а в каждом отверстии расположены пористые мембраны с порами, не пропускающими микробные клетки, образующие зоны роста, причем пористые мембраны расположены либо вровень с верхней поверхностью пластины, либо с образованием лунки, при этом на поверхности пластины между зонами роста сформирована пленка, препятствующая прикреплению микробных клеток.

3. Устройство для выращивания колоний микробных клеток по п.2, отличающееся тем, что пленка выполнена из металла, полимера или гидрофобного материала, препятствующего прикреплению микробных клеток к поверхности пластины.

4. Устройство для выращивания колоний микробных клеток по п.2, отличающееся тем, что пористые мембраны изготовлены из анодного оксида алюминия, керамики, полимера или металла.

5. Устройство для выращивания колоний микробных клеток по п.2, отличающееся тем, что крышка верхней емкости снабжена центральным окном, с закрепленным в нем оптическим стеклом для наблюдения за ростом колоний.

6. Устройство для выращивания колоний микробных клеток по п.2, отличающееся тем, что крышка верхней емкости снабжена окнами, закрытыми полупроницаемыми мембранами, служащими для пропускания газов, но являющимися не проницаемыми для влаги и частиц внешней среды.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано при мониторинговых эколого-микробиологических исследованиях контроля качества морской воды для определения численности нефтеокисляющих микроорганизмов.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ оценки токсичности продукции из полимерных и текстильных материалов.

Изобретение относится к области биотехнологии и представляет собой способ определения неспецифической устойчивости патогенных микроорганизмов к антибиотикам и факта присутствия бактериальных биопленок на основании измерения каталитической активности фосфодиэстераз, расщепляющих циклический дигуанозинмонофосфат, с пороговой чувствительностью 50 пг/мл, включающий: 1) выделение фосфодиэстеразы-мишени из лизированных бактериальных клеток; 2) связывание фосфодиэстеразы биотинилированными антителами, специфичными к некаталитическим доменам фосфодиэстеразы; 3) аффинную очистку комплексов, сформированных фосфодиэстеразой-мишенью и биотинилированным антителом при помощи парамагнитных частиц, содержащих нейтравидин или его аналоги, связывающие биотин; 4) взаимодействие комплексов фосфодиэстераза/биотинилированное антитело, иммобилизованных на парамагнитных частицах, с комплексами, содержащими с-di-GMP в форме G-квадруплексов с интеркалированным красителем, сопровождающееся падением интенсивности флуоресценции по мере разрушения комплексов интеркалирующего красителя c-di-GMP; 5) измерение падения флуоресценции при гидролизе c-di-GMP и разрушении комплекса c-di-GMP с интеркалирующим красителем с последующим количественным определением активности фосфодиэстеразы на основании калибровочных кривых, построенных с использованием известных количеств рекомбинантного фермента фосфодиэстеразы, идентичного исследуемой мишени; 6) выявление повышенного уровня фосфодиэстеразной активности, обнаруживаемого тестируемыми антибиотикоустойчивыми бактериальными штаммами, способными к формированию биопленок, по сравнению с уровнем фосфодиэстеразной активности, обнаруживаемым для контрольных штаммов бактерий того же вида, не обладающих антибиотикоустойчивостью и способностью к формированию биопленок.
Изобретение относится к области медицинской микробиологии и касается способа определения активации плазминогена бактериями. Способ включает внесение протамина сульфата в подготовленный супернатант, инкубацию полученной смеси, осаждение клеток центрифугированием, инкубацию супернатанта с протамин сульфатом, осаждение белка и регистрацию активации плазминогена бактериями по количеству отщепившегося аргинина, содержание которого определяют методом Сакагуши по окрашиванию проб в красный цвет.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен контейнер для изоляции и идентификации микроорганизма.

