Способ формирования многофункциональных микросистем


 


Владельцы патента RU 2532559:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) (RU)
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования Национальный исследовательский ядерный университет МИФИ (НИЯУ МИФИ) (RU)

Изобретение относится к области химии высокомолекулярных соединений, в частности к способам получения полимерных носителей путем химической модификации исходных полимерных микросфер на основе сополимера акролеина-стирола, полученных безэмульгаторной радикальной полимеризацией. Способ включает взаимодействие микросфер с положительно заряженным полиэлектролитом, а затем отрицательно заряженным полиэлектролитом, что приводит к формированию полиэлектролитного комплекса (ПЭК) на поверхности частиц. После двукратного повторения процедуры последовательного осаждения ПЭК вводят агенты, обеспечивающие визуализацию - полупроводниковые нанокристаллы (квантовые точки), соли редкоземельных металлов, магнитные частицы, органические красители. Причем положительно заряженный полиэлектролит добавляют в количестве 100-200% от массы микросфер, а отрицательно заряженный полиэлектролит - в эквимолярном количестве. Количество визуализирующих агентов составляет 5-40% от массы полиэлектролита. Далее формируют внешний полиэлектролитный слой поли-L-лизина и полиакриловой кислоты. Способ позволяет получить носители визуализирующих и физиологически активных агентов, предназначенные для применения в области биотехнологии, медицины, ветеринарии, биохимии, аналитической химии, мониторинга состояния окружающей среды. 5 пр.

 

Изобретение относится к области химии высокомолекулярных соединений, в частности к способам получения полимерных носителей путем химической модификации исходных полимерных микросфер на основе акролеина и стирола

Изобретение предназначается для использования в биотехнологии, медицине, ветеринарии, биохимии, аналитической химии, мониторинге состояния окружающей среды и других отраслях для получения носителей для иммобилизации физиологически активных лигандов.

Описание изобретения

Полимерные синтетические микросферы с узким распределением по размерам применяют в различных областях науки и техники, например, в качестве калибровочных эталонов в электронной и оптической микроскопии, при подсчете аэрозольных частиц, при малоугловой рефракции рентгеновских лучей, для счета вирусных частиц, для стимулирования клеточного продуцирования антител и их очистки, в качестве модельных коллоидных систем для изучения их реологии, стабильности, седиментации и т.д. В последние годы микросферы монодисперсных суспензий нашли широкое применение в качестве носителей биологических лигандов при создании реагентов для биоаналитических исследований, основанных на детекции специфических взаимодействий биообъектов. Основные требования, которым в этом случае должны удовлетворять полимерные микросферы, - это биологическая, химическая и коллоидная устойчивость в физиологических жидкостях, узкое распределение частиц по размерам, функционализация поверхности, определяющая направленность действия микросфер. Кроме того, необходимо уметь получать дисперсии с заданными размерами микросфер, которые содержат визуализурующие метки, которые определяют их применение в различных видах анализа с визуальной или инструментальной детекцией результатов биоспецифических реакций.

К настоящему времени разработаны способы включения гидрофобных визуализирующих меток в процессе эмульсионной полимеризации стирола, по которому получают частицы с диаметром от 400 нм и широким распределением по размерам. [Yang X, Zhang Y. Encapsulation of quantum nanodots in polystyrene and silica micro-nanoparticles. Langmuir. 20, 6071-6073 (2004)]. Однако частицы характеризовались низкой интенсивностью флуоресценции, вероятно, из-за отсутствия эффективного транспорта визуализирующие метки из капель мономера в растущие полимерно-мономерные частицы.

Известен способ миниэмульсионной полимеризации стирола, который позволяет вводить визуализирующие метки на стадии полимеризации, при этом получают интенсивно флуоресцирующие частицы. [А.С.С. Esteves, A. Barros-Timmons, Т. Monteiro, Т. Trindade, J. Nanosci. Nanotechnol. 2005, 5, 766-771]. Полученные полимерные дисперсии предлагалось использовать в качестве носителя для флуоресцентного иммуноанализа, но наличие двух пулов частиц с различными диаметрами, из которых частицы с наименьшем диаметром на содержат визуализирующие метки, ограничивает область их применения.

