Штамм francisella tularensis 15/23-1δreca со сниженной реактогенностью для создания живой туляремийной вакцины и способ его получения



Штамм francisella tularensis 15/23-1δreca со сниженной реактогенностью для создания живой туляремийной вакцины и способ его получения
Штамм francisella tularensis 15/23-1δreca со сниженной реактогенностью для создания живой туляремийной вакцины и способ его получения
Штамм francisella tularensis 15/23-1δreca со сниженной реактогенностью для создания живой туляремийной вакцины и способ его получения
Штамм francisella tularensis 15/23-1δreca со сниженной реактогенностью для создания живой туляремийной вакцины и способ его получения
Штамм francisella tularensis 15/23-1δreca со сниженной реактогенностью для создания живой туляремийной вакцины и способ его получения
Штамм francisella tularensis 15/23-1δreca со сниженной реактогенностью для создания живой туляремийной вакцины и способ его получения
Штамм francisella tularensis 15/23-1δreca со сниженной реактогенностью для создания живой туляремийной вакцины и способ его получения
Штамм francisella tularensis 15/23-1δreca со сниженной реактогенностью для создания живой туляремийной вакцины и способ его получения
Штамм francisella tularensis 15/23-1δreca со сниженной реактогенностью для создания живой туляремийной вакцины и способ его получения
Штамм francisella tularensis 15/23-1δreca со сниженной реактогенностью для создания живой туляремийной вакцины и способ его получения
Штамм francisella tularensis 15/23-1δreca со сниженной реактогенностью для создания живой туляремийной вакцины и способ его получения
Штамм francisella tularensis 15/23-1δreca со сниженной реактогенностью для создания живой туляремийной вакцины и способ его получения
Штамм francisella tularensis 15/23-1δreca со сниженной реактогенностью для создания живой туляремийной вакцины и способ его получения
Штамм francisella tularensis 15/23-1δreca со сниженной реактогенностью для создания живой туляремийной вакцины и способ его получения
Штамм francisella tularensis 15/23-1δreca со сниженной реактогенностью для создания живой туляремийной вакцины и способ его получения

 


Владельцы патента RU 2567810:

Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии (ФБУН ГНЦ ПМБ) (RU)

Изобретения относятся к области биотехнологии и касаются штамма Francisella tularensis 15/23-1ΔrecA и способа его получения. Охарактеризованный штамм является генетически маркированным: имеет только одну копию гена iglC и делетированный ген recA. Штамм получают из вакцинного штамма Francisella tularensis 15 НИИЭГ путем последовательного аллельного обмена одной из двух копий гена iglC и затем гена recA на их делетированные варианты с помощью суицидной векторной плазмиды, вводимой в клетки штамма методом трансформации с последующим отбором клеток штамма F. tularensis по признаку устойчивости к хлорамфениколу и дальнейшей селекцией модифицированных штаммов на среде с сахарозой. Предложенные изобретения позволяют получать штамм со сниженной реактогенностью и использовать его в качестве живой туляремийной вакцины. 2 н.п. ф-лы, 6 ил., 8 табл., 12 пр.

 

Изобретение относится к области медицины и ветеринарии и может найти применение при создании препаратов микробиологического происхождения для профилактики туляремии в здравоохранении.

В настоящее время для профилактики туляремии используются штамм F. tularensis subsp.holarctica 15 [Олсуфьев и др., 1960], полученный в 40-х годах прошлого столетия в России и применяемый на территории стран бывшего СССР, и его производный штамм F. tularensis LVS (Live Vaccine Strain), полученный в результате многочисленных пассажей F. tularensis 15 на питательных средах и применяемый в ограниченных масштабах в странах Европы и Северной Америки.

Несмотря на более чем полувековую историю разработки и изучения, оба штамма F. tularensis в качестве живых вакцин обладают целым рядом недостатков, основными из которых являются высокая реактогенность и множественные генетические дефекты.

Высокая реактогенность приводит к тому, что у 6-10% вакцинированных людей проявляется нежелательная реакция, которая частично может быть объяснена дефектами иммунной системы. Поэтому исключается применение живой туляремийной вакцины у людей с ослабленным иммунитетом. Например, безопасность штамма F. tularensis LVS для людей с ослабленным иммунитетом до сих пор не оценена, более того, основы протективности и патофизиологические процессы при иммунной перестройке до сих пор недостаточно понятны [Conlan et al., 2007]. Это, в частности, мешает лицензированию штамма F. tularensis LVS в США.

