Иммуногенная композиция



Иммуногенная композиция
Иммуногенная композиция
Иммуногенная композиция

 


Владельцы патента RU 2593789:

ТОРЭЙ ИНДАСТРИЗ, ИНК. (JP)

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и описывает иммуногенную композицию, содержащую в качестве активных веществ: иммуногенную микрочастицу, состоящую из микрочастицы комплекса адъювант-антиген, где антиген(ы), инкапсулирован(ы) в адъювантную микрочастицу, состоящую из амфифильного полимера(ов), у которого(ых) гидрофобный(е) сегмент(ы) представляет(ют) собой поли(гидроксикислоту); и молекулы поверхностно-активного вещества, включающие структуру эфира жирной кислоты, инкапсулированные в иммуногенную микрочастицу. Иммуногенные микрочастицы обеспечивают высокую иммуноактивирующую способность в отношении живого организма, даже при небольшом количестве антигена и/или небольшом количестве доз и могут быть использованы в качестве вакцины для терапии и/или профилактики инфекционных заболеваний, раковых образований. 11 н.п. ф-лы, 6 ил., 6 табл., 13 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к иммуногенной композиции, содержащей в качестве активного ингредиента иммуногенную микрочастицу, при этом иммуногенная микрочастица включает: микрочастицы комплексов адъювант-антиген, где антиген(ы) инкапсулирован(ы) в адъювантной микрочастице, состоящей из амфифильного полимера(ов); и поверхностно-активное вещество.

Уровень техники

Для повышения иммуноактивирующей способности антигена, вместе с антигеном используют адъювант. Хотя полный адъювант Фрейнда (CFA), как известно, имеет превосходный эффект в качестве адъюванта, CFA готовят из убитых бактерий и эмульсии масла, и, следовательно, он имеет сильные побочные эффекты, такие как сильная воспалительная реакция и образование язвенной опухоли (гранулемы) в области введения. Поэтому использование CFA для человека не разрешено по причине безопасности. Соответственно, адъюванты, которые разрешены для введения человеку, ограничены.

Примеры адъювантов, которые разрешены для введения человеку, включают адъюванты на основе гидроксида алюминия, но их иммуноактивизирующая способность необязательно является достаточной, и, следовательно, их нужно неоднократно вводить, для достижения приобретения иммунитета. Поэтому разработка иммуногенной композиции, в которой используется эффективный и сильный адъювант, и где такая композиция может быть использована для людей, остается востребованной.

Для разработки нового адъюванта, предназначенного для достижения высокой иммуноактивирующей способности, был реализован способ, где антиген инкапсулирован в микрочастицу. Сообщалось, что введение антигена в виде микрочастиц увеличивает иммунологические реакции, такие как продукция антител, по сравнению со случаем введения только одного антигена, но эффект от его введения не являлся достаточно высоким, поскольку было сообщено только об эффекте с почти таким же уровнем, как в случае вышеуказанного адъюванта на основе гидроксида алюминия. Это, как полагают, происходит из-за трудности в эффективном инкапсулировании гидрофильных антигенных молекул, таких как белки, в микрочастицы, которые известны как микрочастицы, состоящие из гидрофобных сополимеров полимолочных кислот и полигликолевых кислот, с поддержанием структуры молекул антигена (непатентный документ 1).

В последние годы сообщалось о новой технологии микрочастиц (патентные документы 1 и 2), где в такой технологии используют амфифильный полимер, который позволяет с высокой эффективностью инкапсулировать белок с высокой молекулярной массой. Хотя эта новая микрочастица была изучена для ее работы при замедленном высвобождении лекарственных средств, ее адъювантная функция в случаях инкапсуляции антигена в целом не была изучена. Кроме того, на основе механизма, по которому микрочастица, содержащая антиген, функционирует в качестве адъюванта, считается, что функция замедленного высвобождения молекулы антигена, так же как и механизма, по которому микрочастица, содержащая антиген, полностью включается в иммуноцит и высвобождает антиген в клетке, являются важными, и что функция высвобождения лекарственного средства из частицы и работы в качестве адъюванта необязательно коррелированы друг с другом. Поэтому трудно вывести адъювантную функцию, основанную на замедленном высвобождении частицы, и невозможно предложить эффективный адъювант, имеющий намного лучшее действие, чем алюминиевые адъюванты, на основе обычных технологий с использованием микрочастиц, несмотря на необходимость его создания.

Документы уровня техники

Патентные документы

Патентный документ 1 - WO2006/095668

Патентный документ 2 - JP 2008-088158 A

Непатентные документы

Непатентный документ 1 - Advanced drug delivery reviews, 2005, vol. 57, pp. 391-410.

Сущность изобретения

Проблемы, решаемые изобретением

Настоящее изобретение обеспечивает иммуногенную композицию, которая проявляет высокую иммуноактивирующую способность даже с небольшим количеством антигена и/или при небольшом количестве доз.

Средства для решения проблемы

Для решения вышеуказанных проблем, авторы настоящего изобретения изучили способ, которым может быть индуцирован высокий уровень иммунной активации при использовании небольшого количества антигена и небольшого количества его доз, и в результате обнаружили, что иммуногенная композиция, содержащая в качестве активных ингредиентов: иммуногенную микрочастицу, состоящую из микрочастицы комплекса адъювант-антиген, где антиген(ы) инкапсулирован(ы) в адъювантную микрочастицу; и поверхностно-активное вещество; имеет высокую иммуноактивирующую способность в условиях in vivo. Таким образом, настоящее изобретение включает следующее.

(1) Иммуногенная композиция, содержащая в качестве активного ингредиента: иммуногенную микрочастицу, состоящую из микрочастицы комплекса адъювант-антиген, где антиген(ы) инкапсулирован(ы) в адъювантную микрочастицу, состоящую из амфифильного полимера(ов), у которого(ых) гидрофобный(е) сегмент(ы) представляет(ют) собой поли(гидроксикислоту); и поверхностно-активное вещество, где поверхностно-активное вещество инкапсулировано в иммуногенную микрочастицу.

(2) Иммуногенная композиция по (1), где иммуногенная микрочастица представляет собой частицу, состоящую из микрочастиц комплекса адъювант-антиген, ассоциированных друг с другом.

(3) Иммуногенная композиция по (1) или (2), где поверхностно-активное вещество включает структуру эфира жирной кислоты.

(4) Иммуногенная композиция по любому из (1)-(3), где адъювантная микрочастица имеет в своей внутренней части гидрофильную часть(и), состоящую(ие) из гидрофильного сегмента(ов) амфифильного полимера(ов), и имеет внешний слой, состоящий из гидрофобной части(ей), состоящий(их) из гидрофобного сегмента(ов) амфифильного полимера(ов).

(5) Иммуногенная композиция по любому из (1)-(4), где гидрофильный сегмент амфифильного полимера представляет собой полисахарид.

(6) Иммуногенная композиция по любому из (1)-(5), где амфифильный полимер представляет собой привитый амфифильный полимер, состоящий из полисахаридного каркаса и присоединенной(ых) цепи(ей) поли(гидроксикислоты).

(7) Иммуногенная композиция по (5) или (6), где полисахарид представляет собой декстран.

(8) Иммуногенная композиция по любому из (1)-(7), где поли(гидроксикислота) представляет собой сополимер молочной и гликолевой кислот.

(9) Иммуногенная композиция по любому из (1)-(8), где поверхностно-активное вещество дополнительно включает моносахарид и/или структуру(ы) полиэтиленгликоля.

(10) Иммуногенная композиция по любому из (1)-(8), где поверхностно-активное вещество представляет собой одно или более соединений, выбранных от группы, состоящей из полисорбата 80, полисорбата 20, моноолеата сорбитана, триолеата сорбитана и полиоксиэтилена гидрогенизированного касторового масла.

