Мутантная формиатдегидрогеназа (варианты)

Изобретение относится к области генной инженерии и может быть использовано в процессах синтеза оптически активных соединений или физиологически активных веществ, детекции формиата, а также для получения стрессоустойчивых растений. Изобретение представляет собой четыре новые мутантные формы растительной формиатдегидрогеназы (ФДГ). В первом из предложенных мутантных белков природный остаток фенилаланина в положении, соответствующем положению 290 в последовательности формиатдегидрогеназы из сои Glycine max, заменен на остаток аланина. Во второй мутантной форме фермента этот же природный остаток фенилаланина 290 заменен на остаток тирозина, в третьей - на остаток треонина и в четвертой - на остаток глутамина. Изобретение позволяет получить формиатдегидрогеназы, обладающие улучшенными свойствами по сравнению как с ферментом дикого типа, так и с ранее описанными его мутантными формами 4 н.п. ф-лы, 2 табл., 5 пр.

 

Изобретение относится к области генной и белковой инженерии и может быть использовано в процессах синтеза оптически активных соединений или физиологически активных веществ, детекции формиата, а также для получения стрессоустойчивых растений.

Получены четыре новые мутантные формы растительной формиатдегидрогеназы (ФДГ), обладающие улучшенными свойствами по сравнению, как с ферментом дикого типа, так и с ранее описанными его мутантными формами. В первом из предложенных мутантных белков природный остаток фенилаланина в положении, соответствующем положению 290 в последовательности формиатдегидрогеназы из сои Glycine max, заменен на остаток аланина. Во второй мутантной форме фермента этот же природный остаток фенилаланина 290 заменен на остаток тирозина, в третьей - на остаток треонина и в четвертой - на остаток глутамина. Данные замены могут быть использованы в комбинации с другими мутациями, обеспечивающими приобретение формиатдегидрогеназами новых или улучшенных свойств.

Данное изобретение относится к новому белку, в частности, к мутантным формиатдегидрогеназам из растений, которые обладают улучшенными каталитическими свойствами по сравнению с соответствующим ферментом дикого типа, к ДНК, кодирующей мутантные формы формиатдегидрогеназы, к применению данных ферментов в системах синтеза оптически активных соединений или физиологически активных веществ, для детекции формиата, а также для получения стрессоустойчивых растений.

NAD⁺-зависимая формиатдегидрогеназа катализирует окисление формиата до углекислого газа при сопряженном восстановлении NAD⁺ до NADH.

ФДГ обладает высокой специфичностью к формиату, поэтому этот фермент успешно применяют для определения формиата в сложных смесях.

Реакция окисления формиат-иона является необратимой, продуктом является углекислый газ, который можно легко вывести из сферы реакции. Также ФДГ обладает широким pH-оптимумом активности. Поэтому формиатдегидрогеназа может быть эффективно использована для регенерации NADH в процессах синтеза оптически активных соединений с использованием дегидрогеназ. В качестве примера можно привести крупномасштабный процесс получения терт-L-лейцина из триметилпирувата с использованием лейциндегидрогеназы с системой регенерации NADH на основе формиатдегидрогеназы из дрожжей Candida boidinii (Bommarius A.S., Schwarm M., Stingl K., Kottenhahn M., Huthmacher K. and Drauz K., Synthesis and Use of Enantiomerically Pure tert-Leucine, Tetrahedron Asymmetry, 1995, v.6, p.2851-2888). Также применяют способ, в котором процесс синтеза и регенерацию осуществляют непосредственно в бактериальной клетке. В одной из первых работ ген ФДГ из бактерий Mycobacterium vaccae N10 был экспрессирован в клетках E.coli совместно с одним из ферментов - или лейциндегидрогеназой, или аланиндегидрогеназой, или фенилаланиндегидрогеназой. Такие клетки E.coli были использованы для синтеза L-лейцина, L-валина, L-норлейцина, L-метионина, L-фенилаланина и L-тирозина с выходом более 80% и оптической чистотой до 100% (Galkin, A., Kulakova, L., Yoshimura, T., Soda, K., & Esaki, N. Synthesis of optically active amino acids from alpha-keto acids with Escherichia coli cells expressing heterologous genes. Appl. Environ. Microbiol., 1997, v.63, p.4651-4656). Недавно ген ФДГ из дрожжей Candida boidini был экспрессирован в Е.coli совместно с кеторедуктазой и такой биокатализатор был использован в процессах синтеза ксилитола из ксилозы и S-1-(2-хлорфенил) этанола из o-хлорацетофенона (Mädje K., Schmölzer K., Nidetzky В., Kratzer R. Host cell and expression engineering for development of an Е.coli ketoreductase catalyst: Enhancement of formate dehydrogenase activity for regeneration of NADH. Microb. Cell Fact. 2012, v.11, p.11-17). Одним из распространенных приемов для работы с ферментами является их иммобилизация на твердых носителях. Авторами (Demir A.S., Talpur F.N., Betui Sopaci S., Kohring G.W., Celik A. Selective oxidation and reduction reactions with cofactor regeneration mediated by galactitol-, lactate-, and formate dehydrogenases immobilized on magnetic nanoparticles. J BiotechnoL, 2011, v.10, p.176-183.) была проведена иммобилизация формиатдегидрогеназы из дрожжей Candida methylica, а также других ферментов на наночастицы с проведением синтеза S-1,2-пропандиола высокой степени оптической чистоты.

