Способ получения биоспецифического гидрогелевого сорбента для выделения протеиназ


 


Владельцы патента RU 2567623:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Ордена Трудового Красного Знамени Институт нефтехимического синтеза им. А.В. Топчиева Российской академии наук (ИНХС РАН) (RU)

Изобретение относится к области получения биоспецифического гидрогелевого сорбента для выделения протеиназ. Сорбент получают путем радикальной полимеризации под действием окислительно-восстановительного катализатора при комнатной температуре. Полимеризации подвергают водный раствор, содержащий акриламид, овомукоид из белка утиных яиц, ацилированный хлорангидридом акриловой кислоты, сшивающий агент, модифицирующую добавку и бикарбонатный буфер. Образующийся гидрогель измельчают и промывают его бикарбонатным буфером. В качестве сшивающего агента используют смесь, состоящую из 45-65% масс. диметакрилата этиленгликоля и 55-35% масс. диметакрилата тридекаэтиленгликоля. В качестве модифицирующей добавки берут водорастворимый полимер. Технический результат: повышение емкости сорбента до 2,27 мг фермента на 1 мг иммобилизованного овомукоида и повышение скорости сорбции. 2 табл., 14 пр.

 

Изобретение относится к области химии полимеров, биохимии и медицины, а именно к способу получения биоспецифического гидрогелевого сорбента для выделения протеиназ. Сорбент используют для удаления протеолитических ферментов из водных растворов, включая кровь, с целью детоксикации организма при патологических состояниях, сопровождающихся активацией протеолиза и ферментной интоксикацией, включая сепсис, гнойный перитонит, панкреатит, бронхиальную астму и т.п.

Известен способ получения биоспецифического гидрогелевого сорбента для выделения протеиназ путем взаимодействия ингибитора трипсина из сои с активированным сшитым полисахаридом - сефарозой [Gilliam E.B., Kitto G.B., Isolation of starfish trypsin by affinity chromatography, Comparative Biochemistry and Physiology. 1976. V.54. №1. P.21-26].

Недостатком известного способа является невысокая эффективность использования иммобилизованного ингибитора трипсина из сои. Емкость сорбента составляет 0,2 мг фермента на 1 мг химически связанного с полимером ингибитора.

Известен способ получения биоспецифического гидрогелевого сорбента для выделения протеиназ путем радикальной полимеризации при комнатной температуре под действием окислительно-восстановительного катализатора полимеризации водного раствора, содержащего 0.1-0.9% масс. овомукоида из белка утиных яиц, ацилированного хлорангидридом акриловой кислоты, 7.0-12.0% масс. акриламида и 0.5-1.1% масс. N,N′-метиленбисакриламида, с последующим измельчением образующегося гидрогеля и промыванием его бикарбонатным буфером до полного удаления непрореагировавших соединений [Авторское свидетельство СССР №1137388 A, G01N 33/50, Бюл. №4, 1985].

Этот сорбент под названием «Овосорб» находит практическое применение для удаления протеолитических ферментов из крови, с целью детоксикации организма при патологических состояниях, сопровождающихся активацией протеолиза и ферментной интоксикацией, включая общий гнойный перитонит, острый деструктивный панкреатит, обширные гнойно-некротические процессы мягких тканей, ожоговая болезнь, синдром сдавливания, синдром отторжения после трансплантации органов и тканей, лучевая болезнь, острая печеночная недостаточность, острая и хроническая почечная недостаточность, бронхиальная астма и т.д.

Недостатком известного способа является невысокая эффективность использования иммобилизованного овомукоида - самого дорогого компонента сорбента и длительное время проведения операции сорбции. Емкость сорбента составляет 0.8-1.0 мг фермента на 1 мг связанного с полимером овомукоида при сорбции в течение 90-100 минут. Теоретически возможная емкость сорбента составляет 2.4 мг фермента на 1 мг овомукоида (одна молекула овомукоида с ММ 31000 способна одновременно связать одну молекулу химотрипсина с ММ 25000 и две молекулы трипсина с ММ 25000). Большие времена проведения операции гемосорбции при извлечении ферментов из крови больных требуют дополнительного введения антикоагулянтов крови и их последующую нейтрализацию. Это существенно осложняет проведение операции.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемым результатам является способ получения биоспецифического гидрогелевого сорбента для выделения протеиназ путем радикальной полимеризации при комнатной температуре раствора, содержащего 7.0-12.0% масс. акриламида, 0.1-0.9% масс. овомукоида из белка утиных яиц, ацилированного хлорангидридом акриловой кислоты, 0.5-1.1% масс. сшивающего агента - N,N′-метиленбисакриламида, 0.01-0.12% масс. модифицирующей добавки - меркаптоуксусной кислоты и дистиллированную воду, под действием окислительно-восстановительного катализатора с последующим измельчением образующегося гидрогеля и промыванием его бикарбонатным буфером до полного удаления непрореагировавших соединений [Патент Российской Федерации №2484475. Бюл. №16. 2013].