Штаммы F. tularensis 15 и, соответственно, LVS содержат множественные генетические дефекты, включая как точечные мутации, так и большие делеции [Rohmer et al., 2006], и, как следствие, обладают нестабильностью при хранении и диссоциируют при пересевах. Вакцинный штамм F. tularensis LVS при выращивании на пептонно-цистеиновом агаре образует два фенотипических варианта, отличающиеся по цвету колоний - голубые и серые. Голубые колонии способны индуцировать протективный иммунитет у мышей, в то время как серые не обладают такой способностью [Eigelsbach et al., 1961]. При серийном призводстве вакцины (при культивировании в жидкой питательной среде) голубой вариант способен превращаться в серый вариант, который может составлять до 20% от общего количества клеток [Sandstrom, 1994]. Относительный вклад каждого дефекта в возможность реверсии штаммов 15 и LVS остается неизвестным, то есть штаммы генетически не детерминированы.

Поэтому в настоящее время актуальным остается получение улучшенной живой туляремийной вакцины нового поколения. Главными требованиями, предъявляемыми к прототипам живой туляремийной вакцины, являются снижение реактогенности и интенсивности поствакцинальных реакций при сохранении протективных свойств, а также возможность исключения реверсий и стабильность свойств при хранении и пересевах за счет снижения диссоциации микробных клеток в другие формы. Важным требованием также является генетическая маркированность штамма-прототипа живой туляремийной вакцины за счет делеции целевых генов, позволяющая прогнозировать изменение свойств штамма и гарантировать невозможность реверсии этих изменений. Способом получения таких штаммов являются направленные мутации в целевых генах с прогнозируемыми изменениями свойств F. tularensis. В перечне потенциальных генов вирулентности F. tularensis (Broekhuijsen et al., 2003; Twine et al., 2005; Larsson et al., 2005; Rohmer et al., 2006, Лапин и др., 2011) одними из наиболее перспективных генов-мишеней считаются гены iglC и гены rec-оперона. Ген iglC отвечает за размножение F. tularensis внутри фагоцитов, тем самым обеспечивая инфекционный процесс при туляремии, и имеет две копии в геноме. Неполная инактивация этого гена (одной копии) приводит к частичной аттенуации штамма. В результате мутаций по генам recA, recB, recD, sbcA, sbcB утрачивается рекомбинационная способность штаммов F. tularensis, что в свою очередь ведет к снижению диссоциации колоний и стабилизации свойств штамма.

Технический результат изобретения заключается в получении генетически маркированного вакцинного штамма со сниженной реактогенностью и повышенной стабильностью, способного эффективно защищать экспериментальных животных от заражения F. tularensis subsp.holarctica 503.

Технический результат изобретения достигается тем, что предложен штамм F tularensis 15/23-1ΔrecA с целевыми делениями в генах - в одной копии гена iglC и гене recA.

Способ получения штамма F. tularensis 15/23-1ΔrecA из вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ заключается в последовательном аллельном обмене одной из двух копий гена iglC и затем гена recA на их делегированные варианты с помощью сконструированной суицидной векторной плазмиды pGM5, вводимой в клетки туляремийного микроба методом трансформации. Отличием патентируемого нами способа от ранее применявшегося является замена вектора pPV2 для осуществления аллельного обмена в геноме F. tularensis [Golovliov et al., 2003] на вектор pGM5, сконструированный нами на основе плазмиды pHV33 с введенным в нее геном sacB и делецией в ori-области рС194. Использование вектора pGM5 обеспечивает непосредственный перенос делегированных вариантов генов в клетки F. tularensis методом трансформации без дополнительных стадий с использованием Е. coli.

Штамм F. tularensis 15/23-1ΔrecA является генетически маркированным: имеет только одну копию гена iglC и делегированный ген recA. Инактивация этих генов привела к снижению реактогенности и повышению стабильности созданной туляремийной вакцины для лабораторных животных. Подкожное введение мышам линии BALB/c от 1×101 до 1×103 микробных клеток безопасно и способно защищать их от инфицирования 1000 DCL штамма Francisella tularensis subsp.holarctica 503. Штамм депонирован в Государственной коллекции «ГКПМ-Оболенск», номер В-6623. Низкая реактогенность, высокая стабильность, возможность использования стандартных сред и технологий для культивирования, хранения и приготовления позволяют использовать его в качестве живой туляремийной вакцины взамен существующей, приготовленной на основе штамма F. tularensis 15 НИИЭГ.