Кроме того, описанные подходы трудоемки и многоступенчаты, а полученные микросферы не содержат функциональные группы, необходимые для использования микросфер в биоаналитических исследованиях.

Известен способ введения визуализирующих меток в функционализированные полимерные микросферы, согласно которому водную среду предварительно синтезированной дисперсии сополимерных микросфер на основе акролеина и стирола заменяют на водно-органическую (вода:пропанол-2, 20:10). В процессе набухания сополимерных микросфер к ним добавляют визуализирующие метки в смеси растворителей хлороформ:пропанол-2, 1:20 после удаления триоктилфосфин оксида, который стабилизирует визуализирующие метки в процессе их получения [А.N Generalova, S.V. Sizova, Т.A. Zdobnova., М.М. Zarifullina, М.V. Artemyev, А.V. Baranov, V.A. Oleinikov, V.P. Zubov, S.М. Deyev, Submicron polymer particles containing fluorescent semiconductor nanocrystals CdSe/ZnS for bioassays, Nanomedicine, 2011, V. 6, №2, p. 195-209.], Полученные флуоресцентные микросферы отвечают необходимым требованиях для их использования в биоанализе, однако наблюдается снижение интенсивности флуоресценции и смещение пика эмиссии в красную область по сравнению с исходными визуализирующими метками.

Изобретение решает задачу - разработать эффективный способ получения функционализированных частиц регулируемого диаметра без указанных недостатков. Поставленная задача решается за счет введения визуализирующих меток в состав полиэлектролитных (ПЭ) комплексов, сформированных на поверхности полимерных частиц, так называемый метод послойной адсорбции ПЭ, который является простым методом самосборки, позволяющим исключить сложные химические реакции; предлагает большой выбор ПЭ для внешнего слоя (белки, ферменты и т.д.), который определяет применение полимерных частиц в биоанализе; дает возможность подобрать размер и структуру многослойных частиц в соответствии с требованиями дальнейшего их применения.

Визуализирующие метки могут быть включены в состав полимерных микросфер на стадии синтеза. В Авторском свидетельстве №1565845 // Ю.В. Лукин, В.А. Сочилин, В.Н. Бахарев, И.А. Грицкова, В.П. Зубов, М.К. Клявиньш, А.С. Роска, А.Х. Зицманис, 22.01.1990 описан способ получения полиакролеиновых микросфер путем полимеризации акролеина в водно-щелочной среде в присутствии в присутствии водорастворимых органических красителей, который позволяет получать окрашенные и флуоресцентные микросферы. Кроме того, эти микросферы содержат функциональные группы (альдегидные), посредством которых может осуществляться присоединение направляющих биоспецифических модулей. Однако эти микросферы характеризовались недостаточной химической стабильностью. Полупроводниковые нанокристаллы включали в процессе эмульсионной полимеризации стирола, в результате чего получены полимерные микросферы с очень низкой флуоресценцией, вероятно, из-за отсутствия эффективного транспорта нанокристаллов из капель мономера в растущие полимерно-мономерные частицы [Yang X, Zhang Y.: Encapsulation ofquantum nanodots in polystyrene and silica micro-nanoparticles. Langmuir. 20, 6071-6073 (2004)]. Метод миниэмульсионной полимеризации стирола позволил решить эти проблемы, но не дал возможности получить интенсивно флуоресцирующие, коллоидно-устойчивые частицы [Joumaa N, Lansalot М, Theretz A, et al.: Synthesis of quantum dot-tagged submicrometer polystyrene particles by miniemulsion polymerization. Langmur. 22, 1810-1816 (2006). Однако эти подходы трудоемки и многоступенчаты, а введение визуализирующих меток на стадии синтеза снижает агрегативную устойчивость полимерных микросфер, усложняет процесс регулирования их свойств и диаметров.

Известен способ получения полимерных частиц, содержащих визуализирующие метки, которые основаны на введении этих меток в уже сформированные микросферы в процессе их набухания в растворителе. Описаны способы введения маслорастворимых органических красителей в полистирольные микросферы, после их предварительного набухания в растворителе. По другому способу полупроводниковые нанокристаллы включали в микросферы на основе сополимера акролеина и стирола, которые находились в пропаноле-2. Нанокристаллы вводили в виде суспензии в смеси растворителей хлороформ/пропанол-2. [А.Н. Генералова, С.В. Сизова, М.С. Гонцова, А.В. Баранов, В.Г. Маслов, М.В. Артемьев, Д.В. Клинов, К.Е. Мочалов, В.П. Зубов, В.А. Олейников. Синтез субмикронных сополимерных (акролеин/стирол) микросфер, содержащих флуоресцентные полупроводниковые CgSe/ZnS нанокристаллы // Российские нанотехнологии, 2 (7-8), 2007, 144-154].

