Пептиды и их производные, взаимодействующие с никотиновым ацетилхолиновым рецептором и пригодные для использования в косметологии против мимических и возрастных морщин
Владельцы патента RU 2524428:
Общество с ограниченной ответственностью "Синейро" (RU)
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к новым пептидным соединениям, обладающим способностью селективно блокировать мышечный тип ацетилхолинового рецептора. Изобретение может быть использовано в косметологии для разглаживания мимических и возрастных морщин. Данные соединения имеют общую формулу: X1-X2-X3-Pro-X4-Pro-X5, где X1 выбирают из H, Ac-, Palm-; X2 выбирают из Trp, Tyr; X3 выбирают из Trp, Tyr; X4 выбирают из Lys, Orn, Dbu, Dpr, Arg; X5 выбирают из -OH, -NH2, -OCH3, -OC2H5, -NH-C6H5. Данное соединение может быть представлено в виде ретроизомера. Предложенное изобретение позволяет селективно блокировать мышечный никотиновый ацетилхолиновый рецептор с высокой эффективностью. 4 н. и 8 з.п. ф-лы, 7 ил., 1 табл., 5 пр.
Пептиды и их производные, взаимодействующие с никотиновым ацетилхолиновым рецептором и пригодные для использования в косметологии против мимических и возрастных морщин.
Область техники, к которой относится изобретение.
Настоящее изобретение относится к биохимии, а именно к новым пептидным соединениям, способным селективно блокировать мышечный тип ацетилхолинового рецептора. Более конкретно данное изобретение относится к применению таких соединений в косметологии для разглаживания мимических и возрастных морщин.
Уровень техники.
В последние десятилетия наблюдается устойчивый рост продолжительности жизни населения развитых стран. В 2000 году в США людей старше 65 лет было 13%, в 2030 году ожидают, что это значение увеличится до 20%. Этот демографический сдвиг требует активизации усилий по созданию эффективных лекарственных средств для людей старших возрастных групп. Это требование в полной мере относится к косметической дерматологии, которая создает укрепляющие, антивозрастные и противосолнечные средства, а также крема от морщин. Косметические и фармацевтические компании часто используют в таких кремах пептиды, как активные ингредиенты. Пептиды и косметика на их основе обладают различной активностью: стимуляция активности фибробластов, ингибирование ферментов, разрушающих коллаген, стимуляция ангиогенеза, иммуномодулирование, регулирование синтеза меланина, блокирование нервно-мышечной передачи. Одним из наиболее важных препятствий для топического применения пептидов в составе кремов является их пониженная способность проникать в кожу. Вообще, способность проникновения зависит от различных факторов: физико-химических свойств вещества (константа диссоциации кислоты [рКа], молекулярный размер, стабильность, растворимость и коэффициент липофильности); времени проникновения; целостности, толщины и состава кожи, кожного обмена веществ; места, площади и продолжительности применения (Ranade, V.V. Drug delivery systems. 6. Transdermal drug delivery. J. Clin. Pharmacol. 1991, 31, 401-418). Считают, что пептид подходит для топического применения, если он соответствует перечисленным ниже параметрам, но стоит заметить, что это эмпирические параметры, которые не являются универсальными (Guy, R.H. Current status and future prospects of transdermal drug delivery. Pharm. Res. 1996, 13, 1765-1769):
1. Молекулярная масса менее 500 Da
2. Значение коэффициента липофильности (логарифм коэффициента распределения в системе октанол/вода) от 1 до 3
3. Температура плавления ниже 200 C
4. Хорошая растворимость в воде (1 мг/мл)
5. Нет или мало полярных центров.
Пептиды, используемые в косметологии, можно разделить на четыре большие группы: сигнальные пептиды, ингибиторы ферментов, пептиды-переносчики и пептиды-ингибиторы нервно-мышечной передачи (Gorouhi F, Maibach HI. Role of topical peptides in preventing or treating aged skin. Int J Cosmet Sci. 2009 Oct; 31(5): 327-45). Несмотря на одинаковый видимый физиологический эффект при применении пептидов из этих четырех групп, механизм их действия существенно различается. При этом, именно пептиды из группы блокаторов нервно-мышечной передачи рассматриваются как безопасная альтернатива инъекциям ботулотоксина при борьбе с возрастными и мимическими морщинами. Обладая высокой специфичностью, ботокс, тем не менее, не лишен недостатков, основные из которых - высокая токсичность и, как следствие, необходимость точного расчета дозы, существенная зависимость качества препарата от условий производства, применение только в виде инъекций.
Мышечное сокращение - это физиологический процесс, при котором мышцы испытывают напряжение - укорачиваются или удлиняются, тем самым производя механическую работу. Этот процесс обеспечивает способность животных и человека к произвольным и непроизвольным движениям и напрямую связан с пищевыми, дыхательными, оборонительными, выделительными и другими физиологическими процессами. Гладкая мускулатура отвечает за непроизвольные движения, примерами которых могут служить перистальтика желудка и кишечника, изменение тонуса кровеносных сосудов и мочевого пузыря. Поперечно-полосатая мускулатура обеспечивает произвольные движения - перемещение в пространстве, мимику лица, дыхание, глотание и пр. Работа сердца обеспечивается сокращением сердечной мускулатуры.
Мышцы образованы многоядерными мышечными волокнами, каждое из которых в отдельности является не только клеточной, но и физиологической единицей, что обусловлено наличием в них такого специфического «сократительного» элемента как миофибриллы. Эти волокна объединены в пучки первого порядка; несколько таких первичных пучков соединяются, образуя пучки второго порядка и т.д. до образования мышцы. Поскольку сокращение мышцы вызывается импульсами, идущими от центральной нервной системы, то на ней присутствуют участки, которые иннервированы синаптическими окончаниями нейрональных аксонов. Сочленение между нейроном и мышечным волокном называется нервно-мышечным синапсом (НМС).