(11) Иммуногенная композиция, содержащая в качестве активного ингредиента иммуногенную микрочастицу, полученную стадиями:

растворения поверхностно-активного вещества в водном растворителе A, в котором растворен(ы) антиген(ы), или в органическом растворителе B, не смешивающемся с водой, в котором растворен(ы) амфифильный полимер(ы), у которого(ых) гидрофобный сегмент(ы) представляет(ют) собой поли(гидроксикислоту), и смешивания полученной смеси с получением обратнофазной эмульсии; и

удаления растворителя из обратнофазной эмульсии.

(12) Иммуногенная композиция, содержащая в качестве активного ингредиента иммуногенную микрочастицу, полученную способом получения частицы, состоящей из микрочастиц комплекса адъювант-антиген, связанных друг с другом, включающим стадии:

смешивания водного растворителя A, в котором растворен(ы) антиген(ы), и органического растворителя B, не смешивающегося с водой, в котором растворен амфифильный полимер(ы), гидрофобный сегмент(ы) которого представляет(ют) собой поли(гидроксикислоту), с получением обратнофазной эмульсии;

удаления растворителя из обратнофазной эмульсии с получением микрочастиц комплекса адъювант-антиген; и

введения дисперсии C микрочастиц комплекса адъювант-антиген в жидкую фазу D, где растворен поверхностный модификатор, с последующим удалением дисперсионной среды;

где поверхностно-активное вещество(а) растворено(ы) в водном растворителе A, в органическом растворителе B, не смешивающемся с водой, и/или в дисперсии C.

Эффект изобретения

Настоящим изобретением предоставлена иммуногенная композиция с сильной иммунной активацией in vivo, которая ранее была невозможна.

Краткое описание фигур

На фиг.1 показана иммунологическая оценка 1 иммуногенных микрочастиц, содержащих CEA.

На фиг.2 показана иммунологическая оценка 2 иммуногенных микрочастиц, содержащих CEA.

На фиг.3 показана иммунологическая оценка 3 иммуногенных микрочастиц, содержащих CEA.

На фиг.4 показана иммунологическая оценка 4 иммуногенных микрочастиц, содержащих CEA.

На фиг.5 показана иммунологическая оценка 5 иммуногенных микрочастиц, содержащих CEA.

На фиг.6 показана иммунологическая оценка иммуногенных микрочастиц, содержащих OVA.

Лучший вариант осуществления изобретения

Настоящее изобретение относится к иммуногенным композициям, содержащим в качестве активного ингредиента иммуногенную микрочастицу, состоящую из микрочастицы комплекса адъювант-антиген, где антиген(ы), инкапсулирован(ы) в адъювантную микрочастицу, состоящую из амфифильного полимера(ов), гидрофобный(е) сегмент(ы) которого(ых) представляет(ют) собой поли(гидроксикислоту); и поверхностно-активное вещество.

В первую очередь дается описание амфифильного полимера, составляющего адъювантную микрочастицу. Понятие "амфифильный" означает, что сохранены свойства как гидрофильности, так и гидрофобности. Когда растворимость в воде определенной части выше, чем растворимость других частей, эта часть называется гидрофильной. Гидрофильная часть является предпочтительно растворимой в воде, но даже в случаях, когда эта часть имеет плохую растворимость в воде, это является достаточном, если ее растворимость в воде выше, чем растворимость других частей. Когда растворимость в воде определенной части ниже, чем растворимость других частей, эта часть называется гидрофобной. Гидрофобная часть является предпочтительно нерастворимой в воде, но даже в случаях, когда эта часть имеет плохую растворимость в воде, это является достаточном, если ее растворимость в воде ниже, чем растворимость других частей.

Амфифильный полимер означает полимер, имеющий вышеуказанную амфифильность для всей молекулы. Понятие полимер означает, что молекула имеет молекулярную структуру, в которой гидрофильный сегмент(ы) или гидрофобный сегмент(ы) амфифильного полимера, или оба вместе, образует(ют) структуру, в которой повторяются минимальные единицы (мономеры). Амфифильный полимер настоящего изобретения не является ограниченным, если он имеет структуру, включающую гидрофильный сегмент(ы) и гидрофобный сегмент(ы), и он может быть линейным блок-полимером, имеющим гидрофильный сегмент(ы) и гидрофобный сегмент(ы), связанные друг с другом; разветвленным полимером, имеющим разветвления, в котором присутствует множество гидрофильных или гидрофобных сегментов, или оба из них; или привитый полимер, в котором множество гидрофобных сегментов присоединены к гидрофильному сегменту или множество гидрофильных сегментов присоединены к гидрофобному сегменту. Амфифильный полимер настоящего изобретения предпочтительно является полимером, имеющим один гидрофильный сегмент, при этом наиболее предпочтителен линейный блок-сополимер, имеющий как гидрофильный сегмент, и так гидрофобный сегмент, или привитый полимер, имеющий множество гидрофобных сегментов, присоединенных к основной цепи гидрофильной сегмента.

Амфифильные полимеры, составляющие иммуногенную композицию, могут быть набором из множества типов амфифильных полимеров, состоящих из полимерных составляющих, имеющих разные гидрофильные части, и/или из гидрофильных частей, или набор амфифильных полимеров, имеющих такой же полимерный состав, но имеющих множество типов соединений, если такие амфифильные полимеры обладают свойствами адъювантной микрочастицы. Для достижения воспроизводимости и увеличения продуктивности, амфифильные полимеры предпочтительно являются набором небольшого количества типов амфифильных полимеров, более предпочтительно набор преимущественно состоит не более чем из 2 типов амфифильных полимеров, и еще более предпочтительно, он состоит преимущественно из одного типа амфифильного полимера.

В настоящем изобретении гидрофобный сегмент амфифильного полимера представляет собой поли(гидроксикислоту). Поли(гидроксикислота) не является ограниченной и предпочтительно представляет собой биологически совместимый полимер, который не имеет существенного отрицательного воздействия при введении в живой организм. Биологическая совместимость, как используется в данном описании, означает, что в случае орального введения полимера крысам, LD50 составляет не менее 2000 мг/кг. Кроме того, полимер может быть сополимером из множества типов гидроксикислот, и он предпочтительно является полимером, состоящим не более чем из 2 типов гидроксикислот. Конкретные предпочтительные примеры поли(гидроксикислот) включают полигликолевую кислоту, полимолочную кислоту, поли(2-гидроксимасляную кислоту), поли(2-гидроксивалериановую кислоту), поли(2-гидроксикапроновую кислоту), поли(2-гидроксикаприновую кислоту) и поли(яблочную кислоту); производные и сополимеры этих макромолекулярных соединений; среди которых более предпочтительны сополимеры полимолочной кислоты, сополимеры полигликолевой кислоты и сополимеры полимолочной и полигликолевой кислот. Кроме того, в случаях, когда поли(гидроксикислота) представляет собой сополимер полимолочной и полигликолевой кислот, соотношение молочной и гликолевой кислот (мольные %) в составе сополимера полимолочной и полигликолевой кислот не является ограниченным, если достигается цель настоящего изобретения, как описано выше, и предпочтительное соотношение составляет от 100:0 до 30:70, более предпочтительно от 60:40 до 40:60.

Гидрофильный сегмент амфифильного полимера не является ограниченным и предпочтительно представляет собой биологически совместимый полимер, как в случае гидрофобного сегмента. Кроме того, с целью придания персистентной адъювантной способности для адъювантной микрочастицы, состоящей из амфифильного полимера(ов), сегмент предпочтительно представляет собой устойчивый полимер, который не поддается легкой деструкции в живом организме или в клетке млекопитающего или птицы. Конкретные примеры биологически совместимого и устойчивого полимера включают полиэтиленгликоль, поливинилпирролидон, поливиниловый спирт, полиэтиленимин, полиакриловую кислоту, полиметакриловую кислоту, поли-1,3-диоксан, полимер 2-метакрилоилоксиэтилена с фосфорилхолином, поли-1,3,6-триоксан, полиаминовую кислоту и устойчивые полисахариды (например, целлюлозу, хитин, хитозан, геллановую смолу, альгиновую кислоту, гиалуроновую кислоту, пуллулан и декстран). В случаях, когда гидрофильный сегмент представляет собой полиэтиленгликоль, поливинилпирролидон, поливиниловый спирт, полиэтиленимин, полиакриловую кислоту, полиметакриловую кислоту, поли-1,3-диоксан, полимер 2-метакрилоилоксиэтилена с фосфорилхолином, поли-1,3,6-триоксан или полиаминовую кислоту, амфифильный полимер предпочтительно представляет собой линейный блок-сополимер, который имеет как гидрофильный, так и гидрофобный сегменты, и в случаях, когда гидрофильный сегмент представляет собой полисахарид, амфифильный полимер предпочтительно представляет собой привитый полимер, имеющий множество гидрофобных сегментов, присоединенных с основной гидрофильной цепью сегмента. Кроме того, гидрофильный сегмент амфифильного полимера предпочтительно представляет собой полиэтиленгликоль или устойчивый полисахарид, при этом более предпочтительным полисахаридом является декстран.