Формиатдегидрогеназа найдена в бактериях, дрожжах, микроскопических грибах, а также растениях. Впервые формиатдегидрогеназная активность в растениях была обнаружена в 1921 г. (Thunberg Т. Sur la presence de certains ferments oxydants dans les grains de Phaseolus vulgaris. Arch. Int. Physiol., 1921, v.18, pp.601-606). В растениях ФДГ - это фермент стресса, синтез которого резко возрастает при таких стрессовых воздействиях, как засуха, повышенная доза ультрафиолета, резкие скачки температуры, нехватка кислорода и т.п. (Hourton-Cabassa С., Ambard-Bretteville F., Moreau F., Davy de V., Remy R., and Francs-Small C.C. Stress Induction of Mitochondrial Formate Dehydrogenase in Potato Leaves. Plant Physiol, 1998, v.116, pp.627-635; Suzuki K., Itai R., Suzuki K., Nakanishi H., Nishizawa N.K., Yoshimura E., and Mori S. Formate dehydrogenase, an enzyme of anaerobic metabolism, is induced by iron deficiency in barley roots. Plant Physiol, 1998, v.116, pp.725-732; Thompson P., Bowsher C.G., and Tobin A.K. Heterogeneity of mitochondrial protein biogenesis during primary leaf development in barley. Plant Physiol, 1998, v.118, p.1089-1099; Andreadeli A., Flemetakis E., Axarli I., Dimou M., Udvardi M.K., Katinakis P., and Labrou N.E. Cloning and characterization of Lotus japonicus formate dehydrogenase: a possible correlation with hypoxia. Biochim. Biophys. Acta, 2009, v.1794, pp.976-984; David P., des Francs-Small C.C., Sevignac M., Thareau V., Macadre C., Langin Т., and Geffroy V. Three highly similar formate dehydrogenase genes located in the vicinity of the B4 resistance gene cluster are differentially expressed under biotic and abiotic stresses in Phaseolus vulgaris. Theor. Appl Genet., 2010, v.121, pp.87-103). Подробный обзор по физиологической роли, получению и свойствам ФДГ из растений был опубликован в 2011 году (Алексеева А.А., Савин C.C., Тишков В.И. NAD⁺-зависимая формиатдегидрогеназа растений. Acta Naturae, 2011, т.3, №4(11), с.40-56).

Многие из генов, кодирующих данные ферменты, были клонированы и секвенированы, поэтому их можно получать с использованием технологии рекомбинантных ДНК. Последовательность кДНК, кодирующую формиатдегидрогеназу, встраивают в генно-инженерный вектор (плазмида, фаг и т.д.), который используют для трансформации микроорганизмов, например, бактерий E.coli. Полученный рекомбинантный штамм используют для экспрессии желаемого ферментного продукта.

Для растительных формиатдегидрогеназ характерны низкие значения констант Михаэлиса по сравнению с ферментами из других источников. Одной из наиболее перспективных для практического применения формиатдегидрогеназ из растений является формиатдегидрогеназа из сои Glycine max (SoyFDH). Этот фермент был получен в активной и растворимой форме (Садыхов Э.Г., Серов А.Е., Ясный И.Е., Воинова Н.С., Алексеева А.А., Петров А.С., Тишков В.И. NAD⁺-зависимые формиатдегидрогеназы из Arabidopsis thaliana и сои: экспрессия в клетках E.coli и кинетические свойства рекомбинантных ферментов. Вестн. Моск. Ун-та. Сер.2. Химия, 2006, т.47, N1, с.31-34), и он имеет самые низкие значения констант Михаэлиса по сравнению со всеми изученными формиатдегидрогеназами на настоящий момент (Алексеева А.А., Савин С.С., Тишков В.И. NAD⁺-зависимая формиатдегидрогеназа растений. Acta Naturae, 2011, т.3, №4(11), с.40-56).