Механизм мышечного сокращения можно разбить на несколько основных этапов. Первым из них является передача от нейрона стимула в форме потенциала действия. При этом потенциал действия распространяется вдоль нервного волокна до его окончаний на мышечных волокнах, что приводит к выделению нейромедиатора ацетилхолина (АХ) из пресинаптической части НМС в синаптическую щель. Этот нейромедиатор действует на ограниченную область мембраны мышечного волокна (постсинаптическая часть НМС), открывая многочисленные управляемые ацетилхолином каналы - ацетилхолиновые рецепторы (АХР). Результатом открытия каналов становится повышение концентрации ионов натрия внутри мышечного волокна, что ведет к возникновению на мембране потенциала действия, который проводится вдоль мембраны мышечного волокна. Потенциал действия деполяризует мышечную мембрану, что приводит к выделению из саркоплазматического ретикулума большого количества ионов кальция, которые в нем хранятся. Ионы кальция непосредственно инициируют процесс сокращения мышц. В дальнейшем с помощью кальциевого насоса в мембране саркоплазматического ретикулума ионы кальция закачиваются обратно, приводя к расслаблению мышцы.
Механизм функционирования нервно-мышечного синапса описан достаточно детально. Когда нервный импульс, выражающийся в виде потенциала действия, поступает в окончание моторного нейрона, он заставляет открыться в пресинаптической мембране НМС кальциевые каналы. Локальное увеличение здесь внутриклеточной концентрации ионов кальция способствует их взаимодействию с белками, которые способствуют слиянию синаптических везикул, наполненных нейромедиатором АХ, с плазматической мембраной нейрона. Последний процесс также детально изучен и осуществляется с помощью комплекса SNARE, образуемого эффективным четырехспиральным взаимодействием трех белков - синаптобревина с поверхности везикулы, синтаксина и SNAP-25 с поверхности мембраны нейрона. Образование этого комплекса приводит к быстрому слиянию везикулярной и плазматической мембран и вызывает экзоцитоз АХ в синаптическую щель. Молекулы ацетилхолина диффундируют через щель шириной 50-100 нм и достигают постсинаптической мембраны, которая обладает высокой чувствительностью к медиатору за счет наличия там высокоспецифичных рецепторов - АХР. Связывание АХ вызывает открытие канала; при этом образуется мощный градиент ионов натрия внутрь клетки, а значительно более слабый поток ионов калия наружу с последующей деполяризации мышечной мембраны, высвобождение кальция и сокращение мышцы, о чем было сказано выше.
Механизм передачи нервного импульса через постсинаптическую часть НМС опосредуется через взаимодействие нейромедиатора АХ с АХР и также детально изучен. Существует две больших группы АХР - никотиновые (нАХР) и мускариновые (мАХР), которые различаются по способности связывать специфические агонисты. Так, первые получили свое название из-за высокого сродства к растительному алкалоиду никотину, а вторые - к алкалоиду из ядовитых грибов мускарину. нАХР являются ионотропными рецепторами, т.е. представляют собой классические многосубъединичные ионные каналы, которые открываются для прохождения определенных ионов при связывании лиганда. мАХР относится к метаботропным рецепторам; это одноцепочечный белок с 7 трансмембранными фрагментами, сопряженный с G-белком. В этом случае передача сигнала после связывания лиганда происходит за счет большого количества метаболических путей.
На молекулярном уровне нАХР являются олигомерными белками, состоящими из 5-ти субъединиц. Известно, что все 5 субъединиц располагаются в мембране псевдосимметрично вокруг центральной оси, по которой проходит ионный канал диаметром примерно 2.5 нм. Эти данные получены для нАХР из электрического органа скатов Torpedo и имеющего субъединичную стехиометрию (α1)2-β1-γ-δ [Unwin N. Refined structure of the nicotinic acetylcholine receptor at 4 Å resolution. J Mol Biol 2005; 346: 967-89]. К настоящему времени всего выявлено 10 различных подтипов α-субъединиц (α1-α10) и 4 подтипа β-субъединиц (β1-β4). Все эти подтипы α- и β-субъединиц (кроме α1- и β1-) обнаружены в составе нейрональных подтипов нАХР, расположенных в основном в нейронах центральной и/или периферической нервных систем, во многих случаях также и на пресинаптической мембране [Dani JA, Bertrand D. Nicotinic acetylcholine receptors and nicotinic cholinergic mechanisms of the central nervous system. Annu Rev Pharmacol Toxicol 2007; 47: 699-729]. Постсинаптические нАХР нервно-мышечного синапса животных и человека имеют стехиометрию (α1)2-β1-γ-δ (аналогичную таковой для рецептора из электрического органа) только на начальном (эмбриональном) этапе развития организма. Во взрослой форме γ-субъединица замещается на ε- [Yomoto N., Wakatsuki S., Sehara-Fujisawa A. 2005. The acetylcholine receptor gamma-to-epsilon switch occurs in individual endplates. Biochem. Biophys. Res. Commun. 331: 1522-1527]. нАХР со структурой (α1)2-β1-ε-δ и является единственной формой нАХР во взрослой мышце, ответственной за прием нейромедиатора, вызывающего в итоге сокращение этой мышцы. С учетом высокой гомологии всех субъединиц нАХР предполагают и их одинаковую пентамерную канальную пространственную организацию в мембране. На сегодня известно также и о месте расположения участков связывания классических агонистов и конкурентных антагонистов на нАХР: два лиганд-связывающих участка располагаются в областях контакта больших N-концевых внеклеточных доменов двух α1 и соседних с ними γ(ε) и δ субъединиц рецептора примерно в их средней части по отношению к мембранной поверхности.
Для достижения быстрой передачи информации между нейроном и мышечным волокном необходимо наличие высокой концентрации АХР в нужных областях постсинаптической мембраны НМС. Поэтому кластеризация АХР является одним из важнейших этапов в процессе правильного функционирования НМС [Hoch W. 1999. Formation of the neuromuscular junction. Agrin and its unusual receptors. Eur. J. Biochem. 265: 1-10]. В ней задействовано несколько белков, важнейшими из которых являются агрин, рапсин и киназа MuSK (Muscle-Specific Kinase). Разработанные к настоящему времени и создаваемые сегодня новые агенты, блокирующие нервно-мышечную передачу, направлены на нарушение нормального функционирования либо пресинаптической мембраны НМС, либо постсинаптической части синапса.