Максимальная емкость сорбента при извлечении ферментов из плазмы крови человека составляет 1.72-1.75 мг фермента на 1 мг связанного с полимером овомукоида и достигается при временах проведения операции сорбции 120 минут. Причиной такой емкости сорбента является изменение структуры сорбента под действием меркаптоуксусной кислоты. В сорбенте, полученном в присутствии меркаптоуксусной кислоты, количество пор большого размера, доступных для соединений с ММ 141000, составляет 18-23% от суммарного количества пор. Невысокое количество пор большого размера делает сорбент менее проницаемым для сорбируемых соединений и приводит к необходимости увеличения времени проведения операции сорбции для полного насыщения сорбента до 100-120 минут.

Недостатком известного способа является невысокая емкость сорбента (73% от теоретически возможного) и длительное время проведения операции сорбции.

Задачей изобретения и техническим результатом, достигаемым при его использовании, являются повышение емкости сорбента и сокращение времени проведения операции сорбции.

Технический результат достигается тем, что в способе получения биоспецифического гидрогелевого сорбента для выделения протеиназ путем радикальной полимеризации при комнатной температуре водного раствора, содержащего акриламид, овомукоид из белка утиных яиц, ацилированный хлорангидридом акриловой кислоты, сшивающий агент, модифицирующую добавку и водную среду, под действием окислительно-восстановительного катализатора с последующим измельчением образующегося гидрогеля и промыванием его бикарбонатным буфером до полного удаления непрореагировавших соединений, в качестве сшивающего агента используют смесь, состоящую из 45-65% масс. диметакрилата этиленгликоля и 35-55% масс. диметакрилата тридекаэтиленгликоля, в качестве модифицирующей добавки используют водорастворимый полимер, в качестве водной среды - бикарбонатный буфер, а водный раствор содержит, % масс.: акриламид - 7.0-10.0, указанный ацилированный овомукоид - 0.1-0.9, указанный сшивающий агент - 0.5-1.0, водорастворимый полимер - 0.5-1.5, бикарбонатный буфер - остальное. В качестве водорастворимого полимера используют полиакриламид, поли-N-винилпирролидон, поливиниловый спирт.

Используемый овомукоид является ингибитором протеолитических ферментов и относится к классу гликопротеинов. Он имеет молекулярную массу 31000 и содержит 12.5% глюкозамина и 7.8% других сахаров. Его выделяют из белка утиных яиц по методике [Шульгин М.Н., Валуева Т.А., Кестере А.Я., Мосолов В.В. Свойства утиного овомукоида, очищенного методом аффинной хроматографии на трипсин-сефарозе. Биохимия, 1981. Т.46. №3. С.473-480].

Ацилирование овомукоида проводят растворением 100 мг овомукоида в 20 мл раствора бикарбоната аммония с pH 8.0, добавлением к полученному раствору при 0-5°C 0.01 мл хлорангидрида акриловой кислоты и перемешиванием смеси в течение 15 минут. Ацилированный овомукоид выделяют путем лиофильного высушивания.

Пример 1. В 87 мл бикарбонатного буфера (pH 8.0) растворяют 0.1 г овомукоида из белка утиных яиц, ацилированного хлорангидридом акриловой кислоты, 10.0 г акриламида, 1.0 г полиакриламида и 1.0 г смеси сшивающих агентов, состоящей из 0.65 г диметакрилата этиленгликоля (ДМЭГ) и 0.35 г диметакрилата тридекаэтиленгликоля (ТГМ) (т.е. 65% масс. ДМЭГ и 35% масс. ТГМ). В полученный раствор добавляют окислительно-восстановительный катализатор полимеризации: 0.01 г персульфата аммония и 0.2 мл 0.4%-ного водного раствора N,N,N′,N′-тетраметилэтилендиамина. Раствор вакуумируют при давлении 10-14 мм рт.ст. и полимеризацию проводят выдерживанием реакционной смеси при 15-20°C в течение 1 часа. Образующийся гидрогель измельчают и промывают бикарбонатным буфером (pH 8.0) до полного удаления непрореагировавших соединений (до тех пор, пока показатель преломления промывных вод не становится равным показателю преломления исходного бикарбонатного буфера).