Амфифильный полимер, имеющий гидрофобный сегмент(ы), состоящий(е) из поли(гидроксикислоты), и гидрофильный сегмент(ы), предпочтительно не смешивается с водой как целый полимер, из-за способности иммуногенной композиции инкапсулировать антиген и из-за персистентности при введении в живой организм.

Средняя молекулярная масса гидрофильного сегмента амфифильного полимера не ограничена, и в случае блок-сополимера, где гидрофильный сегмент(ы) и гидрофобный сегмент(ы) линейно связаны друг с другом, средняя молекулярная масса предпочтительно составляет от 1000 до 50000, более предпочтительно от 2000 до 15000. Термин "блок", используемый в данном описании, означает часть в молекуле полимера, где такая часть состоит из не менее 5 мономерных звеньев и отличается от другой смежной части(ей) по химической структуре или конфигурации. Полимер, состоящий, по меньшей мере, из двух блоков, линейно связанных друг с другом, называют блок-сополимером. Каждый блок, непосредственно составляющий блок-сополимер, может быть случайным, периодическим или градиентным полимером, состоящим из не менее 2 типов мономерных звеньев. В настоящем изобретении блок-сополимер предпочтительно является таким, в котором предпочтительно присоединены одно звено полимера, образующего гидрофильный сегмент, и одно звено поли(гидроксикислоты).

В случае привитого полимера, имеющего гидрофобный сегмент(ы), присоединенный(ые) к основной цепи гидрофильного сегмента, средняя молекулярная масса гидрофильного сегмента предпочтительно составляет от 1000 до 100 000, более предпочтительно от 2000 до 50000, еще более предпочтительно от 10000 до 40000. Число присоединенных цепей предпочтительно составляет от 2 до 50. Число присоединенных цепей может быть вычислено на основе отношения между основной цепью гидрофильного сегмента и основной цепью гидрофобного сегмента, и средней молекулярной массы гидрофобного сегмента, полученной при помощи 1H-ЯМР измерения, и средней молекулярной массы основной цепи используемого гидрофильного сегмента.

Предпочтительное соотношение средних молекулярных масс гидрофобного сегмента и гидрофильного сегмента варьирует в зависимости от амфифильного полимера и, в случае блок-сополимера, где гидрофобный сегмент(ы) и гидрофильный сегмент(ы) линейно связаны друг с другом, среднее соотношение молекулярной массы между гидрофильным сегментом и гидрофобным сегментом составляет предпочтительно 1:1 или более, более предпочтительно 1:2 или более, еще более предпочтительно 1:4 или более, особенно предпочтительно 1:4 или более; и 1:25 или менее.

В случае привитого полимера, имеющего множество гидрофобных сегментов, присоединенных к основной цепи гидрофильного сегмента, среднее соотношение молекулярной массы между основной цепью гидрофильного сегмента и всеми присоединенными гидрофобными сегментами, предпочтительно составляет 1:3 или более, и средняя молекулярная масса каждой присоединенной цепи составляет от 2500 до 40000. Более предпочтительно, когда среднее соотношение всех молекулярных масс составляет 1:5 или более, и средняя молекулярная масса каждой присоединенной цепи составляет от 5000 до 40000.

Следует отметить, что вышеуказанная средняя молекулярная масса представляет собой значение средней молекулярной массы, если не указано иное. Показатель средней молекулярной массы представляет собой значение средней молекулярной массы, вычисленной без учета молекулярного размера, и значение средней молекулярной массы амфифильного полимера и полимеров, составляющих гидрофильный сегмент(ы) амфифильного полимера, могут быть вычислены как молекулярные массы на основе значений молекулярных масс полистирола или пуллулана, путем измерения гельпроникающей хроматографией (GPC). Кроме того, средняя молекулярная масса поли(гидроксикислот) может быть вычислена с помощью ядерного магнитного резонанса (ЯМР), на основе соотношения площадей под пиками для концевых остатков и площадей под пиками для других остатков.

Амфифильный полимер, используемый в настоящем изобретении, может быть синтезирован известным способом, и примеры такого способа включают способ, где полимер поли(гидроксикислоты) добавляют к полимеру, который будет использоваться в качестве гидрофильного сегмента, и реакцию конденсации полученной смеси, для получения амфифильного полимера; способ, где активированные мономеры гидроксикислот добавляют к полимеру, который будет использоваться в качестве гидрофильного сегмента, и проводят реакцию полимеризации полученной смеси, для получения амфифильного полимера; и способ, где, наоборот, мономеры, составляющие гидрофильный сегмент, добавляют к гидрофобному сегменту, который является поли(гидроксикислотой), и проводят реакцию полимеризации полученной смеси.

Например, амфифильный полимер, состоящий из полиэтиленгликоля и поли(гидроксикислоты), может быть получен способом, в котором активизированные мономеры гидроксикислоты добавляют к полиэтиленгликолю в присутствии оловянного катализатора, чтобы осуществить реакцию полимеризации для введения поли(гидроксикислоты), с получением, таким образом, амфифильного блок-сополимера (Journal of Controlled Release, 71, p. 203-211 (2001)).

Кроме того, амфифильный полимер привитого типа, состоящий из полисахарида и присоединенной цепи(ей) поли(гидроксикислоты), может быть получен, например, как описано в (1), (2) или (3) ниже:

(1) способом, в котором активизированные мономеры гидроксикислоты добавляют к полисахариду в присутствии оловянного катализатора, чтобы осуществить реакцию полимеризации для введения поли(гидроксикислоты), с получением, таким образом, амфифильного полимера привитого типа (Macromolecules, 31, p. 1032-1039 (1998));

(2) способом, в котором незащищенные гидроксильные группы в части полисахарида, у которого большинство его гидроксильных групп защищены заместителями, активируют основанием, и добавляют активированные мономеры гидроксикислоты для включения присоединяемой цепи(ей), состоящих из поли(гидроксикислоты), с последующим удалением защитных групп, получая, таким образом, амфифильный полимер привитого типа (Polymer, 44, p. 3927-3933, (2003)); и

(3) способом, в котором реакцию конденсации сополимера поли(гидроксикислоты) с полисахаридом осуществляют, используя дегидрирующий агент и/или агент, формирующий функциональные группы, с получением амфифильного полимера привитого типа (Macromolecules, 33, p. 3680-3685 (2000)).

Адъювантная микрочастица описана ниже. Адъювантная микрочастица представляет собой микрочастицу, имеющую адъювантную способность, и адъювантная способность означает способность, с которой может быть вызван иммунный ответ на введение антигена в живой организм на более высоком уровне, чем в случае введения только одного антигена. Кроме того, в настоящем изобретении понимается, что адъювантная микрочастица представляет собой микрочастицу, состоящую из амфифильного полимера(ов) и антигена(ов), инкапсулированного(ых) в адъювантную микрочастицу, с образованием микрочастицы комплекса адъювант-антиген, где такой комплекс содержит микрочастицу в качестве активного ингредиента иммуногенной композиции настоящего изобретения.

Структура адъювантной микрочастицы не является ограниченной, но структура, где гидрофильный сегмент(ы) амфифильного полимера(ов) включен(ы) в адъювантную микрочастицу и гидрофобный сегмент(ы) амфифильного полимера(ов) представлен(ы) в виде внешнего слоя, предпочтительна с точки зрения сохранения стабильности инкапсулированного антигена(ов).