Основные свойства штамма F. tularensis 15/23-1 ΔrecA

Культурально-морфологические. Бактерии представляют собой мелкие кокковидные и палочковидные клетки размерами 0,2-0,7 мкм, неподвижны, грамотрицательны, образуют капсулу, обладают полиморфизмом. Аэробы, не растут на простых средах, ауксотрофы, культивируются при температуре 37°C в средах, богатых витаминами. Колонии вырастают на FT-агаре через 48-72 часа. Штамм F. tularensis 15/23-1ΔrecA можно выращивать как в жидких, так и на плотных питательных средах.

Стабильность. При пересевах на плотных питательных средах штамм F. tularensis 15/23-1ΔrecA стабилен и не диссоциирует в другие формы.

Биохимические. Клетки штамма F. tularensis 15/23-1ΔrecA утилизируют цистеин с образованием сероводорода, на среде Даунса ферментируют глюкозу и мальтозу, не ферментируют глицерин, сахарозу и лактозу. Устойчивы к эритромицину, полимиксину, пенициллину, ампициллину, чувствительны к стрептомицину, тетрациклину, доксициклину, гентамицину, канамицину, налидиксовой кислоте, не обладают цитруллинуреидазной и фосфатазной активностью.

Условия и состав сред для хранения и поддержания селекционного мутанта. Музейная культура штамма F. tularensis 15/23-1ΔrecA хранится при температуре +4°C на косяках среды МакКоя до 6 месяцев, в лиофильно высушенном состоянии до 5 лет.

Среда для культивирования. F. tularensis 15/23-1ΔrecA: культивируется на FT-агаре (ФБУН ГНГД ПМБ, Оболенск) и жидкой среде [Лапин и др., 2009].

Технологические особенности при культивировании. Технологических особенностей при культивировании штамма F. tularensis 15/23-1ΔrecA в сравнении с вакциной F. tularensis 15 НИИЭГ нет.

Изобретение иллюстрируется следующими чертежами.

Фиг 1 - схема плазмиды pHV33′mob.

Фиг. 2 - схема плазмиды pHV33′mobSacB.

Фиг. 3 - схема плазмиды pGM5.

Фиг. 4 - электрофореграмма ампликонов, полученных с праймерами 23CF и 23CR и ДНК штаммов F. tularensis: 2-F. tularensis 15; 3-F. tularensis 15/23-1; 4-F. tularensis 15/23-2; 1,5-Маркер GeneRuler™ 100 bp Plus DNA Ladder (Fermentas, Литва).

Фиг. 5 - электрофореграмма ампликонов, полученных с праймерами FSA и RSA и ДНК штаммов F. tularensis: 2-F. tularensis 15; 3-F. tularensis 15/23-1 ΔrecA; 1,4 - ДНК фага λ-HindIII.

Фиг. 6 - график относительного изменения среднего веса мышей в группе в процентах. Динамика изменения веса мышей линии BALB/c после инфицирования штаммами F. tularensis 15 НИИЭГ и F. tularensis 15/23-1 ΔrecA в дозе 1×102 КОЕ по отношению к первому дню.

Пример 1. Получение плазмиды pHV33′mob

Плазмидная ДНК pHV33 [Ehrlich et al., 1978] линеаризуется обработкой эндонуклеазой рестрикции BamHI и лигируется с Bam HI-фрагментом ДНК размером 1,7 т.п.н. с mob-областью плазмиды RP4, взятым из плазмиды pPV [Golovliov et al., 2003]. Полученным лигатом трансформируют клетки штамма Е. coli JM83 методом электропорации с отбором трансформантов на среде LA с хлорамфениколом (10 мг/мл).

Из выросших колоний выделяют плазмидную ДНК, обрабатывают эндонуклеазой рестрикции HindIII и рестрикты анализируют в 0,7%-ном агарозном геле. В результате отбирают два варианта клонов. Во всех образцах наблюдают наличие двух фрагментов ДНК: размером ~4,3 т.п.о. (pBR322) и ~2,9 т.п.о. (рС194) или ~2,7 т.п.о. (рС194, лишенная участка плазмиды, прилегающего к области начала репликации). Делеционный вариант плазмиды pHV33mob был назван pHV33′mob (Фиг. 1). Возникший делеционный вариант плазмиды содержит гибридный ген cat под промотором гена repH.