Косметическая индустрия осуществила несколько различных попыток разработать новые соединения для топического применения при обработке мимических морщин, чтобы избежать побочных эффектов, наблюдаемых при инъекциях ботулического токсина (Lupo MP, Cole AL. Cosmeceutical peptides. Dermatol Ther. 2007, Sep-Oct; 20(5): 343-9). К настоящему времени известны несколько пептидных соединений, блокирующих нервно-мышечную передачу.
| Табл.1. | |
| Аминокислотные последовательности пептидов, блокирующих нервно-мышечную передачу, и их биологическая мишень. |
| Название | Аминокислотная последовательность | Мишень |
| Аргирелин | Ac-Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg-NH2 | Ингибирует образование комплекса SNARE и высвобождение нейромедиатора. |
| Лейфазил | H-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu-OH | Имитирует действие энкефалина - уменьшает возбуждение в нейроне |
| Виалокс | H-Gly-Pro-Arg-Pro-Ala-NH2 | Конкурентный антагонист мнАХР |
| Синэйк | H-β-Ala-Pro-Dab-NHBzl | Конкурентный антагонист мнАХР |
| Инилин | He публикуется | Конкурентный антагонист MuSK |
Первым в списке «косметических аналогов ботокса» значится пептид аргирелин (Blanes-Mira С., et al. A synthetic hexapeptide (Argireline) with antiwrinkle activity. Int J Cosmet Sci. 2002; 24(5): 303-310). Появившись в начале 2000-х годов, он быстро завоевал популярность - сегодня его можно встретить в составе многих косметических средств, нацеленных на борьбу с мимическими морщинами. Шесть аминокислот аргирелина повторяют участок белка SNAP25, необходимого для связывания синаптического пузырька аксона с пресинаптической мембраной. В аксоне аргирелин конкурирует с белком SNAP25 и встраивается вместо него во временный белковый комплекс SNARE - этот комплекс формируется из нескольких мембранных белков непосредственно перед связыванием пузырька с мембраной и необходим для успешного экзоцитоза. Дефектный комплекс не может обеспечить необходимый контакт пузырька с мембраной, в результате не происходит выброса медиатора в синаптическую щель и мышца не получает сигнал о сокращении и продолжает находиться в расслабленном состоянии.
Аналоги аргирелина, полученные из белка SNAP-25 и направленные на ингибирование нейромышечной передачи на синаптическом уровне, за счет конкуренции с SNAP-25 за образование комплекса SNARE, описаны в патентах EP 1180524 и WO 9734620.
На добровольцах показано, что топическое применение крема, содержащего 10% аргирелина, в течение 30 дней приводит к 30% уменьшению глубины мимических морщин против 10% при применении плацебо.
Пентапептид Лейфазил - разработка компании Липотек (Испания), имитирует действие энкефалина - уменьшает возбуждение в нейроне, ингибируя поток ионов кальция через мембрану, и снижает Са2+-зависимый выброс медиатора. Применение Лейфазила в смеси с аргирелином приводит к усилению эффекта последнего в 1.5 раза.
Инилин - ацетил гексапептид, разработанный компанией Липотек (Испания) (WO 2011/009626), создан при помощи молекулярного моделирования, в соответствии с предсказанной структурой сайта связывания агрина в MuSK (Muscle-Specific Kinase). Инилин действует как конкурентный антагонист MuSK в сайте связывания агрина, который является существенным для мышечного сокращения. Постсинаптический механизм уменьшения мышечных сокращений позволяет избежать образования мимических морщин. Испытания на добровольцах показали, что применение 5% раствора инилина в течение 28 дней приводит к уменьшению глубины морщин в области «гусиных лапок» на 14.9%.
Виалокс (Vialox, компания Пентафарм, Швейцария) - пентапептид, являющийся фрагментом компонента яда храмовой гадюки-ваглерина-1. Виалокс обладает кураре-подобной активностью и является конкурентным антагонистом ацетилхолинового рецептора. Когда пептид связан с рецептором натриевый ионный канал находится в закрытом состоянии, что прерывает прохождение нервного импульса и не позволяет мышце сокращаться.
Патент EP 1809652 описывает пептиды антагонисты ацетилхолинового рецептора, которые действуют постсинаптически по механизму, сходному с действием ваглерина-1 - блокируют нервную передачу и предотвращают образование морщин. Виалокс можно использовать и в сочетании с другими косметическими пептидами (WO 2006/069608).
При использовании крема с 5% содержанием виалокса в течение 28 дней приводит к уменьшению размера морщин на 49%, а шероховатости кожи на 47%.
Еще один активный косметический пептид Синэйк (Syn-ake, компания Пентафарм, Швейцария) является обратимым антагонистом мышечного никотинового ацетилхолинового рецептора (мнАХР). Этот трипептид действует по механизму, сходному с действием ваглерина-1, связывается с эпсилон субъединицей мнАХР и, таким образом, препятствует связыванию ацетилхолина и активации канала. Поэтому мышцы остаются в расслабленном состоянии (WO 2006/047900). Испытания на добровольцах показали, что применение крема с 4% содержанием Syn-Ake в течение 28 дней приводит к уменьшению глубины морщин в области лба на 52%.
Таким образом, наиболее эффективными пептидами для уменьшения мимических морщин являются Виалокс и Синэйк - конкурентные антагонисты мнАХР.
Однако ни одно соединение, разработанное косметической или фармацевтической промышленностью, не способно ингибировать мышечное сокращение с эффективностью, сходной с ботулиническим токсином. Поэтому до сих пор существует необходимость в создании новых соединений, способных ингибировать мышечное сокращение для достижения лучших результатов в уменьшении и размягчении морщин и, в особенности, мимических морщин.
Раскрытие изобретения.
Определения.
В настоящем описании обозначения аминокислот соответствуют правилам, рекомендованным IUPAC-IUB (Eur. J. Biochem., 1984, 138: 9-37; J. Biol. Chem., 1989, 264: 633-673). Например, Lys означает NH2-CH(CH2-CH2-CH2-NH2)-COOH, Lys- означает NH2-CH(CH2-CH2-CH2-NH2)-CO-, -Lys означает -NH-CH(CH2-CH2-CH2-NH2)-COOH, -Lys- означает -NH-CH(CH2-CH2-CH2-NH2)-CO-. Следовательно, черта, обзначающая пептидную связь, удаляет гидроксил карбоксильной группы аминокислоты, когда расположена справа от символа аминокислоты, и протон альфа-аминогруппы аминокислоты, когда расположена слева от символа аминокислоты.