Для изучения емкости сорбента его помещают в колонку объемом 25 мл и через колонку пропускают плазму крови человека, содержащие 2,0 мг трипсина и 1,1 мг α-химотрипсина в 1 мл, до полного насыщения сорбента. Количество сорбированных ферментов определяют путем смывания их с колонки водным раствором с pH 1,5.

Примеры 2-8. Процесс проводят по примеру 1, используя различные компоненты реакционной смеси (таблица 1).

Примеры 9-12 (контрольные). Процесс проводят по примеру 1, используя компоненты реакционной смеси в количествах, лежащих вне заявленных пределов (таблица 1).

В примерах 13-14 гидрогелевый сорбент получают по прототипу.

Полученные сорбенты характеризуют следующими свойствами:

1. Содержание химически связанного овомукоида в сорбенте (определяют как разность количества овомукоида в исходном растворе и в промывных водах).

2. Емкость сорбента по протеолитическим ферментам (определяют путем выдерживания набухшего сорбента в плазме крови человека, содержащей 2.0 мг трипсина и 1.1 мг α-химотрипсина в 1 мл, в течение 30, 60 и 120 минут при перемешивании и измерением количества поглощенных ферментов).

3. Количество пор, доступных для белка с молекулярной массой 141000 (алкогольдегидрогеназа из дрожжей), определяют путем выдерживания измельченных сорбентов в водном растворе белка; затем из равновесных степеней набухания сорбента в воде находят общий объем пор в сорбенте и, измеряя равновесную концентрацию белка после инкубирования с сорбентом, находят долю пор, проницаемых для этого белка. Полученные результаты приведены в таблице 2.

Таблица 1
Составы водных растворов для получения гидрогелевого сорбента.
№ примера Кол-во ацилированного овомукоида, % масс. Кол-во акриламида, % масс. Полимер и его кол-во, % масс. Общее кол-во сшивающего агента, % масс. ДМЭГ, г ТГМ, г ДМГ/ТМГ, % масс. Водная среда, % масс.
1 0.1 10.0 Полиакриламид, 1.0 1.0 0.65 0.35 65/35 87.9
2 0.3 10.0 Полиакриламид, 1.0 1.0 0.45 0.55 45/55 87.7
3 0.5 10.0 Полиакриламид, 1.0 0.5 0.25 0.25 50/50 88
4 0.8 8.0 Полиакриловая кислота, 1.0 0.7 0.35 0.35 50/50 89.5
5 0.9 7.0 Поли-N-винил-пирролидон, 1.5 1.0 0.5 0.5 50/50 89.6
6 0.7 7.0 Полиакриламид, 0.5 1.0 0.6 0.4 60/40 90.8
7 0.4 10.0 Полиакриламид, 1.5 0.8 0.4 0.4 50/50 87.3
8 0.5 9.0 Поливиниловый спирт, 1.0 0.5 0.25 0.25 50/50 89
0.7 10.0 нет 1.0 0.6 0.4 60/40 88.3
10к 0.7 10.0 Полиакриламид, 0.5 1.0 нет 1.0 - 87.8
11к 0.7 10.0 Полиакриламид, 0.5 1.0 1.0 нет - 87.8
12к 0.7 10.0 Полиакриламид, 2.0 1.0 0.5 0.5 50/50 86.3
13 (прототип) 0.1 8.0 Нет N,N-метиленбисакриламид, 1.0 нет нет Дистиллированная вода, 90.9
14 (прототип) 0.8 10.0 Нет N,N-метиленбисакриламид, 0.5 нет нет Дистиллированная вода, 88.7
Таблица 2
Свойства полученных сорбентов.
№ примера Кол-во овомукоида в сорбенте,
мг/мл
Емкость по ферментам, мг/ мг овомукоида Кол-во пор, доступных для соединений с ММ 141000
Через 30 минут сорбции Через 60 минут сорбции Через 120 минут сорбции
1 0.6 2.14 2.22 2.27 44
2 2.0 2.00 2.06 2.10 40
3 2.7 1.96 2.00 2.05 51
4 5.4 1.90 1.93 2.00 50
5 6.2 1.84 1.93 1.97 46
6 4.8 1.98 2.10 2.14 45
7 2.7 2.00 2.10 2.11 50
8 2.4 2.02 2.12 2.13 40
5.1 0.45 0.87 1.08 22
10к 4.8 0.48 0.80 0.96 31
11к 4.5 0.44 0.90 1.05 28
12к 6.2 0.84 1.52 1.66 20
13 прототип 0.6 0.77 1.30 1.75 18
14 прототип 1.8 0.83 1.42 1.72 23