Изобретение предлагает такой способ модификации полимерных микросфер на основе акролеина и стирола, который позволяет унифицировать процедуру введения визуализирующих меток, используя предварительно синтезированные коллоидно и химически устойчивые микросферы, модифицированные ПЭК и содержащие на поверхности направляющий модуль.

Прототипом может служить способ включения полупроводниковых нанокристаллов CdSe/ZnS в слои ПЭК, сформированные на поверхности полиакролеиновых частиц [A.N. Generalova, М.М. Zarifullina, E.V. Lankina, S.V. Sizova, M.V. Artemyev, V.P. Zubov, V.A. Oleinikov, Optical sensing quantum dot-labeled polyacrolein particles prepared by layer-by-layer deposition technique, J. of Colloid and Interface Science, 2011, V. 357, 265-272]. Задачей этой работы являлось получение полимерных частиц диаметром 1.2 мкм методом осадительной полимеризацией акролеина в водно-щелочной среде. Полиакролеиновые микросферы играют роль ядра, на которой формируются ПЭК за счет последовательной адсорбции полиэлектролитов: поли-L-лизина и полистиролсульфоната натрия (1 мг/мл в 0,15 М NaCl).

После двухкратного формирования ПЭК проводили адсорбцию положительно заряженного поли-L-лизина, на который адсорбируют нанокристаллы, модифицированные полистиролсульфонатом натрия при участии тетраметиламмоний гидроксида. Адсорбция ПЭК и нанокристаллов, как одного, так и разных диаметров, может быть проведены два и более раз. Последним наносился слой бычьего сывороточного альбумина (БСА), который является направляющим модулем и определяет рН-чувствительные свойства полученных микросфер, а также позволяет использовать эти микросферы для селективного определения ионов меди.

Изобретение решает задачу получения коллоидно устойчивых микросфер с заданными свойствами на основе акролеина и стирола, получаемых безэмульгаторной радикальной полимеризацией в присутствии вещественного инициатора персульфата калия (K2S2O8). Это позволяет, изменяя соотношение мономеров акролеин/стирол в процессе синтеза, получать полимерные частицы различного диаметра (0.15-0.8 мкм), с различным содержанием функциональных групп (альдегидных) и, соответственно, различным гидрофильно-липофильным балансом и различным зарядом поверхности, что даст возможность использовать в качестве первого слоя сильные (например, полидиаллилдиметиламмоний хлорид, т.д.) и слабые (полизин, полиэтилеиимин, т.д.) полиэлектролиты без потери полимерными частицами коллоидной стабильности (это важно).

Кроме того, в эти исходные частицы можно вводить визуализирующие метки, магнетит, метки на основе комплексов с ионами редкоземельных металлов, что позволит получить гибридные частицы (например, флуоресцентно-магнитные). Порядок введения может быть различным в зависимости от задач.

В качестве внешнего слоя можно использовать полиэлектролиты, содержащие карбоксильную группу, например полиакриловую кислоту, Na-соль сополимера акриловой и малеиновой кислот, т.д. Применяя карбодиимидную активацию карбоксильной группы, можно получить конъюгаты описанных выше частиц с направляющими модулями (белками, антителами, ферментами) и использовать их в различных видах биоанализа.

Техническими результатами изобретения является способ получения коллоидно-устойчивых микросфер на основе акролеина и стирола, содержащих на поверхности полиэлектролитные комплексы (ПЭК), которые повышают коллоидную устойчивость микросфер и позволяют вводить агенты для визуализации и направленной доставки микросфер.