Пример 2. Получение плазмиды pHV33′mobsacB

Плазмидная ДНК pHV33′mob линеаризуется эндонуклеазой рестрикции EcoRI и липкие концы достраивают с помощью ДНК-полимеразы фага Т4. PstI-фрагмент ДНК размером 2,4 т.п.о., взятый из плазмиды pPV [Golovliov et al., 2003] и содержащий ген sacB из генома В. subtilis, обрабатывают ДНК-полимеразой фага Т4 для достройки липких концов. Векторную часть и фрагмент смешивают и лигируют. Полученным лигатом трансформируют клетки Е. coli JM83 методом электропорации с отбором трансформантов на среде LA с хлорамфениколом (10 мг/мл). Отобранные клоны не растут на среде с 5%-ной сахарозой, что указывает на экспрессию гена sacB в клетках кишечной палочки. Плазмида с встроенным геном sacB, необходимым для селекции бактерий, потерявших плазмиду, получает название pHV33′mobsacB (Фиг. 2).

Пример 3. Создание плазмидного вектора pGM5 для аллельного обмена в туляремийном микробе

Для удаления BamHI сайта в конструируемой плазмиде ДНК pHV33′mobsacB обрабатывают эндонуклеазой рестрикции BamHI и лигируют с хромосомной ДНК из Е. coli JM83, расщепленной мелкощепящей рестриктазой Sau3A. Полученным лигатом трансформируют клетки штамма Е. coli JM83. Отбор колоний производят на среде LA в присутствии хлорамфеникола (10 мг/мл). Отобранные колонии проверяют на отсутствие mob-фрагмента и находят клоны, содержащие плазмиду pHV33′sacBΔB, лишенную область mob и с инактивированным BamHI сайтом рестрикции. Из одного из клонов выделяют плазмидную ДНК, обрабатывают эндонуклеазами рестрикции SalI и Eco52I[XmaIII] и лигируют с фрагментом ДНК, вырезанным по сайтам рестрикции SalI и Eco52I[XmaIII] из полилинкера плазмиды pBlueskript II SK(-). Полученную плазмидную конструкцию обозначают как pGM5 и используют для проведения сайт-направленного мутагенеза туляремийного микроба. При трансформации клеток F. tularensis плазмидой pGM5 на 4-е сутки появляются мелкие колонии, не способные к нормальному росту на среде с хлорамфениколом (Фиг. 3).

Пример 4. Получение штамма F. tularensis 15/23-1

Конструирование плазмиды для мутагенеза генов iglC. Области генома выше и ниже гена iglC размером 1476 п.о. (5′-левое плечо) и размером 1557 п.о. (3′-правое плечо), включая первые 78 нуклеотидов и последние 8 нуклеотидов гена iglC соответственно (Табл. 1), амплифицируют в ПЦР с использованием в качестве матрицы хромосомной ДНК из штамма F. tularensis 15. Праймеры для левого плеча, FtiglCLl5 и FtiglCL0, содержат рестрикционные сайты SalI и BamHI соответственно. Праймеры для правого плеча, FtiglCR0 и FtiglCR15, содержат рестрикционные сайты BamHI и SalI соответственно.

Полученные фрагменты обрабатывают рестриктазами SalI и BamHI, объединяют, смешивают с плазмидной ДНК pGM5, рестрицированной по сайту узнавания SalI и дефосфорилированной, и лигируют. Этой лигазной смесью трансформируют клетки штамма Е. coli DH5α. Отбор трансформантов проводят по фенотипу ApRCmR. Полученные клоны проверяют в ПЦР на наличие в векторной плазмиде pGM5 вставки делегированного варианта гена iglC. Полученный штамм Е. coli DH5α(ΔiglC) содержит плазмиду pGM5ΔiglC с делегированным на 545 п.о. геном iglC, фланкированным гомологичными последовательностями протяженностью ~1,5 т.п.о. с каждой стороны. Выделенную из этого штамма рекомбинантную ДНК используют для трансформации штамма F. tularensis 15 методом электропорации [Pomerantsev et al., 2001] с целью аллельного замещения интактных генов iglC на мутантный вариант.

Аллельный обмен гена ΔiglC. Трансформант F. tularensis 15 с интегрированной плазмидой pGM5ΔiglC суспендировали в ЗФР до концентрации 5×109 кл./мл, титровали с шагом 10 до седьмого разведения и высевали по 0,2 мл из каждого разведения на среду FTA, содержащую 100 мкг мл-1 полимиксина В и 5% сахарозы. Чашки инкубировали при температуре 37°C в течение 72 ч. Среди клонов с фенотипом SucR отбирали варианты с фенотипом CmSSucR на среде FTA, содержащей 100 мкг мл-1 полимиксина В и 5% сахарозы. Методом ПЦР среди клонов CmSSucR отбирались варианты F. tularensis с делецией в одном гене iglC. Для проведения ПЦР использовали проверочные праймеры: 23CF-5′-AAGGATAAGACCTGTCTG-3′ и 23 CR-5′-TTGAAACCATACCGGGTA-3′, которые в случае делеции в одной копии гена iglC выявляли два ампликона размерами ~990 и ~450 п.о. (Фиг. 4). Отобранный вариант штамма с инактивированной одной копией гена iglC был обозначен как F. tularensis 15/23-1.

