Способ получения конъюгата капсульного полисахарида haemophilus influenzae тип b (hib) c антигенами для создания иммунобиологических препаратов


 


Владельцы патента RU 2542393:

Федеральное бюджетное учреждение науки "Ростовский научно-исследовательский институт микробиологии и паразитологии" (ФБУН РостовНИИ микробиологии и паразитологии) (RU)

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа получения конъюгата капсульного полисахарида Haemophilus influenzae тип b (Hib) с антигенами. Представленный способ включает получение смеси столбнячного и дифтерийного анатоксинов, адсорбированных на геле гидроокиси или фосфата алюминия, которую используют в качестве антигена. Указанную смесь центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин, полученный осадок связывают карбодиимидным способом через дигидразид адипиновой кислоты с 3 мг капсульного полисахарида Hib, растворенного в 1 мл дистиллированной воды. Конъюгат отмывают 0,9% раствором натрия хлорида при центрифугировании 3000 об/мин в течение 5 мин и доводят 0,9% раствором натрия хлорида до объема 100 мл. Охарактеризованный способ позволяет исключить лиофилизацию получаемых конъюгатов и тем самым снизить антигенную нагрузку на иммунизируемый организм. 1 табл.

 

Изобретение относится к биотехнологии и касается способа связывания капсульного полисахарида Haemophilus influenzae тип b (Hib) с антигенами, в качестве которых используются столбнячный и дифтерийный анатоксины.

Существует способ связывания капсульного полисахарида Hib, при котором модифицированный бромцианом капсульный полисахарид Hib и дериват дифтерийного анатоксина десятикратно отмывают от продуктов химической реакции методом ультрафильтрации, концентрируют, смешивают в равных объемах и инкубируют в течение 18 часов при 4°C до получения конъюгата (US 4496538).

Существует способ конъюгации, в котором капсульный полисахарид Hib ковалентно связывают со столбнячным анатоксином через дигидразид адипиновой кислоты и очищают методом ультрафильтрации от не связавшихся компонентов. Полученный конъюгат адсорбируют на геле фосфата алюминия и лиофилизируют. Перед применением препарат смешивают с водой для инъекций или с другой жидкой многокомпонентной вакциной (АКДС), адсорбированной на геле фосфата алюминия (US 20020182226).

Существует также способ связывания, в котором капсульные полисахариды Hib и менингококка конъюгируют со столбнячным и дифтерийным анатоксинами соответственно. Полученные препараты отмывают и концентрируют с использованием ультрафильтрации. Каждый из конъюгатов отдельно адсорбируют на геле фосфата алюминия, объединяют и лиофилизируют в присутствии сахарозы. Перед введением лиофилизат смешивают с жидкими компонентами вакцины (поверхностный антиген гепатита B, цельные клетки коклюша), адсорбированными на геле фосфата алюминия (US 20030180316).

В указанных способах конъюгация капсульного полисахарида Hib с белковыми антигенами осуществляется в водных средах. Для удаления химических реагентов и не связавшихся компонентов использовался метод мембранной ультрафильтрации. Эта технология требует высоких концентраций антигенов, больших объемов буферных растворов и ведет к значительным потерям препарата на различных стадиях производства. Для использования полученного конъюгата в качестве составляющей многокомпонентной вакцины необходима его лиофилизация в присутствии стабилизатора (сахароза, лактоза и т.п.), что существенно сказывается на свойствах и себестоимости конечного продукта. В случае смешивания конъюгата с АКДС-вакциной происходит антигенная перегрузка иммунизируемого организма дифтерийным или столбнячным анатоксинами.

Целью настоящего изобретения явилась разработка способа связывания капсульного полисахарида Hib с белковыми антигенами, который позволил бы исключить лиофилизацию конъюгатов и снизить антигенную нагрузку на иммунизируемый организм.

Поставленная цель достигается тем, что химическое связывание капсульного полисахарида Haemophilus influenzae тип b осуществляют со смесью столбнячного и дифтерийного анатоксинов, адсорбированных на геле гидроокиси алюминия или геле фосфата алюминия.

Способ осуществляют следующим образом.