Термин Ac- обозначает ацетильную группу (CH3-CO-) и Palm- обозначает пальмитоильную группу (CH3-(CH2)14-CO-).
Термин Orn обозначает аминокислоту орнитин, Dbu-2,4-диаминобутановая кислота, Dpr-2,3-диаминопропановая кислота, -NH-C6H5- бензиламид.
Термин «косметически приемлимые соли» пептидов, в контексте настоящего изобретения, означает соли допустимые для использования на людях и включают соли образованные при добавлении неорганических оснований, например лития, натрия, кальция, калия, магния, меди, цинка и др., или органических оснований, например, этиламина, диэтиламина, этилендиамина, этаноламина, диэтаноламина, аргинина, лизина, или соли, полученные при добавлении органических кислот, например, ацетат, цитрат, лактат, малонат, малеат, фумарат, бензоат, аспартат, глутамат, олеат, трифторацетат, оксалат, глюконат, или неорганических кислот, например, хлорид, сульфат, борат, карбонат. Косметически приемлимые соли пептидов настоящего изобретения могут быть получены стандартными методами (Berge S.M., Bighley L.D. and Monkhouse D.C. 1977, "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci. 66: 1-19).
Настоящее изобретение решает задачу расширения арсенала пептидов-блокаторов нейромышечной передачи пригодных для использования в косметологии и дерматологии.
Наиболее близкими аналогами по механизму действия к заявляемому пептиду являются пептиды Синэйк и Виалокс. Оба пептида разработаны швейцарской компанией «Пентафарм» на основе компонента яда храмовой гадюки ваглерина-1, который содержит в своем составе 21 аминокислоту. Известно, что ваглерин-1 блокирует мышечные нАХР, то есть является их антагонистом (Weinstein S.A. et al. Characterization and amino acid sequences of two lethal peptides isolated from venom of Wagler's pit viper, Trimeresurus wagleri. Toxicon. 1991; 29(2): 227-36). Короткие пептиды на его основе не обладают токсичностью и сохраняют способность в больших концентрациях блокировать тот же рецептор. Недавно (Utkin Y.N. et al. Azemiopsin from Azemiops feae Viper Venom, a Novel Polypeptide Ligand of Nicotinic Acetylcholine Receptor. J. Biol. Chem. 2012, Aug 3; 287(32): 27079-86) в яде бирманской гадюки Azemiops feae был открыт полипептид-аземиопсин, содержащий 21 аминокислоту (DNWWPKPPHQGPRPPRPRPKP) и также способный блокировать мышечные нАХР. При этом аземиопсин более активен по сравнению с ваглерином-1.
В ходе поиска активного центра аземиопсина (участка аминокислотной последовательности, определяющей основной вклад в способность связываться с нАХР) с помощью методов электрофизиологии (Фиг.1) была протестирована панель пересекающихся пентапептидных фрагментов исходного токсина (Фиг.2). Исследовали их способность подавлять вызванные ацетилхолином токи через экспрессированный в ооцитах шпорцевой лягушки Xenopus laevis мышечный нАХР. Предварительное тестирование этих фрагментов проводили при их концентрации 150 мкг/мл. Результаты данного исследования приведены на Фиг.2. Наиболее активным в данной панели оказался пентапептид SEQ ID NO:1:WWPKP. Вместе с тем этот пептид не проявляет токсичности при внутрибрюшинном введении в дозах до 30 мг/кг включительно и при пероральном введении в дозах до 160 мг/кг включительно.
Для изучения влияния структуры пептида SEQ ID NO:1:WWPKP на его биологическую активность в последовательность пептида (далее Az3) были внесены изменения: 1. введена амидная группа по C-концу (SEQ ID NO:41: H-Trp-Trp-Pro-Lys-Pro-NH2, далее Az3-NH2); 2. произведены замены остатков триптофана на остатки тирозина: [Tyr1]Az3 (SEQ ID NO:3), [Tyr2]Az3 (SEQ ID NO:2) и [Tyr1,Tyr2]Az3 (SEQ ID NO:4); и произведена замена второго аминокислотного остатка на гидрофобный остаток валина ([Val-2]Az3); 4. осуществлена замена лизина-4 на диаминобутановую кислоту SEQ ID NO:5: H-Trp-Trp-Pro-Dbu-Pro-OH (далее [Dbu4]Az3); 5. последовательность пептида была редуцирована до четырех и трех аминокислотных остатков: [des-Trp1]Az3, [des-Pro5]Az3, [des-Trp1,des-Pro5]Az3; 6. получены варианты пептида SEQ ID NO:1 с заменой лизина-4 на аргинин: WYPRP-NH2 ([Tyr2,Arg4]Az3) и YYPRP-NH2 ([Tyr1,Tyr2 Arg4]Az3); 7. получены пептиды с различными модификациями карбоксильной группы Pro5: метиловый эфир и бензиламид: WYPKP-OCH3, Ac-YYPKP-ОСН3, Ac-WYPKP-NH-C6H5, YYPKP-NH-C6H5. Результаты исследований биологической активности полученных вариантов пептида SEQ ID NO:1 приведены на Фиг.3 и Фиг.7. Изучали способность подавлять вызванные ацетилхолином токи через экспрессированный в ооцитах шпорцевой лягушки Xenopus laevis мышечный нАХР. Тестирование этих фрагментов проводили при их концентрации 1 мМ. Можно сделать вывод, что большинство полученных модифицированных пептидов сохранили биологическую активность по отношению к мышечному нАХР, за исключением [Val-2]Az3, [des-Trp1]Az3, [des-Pro5]Az3, [des-Trp1,des-Pro5]Az3.
Синтезированы и протестированы ретропоследовательноси пептидов Az3 и [Tyr2]Az3: PKPWW и PKPYW соответственно. Ингибирующая активность по отношению к мышечному рецептору сохранена, но находится на более низком уровне. На Фиг.5 приведена диаграмма тестирования ретропопептидов и сравнения с активностью исходных Az3 и [Tyr2]Az3. Пептиды тестировали в концентрации 1 мМ.
Для сравнения эффективности подавления тока через канал рецептора фрагментами аземиопсина и коммерческими образцами Синэйка и Виалокса были проведены дополнительные опыты. Вещества тестировались в концентрации 1 мМ. Результаты приведены на Фиг.3.