Основными недостатками известных природных и рекомбинантных формиатдегидрогеназ из растений дикого типа являюся низкая термостабильность и невысокое значение каталитической константы k_cat этих ферментов, что обуславливает и невысокую каталитическую эффективность (отношение каталитической константы к константе Михаэлиса, k_cat/К_М). Таким образом, для успешного применения формиатдегидрогеназы из сои на практике необходимо повысить каталитическую эффективность этого фермента. Одним из подходов для решения поставленной задачи является мутагенез аминокислотных остатков целевого белка.

Для бактериальных и дрожжевых формиатдегидрогеназ в литературе описано много примеров успешного улучшения температурной и химической стабильности с помощью методов белковой инженерии. Анализ таких работ подробно рассмотрен в обзорах Tishkov V.I. and Popov V.O. Protein engineering of formate dehydrogenase. Biomol. Eng, 2006, v.23, p.89-110 и Алексеева А.А., Савин С.С., Тишков В.И. NAD⁺-зависимая формиатдегидрогеназа растений. Acta Naturae, 2011, т.3, №4(11), с.40-56. Эксперименты по повышению термостабильности рекомбинантной ФДГ из сои описаны в работах (Алексеева А.А., Савин С.С., Клейменов С.Ю., Упоров И.В., Пометун Е.В., Тишков В.И. Стабилизация рекомбинантной формиатдегидрогеназы из сои Glycine max методом рационального дизайна. Биохимия, 2012, т.77, №10, с.1443-1456) и (Alekseeva А.А., Serenko А.А., Kargov I.S., Savin S.S., Kleymenov S.Yu., and Tishkov V.I. Engineering catalytic properties and thermal stability of plant formate dehydrogenase by single-point mutations. Protein Eng. Des. SeL, 2012, v.25, №11, p.781-788).

В то же время успешных примеров улучшения каталитической эффективности формиатдегидрогеназ совсем немного. Известны мутантная PseFDH GAV, у которой К_М по NAD⁺ улучшена до 35 мкМ по сравнению с 65 мкМ у PseFDH дикого типа (Tishkov V.I. and Popov V.O. Biomol. Eng, 2006, v.23, p.89-110). В случае мутанта PseFDH SM4 (Alekseeva А.А. et al. Protein Eng. Des. Sel., 2012, v.25, №11, p.781-788) К_М no NAD⁺ равна 41 мкМ, а К_М по формиату - 3,2 мМ (6,5 мМ у фермента дикого типа). Величина каталитической константы у этих мутантов такая же, что и у PseFDH дикого типа. В диссертации (Felber, S. Optimierung der NAD-abhuengigen Formiatdehydrogenase aus Candida boidinii fuer den Einsatz in der Biokatalyse. Ph.D. dissertation. 1-176. 2001. Heinrich-Heine University of Duesseldorf. URL: http://diss.ub.uniduesseldorf.de/ebib/diss/file?dissid=78. 2001) описана мутантная ФДГ из дрожжей C.boidnii, у которой за счет замены Phe285Ser каталитическая константа возросла с 3,7 до 6,1 с^-1, однако при этом ухудшились (возросли) константы Михаэлиса по NAD⁺ и формиату с 45 до 73 мкМ и с 5,9 до 14 мм соответственно. В результате каталитическая эффективность у мутантного фермента по формиату снизилась с 0,63 до 0,44 мМ-¹ с^-1, а по коферменту NAD⁺ каталитическая эффективность не изменилась.

В случае рекомбинантной ФДГ из сои описаны мутанты с заменами Leu24Asp, Val127Arg и Ala267Met (Алексеева А.А. и соавт. Биохимия, 2012, т.77, с.1443-1456) и Phe290Asp и Phe290Ser (Alekseeva А.А. et al. Protein Eng. Des. Sel., 2012, v.25, №11, p.781-788), у которых была повышена каталитическая константа с 2,9 с^-1 до 3,2-5,1 с^-1, однако эти замены сопровождались ухудшением константы Михаэлиса по формиату. В результате каталитическая эффективность по формиату у этих мутантов (за исключением замены Ala267Met) стала даже хуже, чем у исходного фермента. В случае замены Ala267Met каталитическая эффективность по формиату возросла на 23% - до 2,38 по сравнению с 1,93 мМ^-1 с^-1 у ФДГ сои дикого типа.

Техническая задача, решаемая посредством предлагаемого технического решения, состоит в получении мутантных форм формиатдегидрогеназы из сои Glycine max с улучшенными каталитическими свойствами по сравнению с ферментом дикого типа и известных его мутантов.