Тип антигена, инкапсулированного в адъювантную микрочастицу, не является ограниченным, и он может быть пептидом, белком, гликопротеином, гликолипидом, липидом, углеводом, нуклеиновой кислотой или полисахаридом; или вирусом, бактериальной клеткой, аллергенным веществом, тканью или клеткой, включающих их. Конкретные примеры антигена включают антигены, полученные из пыльцы, антигены, полученные из вируса гепатита A, антигены, полученные из вируса гепатита B, антигены, полученные из вируса гепатита C, антигены, полученные из вируса гепатита D, антигены, полученные из вируса гепатита C, антигены, полученные из вируса гепатита E, антигены, полученные из вируса гепатита F, антигены, полученные из вируса ВИЧ, антигены, полученные из вируса гриппа, антигены, полученные из вируса герпеса (HSV-1, HSV-2), антигены, полученные из возбудителя сибирской язвы, антигены, полученные из хламидий, антигены, полученные из пневмококков, антигены, полученные из вируса японского энцефалита, антигены, полученные из вируса кори, краснухи, антигены, полученные из Clostridium tetani, антигены, полученные из вируса ветрянки, антигены, полученные из вируса атипичной пневмонии (SARS), антигены, полученные из вируса Эпштейна-Барра (EB), антигены, полученные из вируса папилломы, антигены, полученные из Helicobacter pylori, антигены, полученные из вируса бешенства, антигены, полученные из вируса Западного Нила, антигены, полученные из хантавируса, антигены, полученные из Streptococcus, антигены, полученные из Staphylococcus, антигены, полученные из Bordetella pertussis, антигены, полученные из Mycobacterium tuberculosis, антигены, полученные из Plasmodium, антигены, полученные из полиовируса, антигены, полученные из различных зоонозных инфекций, антигены рака и антигены, полученные из различных пищевых аллергенов.

Для инкапсулированного антигена нет требования быть единственным антигеном. В свете применения настоящего изобретения, иммунные ответы могут быть индуцированы против раковых клеток, бактерий, вирусов или подобных, которые состоят из множества элементов. В таких случаях антиген может быть множеством типов белков или подобного, которые могут вызвать иммунные ответы, или может быть смесью веществ, типы которых не могут быть идентифицированы. Кроме того, включение множества типов антигенов для успешной индукции иммунных ответов против множества типов антигенов, является одной из форм использования иммуногенной композиции настоящего изобретения. В адъювантную микрочастицу может быть инкапсулировано предпочтительно более 3 типов антигенов, более предпочтительно один тип антигена.

Микрочастицы комплекса адъювант-антиген настоящего изобретения могут изменять способность удерживания включенного антигена в зависимости от типа(ов) и способа(ов) получения полимера(ов), составляющего(их) адъювантную микрочастицу. Возможные примеры механизма, за счет которого придается иммуногенность микрочастице комплекса адъювант-антиген по настоящему изобретению, включают множество процессов, таких как процесс, где антиген, высвобожденный из адъювантной микрочастицы, распознается иммунокомпетентными клетками, и процесс, где сама адъювантная микрочастица распознается иммунокомпетентными клетками. Также может быть получен превосходный эффект за счет синергического действия этих процессов.

Тип иммунного ответа, индуцируемого процессом, в котором микрочастицы комплекса адъювант-антиген заставляют иммунокомпетентные клетки распознавать антиген, варьирует в зависимости от типа такого процесса, и предпочтительный процесс может быть выбран в зависимости от типа иммунного ответа, который будет индуцирован и от участка введения. Таким образом, в предпочтительном режиме использования, антиген необязательно должен быть высвобожден из микрочастицы комплекса адъювант-антиген, и оптимальный режим, в котором достигается оптимальная целевая иммуногенность, зависит от антигена и типа иммунного ответа, который будет активирован. Однако в случаях, когда антиген чрезвычайно быстро высвобождается из микрочастицы комплекса адъювант-антиген, долгосрочное непрерывное иммуностимулирующее действие, которое является превосходной особенностью настоящего изобретения, не может быть получено, и поэтому предпочтительно, когда через одну неделю после введения не менее 10% антигена в микрочастице комплекса адъювант-антиген сохраняется в живом организме в виде комплекса, и более предпочтительно, когда не менее 50% антигена остается инкапсулированным через одну неделю после введения. Эти режимы высвобождения могут быть подтверждены оценкой in vitro, имитирующей условия окружения in vivo.

Микрочастица комплекса адъювант-антиген обеспечивает хороший эффект даже при таком состоянии частиц, где комплексы ассоциированы друг с другом. Термин "ассоциация", как используется в данном описании, означает, что две или более частиц связаны друг с другом за счет силы взаимодействия между частицами или за счет другого вещества, образуя агрегат. Сила взаимодействия между частицами не является ограниченной, и примеры включают гидрофобное взаимодействие, водородную связь и силу Ван-дер-Ваальса. Ассоциация не ограничена состоянием, когда микрочастицы находятся в контакте друг с другом, и вещество, обладающее аффинностью в отношении микрочастиц, может находиться между микрочастицами, или микрочастицы могут быть диспергированы в матрице. В качестве вещества, обладающего аффинностью в отношении микрочастиц или матрицы, предпочтительным является полимер, и наиболее предпочтительным является амфифильный полимер, гидрофобная часть которого представляет собой поли(гидроксикислоту), и который имеет такую же структуру, как и адъювантная микрочастица. Конкретные примеры включают амфифильные полимеры, где каждый состоит из основной полисахаридной цепи и присоединенной цепи(ей) поли(гидроксикислоты), блок-сополимеры, где каждый состоит из полиэтиленгликоля и поли(гидроксикислоты), и поли(гидроксикислоту).

Ассоциация микрочастиц комплекса адъювант-антиген может быть представлена состоянием, когда высвобождение происходит после применения ассоциата, или состоянием, когда высвобождение не происходит сразу после применения. Следует отметить, что даже в случаях, когда структура частиц, состоящих из связанных вместе микрочастиц комплекса адъювант-антиген, соответствует состоянию, у которого не может быть известно присутствие ассоциации комплекса, частица расценивается как имеющая сформированный ассоциат комплексов, если способ получения частиц включает стадию ассоциации комплексов.

Средний размер микрочастиц комплекса адъювант-антиген или частиц, образованных ассоциацией комплексов, составляет предпочтительно от 0,1 до 50 мкм, более предпочтительно от 0,1 до 10 мкм. В частности, средний размер микрочастиц комплекса адъювант-антиген составляет предпочтительно от 0,1 до 1 мкм, более предпочтительно от 0,1 до 0,5 мкм, и средний размер ассоциатов микрочастиц комплекса адъювант-антиген составляет предпочтительно от 0,1 до 50 мкм, более предпочтительно от 0,1 до 10 мкм, еще более предпочтительно от 1 до 10 мкм. Средний размер микрочастиц комплекса адъювант-антиген или частиц, образованных ассоциацией комплексов, может быть непосредственно измерен путем анализа изображения, с использованием сканирующего электронного микроскопа (SEM, например, модель S-4800, выпускаемая Hitachi, Ltd).

Микрочастицы комплекса адъювант-антиген или частицы, образованные ассоциацией комплексов, имеют эффект усиления иммуногенности инкапсулированного антигена. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что иммуногенность инкапсулированного антигена может быть дополнительно увеличена за счет инкапсулирования поверхностно-активного вещества, в качестве активного ингредиента, в иммуногенную микрочастицу, состоящую из микрочастиц комплекса адъювант-антиген или частиц, образованных ассоциацией комплексов (далее называемой “иммуногенной микрочастицей”). Таким образом, иммуногенная микрочастица, в качестве активного ингредиента иммуногенной композиции настоящего изобретения, включает поверхностно-активное вещество, инкапсулированное в нее, в качестве составляющего.