Из табл.2 видно, что использование предложенного способа позволяет получать биоспецифический гидрогелевый сорбент с повышенной эффективностью использования овомукоида (до 2.27 мг фермента на 1 мг иммобилизованного овомукоида вместо 1.75 мг фермента на 1 мг иммобилизованного овомукоида по способу-прототипу) и повышенной скоростью сорбции ферментов (за первые 30 минут сорбент сорбирует до 95% от предельно возможного количества сорбированных ферментов, достигаемого за 120 минут; в то время как в способе-прототипе эта величина не превышает 48%). Причина повышенной скорости сорбции обусловлена особенностями структуры сорбента. Получаемый сорбент содержит до 50% пор, проницаемых для высокомолекулярных белков. Сорбент, получаемый по способу-прототипу, содержит 18-23% пор аналогичного размера. В контрольных примерах, в которых компоненты используют в количествах, лежащих вне заявленных пределах, эффективность использования овомукоида не превышает 1.66 мг фермента на 1 мг иммобилизованного овомукоида, а за первые 30 минут сорбции сорбируется не более 30% от предельно возможного количества сорбируемых ферментов.

Таким образом, предложенный способ позволяет получать биоспецифический гидрогелевый сорбент, обладающий лучшими эксплуатационными характеристиками, по сравнению с сорбентом, полученным по способу-прототипу.

Способ получения биоспецифического гидрогелевого сорбента для выделения протеиназ путем радикальной полимеризации при комнатной температуре водного раствора, содержащего акриламид, овомукоид из белка утиных яиц, ацилированный хлорангидридом акриловой кислоты, сшивающий агент, модифицирующую добавку и водную среду, под действием окислительно-восстановительного катализатора с последующим измельчением образующегося гидрогеля и промыванием его бикарбонатным буфером до полного удаления непрореагировавших соединений, отличающийся тем, что в качестве сшивающего агента используют смесь, состоящую из 45-65% масс. диметакрилата этиленгликоля и 35-55% масс. диметакрилата тридекаэтиленгликоля, в качестве модифицирующей добавки используют водорастворимый полимер, а в качестве водной среды - бикарбонатный буфер при содержании компонентов, % масс.:

акриламид 7.0-10.0
указанный ацилированный овомукоид 0.1-0.9
указанный сшивающий агент 0.5-1.0
водорастворимый полимер 0.5-1.5
бикарбонатный буфер остальное



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к способу получения сорбентов. Сорбент получают карбонизацией измельченных стеблей Тростника Южного, которые нагревают при 450-500°С в течение 10-15 минут, до потери ~ 70% массы, обрабатывают раствором 5% азотной кислоты, промывают в воде, высушивают при 100°С.

Изобретение относится к способам получения адсорбента на основе цеолитсодержащей породы. Цеолитсодержащую породу размалывают и перемешивают с выгорающей добавкой, связующим и с водным раствором пластификатора и формируют гранулы.

Изобретение относится к способам получения адсорбента диоксида углерода, предназначенного для использования в средствах защиты органов дыхания. Способ включает образование дисперсии оксидов щелочноземельных и/или гидроксидов щелочных и/или щелочноземельных металлов и нанесение дисперсии на листовую основу.

Изобретение относится к области неорганической химии, в частности к получению сорбентов на основе терморасширенного графита. Способ получения сорбента на основе термически расширенного графита, модифицированного железосодержащими фазами с ферримагнитными свойствами, включает следующие стадии: (A) получение смеси интеркалированного графита с раствором соли 2 и/или 3 валентного железа в органической жидкости, разлагающейся при нагреве с выделением метана, где концентрация соли железа в растворе составляет от 10 до 50 масс.
Изобретение относится к области промышленной экологии и может быть использовано для очистки сточных вод от тяжелых металлов и органических веществ. Предложен способ получения ионообменного сорбента, представляющего собой сополимер лигносульфоната натрия и полиметилакрилата.
Изобретение относится к сорбционной технике, а именно к способам подготовки сорбентов для концентрирования и выделения из газовых смесей паров полярных органических веществ.