По результатам тестов наиболее целесообразным было признано в дальнейших исследованиях использовать амидированную форму пентапептидного фрагмента аземиопсина с заменой второй аминокислоты на тирозин SEQ ID NO:42: H-Trp-Tyr-Pro-Lys-Pro-NH2 (далее [Tyr2]Az3-NH2).
Для более детального сравнения [Tyr2]Az3-NH2 с наиболее распространенным коммерческим продуктом Синэйком были построены кривые зависимости ингибирующей активности от концентрации, которые представлены на Фиг.3. Концентрация, при которой происходит подавление тока на 50% (значение IC50), для пептида [Tyr2]Az3-NH2 соответствует 23 мкМ, в то время как аналогичная концентрация Синэйка равняется 180 мкМ, то есть новый пептид оказался почти в 8 раз функционально активнее коммерческого продукта. Это отражено в виде гистограммы на Фиг.5.
Соединения изобретения.
1. Поставленная задача получения новых соединений блокирующих мнАХР решается за счет за счет структуры пептида, имеющего следующую формулу (I): X1-X2-X3-Pro-X4-Pro-X5, где
X1 выбирают из H, Ac-, Palm-
X2 выбирают из Trp, Tyr,
X3 выбирают из Trp, Tyr,
X4 выбирают из Lys, Orn, Dbu, Dpr, Arg
X5 выбирают из -OH, -NH2, -OCH3, -OC2H5, -NH-C6H5,
Предпочтительно соединения формулы (I) выбирают из группы, состоящей из:
SEQ ID NO:1: H-Trp-Trp-Pro-Lys-Pro-OH
SEQ ID NO:2: Н-Trp-Tyr-Pro-Lys-Pro-OH
SEQ ID NO:3: H-Tyr-Trp-Pro-Lys-Pro-OH
SEQ ID NO:4: H-Tyr-Tyr-Pro-Lys-Pro-OH
SEQ ID NO:5: H-Trp-Trp-Pro-Dbu-Pro-OH
SEQ ID NO:6: H-Trp-Tyr-Pro-Dbu-Pro-OH
SEQ ID NO:7: H-Tyr-Trp-Pro-Dbu-Pro-OH
SEQ ID NO:8: H-Tyr-Tyr-Pro-Dbu-Pro-OH
SEQ ID NO:9: Ac-Trp-Trp-Pro-Lys-Pro-OH
SEQ ID NO:10: Ac-Trp-Tyr-Pro-Lys-Pro-OH
SEQ ID NO:11: Ac-Tyr-Trp-Pro-Lys-Pro-OH
SEQ ID NO:12: Ac-Tyr-Tyr-Pro-Lys-Pro-OH
SEQ ID NO:13: Ac-Trp-Trp-Pro-Dbu-Pro-OH
SEQ ID NO:14: Ac-Trp-Tyr-Pro-Dbu-Pro-OH
SEQ ID NO:15: Ac-Tyr-Trp-Pro-Dbu-Pro-OH
SEQ ID NO:16: Ac-Tyr-Tyr-Pro-Dbu-Pro-OH
SEQ ID NO:17: Ac-Trp-Trp-Pro-Lys-Pro-NH2
SEQ ID NO:18: Ac-Trp-Tyr-Pro-Lys-Pro-NH2
SEQ ID NO:19: Ac-Tyr-Trp-Pro-Lys-Pro-NH2
SEQ ID NO:20: Ac-Tyr-Tyr-Pro-Lys-Pro-NH2
SEQ ID NO:21: Ac-Trp-Trp-Pro-Dbu-Pro-NH2
SEQ ID NO:22: Ac-Trp-Tyr-Pro-Dbu-Pro-NH2
SEQ ID NO:23: Ac-Tyr-Trp-Pro-Dbu-Pro-NH2
SEQ ID NO:24: Ac-Tyr-Tyr-Pro-Dbu-Pro-NH2
SEQ ID NO:25: H-Trp-Trp-Pro-Lys-Pro-OCH3
SEQ ID NO:26: H-Trp-Tyr-Pro-Lys-Pro-OCH3
SEQ ID NO:27: H-Tyr-Trp-Pro-Lys-Pro-OCH3
SEQ ID NO:28: H-Tyr-Tyr-Pro-Lys-Pro-OCH3
SEQ ID NO:29: H-Trp-Trp-Pro-Dbu-Pro-OCH3
SEQ ID NO:30: H-Trp-Tyr-Pro-Dbu-Pro-OCH3
SEQ ID NO:31: H-Tyr-Trp-Pro-Dbu-Pro-OCH3
SEQ ID NO:32: H-Tyr-Tyr-Pro-Dbu-Pro-OCH3
SEQ ID NO:33: Ac-Trp-Trp-Pro-Lys-Pro-OCH3
SEQ ID NO:34: Ac-Trp-Tyr-Pro-Lys-Pro-OCH3
SEQ ID NO:35: Ac-Tyr-Trp-Pro-Lys-Pro-OCH3
SEQ ID NO:36: Ac-Tyr-Tyr-Pro-Lys-Pro-OCH3
SEQ ID NO:37: Ac-Trp-Trp-Pro-Dbu-Pro-OCH3
SEQ ID NO:38: Ac-Trp-Tyr-Pro-Dbu-Pro-OCH3
SEQ ID NO:39: Ac-Tyr-Trp-Pro-Dbu-Pro-OCH3
SEQ ID NO:40: Ac-Tyr-Tyr-Pro-Dbu-Pro-OCH3
SEQ ID NO:41: H-Trp-Trp-Pro-Lys-Pro-NH2
SEQ ID NO:42: H-Trp-Tyr-Pro-Lys-Pro-NH2
SEQ ID NO:43: H-Tyr-Trp-Pro-Lys-Pro-NH2
SEQ ID NO:44: H-Tyr-Tyr-Pro-Lys-Pro-NH2
SEQ ID NO:45: H-Trp-Trp-Pro-Dbu-Pro-NH2
SEQ ID NO:46: H-Trp-Tyr-Pro-Dbu-Pro-NH2
SEQ ID NO:47: H-Tyr-Trp-Pro-Dbu-Pro-NH2
SEQ ID NO:48: H-Tyr-Tyr-Pro-Dbu-Pro-NH2
Пептиды настоящего изобретения могут состоять из стереоизомеров или смесей стереоизомеров аминокислот, то есть аминокислоты могут быть L- и/или D-конфигурации или быть рацемической смесью, независимо друг от друга.