Поверхностно-активное вещество, используемое в настоящем изобретении, не является ограниченным, и конкретные примеры поверхностно-активных веществ включают полисорбат 20, полисорбат 40, полисорбат 60, полисорбат 65, полисорбат 80, полисорбат 85, моноолеат глицерина, моноолеат сорбитана, моноолеат полиэтиленгликоля, моностеарат этиленгликоля, моностеарат глицерина, моностеарат сорбитана, моностеарат пропиленгликоля, моностеарат полиэтиленгликоля, монопальмитат сорбитана, мономиристат глицерина, монолаурат сорбитана, монолаурат полиэтиленгликоля, триолеат сорбитана, тристеарат сорбитана, полиоксиэтилен гидрогенизированного касторового масла, сополимеры пропиленгликоля и полиоксиэтилена, полиэтиленгликоль, поливиниловый спирт, алкиловый эфир полиоксиэтилена, диэтаноламид жирной кислоты (например, диэтаноламид стеариновый кислоты, диэтаноламид олеиновой кислоты и диэтаноламид лауриновой кислоты), лецитин, натриевую соль жирной кислоты (например, стеарат натрия, олеат натрия и лаурат натрия), алкилсульфат натрия, октилфениловый эфир полиоксиэтилена и алкилгликозид. Поверхностно-активное вещество, используемое в настоящем изобретении, может быть или одного типа, или двух и более типов.

Поверхностно-активное вещество, используемое в настоящем изобретении, предпочтительно является одобренным для использования в качестве фармацевтической добавки. Конкретные примеры поверхностно-активных веществ, одобренных в качестве фармацевтических добавок, включают полисорбат 20, полисорбат 40, полисорбат 60, полисорбат 65, полисорбат 80, полисорбат 85, моноолеат глицерина, моноолеат сорбитана, моноолеат полиэтиленгликоля, моностеарат этиленгликоля, моностеарат глицерина, моностеарат сорбитана, моностеарат пропиленгликоля, моностеарат полиэтиленгликоля, монопальмитат сорбитана, мономиристат глицерина, монолаурат сорбитана, монолаурат полиэтиленгликоля, триолеат сорбитана, тристеарат сорбитана, полиоксиэтилен гидрогенизированного касторового масла, сополимеры пропиленгликоля и полиоксиэтилена, полиэтиленгликоль, поливиниловый спирт, алкиловый эфир полиоксиэтилена, диэтаноламид жирной кислоты (например, диэтаноламид стеариновый кислоты, диэтаноламид олеиновой кислоты и диэтаноламид лауриновой кислоты), лецитин, натриевую соль жирной кислоты (например, стеарат натрия, олеат натрия и лаурат натрия) и алкилсульфат натрия.

Поверхностно-активное вещество, используемое в настоящем изобретении, является предпочтительно неионогенным поверхностно-активным веществом. Конкретные примеры неионогенного поверхностно-активного вещества включают полисорбат 20, полисорбат 40, полисорбат 60, полисорбат 65, полисорбат 80, полисорбат 85, моноолеат глицерина, моноолеат сорбитана, моноолеат полиэтиленгликоля, моностеарат этиленгликоля, моностеарат глицерина, моностеарат сорбитана, моностеарат пропиленгликоля, моностеарат полиэтиленгликоля, монопальмитат сорбитана, мономиристат глицерина, монолаурат сорбитана, монолаурат полиэтиленгликоля, триолеат сорбитана, тристеарат сорбитана, полиоксиэтилен гидрогенизированного касторового масла, сополимеры пропиленгликоля и полиоксиэтилена, полиэтиленгликоль, поливиниловый спирт, алкиловый эфир полиоксиэтилена и диэтаноламид жирной кислоты (например, диэтаноламид стеариновый кислоты, диэтаноламид олеиновой кислоты и диэтаноламид лауриновой кислоты).

Среди поверхностно-активных веществ предпочтительно используются поверхностно-активные вещества, включающие структуру эфира жирной кислоты. Конкретные примеры структуры эфира жирной кислоты включают эфир лауриновой кислоты, эфир пальмитиновой кислоты, эфир стеариновой кислоты, эфир олеиновой кислоты и гидрогенизированное касторовое масло, и предпочтительные примеры структуры эфира жирной кислоты включают эфир лауриновой кислоты, эфир олеиновой кислоты и гидрогенизированное касторовое масло. Конкретные примеры поверхностно-активных веществ, включающих структуру эфира жирной кислоты, включают полисорбат 20, полисорбат 40, полисорбат 60, полисорбат 65, полисорбат 80, полисорбат 85, моноолеат глицерина, моноолеат сорбитана, моноолеат полиэтиленгликоля, моностеарат этиленгликоля, моностеарат глицерина, моностеарат сорбитана, моностеарат пропиленгликоля, моностеарат полиэтиленгликоля, монопальмитат сорбитана, мономиристат глицерина, монолаурат сорбитана, монолаурат полиэтиленгликоля, триолеат сорбитана, тристеарат сорбитана и гидрогенизированное касторовое масло.

Кроме того, исходя из структур, иных, чем эфиры жирных кислот, поверхностно-активное вещество предпочтительно включает биологически совместимую молекулу. Конкретные примеры биологически совместимой молекулы в поверхностно-активном веществе, иной, чем эфиры жирных кислот, включают аминокислоты, нуклеиновые кислоты, фосфорную кислоту, сахар (например, моносахариды, такие как сахароза, сорбит, манноза и глюкоза), полиэтиленгликоль и глицерин. Биологически совместимая молекула предпочтительно состоит из моносахарида(ов) и/или полиэтиленгликоля, и более предпочтительно представляет собой сорбит. Конкретные примеры поверхностно-активного вещества, включающего биологически совместимую молекулу в качестве структуры, иной чем эфиры жирных кислот, включают полисорбат 20, полисорбат 40, полисорбат 60, полисорбат 65, полисорбат 80, полисорбат 85, моноолеат глицерина, моноолеат сорбитана, моноолеат полиэтиленгликоля, моностеарат этиленгликоля, моностеарат глицерина, моностеарат сорбитана, моностеарат пропиленгликоля, моностеарат полиэтиленгликоля, монопальмитат сорбитана, мономиристат глицерина, монолаурат сорбитана, монолаурат полиэтиленгликоля, триолеат сорбитана, тристеарат сорбитана и полиоксиэтилен гидрогенизированного касторового масла, и предпочтительные конкретные примеры поверхностно-активного вещества включают полисорбат 80, полисорбат 20, триолеат сорбитана и полиоксиэтилен гидрогенизированного касторового масла.

В иммуногенной микрочастице поверхностно-активное вещество инкапсулировано в микрочастицу. Под понятием "инкапсулирование поверхностно-активного вещества" в данном описании понимается состояние, когда поверхностно-активное вещество присутствует во внутренней части микрочастицы, и поверхностно-активное вещество может присутствовать во всей внутренней части микрочастицы или может быть локализовано в некоторой части внутренней части этой микрочастицы. По условиям инкапсуляции поверхностно-активного вещества, поверхностно-активное вещество рассматривается как инкапсулированное в частицу, когда способ получения микрочастиц включает стадию инкапсулирования поверхностно-активного вещества в микрочастицу. Количество поверхностно-активного вещества в иммуногенной микрочастице не является ограниченным, пока сохраняется эффект настоящего изобретения, и составляет предпочтительно от 0,01 до 50% (масс./масс.), более предпочтительно от 0,1 до 20% (масс./масс.), еще более предпочтительно 1% (масс./масс.), относительно количества амфифильного полимера, включенного в процесс получения иммуногенной микрочастицы. Количество поверхностно-активного вещества в иммуногенной микрочастице измеряют путем экстракции поверхностно-активного вещества (веществ) из иммуногенной микрочастицы с использованием растворителя, в котором амфифильный полимер может быть растворен, и очистки полученного экстракта, с последующим анализом очищенного экстракта жидкостной хроматографией, используя колонку с обратной фазой, определяя, таким образом, количество поверхностно-активного вещества, содержащегося в экстракте. Количество поверхностно-активного вещества (веществ) по отношению к количеству амфифильного полимера(ов), включенного(ых) в процесс получения иммуногенной микрочастицы, рассчитывается на основе количества поверхностно-активного вещества, содержащегося в экстракте.