Способ осуществляют следующим образом. Полимерные микросферы получают безэмульгаторной радикальной сополимеризацией акролеина и стирола при объемном соотношении мономер-вода, равном 1:9, в присутствии инициатора персульфата калия при перемешивании в атмосфере инертного газа при температуре 65°C в течение 8 часов. Синтез проводят при мольном соотношении мономеров акролеинхтирол от 0.25:1 до 10:1. Выход полимера составляет порядка 75%, диаметры получаемых частиц от 100 до 600 нм. Полученные суспензии являются коллоидно-устойчивыми в 0.1М растворе электролита NaCl. Затем микросферы на основе сополимера акролеина со стиролом последовательно обрабатывают положительно заряженным полиэлектролитом, а затем отрицательно заряженным полиэлектролитом, что приводит к формированию ПЭК на поверхности частиц, и после двукратного повторения процедуры последовательного осаждения ПЭК, вводят агенты, обеспечивающие визуализацию и направленность доставки микросистем (органические красители, полупроводниковые нанокристаллы, соли редкоземельных металлов, магнитные наночастицы), в один или более слоев ПЭК, регулируя свойства поверхности микросфер с помощью ПЭК внешнего слоя. Агенты могут включать полупроводниковые нанокристаллы, такие как селенид кадмия, селенид кадмия/сульфид цинка, теллурид кадмия, или органические красители из класса флуоресцеина, или комплексы редкоземельных металлов, такие как иттрий фосфаты европия, эрбия, тербия; п-сульфонатотиакаликс[4]арены европия, тербия, гадолиния; фенантролин европия, или магнитные наночастицы, такие как оксид железа (II), оксид железа (III), оксид кобальта (II).

Изобретение иллюстрируется следующими примерами:

Пример 1. В термостатированную колбу, снабженную механической мешалкой и вводом для инертного газа, помещают 5,8 мл свежеперегнанного акролеина, 1 мл стирола (мольное соотношение мономеров 10:1), 61,2 мл дистиллированной воды с растворенным инициатором персульфатом калия (0,1% в расчете на мономеры). Смесь перемешивают в атмосфере инертного газа при температуре 65°C в течение 8 часов. Выход полимера составляет порядка 75%. Получают белую дисперсию частиц на основе сополимера акролеина и стирола со средним диаметром 198±9,7 нм. Полученную дисперсию трижды промывают дистиллированной водой от непрореагировавших компонентов центрифугированием при 8000 об/мин в течение 10 мин. Для получения ПЭ комплекса отмытый осадок редиспергируют в воде до 0,1% концентрации. 0,2 мл полученной дисперсии осаждают центрифугированием и добавляют 0,2 мл Na-боратного буфера рН 8.2 и 0,1 мл положительно заряженного ПЭ поли-L-лизина (0,1%, Мм 120000) в Na-боратного буфере рН 8.2. Выдерживают при комнатной температуре при перемешивании в течение 15 мин, затем трижды промывают центрифугированием. К отмытому осадку добавляют 0,2 мл Na-боратного буфера рН 8.2 и 0,1 мл отрицательно заряженного ПЭ полистиролсульфонат натрия (0,1%, Мм 70000) в Na-боратного буфере рН 8.2. Выдерживают при комнатной температуре при перемешивании в течение 15 мин, затем трижды промывают центрифугированием. Затем дважды повторяют процедуру получения ПЭ комплекса и добавляют поли-L-лизина (0,1%) в Na-боратном буфере рН 8.2, выдерживают при комнатной температуре при перемешивании в течение 15 мин, затем трижды промывают центрифугированием. Добавляют 0,1 мл отрицательно заряженного модифицированного агента в 0,1 М Na-боратном буфере рН 8,2, стабилизированном полистиролсульфонатом натрия (0,1%). Выдерживают при комнатной температуре при перемешивании в течение 30 мин, затем трижды промывают центрифугированием. Формируют ПЭ комплекс поли-L-лизииа (0,1 мл, 0,1%) и полиакриловой кислоты (0,1 мл, 0,1%).

Пример 2. Процесс проводят аналогично описанному в примере 1, для синтеза берут 2,5 мл акролеина, 4,3 мл стирола (мольное соотношение 1:1). Выход полимера составляет порядка 85%. Получают белую дисперсию частиц на основе сополимера акролеина и стирола со средним диаметром 500±20 нм.