Технический результат, получаемый при реализации предлагаемого технического решения, состоит в улучшении каталитических свойств полученных новых мутантных форм формиатдегидрогеназы из сои Glycine max по отношению к свойствам фермента дикого типа и известных его мутантов.

Для достижения указанного технического результата, предложено использовать рекомбинантную растительную формиатдегидрогеназу, в которой в качестве основы использована аминокислотная последовательность формиатдегидрогеназы из сои Glycine max дикого типа. Полная последовательность кДНК этого фермента (код доступа в базе GeneBank BT094321.1), содержит в начале нуклеотидную последовательность, кодирующую сигнальный пептид, необходимый для транспорта белка-предшественника формиатдегидрогеназы из цитоплазмы в митохондрии клеток растений. После попадания про-белка внутрь митохондрии этот пептид отщепляется с образованием активной формиатдегидрогеназы. В связи с отсутствием в бактериях митохондрии, вышеописанная посттрансляционная модификация белка-предшественника формиатдегидрогеназы невозможна. Поэтому для экспрессии в клетках E.coli из последовательности кДНК формиатдегидрогеназы сои была удалена последовательность, кодирующая сигнальный пептид (31 аминокислотный остаток). В результате синтезируется активный рекомбинантный фермент дикого типа без дополнительной стадии посттрансляционной модификации (Алексеева А.А., Савин С.С., Тишков В.И. NAD⁺-зависимая формиатдегидрогеназа растений. Acta Naturae, 2011, т.3, №4(11), с.40-56).

В дальнейшем получение и преимущества полученной мутантной формиатдегидрогеназы будут рассмотрены с использованием примеров получения и реализации этого фермента.

Пример 1.

Получение мутантной формиатдегидрогеназы, в которой остаток Phe290 заменен на остаток Ala.

Направленный мутагенез проводили с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР). В качестве матрицы для проведения направленного мутагенеза использовали плазмиду pSoyFDH. Плазмида pSoyFDH получена из коммерчески доступной плазмиды pET21a (Novagen, США), в которую по сайтам рестрикции NdeI и EcoRI встроена кДНК формиатдегидрогеназы сои Glycine max без участка, кодирующего сигнальный пептид.

Для введения мутации Phe290Ala в ген формиатдегидрогеназы с использованием ПЦР применяли универсальные праймеры T7for и T7rev:

T7For	5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′
T7rev	5′-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3′,

а также прямой и обратный праймеры, несущие требуемую замену в триплете, кодирующем в гене soyfdh остаток Ala в положении 290:

SoyF290Afor	5′-GATGTTTGG GCC CCACAGCCAGCTCCAA-3′
SoyF290Arev	5′-GCTGTGG GGC CCAAACATCACCACTATAACCT-3′

Полужирным шрифтом с подчеркиванием выделены нуклеотидные замены, обеспечивающие мутацию Phe290Ala.

Реакцию ПЦР проводили в тонкостенной пластиковой пробирке объемом 0,5 мл («SSI», США). Для предотвращения испарения реакционной смеси и ее конденсации на крышке в пробирку добавляли 30 мкл минерального масла. Пробирку прогревали 5 мин при 95°C и затем проводили реакцию ПЦР по следующей программе: 1-я стадия - 95°C, 60 с; 2-я стадия - 56°C, 60 с и 3-я стадия - 72°C, 2 мин, всего 25-35 циклов. После этого реакционную смесь выдерживали еще 10 мин при 72°C. Температуру на второй стадии выбирали на 3-5° ниже T_m температуры плавления дуплексов, образуемых праймерами.

Реакционная смесь для проведения ПЦР имела следующий состав (таблица 1):

Таблица 1.
Условия проведения полимеразной цепной реакции (ПНР).
Количество	Компонент
2,5 мкл	10-кратный буфер для PFU Turbo ДНК-полимеразы (Fermentas, Литва)
2 мкл	смесь dNTP (dATP, dGTP, dTTP, dCTP), концентрация 2,5 мМ
1 мкл	ДНК-матрица, концентрация ~10 нг/мкл
2 мкл	праймер 1, концентрация 10 нмоль/мл (Синтол, Россия)
2 мкл	праймер 2, концентрация 10 нмоль/мл (Синтол, Россия)
0,5 мкл	PFU Turbo ДНК-полимераза (2,5 Ед/мкл) (Fermentas, Литва)
до 25 мкл	деионизованная вода, очищенная с использованием системы MilliQ (Millipore, США)

На первом этапе проводили две полимеразные цепные реакции с использованием следующих пар праймеров: 1) T7For+SoyF290Arev и 2) SoyF290Afor+T7Rev. В качестве матрицы использовали плазмиду pSoyFDH. Полученные продукты ПЦР, фрагмент 1 и фрагмент 2, очищали с использованием препаративного электрофореза в агарозном геле с применением предназначенных для этого наборов, например, GeneJet Gel Extraction Kit (Fermentas, Литва). Затем проводили третью, объединяющую ПЦР с праймерами T7For и T7Rev, где в качестве ДНК-матрицы использовали полученные ранее фрагменты 1 и 2.