Пример 5. Получение штамма F. tularensis 15/23-1 ΔrecA

Конструирование плазмиды для мутагенеза гена recA. Области генома выше и ниже гена recA размером 1592 п.о. (3′-левое плечо) и размером 1392 п.о. (3′-правое плечо), включая первые 28 нуклеотидов и последние 28 нуклеотидов гена recA соответственно (Табл. 2), амплифицируют в ПЦР с использованием в качестве матрицы хромосомной ДНК из штамма F. tularensis 15. Праймеры для левого плеча, FSA и RBA, содержат рестрикционные сайты SalI и BamHI соответственно. Праймеры для правого плеча, FBA и RSA, содержат рестрикционные сайты BamHI и SalI соответственно.

Полученные фрагменты обрабатывают рестриктазами SalI и BamHI, объединяют, смешивают с плазмидной ДНК pGM5, рестрицированной по сайту узнавания SalI и дефосфорилированной, и лигируют. Этой лигазной смесью трансформируют клетки штамма Е. coli DH5α. Отбор трансформантов проводят по фенотипу ApRCmR. Полученные клоны проверяют в ПЦР на наличие в векторной плазмиде pGM5 вставки делегированного варианта гена recA. Полученный штамм Е. coli DH5α(ΔrecA) содержит плазмиду pGM5ΔrecA с делегированным на 1060 п.о. геном recA, фланкированным гомологичными последовательностями протяженностью ~1,6 т.п.о. и ~1,4 т.п.о. соответственно. Выделенную из этого штамма рекомбинантную ДНК используют для трансформации штамма F. tularensis 15/23-1 методом электропорации [Pomerantsev et al., 2001] с целью аллельного замещения интактного гена recA на мутантный вариант.

Аллельный обмен гена recA. Трансформант F. tularensis 15/23-1 с интегрированной плазмидой pGM5ΔrecA суспендирую в ЗФР до концентрации 5×109 кл./мл, титруют с шагом 10 до седьмого разведения и высевают по 0,2 мл из каждого разведения на среду FTA, содержащую 100 мкг мл-1 полимиксина В и 5% сахарозы. Чашки инкубируют при температуре 37°C в течение 72 ч. Среди клонов с фенотипом SucR отбирают варианты с фенотипом CmSSucR на среде FTA, содержащей 100 мкг мл-1 полимиксина В и 5% сахарозы. Методом ПЦР среди клонов CmSSucR отбирают варианты F. tularensis с делецией в гене recA. Для проведения ПЦР используют краевые праймеры FSA и RSA (Табл. 2), которые в случае нативного гена recA в исследуемом клоне выявляют ампликон размером 4009 п.о., а в случае делегированного гена recA - ампликон размером 2949 п.о. Отобранный вариант штамма с инактивированной одной копией гена iglC и делегированным геном recA был обозначают как F. tularensis 15/23-1ΔrecA (Фиг. 5).

Пример 6. Персистенция клеток штамма F. tularensis 15/23-1ΔrecA в организме мышей линии BALB/c

Культуру F. tularensis 15/23-1ΔrecA выращивают при температуре 37°C на FT-агаре. Стандартную суспензию клеток готовят в забуференном физиологическом растворе (ЗФР) с использованием стандарта мутности (ОСО 42-28-85-2012 ФГБУ НЦЭСМП). Из полученной взвеси 5×109 КОЕ/мл готовят десятикратные разведения и для заражения используют 7-е разведение (с концентрацией 5×102 КОЕ/мл). Для контроля заражающей дозы из седьмого разведения высевают по 0,1 мл взвеси на три чашки Петри с FT-агаром. Мышей линии BALB/c в количестве 15 штук инфицируют клетками штамма F. tularensis 15/23-1ΔrecA в дозе 1×102 КОЕ (суспензию с концентрацией 5×102 кл/мл вводят подкожно в объеме 0,2 мл). В качестве контроля используют взвесь вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ, приготовленную аналогично, и так же используют для заражения 15 мышей линии BALB/c.

На 4, 7, 14 и 21 сутки после заражения проводят эвтаназию животных (по 3 мыши), селезенки объединяют, гомогенизируют и суспендируют в объеме 5 мл ЗФР. Из полученной взвеси готовят ряд десятикратных разведений, проводят высевы на плотную питательную среду и инкубируют при температуре 37°C. Подсчет выросших на агаре колоний проводят через 72 ч. Статистическую обработку результатов проводят в программе Excel. Результаты представлены в таблице 3.