Используют капсульный полисахарид Haemophilus influenzae тип b, полученный по технологии, описанной в патенте RU 2185191 (2002). Бактерии Haemophilus influenzae тип b выращивают на твердой питательной среде (шоколадный питательный агар), культуру смывают физиологическим раствором и инокулят засевают на жидкую синтетическую питательную среду. Выращенную биомассу обрабатывают 0,1% водным раствором формалина в течение 1-2 ч, а клетки отделяют ультрафильтрацией на молекулярных волоконных фильтрах. Капсульный полисахарид Hib, находящийся в ультрафильтрате, концентрируют на молекулярных волоконных фильтрах и лиофилизируют.

100 мл смеси столбнячного и дифтерийного анатоксинов, адсорбированных на геле гидроокиси алюминия или фосфата алюминия, центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин. Осадок химически связывают карбодиимидным способом через дигидразид адипиновой кислоты с 3 мг капсульного полисахарида Hib, растворенного в 1 мл дистиллированной воды. Полученный конъюгат отмывают 0,9% раствором натрия хлорида при центрифугировании 3000 об/мин в течение 5 мин и доводят 0,9% раствором натрия хлорида до объема 100 мл.

Изучение иммуногенности препарата проводили на четырех группах беспородных белых мышей. Животных вакцинировали однократно внутрибрюшинно в объеме 0,5 мл (одна человекодоза).

Первую группу прививали экспериментальным адсорбированным жидким дифтерийно-столбнячно-гемофильным конъюгатом, вторую - коммерческой АДС-вакциной, смешанной с одной человекодозой сухой коньюгированной со столбнячным анатоксином гемофильной вакциной (AKT-Hib), третью иммунизировали коммерческой АДС-вакциной, четвертую группу животных не иммунизировали, использовали в качестве контрольной. Через месяц в сыворотках крови мышей определяли методом иммуноферментного анализа содержание антител к капсульному полисахариду Hib, а также к дифтерийному и столбнячному анатоксинам, сравнивая оптическую плотность реакционной смеси. Результаты испытаний представлены в таблице №1.

Таблица 1
Результаты ИФА сывороток крови белых мышей после иммунизации вакцинными препаратами
№№ п/п Наименование группы Кол-во животных Средняя оптическая плотность λ 450 нм/630 нм
Hib столбнячный анатоксин дифтерийный анатоксин
1. конъюгат АДС-Hib (экспериментальная) 10 1,72 1,41 0,62
2. смесь АДС и AKT-Hib (прототип, коммерческая) 10 0,84 1,62 0,66
3. контрольная группа, иммунизированная АДС 10 - 1,38 0,84
4. контрольная (неиммунизированная) 10 0,03 0,03 0,05

Как видно из таблицы, препарат, полученный предлагаемым способом, обладает более высокой иммуногенной активностью Hib-компонента по сравнению с коммерческой АДС-вакциной, смешанной с лиофилизированным гемофильно-столбнячным конъюгатом и не вызывает антигенной перегрузки столбнячным анатоксином. Полученные данные свидетельствуют, что предлагаемый способ связывания капсульного полисахарида Hib не требует высокой концентрации антигенов, большого объема буферных растворов и не приводит к потерям гемофильного компонента. В качестве антигенов могут быть использованы и другие иммуногенные полимеры. Разработанная технология не нуждается в лиофилизации и не приводит к антигенной перегрузке T-зависимым компонентом, использованным в качестве носителя.

Способ получения конъюгата капсульного полисахарида Haemophilus influenzae тип b (Hib) с антигенами карбодиимидным методом через дигидразид адипиновой кислоты, отличающийся тем, что в качестве антигена используют смесь столбнячного и дифтерийного анатоксинов, адсорбированных на геле гидроокиси или фосфата алюминия, которую центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин, полученный осадок связывают карбодиимидным способом через дигидразид адипиновой кислоты с 3 мг капсульного полисахарида Hib, растворенного в 1 мл дистиллированной воды, конъюгат отмывают 0,9% раствором натрия хлорида при центрифугировании 3000 об/мин в течение 5 мин и доводят 0,9% раствором натрия хлорида до объема 100 мл.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в производстве препаратов, обладающих фитозащитным действием, корригирующих микрофлору почвы и улучшающих ее структуру.
Изобретение относится к биотехнологии и касается получения регулятора роста растений на основе микроорганизмов. .

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии, в частности к средствам защиты растений, и представляет собой консорциум штаммов-антагонистов для получения этих средств.

Изобретение относится к средствам борьбы с загрязнениями объектов окружающей среды нефтью и нефтепродуктами. .
Изобретение относится к области инкапсулирования ароматизаторов, а именно к способу получения микрокапсул ароматизатора «зеленое яблоко», в котором в качестве оболочки микрокапсул используется альгинат натрия.