Пример 3. Процесс проводят аналогично описанному в примере 1, для синтеза берут 1,3 мл акролеина, 5,5 мл стирола (мольное соотношение 0,5:1). Выход полимера составляет порядка 81%. Получают белую дисперсию частиц на основе сополимера акролеина и стирола со средним диаметром 800±35 нм.

Пример 4. Процесс проводят аналогично описанному в примере 1, для синтеза берут 2,9 мл акролеина, 3,9 мл стирола (мольное соотношение 5:1). Выход полимера составляет порядка 78%. Получают белую дисперсию частиц на основе сополимера акролеина и стирола со средним диаметром 300±15 нм.

Пример 5. Процесс проводят аналогично описанному в примере 1, для синтеза берут 6,35 мл акролеина, 0,45 мл стирола (мольное соотношение 15:1). Выход полимера составляет порядка 65%. Получают белую дисперсию частиц на основе сополимера акролеина и стирола со средним диаметром 120±7 нм.

Способ получения функционализированных полимерных микросфер путем введения агентов для визуализации в полиэлектролитные комплексы, сформированные на поверхности полимерных микросфер, отличающийся тем, что полимерные частицы из сополимера акролеина-стирола, полученные безэмульгаторной радикальной полимеризацией, обрабатывают положительно заряженным полиэлектролитом, затем отрицательно заряженным полиэлектролитом, что приводит к формированию полиэлектролитного комплекса на поверхности полимерной частицы, и после двукратного повторения процедуры последовательного осаждения полиэлектролитного комплекса в один или более слоев вводят визуализирующий агент, выбранный из органических красителей, полупроводниковых нанокристаллов, комплексов редкоземельных металлов, магнитных наночастиц с последующим формированием комплекса поли-L-лизина и полиакриловой кислоты.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к композиции вспениваемых винилароматических полимеров с улучшенной теплоизоляционной способностью, способу ее получения и к вспененным изделиям, полученным из этой композиции.

Настоящее изобретение относится к композициям из вспениваемых винилароматических полимеров. Описана композиция из вспениваемых винилароматических полимеров для получения вспениваемых изделий или экструдированных вспениваемых листов, включающая: а) полимерную матрицу, полученную полимеризацией основы, включающей 50-100 масс.% одного или более винилароматических мономеров и 0-50 масс.% по меньшей мере одного сополимеризуемого мономера; б) 1-10 масс.%, относительно полимера (а), вспенивающего агента, введенного в полимерную матрицу; и нетеплопроводный наполнитель, включающий: в) 0,05-25 масс.%, относительно полимера (а), кокса в форме частиц со средним диаметром (d50) (размером) от 0,5 до 100 мкм, имеющего площадь поверхности, измеренную в соответствии c ASTM D-3037-89 (по методу БЭТ), от 5 до 200 м2/г, и г) 0,05-10 масс.%, относительно полимера (а), вспученного графита в форме частиц со средним диаметром (d50) (размером) от 1 до 30 мкм, имеющего площадь поверхности, измеренную в соответствии с ASTM D-3037-89 (по методу БЭТ), от 5 до 500 м2/г.

Изобретение относится к области получения синтетических каучуков, в частности диеновых (со)полимеров, таких как полибутадиен, полиизопрен и бутадиен-стирольный каучук (БСК), применяемых при производстве шин, резинотехнических изделий, модификации битумов, в электротехнической и других областях.

Изобретение относится к способу получения вспененного полимера на основе стирольного гомополимера или сополимера и к экструдированным пенопластам, полученным этим способом.
Изобретение относится к термопластичным полимерным пенам, и в особенности к экструдированным пеносмесям низкой плотности, и к их переработке. .

Изобретение относится к вспениваемым гранулированным композитным материалам на основе винилароматических полимеров, имеющих улучшенные теплоизоляционные свойства, и к способу их получения (варианты).

Изобретение относится к низкопроницаемым эластомерным нанокомпозитным смесям. .