Изобретение относится к синтезу сорбентов с химически закрепленными функциональными группами. Сорбент содержит 3-глицидилоксипропил-силикагель, который обработан тиосемикарбазидом при катализе хлорной кислотой в среде кипящего метанола в течение 8 часов.

Изобретение относится к методам химического модифицирования природных глинистых материалов для получения сорбента. Согласно изобретению 20 г монтмориллонитовой глины обрабатывают 100 мл 0,04 М раствора родамина Б при температуре 20-22°C, pH 2 в течение 60 мин.

Изобретение может быть использовано для детоксикации водоемов и очистки сточных вод, загрязненных солями мышьяка. Для осуществления заявленного способа детоксикацию сточных вод проводят с использованием сорбирующих материалов, состоящих из термически и химически модифицированного цеолита.

Изобретение относится к получению сорбентов для очистки растворов от ионов тяжелых металлов. Согласно способу нитраты алюминия, магния и натрия растворяют в азотной кислоте с добавлением этилового спирта, в полученную смесь вливают тетраэтоксисилан.

Изобретение относится к способам получения адсорбента диоксида углерода, предназначенного для использования в средствах защиты органов дыхания. Способ включает образование дисперсии оксидов щелочноземельных и/или гидроксидов щелочных и/или щелочноземельных металлов и нанесение дисперсии на листовую основу.
Изобретение относится к области промышленной экологии и может быть использовано для очистки сточных вод от тяжелых металлов и органических веществ. Предложен способ получения ионообменного сорбента, представляющего собой сополимер лигносульфоната натрия и полиметилакрилата.

Изобретение относится к анионообменным сорбентам для ионохроматографического определения органических и неорганических анионов. Сорбент общей формулы (1) содержит химически привитую с помощью спейсера четвертичную аммониевую функциональную группу, содержащую по крайней мере один 2-гидроксипропильный радикал. При этом R1 - (СН2)n, где n=2-8, R2 выбран из ряда: Н, ОН, Hal (галоген), Alkyl (алкильный радикал). В качестве исходного материала при получении берут аминированную матрицу, выбранную из ряда аминированных: полимера на основе дивинилбензола, в котором дивинилбензол является сшивающим агентом, полиметакрилата, диоксида кремния, диоксида титана, диоксида циркония или оксида алюминия.

Изобретение относится к области ионного обмена и может быть использовано для извлечения индия из растворов и при получении веществ особой чистоты. Предложены два варианта способа получения комплексообразующего сорбента.
Изобретение относится к области биологии и медицины и может быть использовано в клинической практике для терапии заболеваний, связанных с нарушениями липидного и липопротеинного обмена.

Изобретение относится к технологии получения сорбентов, используемых в природоохранных целях для локализации сбора и утилизации нефти и нефтепродуктов с загрязненных участков поверхности воды и грунта.
Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен биогибридный композиционный материал для сорбции и деградации нефти и нефтепродуктов.
Изобретение относится к технологии получения магнитных сорбентов. Сорбент содержит полимерное связующее в виде гуминовых кислот и магнитный наполнитель-магнетит.

Изобретение относится к области аналитической химии, химической технологии и экологии. Предложен способ группового извлечения меди, цинка и кадмия, включающий сорбционное концентрирование металлов на амберлите IRA-400, модифицированном 2,7-бисазопроизводным хромотроповой кислоты.

Изобретение относится к способам получения сорбентов для хроматографического разделения фуллеренов. Проводят термическую обработку многослойных углеродных нанотрубок при 800-1000°C.

Изобретение относится к способам получения хемосорбционных элементов. Готовят исходную композицию путём смешивания порошкообразных гидроксидов щелочных и/или щелочноземельных металлов с органическим полимером и растворителем. Осуществляют формование полученной суспензии с удалением растворителя. Смешение исходных компонентов осуществляют при весовом соотношении гидроксидов к полимеру, равном 70÷95/30÷5, количество растворителя при смешении составляет 10,0-30,0 см3 на 1 г полимера. После формования и сушки осуществляют компактирование, соединяя по меньшей мере два хемосорбирующих элемента их торцевыми поверхностями. После соединения хемосорбирующих элементов проводят обработку места контакта либо термическим воздействием при температуре 45-95°C, либо воздействием поля сверхвысокой частоты на место контакта. Затем проводят увлажнение полученного изделия водой или раствором гидроксида калия или натрия. Способ позволяет получать квазимонолитные хемосорбирующие элементы больших размеров, обладающие улучшенными эксплуатационными характеристиками. 1 з.п. ф-лы, 2 табл., 5 пр., 1 ил.
Наверх