Продукт третьей ПЦР очищали аналогично фрагментам 1 и 2 и обрабатывали эндонуклеазами рестрикции KpnI и EcoRI в течение двух часов при 37°C, затем инкубировали рестрикционную смесь для инактивации рестриктаз в течение 20 минут при 65°C (использовали рестриктазы и буферные растворы фирмы Fermentas (Литва)). Затем полученные фрагменты ДНК очищали от коротких фрагментов препаративным электрофорезом в агарозном геле с последующей экстракцией нужной полосы из агарозы с использованием соответствующего набора, например, GeneJet Gel Extraction Kit (Fermentas, Литва) и лигировали с фрагментом исходной плазмиды pSoyFDH, из которой расщеплением по тем же сайтам рестрикции KpnI и EcoRI был удален фрагмент гена soyfdh из G.max дикого типа.

Полученной после лигирования реакционной смесью трансформировали клетки Е.coli TG1 (генотип supE hsdΔ5 thi Δ(lac-proAB) F′[traD36 proAB⁺ lacI^q lacZΔM15]) и выращивали в течение ночи при 37°C на твердой агаризованной среде LB, содержащей ампициллин в концентрации 100 мкг/мл (плазмида pSoyFDH содержит ген устойчивости к ампициллину).

Выросшие колонии инокулировали в 6-8 мл среды 2YT, содержащей 150 мкг/мл ампициллина, и растили при 37°C в течение 8-10 часов при аэрировании. Плазмидную ДНК выделяли из полученной культуры клеток с использованием предназначенного для этого набора, например, GeneJet Plasmid Miniprep Kit (Fermentas, Литва). Для контроля введения требуемых мутаций проводили секвенирование гена мутантной SoyFDH Phe290Ala в выделенных плазмидах. В результате у 5 выделенных плазмид во всех случаях в гене мутантного фермента были идентифицированы только те мутации, которые обеспечивали замену Phe290Ala. Таким образом, была получена плазмида pSoyFDH_F290A, которая обеспечивала получение новой формиатдегидрогеназы SoyFDH Phe290Ala с заменой Phe290Ala.

Для получения мутантного фермента клетки E.coli BL21 (DE3) pLysS Codon Plus (генотип Е.coli В F^- ompT hsdS(rB^- mB^-) dcm⁺ Tet^r gal λ(DE3)pLysS endA Hte [argU proL Cam^r) трансформировали плазмидой pSoyFDH_F290A, высевали на чашки Петри с агаризованной средой, содержащей ампициллин (100 мкг/мл) и хлорамфеникол (25 мкг/мл) и проводили их культивирование (см. ниже).

Пример 2.

Получение мутантной растительной формиатдегидрогеназы, в которой остаток Phe290 заменен на остаток Tyr.

Данный пример идентичен примеру 1 за исключением того, что в качестве прямого и обратного праймеров, обеспечивающих введение замены Phe290Tyr, использовали следующие дезоксирибоолигонуклеотиды:

Soy_F290Yfor	5′-GATGTTTGG TAT CCACAGCCAGCTCCAAAG-3′
Soy_F290Yrev	5′-GGCTGTGG ATA CCAAACATCACCACTATAACCT-3′

Полужирным шрифтом с подчеркиванием выделены нуклеотидные замены, обеспечивающие мутацию Phe290Tyr.

Плазмида pSoyFDH с нуклеотидными заменами, обеспечивающими в гене фермента мутацию Phe290Tyr, получила название pSoyFDH_F290Y.

Для получения мутантного фермента клетки E.coli BL21 (DE3) pLysS Codon Plus (генотип Е.coli В F^- ompT hsdS(rB^- mB^-) dcm⁺ Tet^r gal λ(DE3)pLysS endA Hte [argU proL Cam^r]) трансформировали плазмидой pSoyFDH_F290Y, высевали на чашки Петри с агаризованной средой, содержащей ампициллин (100 мкг/мл) и хлорамфеникол (25 мкг/мл) и проводили их культивирование (см. ниже).

Пример 3.

Получение мутантной растительной формиатдегидрогеназы, в которой остаток Phe290 заменен на остаток Thr.