Изобретение относится к области микробиологии и дезинфектологии. Плотную питательную среду засевают исследуемыми штаммами бактерий.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при биологической очистке сточных вод гальванических цехов от солей тяжелых металлов. Способ предусматривает внесение в сточную воду биомассы дрожжей в виде отходов пивоваренных производств, содержащих ассоциацию дрожжей различных штаммов Saccharomyces cerevisiae с жизнеспособностью 90-95% в заданном количестве.

Настоящее изобретение относится к области молекулярной биологии. Предложен способ выявления в гене BRCA1 мутаций сдвига рамки считывания и нонсенс-мутаций, заключающийся в создании рекомбинантных плазмид, в которых амплифицированный фрагмент гена находится в единой трансляционной рамке с геном щелочной фосфатазы Е.соli (phoA).
Способ обнаружения микроскопических грибов рода Coccidioides posadasii 36 S и Coccidioides immitis C-5 in vitro включает предварительное выращивание культуры в мицелиальной фазе, приготовление взвеси, соответствующей 5ЕД стандартного образца мутности, обеспечение возможности формирования сферул и обнаружение сферул, заполненных эндоспорами.
Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии и касается способа определения адгезивных свойств бактерий рода Enterococcus. Представленный способ включает подготовку бактериальной суспензии, отделение полученной биомассы бактерий центрифугированием, разведение полученной биомассы в физиологическом растворе, подготовку монослоя клеток СаСо-2, внесение бактериальной культуры, культивирование клеток, промывку физраствором, снятие монослоя с бактериальными клетками и подсчитывание количества связанных с 1000 клетками СаСо-2 бактериальных клеток, при этом бактерии относят к высокоадгезивным, если количество связавшихся клеток составляет от 1010 до 3000, к среднеадгезивным - от 210 до 1000, к низкоадгезивным - от 0 до 200.
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при очистке мерзлотных почв и водной среды от нефти и нефтепродуктов. Выращивают штамм бактерий Exguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011 и готовят из него суспензию, которую вносят в мерзлотную почву и водную среду.
Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ очистки водного раствора, содержащего соль никеля, от ионов никеля.
Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и биотехнологии. Штамм Moraxella bovoculi обладает антигенными, вирулентными свойствами и иммуногенной активностью.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Штамм Bifidobacterium lactis CNCM I-3446 применяют в производстве пробиотической композиции для стимуляции развития начальной бифидогенной кишечной микробиоты у детей, рожденных путем кесарева сечения.
Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложен штамм бактерий Rhodococcus aetherivorans ВКМ Ac-2610D.
Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано при производстве медико-биологических препаратов. Фармацевтическая композиция содержит бактериофаги, полученные путем культивирования на питательной среде, содержащей глюкозу, натрий хлористый, натрий двузамещенный фосфорнокислый, дрожжевой автолизат жидкий и очищенную воду в заданном соотношении, и высушенные с наполнителем без лиофилизации, в виде таблеток с желудочно-резистентным покрытием.
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к микробиологическим средствам борьбы с вредными мышевидными грызунами. Штамм бактерий Salmonella enteritidis var.

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии. Предложен штамм бактерий Aeromonas bestiarum - продуцент щелочной рибонуклеазы, обладающий противовирусной активностью и депонированный в коллекции бактерий, бактериофагов и грибов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» под регистрационным номером B-1270.

Изобретение относится к препарату для младенцев для снижения или предупреждения воспаления у младенца. Препарат для младенцев включает источник белка, обеспечивающий от 1 до 5 г белка на 100 ккал препарата, источник жира или липидов, обеспечивающий от 3 до 7 г жира или липидов на 100 ккал препарата, источник углеводов, обеспечивающий от 8 до 12 г углеводов на 100 ккал препарата, источник длинноцепочечных полиненасыщенных жирных кислот, включающий докозагексановую кислоту.

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано при мониторинговых эколого-микробиологических исследованиях контроля качества морской воды для определения численности нефтеокисляющих микроорганизмов.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложено устройство для получения наночастиц металлов путем восстановления металлов из исходных солей в присутствии культивируемых клеток микроорганизмов.
Наверх