Пример 7. Реактогенность штамма F. tularensis 15/23-1ΔrecA для мышей линии BALB/c

Изменение веса мышей линии BALB/c, как меру реактогенности, оценивают в течение 21 суток после иммунизации штаммом F. tularensis 15/23-1ΔrecA в дозе 1×102 КОЕ. В качестве контроля используют штамм F. tularensis 15 НИИЭГ в той же дозе. Мышей взвешивают группой по 5 животных в одно и то же время суток. График относительного изменения среднего веса мышей в группе в процентах приведен на Фиг. 6.

Пример 8. Изменения гематологических показателей мышей линии BALB/c после вакцинации

Дополнительным показателем реактогенности вакцинного штамма являются изменения гематологических показателей мышей линии BALB/c после вакцинации.

Общий анализ крови животных исследуют с помощью автоматического гематологического анализатора для ветеринарии PCE90Vet («High Technology», США). Забор крови у животных проводят на 4, 7, 14 и 21 сутки после иммунизации, подвергая анестезии с помощью СО2. Животных накануне эксперимента лишают корма, оставляя свободным доступ к воде. Для определения форменных элементов крови с дифференциацией лейкоцитов используют рекомендованные к гематологическому анализатору микропробирки с антикоагулянтом К2-ЭДТА («Labor Diagnostik Systeme», Германия).

У мышей линий BALB/c при вакцинации штаммом F. tularensis 15 НИИЭГ наблюдают выраженную лейкопению в период 4-7 суток и относительный лейкоцитоз в период 14-21 суток. У мышей, иммунизированных штаммом F. tularensis 15/23-1ΔrecA, лейкопении не наблюдают, относительный лейкоцитоз отмечают на 14 сутки. Вакцинация обоими штаммами сопровождалась выраженной тромбоцитопенией с максимальным снижением на 7 сутки и относительным тромбоцитозом на 14-21 сутки. Наибольшие изменения количества тромбоцитов наблюдают у мышей, вакцинированных штаммом F. tularensis 15 НИИЭГ (Табл. 4).

Пример 9. Вирулентность штамма F. tularensis 15/23-1ΔrecA для мышей линии BALB/c

Вирулентность штаммов определяют на мышах линий BALB/c путем подкожного введения бактерий F. tularensis 15/23-1 ΔrecA в дозах 5×100, 5×101, 5×102, 5×103, 5×104, 5×105, 5×106 КОЕ/на мышь, по 10 мышей на каждое разведение. После наблюдения за животными в течение 21 дня рассчитывают величину LD50 (по методу Кербера в модификации Ашмарина) с величиной средней ошибки (Табл. 5).

Пример 10. Уровень специфического гуморального иммунитета у мышей линии BALB/c, вызываемого вакцинацией штаммом F. tularensis 15/23-1ΔrecA

Определение титра антител проводят методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). Ультразвуковой дезинтеграт F. tularensis (концентрация суспензии - 1×108 м.к./мл) адсорбируют в 96-луночных планшетах фирмы Greiner Bio-One (Германия) средней сорбции в 0,1 М карбонат-бикарбонатном буфере, pH 9,6, в течение ночи при температуре 4°C. Сыворотки, предварительно разводят в 50 раз, титруют с шагом 1:2 и инкубируют с антигеном в течение 1 ч при температуре 37°C. Оптическую плотность (ОД) в лунках измеряют при длине волны 492 нм. За титр антител принимают максимальное разведение сыворотки, в которой ОД хромогена превышает двойное значение фоновой оптической плотности.

Для оценки гуморального иммунитета мышей линии BALB/c вакцинируют подкожно клетками штамма 15/23-1ΔrecA и 15 НИИЭГ F. tularensis в дозе 102 КОЕ на мышь, концентрацию антител к антигенам F. tularensis определяют на 21 сутки после введения вакцин (Табл. 6).

Пример 11. Определение уровня гамма-интерферона в сыворотках мышей линии BALB/c, индуцируемого бактериями штамма F. tularensis 15/23-1ΔrecA

Уровень гамма-интерферона в сыворотке крови мышей оценивают иммуноферментным методом, используя наборы фирмы eBioScience (Австрия) согласно инструкции. Забор крови у животных проводят на 4, 7, 11 и 21 сутки после иммунизации, подвергая анестезии с помощью СО2. Животных накануне эксперимента лишают корма, оставляя свободным доступ к воде. Для получения сыворотки образцы крови оставляют при комнатной температуре на 15 мин, затем тонкой палочкой отделяют сгусток от стенок пробирки и центрифугируют в течение 10-15 мин при 3000 об/мин. Сразу после центрифугирования сыворотку отбирают, делят ее на аликвоты и хранят при температуре минус 20°C до выполнения анализа.