Технический результат заявляемого изобретения достигается за счет таких свойств нового пептида, как: селективное блокирование мнАХР, отсутствие токсичности и аллергенности.
Поскольку заявляемые пептиды небольшие по размеру и содержат в своем составе 5 аминокислотных остатков, то они могут быть получены при помощи химического синтеза. Заявляемые пептиды являются новыми соединениями и не имеют близких гомологов.
Заявляемые пептиды могут быть использованы в косметологии в косметической композиции в форме крема, лосьона или геля для нанесения на кожу лица для уменьшения глубины мимических и возрастных морщин. Весовая концентрация пептида в косметической композиции находится в диапазоне 0.01-5%. Кроме соединения общей формулы (I) такая косметическая композиция может содержать как минимум один дополнительный компонент, выбранный из: аминокислот, белков, гидролизатов белков, факторов роста, ферментов, ингибиторов ферментов, пептидов, олигосахаридов, полисахаридов, пиримидинов, пуринов, нуклеотидов, нуклеозидов, карбоксильных кислот, жирных кислот, липидов, сфинголипидов, флавоноидов, фенолов, полифенолдов, терпенов, алкалоидов, бензофуранов, полиспиртов, антимикробных компонентов, антимикробных пептидов, витаминов, провитаминов, ретиноидов, каротеноидов, хелатирующих агентов, антиоксидантов, веществ, улучшающих проницаемость кожи.
Изобретение иллюстрируют Фиг.1-6:
Фиг.1 Пример записи тока через мышечный нАХР, гетерологически экспрессированный в ооцитах шпорцевой лягушки Xenopus laevis, в ответ на добавление 20 мкМ ацетилхолина. Каждая аппликация ацетилхолина, в присутствии лиганда или без него, отмечена черным прямоугольником сверху. Контрольный ток, крайний слева, сравнивается с током, полученным в присутствии 50 мкМ аземиопсина. Стрелкой показано время начала преинкубации. Временной интервал между аппликациями ацетилхолина 5 минут. Продемонстрировано полное подавление аземиопсином активности мышечного рецептора.
Фиг.2. Сравнение эффективности подавления тока через канал мышечного нАХР перекрывающимися пятичленными фрагментами аземиопсина, а так же коммерчески доступными соединениями Syn-ake и Vialox. За 100% принято полное подавление тока, 0% - ток на уровне контрольного. Все соединения взяты в концентрации 150 мкг/мл.
Фиг.3. Сравнение эффективности подавления тока через канал мышечного нАХР различными производными аземиопсина и коммерчески доступными препаратами Syn-ake и Vialox. Тестируемые соединения взяты в концентрации 1 мМ. За 100% принято полное подавление тока, 0% - ток на уровне контрольного тока в ответ на аппликацию 20 мкМ ацетилхолина.
Фиг.4. Сравнение кривых зависимости ингибирующей активности от концентрации для пептида SEQ ID NO:41 ([2Tyr]Az3NH2) и коммерческого препарата Syn-ake. По оси абсцисс отложены десятичные логарифмы концентраций лигандов, по оси ординат отложен ток через канал рецептора в процентах от контрольного тока в ответ на аппликацию 20 мкМ ацетилхолина.
Фиг.5. Сравнение концентраций половинного подавления ответа тока через канал мышечного нАхР. По оси ординат отложена концентрация тестируемого препарата ([Tyr2]Az3-NH2 и Syn-ake).
Фиг.6. Сравнение эффективности подавления тока через канал мышечного нАХР пептидами Az3-NH2, [2Tyr]Az3-NH2 и их ретропоследовательностями в концентрации 1 мМ. За 100% принято полное подавление тока, 0% - ток на уровне контрольного.
Фиг.7. Запись тока через мышечный нАХР, гетерологически экспрессированный в ооцитах шпорцевой лягушки Xenopus laevis, в ответ на добавление 20 мкМ ацетилхолина. Каждая аппликация ацетилхолина, в присутствии лиганда или без него, отмечена черным квадратом сверху. Контрольный ток, крайний слева, сравнивается с током, полученным в присутствии 1 мМ раствора пептида. Серые прямоугольники обозначают период аппликации тестируемого пептида. Для пептида WYPKP-OCH3 (Фиг.7А) ингибирование тока составило 40%, для Ac-YYPKP-OCH3 (Фиг.7Б) ингибирование тока составило 38%, для Ac-WYPKP-NH-C6H5 (Фиг.7В) ингибирование тока составило 62%, для YYPKP-NH-C6H5 (Фиг.7Г) ингибирование тока составило 18%, для WYPRP-NH2 (Фиг.7Д) ингибирование тока составило 100%, для YYPRP-NH2 (Фиг.7Е) ингибирование тока составило 100%;
Примеры осуществления изобретения.
Пример 1. Химический синтез пептида SEQ ID NO:1: H-Trp-Trp-Pro-Lys-Pro-OH.
Присоединение первой аминокислоты. Получение Fmoc-Pro-P (Fmoc=9-флуоренилметилоксикарбонил, P=полимер).
200 мг 2-хлоротритилхлоридного полимера с содержанием гидроксильных групп 1,0 ммоль/г промывают безводным хлористым метиленом. В 5 мл хлористого метилена растворяют 374 мг (1,1 ммоль) Fmoc-Pro-OH и 374 мкл (2,2 ммоль) диизопропилэтиламина, раствор перемешивают 5 мин и затем приливают к полимеру. Реакцию проводят 1 час при комнатной температуре и перемешивании. По окончании реакции полимер отфильтровывают и трижды промывают последовательно хлористым метиленом, этиловым спиртом, диметилформамидом.
Описание одного синтетического цикла наращивания полипептидной цепи.
Получение Fmoc-Lys(Boc)-Pro-P:
а) Полученный на предыдущем этапе пептидил-полимер в течение 20 мин обрабатывают 20%-ным раствором пиперидина в диметилформамиде. Полимер промывают последовательно 5 мл следующих растворителей: диметилформамидом - 3 раза по 2 мин, смесью диоксан-вода (2:1) - 2 раза по 5 мин, диметилформамидом - 5 раз по 2 мин.