Данный пример идентичен примеру 1 за исключением того, что в качестве прямого и обратного праймеров, обеспечивающих введение замены Phe290Thr, использовали следующие дезоксирибоолигонуклеотиды:

Soy_F290TFor	5′-GATGTTTGG ACC CCACAGCCAGCTCCAA-3′
Soy_F290TRev	5′-GCTGTGG GGT CCAAACATCACCACTATAACCT-3′

Полужирным шрифтом с подчеркиванием выделены нуклеотидные замены, обеспечивающие мутацию Phe290Thr.

Плазмида pSoyFDH с нуклеотидными заменами, обеспечивающими в гене фермента мутацию Phe290Thr, получила название pSoyFDH_F290T.

Для получения мутантного фермента клетки E.coli BL21 (DE3) pLysS Codon Plus (генотип Е.coli В F^- ompT hsdS(rB^- mB^-) dcm⁺ Tet^r gal λ(DE3)pLysS endA Hte [argU proL Cam^r]) трансформировали плазмидой pSoyFDH_F290T, высевали на чашки Петри с агаризованной средой, содержащей ампициллин (100 мкг/мл) и хлорамфеникол (25 мкг/мл) и проводили их культивирование (см. ниже).

Пример 4.

Получение мутантной растительной формиатдегидрогеназы, в которой остаток Phe290 заменен на остаток Gln.

Данный пример идентичен примеру 1 за исключением того, что в качестве прямого и обратного праймеров, обеспечивающих введение замены Phe290Gln, использовали следующие дезоксирибоолигонуклеотиды:

Soy_F290QFor	5′-GATGTTTGG CAG CCACAGCCAGCTCCAAAG-3′
Soy_F290QRev	5′-GCTGTGG CTG CCAAACATCACCACTATAACCT-3′

Полужирным шрифтом с подчеркиванием выделены нуклеотидные замены, обеспечивающие мутацию Phe290Gln.

Плазмида pSoyFDH с нуклеотидными заменами, обеспечивающими в гене фермента мутацию Phe290Gln, получила название pSoyFDH_F290Q.

Для получения мутантного фермента клетки E.coli BL21 (DE3) pLysS Codon Plus (генотип Е.coli В F^- ompT hsdS(rB^- mB^-) dcm⁺ Tet^r gal λ(DE3)pLysS endA Hte [argU proL Cam^r) трансформировали плазмидой pSoyFDH_F290Q, высевали на чашки Петри с агаризованной средой, содержащей ампициллин (100 мкг/мл) и хлорамфеникол (25 мкг/мл) и проводили их культивирование (см. ниже).

Пример 5

Определение каталитических параметров мутантных форм формиатдегидрогеназы из сои, содержащих одну из аминокислотных замен - Phe290Ala, Phe290Tyr, Phe290Thr и Phe290Gln.

Для определения каталитических параметров мутантные SoyFDH Phe290Ala, SoyFDH Phe290Tyr, SoyFDH Phe290Thr, pSoyFDH Phe290Gln и формиатдегидрогеназу сои дикого типа выделяли в высокоочищенном виде. Методика получения высокоочищенных препаратов была одинакова как для мутантных SoyFDH Phe290Ala, SoyFDH Phe290Tyr, SoyFDH Phe290Thr, pSoyFDH Phe290Gln, так и для фермента дикого типа.

Экспрессию SoyFDH дикого типа и ее мутантов проводили в клетках Е.coli BL21 (DE3) CodonPlus/pLysS. Для приготовления посевного материала с чашки отбирали единичную колонию и культивировали в течение 7-9 ч при 30°C и 180 об/мин до достижения величины поглощения на длине волны 600 нм A₆₀₀≈0,6-0,8 в 5 мл среды 2YT (дрожжевой экстракт 10 г/л, бактотриптон 16 г/л, хлорид натрия 5 г/л, pH 7.0) в присутствии 150 мкг/мл ампициллина и 25 мкг/мл хлорамфеникола. Затем содержимое пробирок переносили в конические качалочные колбы с отбойниками объемом 1 л, содержащими 200 мл среды 2YT и 150 мкг/мл ампициллина и клетки культивировали при 30°C и 80-90 об/мин до достижения величины поглощения на 600 нм, A₆₀₀=0,6-0,8. Далее проводили индукцию клеток, добавляя в среду для культивирования раствор лактозы (300 г/л) до конечной концентрации индуктора 20 г/л. После индукции температуру культивирования снижали до 20°C и клетки культивировали в течение 17 ч при 120 об/мин. Полученную биомассу осаждали на центрифуге Beckman J-21 (США) при 7500 об/мин в течение 20 мин при 4°C и после удаления культуральной жидкости клетки ресуспендировали в 0,1 М натрий-фосфатном буфере, pH 8,0 в соотношении 1:4 (масс.). Полученную суспензию замораживали и хранили при -20°C.