Уровень гамма-интерферона в сыворотке, свидетельствующий об активации иммунной системы, достигет максимума на 7 сутки, превышая исходные значения в 18 раз у мышей, вакцинированных F. tularensis 15 НИИЭГ, и 3,5 раза у мышей, вакцинированных штаммом F. tularensis 15/23-1ΔrecA (Табл. 7).

Пример 12. Протективные свойства штамма F. tularensis 15/23-1ΔrecA для мышей линии BALB/c

Мышей линии BALB/c иммунизируют подкожно дозами 5×100, 5×101, 5×102, 5×103 КОЕ/на мышь по 10 мышей на каждую дозу штаммами F. tularensis 15 НИИЭГ и F. tularensis 15/23-1ΔrecA. Через 30 суток после иммунизации животных подкожно инфицируют 1000 DCL (5×103 м.к.) тест-заражающего штамма F. tularensis 503. Наблюдение за животными ведут в течение 21 суток. Показано, что уровень защиты для всех животных составляет 100% вне зависимости от дозы иммунизации (Табл. 8).

Таким образом, предложенный штамм является генетически маркированным: имеет только одну копию гена iglC и делегированный ген recA. Инактивация этих генов привела к снижению реактогенности и повышению стабильности созданной туляремийной вакцины для лабораторных животных. Подкожное введение мышам линии BALB/c от 1×101 до 1×103 микробных клеток безопасно и способно защищать их от инфицирования 1000 DCL штамма Francisella tularensis subsp.holarctica 503. Низкая реактогенность, высокая стабильность, возможность использования стандартных сред и технологий для культивирования, хранения и приготовления позволяют использовать его в качестве живой туляремийной вакцины взамен существующей, приготовленной на основе штамма F. tularensis 15 НИИЭГ.

Литература

1. Лапин А.А., Павлов В.М., Мокриевич А.Н., Домотенко Л.В., Храмов М.В. Простая жидкая питательная среда для молекулярно-генетических исследований Francisella tularensis. Пробл. особо опасных инф. 2009; 102(4):66-7.

2. Лапин А.А., Мокриевич А.Н., Вахрамеева Г.М., Комбарова Т.И., Бахтеева И.В., Дятлов И.А., Павлов В.М. Иммунобиологические свойства штамма Francisella tularensis 15/10 с делетированным геном гесА. Пробл. особо опасных инф. 2011; 110(4):65-7.

3. Олсуфьев Н.Г., Руднев Г.П. (под ред). Туляремия. Медицина, Москва; 1960. С.460.

4. Conlan W.J., Oyston Р.С. Vaccines against Francisella tularensis. Ann. NY Acad. Sci. 2007; 1105:325-50.

5. Ehrlich S.D. DNA cloning in Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1978; 75:1433-36.

6. Eigelsbach H.T., Downs CM. Prophylactic effectiveness of live and killed tularemia vaccines. I. Production of vaccine and evaluation in the white mouse and guinea pig. J. Immunol. 1961; 87:415-25.

7. Golovliov I., Sjostedt A., Mokrievich A., Pavlov V. A method for allelic replacement in Francisella tularensis. FEMS Microbiol. Lett. 2003; 222:273-80.

8. Hornik R.B., Eigelsbach H.T. Aerogenic immunization of man with live tularemia vaccine. Bacteriol. Rev. 1966; 30:532-8.

9. McCrumb F.R.J. Aerosol infection of man with Pasteurella tularensis. Bacteriol. Rev. 1961; 25:262-7.

10. Pomerantsev A.P., Golovliov I.R., Ohara Y., Mokrievich A.N., Obuchi M., Norqvist A., Kuoppa K., Pavlov V.M. Genetic organization of the Francisella plasmid pFNLlO. Plasmid. 2001; 46(3):210-22.

11. Rohmer L., Brittnacher M., Svensson K, Buckley D., Haugen E., Zhou Y., Chang J., Levy R., Hayden H.,. Forsman M, Olson M., Johansson A., Kaul R., Miller S.I. Potential Source of Francisella tularensis Live Vaccine Strain Attenuation Determined by Genome Comparison. Infect. Immun. 2006; 74(12):6895-906.