Изобретение относится к вспенивающимся гранулированным материалам, имеющим композиции на основе винилароматических полимеров, содержащие: а) 65-99,8% по массе полимера, полученного путем полимеризации 85-100% по массе одного или более винилароматических мономеров, имеющих общую формулу (I) где n представляет собой ноль или целое число, колеблющееся в диапазоне от 1 до 5, и Y представляет собой галоген, такой как хлор или бром, или алкил или алкоксильную радикальную группу, имеющую от 1 до 4 атомов углерода, и 0-15% по массе -алкилстирола, в котором алкильная группа содержит от 1 до 4 атомов углерода; b) 0,01-20% по массе, рассчитанных по отношению к полимеру (а), сажи, имеющей средний диаметр частиц, колеблющийся в диапазоне от 10 до 1000 нм, и площадь поверхности, колеблющуюся в диапазоне от 5 до 200 м2/г; с) по меньшей мере, одну из следующих добавок (с1)-(с3): с1) 0,01-5% по массе, рассчитанных по отношению к полимеру (а), графита, имеющего средний диаметр частиц, колеблющийся в диапазоне от 0,5 до 50 мкм; с2) 0,01-5% по массе, рассчитанных по отношению к полимеру (а), оксидов, и/или сульфатов, и/или пластинчатых дихалькогенидов металлов групп IIA, IIIA, IIB, IVB, VIB или VIIIB; с3) 0,01-5% по массе, рассчитанных по отношению к полимеру (а), неорганических производных кремния пластинчатого типа; d) 0,01-4,5% по массе, рассчитанных по отношению к полимеру (а), агента зародышеобразования и е) 1-6% по массе, рассчитанных по отношению к 100 частям общей массы (a)-(d), одного или более вспенивающих веществ.
Изобретение относится к лакокрасочным материалам, а именно к разработке новой пленкообразующей композиции и способа ее получения на основе инден-кумароновой фракции.

Изобретение может быть использовано в космической технике, строительстве, в химической, пищевой и легкой промышленности. Пигмент для светоотражающих покрытий содержит смесь частиц диоксида циркония со средним размером 3 мкм и наночастицы диоксида циркония размером 30-40 нм.
Изобретение относится к технологии получения наноразмерных пленок мультиферроиков и может найти применение в производстве высокодобротных магнитооптических устройств обработки и хранения информации, магнитных сенсоров, емкостных электромагнитов, магнитоэлектрических элементов памяти, невзаимных сверхвысокочастотных фильтров.
Изобретение относится к технологии получения пленок ферритов-гранатов и может быть использовано в прикладной магнитооптике для получения магнитооптических дисков, модуляторов, дефлекторов.

Предлагаемое изобретение относится к порошковой металлургии и может быть использовано для формования изделий как методом литья термопластичного шликера, так и методом прямого формования инжектированием через форсунки.
Группа изобретений может быть использована в производстве катализаторов, в частности, для селективного восстановления NOx. Каталитическая композиция содержит по меньшей мере один оксид на носителе, состоящий из оксида циркония, или оксида титана, или смешанного оксида циркония и титана, или из оксида циркония и оксида по меньшей мере одного оксида другого элемента, выбранного из празеодима, лантана, неодима и иттрия, нанесенный на носитель на основе оксида кремния.

Изобретение относится к области плазмохимии и может быть использовано для производства фуллеренов и нанотрубок. Углеродосодержащее сырье разлагают в газовом разряде, для чего сначала зажигают объемный тлеющий разряд в смеси газообразных углеводородов и инертного газа при давлении 20-80 Торр.
Изобретение может быть использовано при изготовлении композитов на основе полимеров. Углеродные нанотрубки функционализируют карбоксильными и/или гидроксильными группами и обрабатывают ультразвуком в органическом растворителе в присутствии продуктов реакции тетрабутилтитаната со стеариновой или олеиновой кислотой при температуре от 40оС до температуры кипения растворителя.
Изобретение может быть использовано при изготовлении композитов, содержащих органические полимеры. Дисперсия углеродных нанотрубок содержит 1 мас.ч.

Изобретение относится к нанотехнологии, в частности к способу получения модифицированных наночастиц железа, которые могут быть использованы при создании магнитоуправляемых материалов.

Изобретение относится к способу нанесения наноалмазного материала комбинированной электромеханической обработкой и может быть использовано в машиностроительной, авиационной, автомобильной и других отраслях промышленности.

Изобретение может быть использовано в космической технике, строительстве, в химической, пищевой и легкой промышленности. Пигмент для светоотражающих покрытий содержит смесь частиц диоксида циркония со средним размером 3 мкм и наночастицы диоксида циркония размером 30-40 нм.
Наверх