Для выделения мутантных SoyFDH Phe290Ala, SoyFDH Phe290Tyr, SoyFDH Phe290Thr, pSoyFDH Phe290Gln и фермента дикого типа 20% суспензию клеток в 0,1 М натрий-фосфатном буфере, pH 8,0 подвергали двум циклам заморозки-разморозки, и затем клетки разрушали с использованием ультразвукового дезинтегратора «Branson Sonifier 250» (Германия) при постоянном охлаждении. Осадок удаляли центрифугированием на центрифуге «Eppendorf 5804 R» (11000 об/мин, 30 мин).

Для очистки использовали модифицированную методику, разработанную для получения рекомбинантной ФДГ из бактерий Pseudomonas sp. 101 (Rojkova A.M., Galkin A.G., Kulakova L.B., Serov A.E., Savitsky P.A., Fedorchuk V.V., and Tishkov V.I. Bacterial formate dehydrogenase. Increasing the enzyme thermal stability by hydrophobization of alpha-helices. FEBS Lett., 1999, v.445, pp.183-188). Процедура очистки фермента включала высаживание балластных белков сульфатом аммония (45% от насыщения), осаждение целевого белка при концентрации сульфата аммония 85% от насыщения и его последующее перерастворение в растворе, содержащем 45% сульфат аммония в 0,1 M фосфатном буфере, pH 7,0 (буфера A). Полученный супернатант использовали для гидрофобной хроматографии на Phenyl Sepharose Fast Flow (Pharmacia Biotech) в нисходящем градиенте 45-0% концентрации сульфата аммония в буфере A и обессоливание на колонке с Сефадекс G-25 в том же буфере. Контроль чистоты полученных препаратов осуществлялся с использованием аналитического электрофореза в 12% полиакриламидном геле в присутствии 0,1% додецилсульфата натрия на приборе для электрофореза MiniProtean II фирмы «BioRad».

Активность ФДГ определяли спектрофотометрически по накоплению NADH на длине волны 340 нм (ε₃₄₀=6220 М^-1 см^-1) на спектрофотометре «Schimadzu UV 1800 PC» при 30°C в 0,1 М натрий-фосфатном буфере, pH 7,0. Концентрация формиата натрия и NAD⁺ в кювете составляла 0,6 М и 0,2 мг/мл соответственно.

Константы Михаэлиса по NAD⁺ и формиату определяли из зависимостей активности фермента от концентрации (0,4-6 K_М) соответствующего субстрата. Концентрация второго субстрата была насыщающей (>30K_М). Точную концентрацию исходного раствора NAD⁺ определяли спектрофотометрически на длине волны 260 нм (ε₂₆₀=17800 М^-1 см^-1). Раствор формиата натрия с заданной концентрацией готовили, растворяя нужное количество субстрата в 0,1 М натрий-фосфатном буфере, pH 7,0. Объем раствора доводили в мерной колбе. Значения K_м были рассчитаны из экспериментальных кривых с применением метода нелинейной регрессии, используя программу Origin Pro 8.5.

Для нахождения каталитических констант готовили несколько проб исследуемого фермента с различной концентрацией. Для каждой пробы определяли значения максимальной скорости и концентрацию активных центров. Концентрацию активных центров определяли из зависимостей тушения собственной флуоресценции фермента в комплексе с NAD⁺ при добавлении азид-иона как описано в (Романова Е.Г., Алексеева А.А., Пометун Е.В., Тишков В.И. Определение концентрации активных центров и каталитической константы рекомбинантной формиатдегидрогеназы из сои Glycine max. Вестник Московского Университета, Сер. 2: Химия, 2010, т.51, №3, с.156-159). Измерения проводили в 0,1 М натрий-фосфатном буфере, pH 7,0 на спектрофлуориметре Cary Eclipse ("Varian" США). Далее строили график зависимости максимальной скорости от концентрации активных центров и значение каталитической константы определяли как тангенс угла наклона прямой методом линейной регрессии, используя программу Origin Pro 8.5.