12. Sandstrom G. The tularemia vaccine. J. Chem. Tech. Biotechnol. 1994; 59:315-20.

1. Штамм Francisella tularensis 15/23-1ΔrecA со сниженной реактогенностью для создания живой туляремийной вакцины является генетически маркированым: имеет только одну копию гена iglC и делетированый ген recA.

2. Способ получения штамма по п. 1 из вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ, заключающийся в последовательном аллельном обмене одной из двух копий гена iglC и затем гена recA на их делегированные варианты с помощью сконструированной суицидной векторной плазмиды, показанной на фиг. 3, вводимой в клетки штамма F. tularensis методом трансформации, с последующим отбором клеток штамма F. tularensis по признаку устойчивости к хлорамфениколу и дальнейшей селекцией модифицированных штаммов на среде с сахарозой, проверкой потери устойчивости к хлорамфениколу и ПЦР-анализом наличия соответствующих делеций.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к способу идентификации улучшенных вариантов белка. Способ включает тестирование множества вариантов белка с единичными заменами в первом тесте первого свойства и во втором тесте второго свойства.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа получения непрерывных клеточных линий живых клеток и их применений. Представленный способ включает облучение указанных живых клеток дозой УФ-света от около 20 мДж/см2 до около 300 мДж/см2 при длине волны между около 100 нм и около 400 нм в течение от около 30 сек до 5 мин и отбор клеток, способных к пролиферации после по меньшей мере 20 пассажей.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и микробиологии. .

Изобретение относится к микробиологии и молекулярной биологии и касается конструирования транспозон-индуцированного мутанта возбудителя мелиоидоза Burkholderia pseudomallei, несущего инактивированные последовательности генов лекарственного эффлюкса (multidrag efflux pumps) и хромосомных b-лактамаз класса А для использования в качестве модельного микроорганизма при анализе молекулярно-генетических основ множественной лекарственной устойчивости В.

Изобретение относится к способу получения новых чувствительных к тетрациклину штаммов рода Bifidobacteriaum sp., содержащих мутантный ген tet на хромосоме, а также к новым чувствительным к антибиотикам штаммам, получаемым из устойчивых к антибиотикам пробиотических штаммов.

Изобретение касается применения композиции, содержащей Bifidobacterium longum АТСС ВАА-999, для поддержания уменьшения веса или сохранения веса у половозрелых людей или животных.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложен способ определения наличия штамма молочнокислых бактерий, включающего IS-элемент, в молочном продукте.
Изобретение относится к биотехнологии. Штамм Streptococcus thermophilus Во4-I, обладающий высокой антагонистической активностью, депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ В-10893 и может быть использован при производстве кисломолочных продуктов и пробиотических препаратов.
Изобретение относится к биотехнологии. Штамм Lactobacillus plantarum В2-II, обладающий высоко антагонистической активностью, депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ В-10816 и может быть использован при производстве кисломолочных продуктов и пробиотических препаратов.
Изобретение относится к биотехнологии. Штамм Streptococcus salivarius М-9, обладающий высокой антагонистической активностью, депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ В-11177 и может быть использован при производстве кисломолочных продуктов и пробиотических препаратов.
Изобретение относится к биотехнологии. Штамм Enterococcus hirae О-45, обладающий высокой антагонистической активностью, депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ В-11173 и может быть использован при производстве кисломолочных продуктов.
Изобретение относится к биотехнологии. Штамм Enterococcus durans С-45, обладающий высокой антагонистической активностью, депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ В-11171 и может быть использован при производстве кисломолочных продуктов и пробиотических препаратов.

Группа изобретений относится к штамму Lactococcus lactis CNCM I-2807, предназначенному для лечения или профилактики расстройства пищеварения, и его применению. Для лечения или профилактики расстройства пищеварения может применяться также и штамм Lactococcus lactis CNCM I-1631.

Группа изобретений относится к вариантам штаммов молочнокислых бактерий, предназначенных для получения плантарицина А, K и N, и применению указанных штаммов. Предложены штамм молочнокислых бактерий Lactobacillus plantarum DSM 23213 и штамм молочнокислых бактерий Lactobacillus rossiae DSM 23214, совместное культивирование которых позволяет активировать синтез плантарицина А, K и N и получить продукт, содержащий плантарицин А, K и N.

Изобретение относится к медицине, а именно для использования в области иммунологии, и касается индуктора гамма интерферона. Для этого применяют экзополисахарид бактерий P.nigrifaciens штамма КММ 156 в качестве индуктора IFN-γ.
Наверх