б) В 5 мл диметилформамида растворяют 505 мг (1,1 ммоль) Fmoc-Lys(Boc)-OH, 150 мг (1,1 ммоль) 1-гидроксибензотриазола, и 170 мкл (1,1 ммоль) N,N′-диизопропилкарбодиимида, раствор перемешивают 10 мин при 0°C и затем приливают к полимеру. Реакцию проводят 4 часа при периодическом перемешивании. По окончании реакции полимер отфильтровывают, промывают диметилформамидом, и обрабатывают 5 мл смеси Ac2O-пиридин-диметилформамид (20:20:60) в течение 1 ч., после чего полимер последовательно промывают диметилформамидом, изопропанолом, диметилформамидом.
Синтез полипептидной цепи проводят вручную в стеклянном проточном реакторе (2×20 см) по следующему протоколу для каждого синтетического цикла (из расчета 8-10 мл растворителя на 400 мг исходного полимера), при проведении реакции конденсации (операция 6) используют объем реакционной смеси 5-7 мл:
1. ДМФА (диметилформамид) (5×2 мин);
2. 20% пиперидин в ДМФА (20 мин);
3. ДМФА (3×2 мин);
4. диоксан-вода, 2:1, (2×5 мин);
5. ДМФА (5×2 мин);
6. Реакция конденсации: 5 молярных эквивалентов активированной Fmoc-аминокислоты (4 ч.);
7. ДМФА (3×2 мин);
8. ацилирование: Ac2O-пиридин-диметилформамид, 20:20:60, (1 ч.);
9. ДМФА (3×2 мин);
10. изопропанол (3×2 мин);
Для активации Fmoc-производных аминокислот с использованием смеси DIPCDI/HOBT (N,N′-диизопропилкарбодиимид/1-гидроксибензотриазол) к раствору 1,1 ммоль (5 эквивалентов) Fmoc-защищенной аминокислоты и 150 мг (1,1 ммоль, 5 эквивалентов) HOBt в 4 мл ДМФА добавляют 170 мкл (1,1 ммоль, 5 эквивалентов) DIPCDI, раствор перемешивают 10 мин.
Полноту протекания реакции конденсации контролируют с помощью нингидринового или, в случае N-концевого пролина, изатинового тестов после операции 6 синтетического протокола.
Для синтеза используют следующие производные аминокислот: Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH.
Отщепление пептида от полимера.
Для реакции отщепления пептида от полимера и одновременного деблокирования защитных групп боковых цепей аминокислот отбирают 800 мг пептидил-полимера. К пептидил-полимеру приливают 15 мл смеси ТФУ (трифторуксусная кислота) -H2O в объемном соотношении 97.5:2.5, суспензию перемешивают в течение 2 ч., затем полученный раствор пептида отфильтровывают от полимера, промывают 5 мл ТФУ и избыток ТФУ упаривают при пониженном давлении. Пептид осаждают 100 мл этилового эфира, отфильтровывают и промывают эфиром (5×20 мл). Осадок растворяют в 5 мл 10% уксусной кислоты 20 мин, отфильтровывают и промывают 5 мл 10% уксусной кислоты. Полученный раствор пептида лиофилизируют и обессоливают на колонке (2,5×60 см) с Сефадексом G-10 в 0.1М уксусной кислоте. Очистку пептида проводят с помощью обращенно-фазной ВЭЖХ в градиенте ацетонитрила (от 10% до 35% за 75 мин) в 0.1% уксусной кислоте при расходе элюента 3 мл/мин, поглощение элюата регистрируют при длине волны 226 нм. Фракции, соответствующие основному пику на хроматограмме собирают и лиофилизируют. Молекулярная масса пептида, установленная методом масс-спектрометрии, составила 713.8 Да, теоретическая расчетная молекулярная масса - 712.8 Да.
Пример 2. Определение острой токсичности пептида H-Trp-Trp-Pro-Lys-Pro-OH.
Определение острой токсичности (LD50) при внутрибрюшинном введении пептида H-Trp-Trp-Pro-Lys-Pro-OH было проведено на 40 самцах мышей линии Balb весом 20-23 г., разделенных на пять равных групп. Пептид вводили мышам внутрибрюшинно в концентрациях 1 мг/кг, 3 мг/кг, 10 мг/кг и 30 мг/кг в 0,2 мл стерильного 0,9% раствора NaCl. Животным контрольной группы в том же объеме вводили 0,9% раствор NaCl. По результатам эксперимента не было обнаружено токсического эффекта пептида ни для одной из указанных концентраций.
Исследование по изучению острой токсичности (DI50 per os) при введении пептида в желудок проведено на 40 самцах мышей линии Balb весом 20-23 г. Животные были случайным образом разделены на 5 равных групп. Препарат вводили животным однократно в желудок с использованием специального зонда в дозах 2,5 мг/кг, 10 мг/кг, 40 мг/кг, 160 мг/кг в 0,2 мл стерильного 0,9% раствора NaCl. Животным контрольной группы в том же объеме вводили 0,9% раствор NaCl. При введении исследуемого пептида в желудок мышей в вышеприведенных концентрациях не было обнаружено токсического эффекта.
Пример 3. Приготовление косметического крема, содержащего пептид H-Trp-Trp-Pro-Lys-Pro-OH в диапазоне весовых концентраций 0.01-5%. Состав крема: H-Trp-Trp-Pro-Lys-Pro-ОН - 0.01%, 1% или 5%, глицерин - 20%, стеариновая кислота - 2%, бутилпарабен - 1%, глицерил стеарат - 1%, цетеариловый спирт - 2%, децилолеат - 3%, вода до 100%. Все ингредиенты, кроме воды и пептида H-Trp-Trp-Pro-Lys-Pro-OH, смешивают и нагревают до 70°C до получения однородной прозрачной массы. Затем смесь охлаждают до температуры 40°C и добавляют при интенсивном перемешивании водный раствор пептида H-Trp-Trp-Pro-Lys-Pro-OH. Дают крему медленно охладиться до комнатной температуры.