Результаты определения каталитических параметров для полученных мутантных форм SoyFDH Phe290Ala, SoyFDH Phe290Tyr, SoyFDH Phe290Thr, pSoyFDH Phe290Gln и белка дикого типа представлены в таблице 2. Для сравнения в этой таблице также представлены данные по каталитическим параметрам ранее полученных мутантных SoyFDH. Как следует из таблицы 2, замена остатка фенилаланина в 290 положении на остатки аланина, тирозина, треонина и глутамина приводит к увеличению величины каталитической константы на 21-38% по сравнению с ферментом дикого типа. В случае K_м по NAD⁺ в пределах ошибки эксперимента этот параметр не изменился в случае замены Phe290Thr и немного улучшился в случае замен Phe290Ala, Phe290Tyr и Phe290Gln. Основным важным результатом является тот факт, что при введении замен Phe290Ala, Phe290Tyr, Phe290Thr и Phe290Gln константа Михаэлиса по формиату по сравнению с ферментом дикого типа не только не ухудшается (что наблюдалось для других, описанных ранее мутантных SoyFDH, табл.2), но и немного улучшается. В результате каталитическая эффективность полученных мутантов по формиату (отношение $$k_{cat}/K_{м}^{HCO{O}^{-}}$$ ) возросла по сравнению с исходной формиатдегидрогеназой сои на 51-102%. Кроме того, все четыре новые мутантные SoyFDH превосходят по каталитической эффективности по формиату и лучшую ранее описанную мутантную SoyFDH Ala267Ile (табл.2).

Таблица 2
Кинетические параметры мутантных SoyFDH и фермента дикого типа (0,1 М натрий-фосфатный буфер, pH 7,0)*
Фермент	kcat, с-1	$$K_{м}^{NA{D}^{+}}$$ , мкМ	$$K_{м}^{HCO{O}^{-}}$$ , мМ	$$k_{cat}/K_{м}^{NA{D}^{+}}$$ , (мкМ∗с)-1	$$k_{cat}/K_{м}^{HCO{O}^{-}}$$ , (мМ∗с)-1-
SoyFDH дикого типа	2,9±0,1	13,3±0,8	1,5±0,1	0,20	1,93
Мутантные SoyFDH данной заявки
SoyFDH F290A	3,8±0,1	8,6±0,6	1,1±0,1	0,44	3,45
SoyFDH F290Y	3,5±0,1	10,9±0,3	0,9±0,1	0,32	3,89
SoyFDH F290T	4,0±0,4	14,3±0,9	1,3±0,1	0,28	3,08
SoyFDH F290Q	3,5±0,2	11,7±0,6	1,2±0,1	0,29	2,92
Мутантные SoyFDH, описанные ранее∗∗
SoyFDH F290N	2,8±0,1	14,0±1,0	4,5±0,3	0,20	0,62
SoyFDH F290D	5,1±0,3	12,8±0,8	5,0±0,2	0,40	1,02
SoyFDH F290S	4,1±0,2	9,1±0,7	4,1±0,3	0,45	1,00
SoyFDH L24D	3,2±0,2	13,7±0,7	2,3±0,1	0,23	1,39
SoyFDH V127R	3,6±0,7	9,5±0,5	3,4±0,2	0,38	1,06
SoyFDH A267M	5,0±0,9	9,9±0,8	2,1±0,2	0,51	2,38
∗ Полужирным шрифтом выделены параметры, которые превосходят таковые для фермента дикого типа.
∗∗ Алексеева А.А., Савин С.С., Клейменов С.Ю., Упоров И.В., Пометун Е.В., Тишков В.И. Стабилизация рекомбинантной формиатдегидрогеназы из сои Glycine max методом рационального дизайна. Биохимия, 2012, т.77, N10, с.1443-1456 и Alekseeva А.А., Serenko А.А., Kargov I.S., Savin S.S., Kleymenov S.Yu., and Tishkov V.I. Engineering catalytic properties and thermal stability of plant formate dehydrogenase by single-point mutations. Protein Eng. Des. Sel., 2012, v.25, №11, p.781-788.

1. Мутантная формиатдегидрогеназа с улучшенными свойствами, характеризующаяся аминокислотной последовательностью, соответствующей аминокислотной последовательности формиатдегидрогеназы из Glycine max дикого типа, в которой остаток фенилаланина в положении 290 заменен остатком аланина.

2. Мутантная формиатдегидрогеназа с улучшенными свойствами, характеризующаяся аминокислотной последовательностью, соответствующей аминокислотной последовательности формиатдегидрогеназы из Glycine max дикого типа, в которой остаток фенилаланина в положении 290 заменен остатком тирозина.

3. Мутантная формиатдегидрогеназа с улучшенными свойствами, характеризующаяся аминокислотной последовательностью, соответствующей аминокислотной последовательности формиатдегидрогеназы из Glycine max дикого типа, в которой остаток фенилаланина в положении 290 заменен остатком треонина.

4. Мутантная формиатдегидрогеназа с улучшенными свойствами, характеризующаяся аминокислотной последовательностью, соответствующей аминокислотной последовательности формиатдегидрогеназы из Glycine max дикого типа, в которой остаток фенилаланина в положении 290 заменен остатком глутамина.