Изобретение относится к области инкапсуляции, а именно к способу получения микрокапсул фуллерена С60, где в качестве оболочки микрокапсул используется каппа-каррагинан.

Группа изобретений относится к области фармацевтики и медицины и касается состава для стабилизации белков и пептидов, который содержит гидрофильный полимер, смесь полиспирта и сахара, где массовое отношение полиспирта к сахару составляет от 2:1 до 5:1 (масс.%), детергент и где состав не содержит стабилизирующих белков.
Изобретение относится к медицине. Описан способ получения лечебной салфетки, включающий приготовление полимерной основы, содержащей соли альгиновой кислоты, введение активного вещества в терапевтически эффективном количестве, перемешивание смеси в тихоходной мешалке, нанесение полученной композиции на текстильный материал, содержащий не менее 50% целлюлозных волокон, а композицию полимера с активным веществом наносят на текстильный материал через сетчатый шаблон с размером ячейки от 200 до 450 мкм до создания на лицевой поверхности текстильного материала сплошного полимерного слоя без проникновения на изнаночную сторону.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и представляет собой подложку для доставки активного агента, имеющую содержание влаги менее 10 мас.%, включающую подложку и композицию для доставки, содержащую углеводную матрицу, летучий активный агент, включенный в углеводную матрицу, и высвобождающий агент, включенный в углеводную матрицу, причем высвобождающий агент представляет собой газ, выбранный из диоксида углерода, окиси азота, воздуха, сульфида водорода и азота, или инициируемый высвобождающий агент, выбранный из лимонной кислоты и бикарбоната, которые инициируются водой с образованием газа.
Изобретение относится в области инкапсуляции, а именно к способу получения микрокапсул сульфата железа или сульфата цинка, в котором в качестве оболочки микрокапсул используется каррагинан.
Изобретение относится в области инкапсуляции, а именно к способу получения микрокапсул сульфата железа или сульфата цинка, где в качестве оболочки микрокапсул используется каппа-каррагинан.

Группа изобретений относится к биотехнологии, а именно к сухой стекловидной композиции для стабилизации и защиты биологически активного материала в жестких условиях хранения и применения и к способу ее получения.
Изобретение относится к способу инкапсуляции фенбендазола. Указанный способ характеризуется тем, что раствор фенбендазола диспергируют в раствор натрий карбоксиметилцеллюлозы в этилацетате, содержащий препарат Е472с, при соотношении фенбендазол/натрий карбоксиметилцеллюлоза 1:3, затем приливают бутанол и дистиллированную воду, отфильтровывают полученную суспензию микрокапсул и сушат при комнатной температуре.

Группа изобретений относится к медицине. Описан способ доставки медицинского активного агента, включающий стадию, на которой вводят млекопитающему, которое нуждается в полезных эффектах для здоровья или лечении состояния здоровья, индивидуальное медицинское изделие.
Изобретение относится к ветеринарной иммунологии. Способ иммунопрофилактики массовых вирусных болезней телят заключается в следующем: клинически здоровых телят 20-30-дневного возраста иммунизируют трехкратно с интервалом в 10-12 дней подкожными инъекциями гипериммунной сыворотки животных-доноров, содержащей антигемагглютинины к вирусу парагриппа-3 (в титре не ниже 1:1280), к вирусу инфекционного ринотрахеита (в титре 1:256), к вирусу вирусной диареи-болезни слизистых (в титре 1:1024), к респираторно-синтициальному вирусу (в титре 1:128), к ротавирусу и коронавирусу (в титре 1:128), в дозе 1 мл/кг живой массы, а через 15 дней после последней инъекции иммунизируют инъекциями инактивированной комбинированной вакцины «Комбовак» против инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, вирусной диареи-болезни слизистых, респираторно-синцитиальной, рота- и коронавирусных болезней, а перед пассивной (с применением гипериммунной сыворотки) и перед активной (с применением вакцины «Комбовак») иммунизациями однократно в течение 15 дней применяют внутрь комплексный фитопрепарат, представляющий собой спиртовую настойку из измельченной растительной смеси равных количеств травы и соцветий эхинацеи пурпурной, мать-и-мачехи, тимьяна ползучего и корней солодки голой, в виде 7% водного раствора в дозе 2,0 мл/кг живой массы животного.
Наверх