Способ получения иммуногенной микрочастицы не является ограниченным, и в случаях, когда иммуногенная микрочастица представляет собой микрочастицу комплекса адъювант-антиген, примеры способа, которым может быть получена такая иммуногенная микрочастица, включают способ, включающий стадии: (a) смешивания водного растворителя A, в котором растворен(ы) антиген(ы), и органического растворителя B, который не смешивается с водой, в котором растворен амфифильный(е) полимер(ы), с образованием обратнофазной эмульсии; и (b) удаления растворителя из обратнофазной эмульсии для получения иммуногенной микрочастицы. Стадии (a) и (b) описаны ниже.

На стадии (a) используют водный растворитель, который представляет собой воду или водный раствор, содержащий растворимый в воде компонент. Примеры растворимого в воде компонента включают неорганические соли, сахар, органические соли и аминокислоты.

Не смешивающийся с водой органический растворитель B на стадии (a) предпочтительно является растворителем, в котором поли(гидроксикислота) амфифильного полимера является растворимой, и полимер, представляющий гидрофильный сегмент, является плохо растворимым или нерастворимым, и, предпочтительно, растворитель может быть удален сублимацией при сублимационной сушке. Растворимость не смешивающегося с водой органического растворителя B в воде составляет предпочтительно не больше 30 г (не смешивающегося с водой органического растворителя B) в 100 мл воды. Конкретные примеры не смешивающегося с водой органического растворителя B включают этилацетат, изопропилацетат, бутилацетат, диметилкарбонат, диэтилкарбонат, метиленхлорид и хлороформ.

Соотношение между не смешивающимся с водой органическим растворителем B и водным растворителем A составляет от 1000:1 до 1:1, предпочтительно от 100:1 до 1:1. Концентрация амфифильного полимера(ов) в не смешивающемся с водой органическом растворителе B варьирует в зависимости от типов не смешивающегося с водой органического растворителя B и амфифильного полимера(ов), и концентрация составляет от 0,01 до 90% (масс./масс.), предпочтительно от 0,1 до 50% (масс./масс.), более предпочтительно 1% (масс./масс.).

Путем растворения поверхностно-активного вещества в водном растворителе A или в не смешивающемся с водой органическом растворителе B, используемом на стадии (a), поверхностно-активное вещество может быть инкапсулировано в иммуногенную микрочастицу. Количество поверхностно-активного вещества, добавляемого на стадии (a), составляет предпочтительно от 0,01 до 50% (масс./масс.), более предпочтительно от 0,1 до 20% (масс./масс.), еще более предпочтительно 1% (масс./масс.) по отношению к количеству амфифильного полимера(ов), растворенного(ых) в не смешивающемся с водой органическом растворителе B.

На стадии (a), в процессе получения обратнофазной эмульсии с водным растворителем A и с не смешивающимся с водой органическим растворителем B, в котором растворен амфифильный полимер(ы), может быть получена обратнофазная эмульсия, с использованием, в зависимости от фармацевтической цели, не смешивающегося с водой органического растворителя B, в котором растворены два или более типов амфифильных полимеров.

На стадии (a), с целью облегчения формирования обратнофазной эмульсии и получения однородной и тонкодисперсной обратнофазной эмульсии, может быть добавлена добавка(и). Добавка предпочтительно представляет собой соединение, выбранное из C3-C6алкилированных спиртов, C3-C6алкилированных аминов и C3-C6алкилированных карбоновых кислот. Структура каждой алкильной цепи в этих добавках не является ограниченной, и алкильная цепь может иметь линейную или разветвленную структуры, а также может быть насыщенным или ненасыщенным алкилом. В настоящем изобретении добавка в виде трет-бутанола, изопропилового спирта или пентанола является особенно предпочтительной.

Способ удаления растворителя из обратнофазной эмульсии на стадии (b) не является ограниченным, и его примеры включают нагревание, сушку при пониженном давлении, диализ, сублимацию, центрифугирование, фильтрование и переосаждение, а также их комбинации. Среди способов удаления растворителя из обратнофазной эмульсии предпочтительна сублимация, поскольку она вызывает меньшие структурные изменения из-за слияния частиц в обратнофазной эмульсии, или подобного. Условия и аппаратура для сублимации являются такими, которые позволяют включить в стадию процесс замораживания и сушки при пониженном давлении, и процесс сублимации особенно предпочтительно включает предварительное замораживание, первичное высушивание при пониженном давлении и при низкой температуре, и вторичную сушку при пониженном давлении, которые традиционно применяются в способах сушки с замораживанием (сублимации). Например, в случаях, когда получена дисперсия микрочастиц комплекса адъювант-антиген в не смешивающемся с водой растворителе, обратнофазная эмульсия охлаждается/замораживается до температуры не выше точек плавления водного растворителя A и не смешивающегося с водой органического растворителя B, в котором образована обратнофазная эмульсия, и затем ее сушат при пониженном давлении, с получением адъювантных микрочастиц, высушенных путем сублимации. Соответствующая температура для предварительного замораживания может быть экспериментально определена в зависимости от состава растворителей, и предпочтительно составляет не выше -20°C. Приемлемый уровень снижения давления во время процесса сушки также может быть определен в зависимости от состава растворителей, и предпочтительная величина давления составляет не более 3000 Па, более предпочтительно не более 500 Па, для сокращения времени высыхания. Сублимацию предпочтительно осуществляют с использованием лабораторного сублиматора, который имеет холодовую ловушку и может быть связан с вакуумным насосом, или с использованием вакуумного сублиматора с полками, который используется в производстве фармацевтических препаратов, или подобного. После предварительного замораживания жидким азотом, охлаждающей средой или подобным, сушка при пониженном давлении может быть выполнена с охлаждением или при комнатной температуре, с использованием вакуумного устройства, такого как вакуумный насос.

В случаях, когда иммуногенная микрочастица представляет собой микрочастицу, состоящую из связанных друг с другом микрочастиц комплекса адъювант-антиген, примеры получения иммуногенной микрочастицы включают способ, включающий стадии: (a') смешивания водного растворителя A, в котором растворен антиген(ы), и не смешивающегося с водой органического растворителя B, в котором растворен амфифильный полимер(ы), с получением обратнофазной эмульсии; (b') удаления растворителя из обратнофазной эмульсии, для получения микрочастиц комплекса адъювант-антиген; и (c') введения дисперсии C микрочастиц комплекса адъювант-антиген в жидкую фазу D, включающую поверхностный модификатор, с последующим удалением дисперсионной среды; посредством чего могут быть получены иммуногенные микрочастицы, состоящие из связанных друг с другом микрочастиц комплекса адъювант-антиген.

Составы водного растворителя, используемого на стадии (a'), и не смешивающегося с водой органического растворителя B, используемого на стадии (b'), являются такими же, как в вышеуказанных стадиях (a) и (b).

Способ, используемый для удаления растворителя из обратнофазной эмульсии на стадии (b'), является таким же, как в вышеуказанном способе на стадии (b).

На стадии (c'), где дисперсионная среда используется для диспергирования микрочастиц комплекса адъювант-антиген с целью получения комплекса, дисперсия C не является ограниченной, и в случаях, когда адъювантная микрочастица имеет в ее внутренней части гидрофильную часть, состоящую из гидрофильного сегмента(ов) гидрофильного полимера, и имеет во внешнем слое гидрофобную часть, состоящую из гидрофобного сегмента(ов) гидрофильного полимера, дисперсионная среда представляет собой растворитель, в котором поли(гидроксикислота) амфифильного полимера является предпочтительно растворимой, и полимер, представляющий гидрофильный сегмент, является по существу нерастворимым для защиты структуры адъювантной микрочастицы. В этом случае, растворитель может быть не смешивающимся с водой органическим растворителем или смешивающимся с водой органическим растворителем. Конкретные примеры растворителя, в котором растворяется поли(гидроксикислота) амфифильного полимера, и полимер, представляющий гидрофильный сегмент, является по существу нерастворимым, включают этилацетат, изопропилацетат, бутилацетат, диметилкарбонат, диэтилкарбонат, метиленхлорид, хлороформ, диоксан, толуол и ксилол.