Пример 4. Исследование кожно-раздражающего действия препарата в остром, однократное воздействие, и подостром, повторное ежедневное воздействие в течение 2-х недель, опытах было проведено на пяти здоровых добровольцах (3 женщины (возраст 24, 29 и 51 год) и 2 мужчины (возраст 44, 46 лет). Образцы крема, содержащего 0.01%, 1% или 5% исследуемого пептида, наносили ежедневно в течение двух недель на области лба и предплечья. Кожно-раздражающего действия не было обнаружено ни при однократном, ни при последовательном нанесении препарата.
Пример 5. Электрофизиологическое исследование проводимости никотиновых ацетилхолиновых рецепторов (нАХР) мышечного типа, гетерологически экспрессированых в ооцитах шпорцевой лягушки Xenopus laevis. Взрослую шпорцевую лягушку (не менеее 8 см) помещали в раствор пара-аминобензойной кислоты на 15-20 минут до полного обездвиживания. Для извлечения необходимого количества ооцитов делали надрез кожи и слоя мышц на брюхе лягушки параллельно «линии бикини» и отделяли небольшую часть яичника. Извлеченную часть яичника помещали в буфер ND96 без ионов кальция и измельчали. При необходимости ооциты дополнительно обрабатывали раствором коллагеназы. Прооперированному животному зашивали операционные надрезы тканей с помощью шовного материала из полигликолида. Каждую шпорцевую лягушку оперировали не чаще, чем раз в 6 недель.
Экспрессию рецептора проводили в соответствии со следующей процедурой: раствор смеси плазмид, содержащих вставки процессированных генов α1, β1, δ и ε-субъединиц мышечного нАХР под управлением CMV-промотора, инъецировали в ядро свежевыделенных ооцитов с помощью установки Nanoject («Drummond scientific», США), после чего ооциты инкубировали при 18°C в течение 48 часов.
нАХР мышечного типа является лиганд-управляемым ионным каналом. При взаимодействии с агонистом (ацетилхолин или никотин) рецептор претерпевает конформационные изменения, в результате которых сквозь пору между его субъединицами проходят положительно заряженные ионы. При подключении электродов к мембране клетки, экспрессирующей данный рецептор, появляется возможность производить запись ионного тока через открытые каналы рецепторов.
Ооциты помещали в камеру с электродами, подключенными к усилителю Turbo-TEC 03Х (NPI Electronics, США); камера была предварительно заполнена буфером ND96. Тестирование проводилось в опытах по двухэлектродной фиксации потенциала на мембране. Электроды усилителя, изготовленные из боросиликатного стекла и заполненные 3M КСl вводились в ооцит. Мембранный потенциал фиксировали на уровне - 70 мВ. Ооциты, экспрессирующие мышечный нАХР, подвергали воздействию 20 мкМ ацетилхолина каждые пять минут до тех пор, пока амплитуда тока в ответ на аппликацию ацетилхолина не достигала стационарного уровня. Затем проводили пятиминутную преинкубацию ооцита в растворе тестируемого пептида. После пятиминутной преинкубации с пептидом ооцит подвергали воздействию раствора 20 мкМ ацетилхолина в присутствии тестируемого лиганда. Опыты повторяли с различными концентрациями тестируемых пептидов на нескольких ооцитах из разных партий. Амплитуду тока в ответ на аппликацию ацетилхолина в присутствии тестируемого лиганда сравнивали с амплитудой тока в ответ на контрольную аппликацию (в отсутствии тестируемого лиганда), предшествовавшую каждому опыту. Для выяснения характеристик тестируемого пептида строили зависимость амплитуды тока (выраженной в процентах от контрольной) от десятичного логарифма концентрации лиганда. Расчет кривых ингибирования и значений ЕС50 проводили с помощью программы Origin7.5 с использованием модели «dose response».
1. Соединение общей формулы (I): X1-X2-X3-Pro-X4-Pro-X5, где
X1 выбирают из H, Ac-, Palm-
X2 выбирают из Trp, Tyr,
X3 выбирают из Trp, Tyr,
X4 выбирают из Lys, Orn, Dbu, Dpr, Arg
X5 выбирают из -OH, -NH2, -OCH3, -OC2H5, -NH-C6H5,
характеризующееся способностью селективно блокировать мышечный никотиновый ацетилхолиновый рецептор и пригодное для использования в косметологии для разглаживания мимических и возрастных морщин, причем это соединение может быть представлено в виде ретроизомера.
2. Соединение по п.1, отличающееся тем, что X1 означает Ac-
3. Соединение по п.1, отличающееся тем, что X5 означает -NH2
4. Соединение по п.1, отличающееся тем, что X2 и X3 означает -Trp- или -Tyr-, X4 означает -Lys- или -Dbu-.
5. Соединение по п.1, характеризующееся тем, что оно имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48
6. Применение одного из соединений по любому из пп.1-5 в качестве активного вещества для блокирования нервно-мышечной передачи.
7. Применение одного из соединений по любому из пп.1-5 для получения косметической композиции для топического применения, пригодной для разглаживания мимических и возрастных морщин.
8. Косметическая композиция для разглаживания мимических и возрастных морщин, отличающаяся тем, что содержит в качестве активного начала соединение общей формулы (I) в диапазоне весовых концентраций от 0.01 до 5%.
9. Косметическая композиция по п.8, отличающаяся тем, что содержит: как минимум одно соединение общей формулы (I) и как минимум один дополнительный компонент, выбранный из аминокислот, белков, гидролизатов белков, факторов роста, ферментов, ингибиторов ферментов, пептидов, олигосахаридов, полисахаридов, пиримидинов, пуринов, нуклеотидов, нуклеозидов, карбоксильных кислот, жирных кислот, спиртов, липидов, сфинголипидов, флавоноидов, терпенов, алкалоидов, бензофуранов, полиспиртов, антимикробных компонентов, антимикробных пептидов, витаминов, провитаминов, ретиноидов, каротеноидов, хелатирующих агентов, антиоксидантов, веществ, улучшающих проницаемость кожи.
10. Косметическая композиция по п.8 для разглаживания мимических и возрастных морщин, отличающаяся тем, что содержит дерматологически приемлимый носитель.
11. Косметическая композиция по п.8, отличающаяся тем, что представлена в форме раствора, дисперсии, эмульсии или липосом.
12. Косметическая композиция по п.8, отличающаяся тем, что представлена в форме лосьона, молочка, мази, крема, геля, гелеобразных полимеров, спреев или масок для лица.