Жидкая фаза D на стадии (c') предпочтительно является такой, в которой растворяется поверхностный модификатор, и она имеет более высокую точку кипения, чем дисперсионная среда дисперсии C. Жидкая фаза D может быть любым водным растворителем, не смешивающимся с водой органическим растворителем или смешивающимся с водой органическим растворителем. Когда водный растворитель, вода или водный раствор, содержащий растворимый в воде компонент, является предпочтительным, примеры растворимого в воде компонента включают неорганические соли, сахар, органические соли и аминокислоты. Примеры не смешивающегося с водой органического растворителя включают силиконовое масло, сезамовое масло, соевое масло, кукурузное масло, хлопковое масло, кокосовое масло, льняное масло, минеральное масло, касторовое масло, гидрогенизированное касторовое масло, жидкий керосин, н-гексан, н-гептан, глицерин и олеиновую кислоту. Примеры смешивающегося с водой органического растворителя включают глицерин, ацетон, этанол, уксусную кислоту, дипропиленгликоль, триэтаноламин и триэтиленгликоль. В настоящем изобретении жидкая фаза D, среди них, предпочтительно является водным растворителем или смешивающимся с водой органическим растворителем. В случаях, когда жидкая фаза D представляет собой водный растворитель, и дисперсионная среда представляет собой не смешивающийся с водой органический растворитель, полученная суспензия микрочастиц комплекса адъювант-антиген находится в форме так называемой эмульсии "частица-в масле-в воде" (S/O/W), и в случаях, когда жидкая фаза D представляет собой не смешивающийся с водой органический растворитель или смешивающийся с водой органический растворитель и не смешивающийся с дисперсионной средой, суспензия находится в форме эмульсии "частица-в масле-в масле" (S/O1/O2).

За счет растворения поверхностно-активного вещества (веществ) в водном растворителе A или в не смешивающемся с водой органическом растворителе B, используемом на стадии (a'), или в дисперсии C, используемой на стадии (c'), поверхностно-активное вещество(ва) может(гут) быть инкапсулирован(ны) в иммуногенную микрочастицу, состоящей из микрочастиц комплекса адъювант-антиген, ассоциированных друг с другом. С другой стороны, эффект настоящего изобретения не может быть достигнут, когда поверхностно-активное вещество(ва) растворено(ы) в жидкой фазе D, используемый на стадии (c'), поверхностно-активное вещество(ва) связано(ы) с поверхностью иммуногенной микрочастицы, состоящей из микрочастиц комплекса адъювант-антиген, ассоциированных друг с другом. Количество поверхностно-активного вещества (веществ), добавленного(ых) на стадии (a') или (c'), предпочтительно составляют от 0,01 до 50% (масс./масс.), более предпочтительно от 0,1 до 20% (масс./масс.), и еще более предпочтительно 1% (масс./масс.), относительно количества амфифильного полимера(ов), растворенного(ых) в не смешивающемся с водой органическом растворителе.

Поверхностный модификатор, который добавляется на стадии (c'), является предпочтительно соединением, которое стабилизирует поверхность "вода-масло" в эмульсии S/O/W или поверхность "масло-масло" в эмульсии S/O1/O2, при этом соединение обладает способностью увеличивать стабильность коллоидных частиц, состоящих из микрочастиц комплекса адъювант-антиген, ассоциированных друг с другом.

Повышение стабильности коллоида подразумевает в данном описании предотвращение или задержку агрегирования в растворителе частиц, состоящих из микрочастиц комплекса адъювант-антиген, ассоциированных друг с другом. Поверхностный модификатор может быть одним агентом или смесью нескольких агентов.

Поверхностный модификатор предпочтительно представляет собой гидрофильный полимер или амфифильное соединение.

Гидрофильный полимер, используемый в качестве поверхностного модификатора, предпочтительно представляет собой полиэтиленгликоль, поливинилпирролидон, поливиниловый спирт, полиэтиленимин, полиакриловую кислоту, полиметакриловую кислоту, поли-1,3-диоксан, полимер 2-метакрилолеилоксиметила и фосфорилхолина, поли-1,3,6-триоксан, полиаминовую кислоту, пептид, белок или сахарный полисахарид, или аналог любого из них. Примеры аналогов гидрофильного полимера включают, но без ограничений, полученные из гидрофильных полимеров аналоги, например, длинноцепочечный алкил, полученный за счет частичной модификации гидрофобных групп.

Аналог полиэтиленгликоля, используемый в качестве поверхностного модификатора, предпочтительно представляет собой плюроник (Pluronic - зарегистрированная торговая марка BASF), коммерчески доступный от BASF, или его эквивалент.

Полиаминокислота, используемая в качестве поверхностного модификатора, предпочтительно представляет собой полиаспарагиновую кислоту или полиглутаминовую кислоту, или их аналог. Аналоги, полученные путем введения длинноцепочечного алкила в часть полиаспарагиновой кислоты или полиглутаминовой кислоты, являются более предпочтительными.

Примеры пептида, используемого в качестве поверхностного модификатора, включают основные пептиды и белок, и поверхностный модификатор предпочтительно представляет собой желатин, казеин или альбумин, ввиду повышенной способности к диспергированию частиц. Предпочтительные примеры белка также включают антитела.

Сахар, используемый в качестве поверхностного модификатора, предпочтительно представляет собой моносахарид, олигосахарид или полисахарид. Полисахарид предпочтительно представляет собой целлюлозу, хитин, хитозан, геллановую смолу, альгиновую кислоту, гиалуроновую кислоту, пуллулан или декстран, и пуллулан, несущий холестерин, является особенно предпочтительным ввиду повышенной способности к диспергированию частиц. Также предпочтительны аналоги любого из геллановой смолы, альгиновой кислоты, гиалуроновой кислоты, пуллулана или декстрана.

Пептид, белок или сахар, используемые в качестве поверхностного модификатора, являются особенно предпочтительными в виде аналогов, полученных, например, за счет частичной модификации гидрофобных групп, таких как длинноцепочечный алкил, или аналоги, полученные за счет изменения вышеуказанных гидрофильных полимеров или амфифильных соединений.

Предпочтительные примеры амфифильного соединения, используемого в качестве поверхностного модификатора, включают неионогенные активаторы, такие как сополимеры полипропиленгликоля и полиоксиэтилена, эфиры жирных кислот и сахаров, эфиры жирных кислот и полиэтиленгликоля, моноэфиры жирных кислот и полиоксиэтиленсорбитана, диэфиры жирных кислот и полиоксиэтиленсорбитана, моноэфиры жирных кислот и глицеринполиоксиэтилена, диэфиры жирных кислот и глицеринполиоксиэтилена, эфиры жирных кислот и полиглицерина, полиоксиэтилен гидрогенизированного касторового масла; алкилсульфаты, такие как лаурилсульфат натрия, лаурилсульфат аммония и стеарилсульфат натрия; и лецитин.

Соотношение объемов между дисперсионной средой, в которой диспергированы микрочастицы комплекса адъювант-антиген, и жидкой фазой D, составляет от 1000:1 до 1:1000, предпочтительно от 100:1 до 1:100. Количество полученных микрочастиц комплекса адъювант-антиген варьирует в зависимости от этого объемного соотношения, и, когда доля липидной фазы D увеличена, получают водную дисперсия частиц, состоящую из большего числа микрочастиц комплекса адъювант-антиген, ассоциированных друг с другом, но когда доля липидной фазы D уменьшена, то количество ассоциатов уменьшается. В случаях, когда доля жидкой фазы D является меньшей, чем при соотношении растворов 1:4, большинство частиц в водной дисперсии состоит из одиночных микрочастиц комплекса адъювант-антиген. Таким образом, контролируя соотношение объемов жидкой фазы D в серии процессов при получении частиц, состоящих из микрочастиц комплекса адъювант-антиген, ассоциированных друг с другом, можно по выбору получить микрочастицы комплекса адъювант-антиген и микрочастицы комплекса адъювант-антиген, ассоциированные друг с другом.

Когда дисперсионная среда, содержащая микрочастицы комплекса адъювант-антиген, смешивают с жидкой фазой D, может потребоваться использование смешивающего устройства, такого как магнитная мешалка, турбинная мешалка, гомогенизатор, мембранный аппарат для эмульгирования, снабженный пористой мембраной, или подобное.

Жидкая фаза D, в дополнение к поверхностному модификатору, может содержать различные добавки, такие как буфер, антиоксидант, соль, полимер и/или сахар, в зависимости от фармацевтического назначения. Кроме того, дисперсионная среда, в которой диспергируются микрочастицы комплекса адъювант-антиген, может содержать различные растворимые в дисперсионной среде добавки, такие как кислотное соединение, основное соединение, амфифильный полимер и/или биоразлагаемый полимер, с целью контроля скорости высвобождения инкапсулированного антигена(ов) за счет деструкции или распада комплекса.

Кроме того, операция эмульгирования полученной эмульсии "твердая частица-в масле-в воде" (S/O/W) или эмульсии "твердая частица-в масле-в масле" (S/O1/O2) может быть выполнена с целью получения высокодисперсных частиц, состоящих из микрочастиц комплекса адъювант-антиген, ассоциированных друг с другом. Способ эмульгирования не является ограниченным, если таким способом может быть получена устойчивая эмульсия, и примеры включают способы интенсивного перемешивания и способы с использованием гомогенизатора высокого давления, высокоскоростного миксера-гомогенизатора или подобного.

В случаях, когда микрочастицы комплекса адъювант-антиген уже диспергированы в дисперсионной среде, и полученная дисперсия C добавлена к жидкой фазе D, содержащий поверхностный модификатор, суспензия частиц, состоящих из ассоциированных друг с другом целевых адъювантных микрочастиц, может быть получена удалением дисперсионной среды. Способ удаления среды дисперсии не является ограниченным, и примеры включают испарение растворителя, диализ, сублимацию, центрифугирование, фильтрование и переосаждение, среди которых особенно предпочтительно испарение растворителя и сублимация. В случаях, когда в качестве жидкой фазы D используют водный растворитель, водная дисперсия частиц, состоящих из ассоциированных друг с другом целевых адъювантных микрочастиц, может быть получена такой стадией способа.

В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения, поверхностный модификатор связан с иммуногенной микрочастицей. Связывание, как используется в данном описании, может представлять собой нековалентную связь или ковалентную связь. Нековалентная связь предпочтительно представляет собой гидрофобное взаимодействие, а также может быть электростатическим взаимодействием, водородной связью или силой Ван-дер-Ваальса, или комбинацией этих связей. В случаях нековалентной связи поли(гидроксикислота) иммуногенной микрочастицы, содержащей амфифильный полимер, предпочтительно связана гидрофобным взаимодействием с гидрофобной частью поверхностного модификатора, и в этом случае, дисперсионная среда для микрочастиц комплекса адъювант-антиген в дисперсии микрочастиц предпочтительно представляет собой воду, буфер, физиологический солевой раствор, водный раствор поверхностного модификатора или гидрофильный растворитель.

Иммуногенная композиция настоящего изобретения представляет собой композицию, которая может индуцировать иммунный ответ в живом организме, и она содержит иммуногенную микрочастицу в качестве активного ингредиента. Тип иммунного ответа, индуцируемого иммуногенной композицией, не является ограниченным. Примеры типов индуцированных иммунных ответов включают иммунный ответ Th1 и иммунный ответ Th2, при этом известно, что один из этих иммунных ответов является преобладающим, индуцируемым в зависимости от антигена, участка введения и вида способа введения. Настоящее изобретение может индуцировать оба иммунных ответа, как Th1, так и Th2. Иммунный ответ Th1 может быть эффективно индуцирован микрочастицами комплекса адъювант-антиген настоящего изобретения, имеющими небольшой размер частиц, или частицами, состоящими из связанных вместе комплексов, как показано в примерах. Уровни иммунного ответа Th1 и иммунного ответа Th2 могут быть оценены различными известными способами. Например, в случае использования мышей, как известно, количество продуцируемого антитела IgG2a является индексом иммунного ответа Th1. Кроме того, известно, что количество антитела IgG1 и всех антител IgG является показателем иммунного ответа Th2.

Иммуногенная композиция настоящего изобретения может обеспечить высокую иммуноактивирующую способность за счет дополнительного включения иммуноактивирующего вещества. Иммуноактивирующее вещество может содержаться в адъювантной микрочастице или быть за ее пределами, или быть инкапсулированным в нее, при этом предпочтительно, когда вещество инкапсулировано в адъювантную микрочастицу. Иммуноактивирующее вещество не является ограниченным, пока оно может функционировать в качестве иммуноактивирующего вещества, и примеры его включают масла, алюминиевые соли, соли кальция, образующие гель полимеры, иммуноактивирующие цитокины и лиганды TLR рецептора, среди которых предпочтительны иммуноактивирующие цитокины и лиганды TLR рецептора.

Примеры иммуноактивирующих цитокинов включают интерлейкин 12, интерферон α, интерлейкин 18, TNF α, интерлейкин 6, NO, интерферон γ и интерферон β.

Примеры лигандов TLR рецептора включают липопротеины; двухцепочечные РНК, такие как поли I:C и поли I:CLC; флагеллин; одноцепочечные РНК; CpG; профилин; MPL; QS21; и TDM, среди которых наиболее предпочтительны нуклеиновые кислоты, такие как двухцепочечные РНК, одноцепочечные РНК и CpG. Как используется в данном описании, CpG означает неметилированный CpG (цитозин-гуанин) мотив ДНК, присутствующий в вирусах, бактериях и т.п. (см., выложенную японскую патентную заявку, переведенную на стадию PCT, No. 2001-503254). Сообщалось о различных последовательностях, эффективных в качестве мотивов CpG, и тип последовательности не является ограниченным, пока у нее имеется иммуноактивирующая способность, и последовательность может быть получена путем использования аналогов по основаниям, или может быть выбрана из различных типов модифицированных продуктов.

В случаях, когда иммуногенная композиция настоящего изобретения используется в качестве фармацевтической композиции или в качестве вакцины, могут быть добавлены различные фармацевтически полезные добавки в дополнение к амфифильному полимеру, гидрофильному активному веществу, поверхностному модификатору и дисперсионной среде. Примеры добавок, которые могут быть введены, включают буферы, антиоксиданты, соли, полимеры и сахара.

Способ индукции иммунного ответа с использованием иммуногенной композицию настоящего изобретения не является ограниченным, и иммуногенную композицию можно вводить в живой организм или приводить в контакт с иммунокомпетентными клетками, выделенными из живого организма. Способ введения иммуногенной композиции в живой организм не является ограниченным, и примеры его включают подкожное введение, внутрикожное введение, внутримышечное введение, трансназальное введение, внутрилегочное введение, оральное введение, трансдермальное введение, сублингвальное введение, внутривлагалищное введение, внутрибрюшинное введение и введение в лимфоузлы, среди которых предпочтительны внутрикожное введение и подкожное введение.

Исходя из количества иммуногенной композиции настоящего изобретения, которое будет использоваться для индукции иммунного ответа, необходимое количество антигена, требуемого для индукции целевой иммунной реакции, устанавливается соответственно в зависимости от типа антигена, способа введения и количества доз. Например, в случаях, когда иммуногенную композицию настоящего изобретения, вводят подкожно человеку для того, чтобы вызвать иммунный ответ, композицию водят каждый раз в дозе от 0,01 до 1000 мкг из расчета на количество антигена, содержащегося в иммуногенной композиции. Количество доз может быть соответственно определено, а также дозировки, и иммунный ответ может быть индуцирован за счет 1-10 введений, так как иммуногенная композиция настоящего изобретения обладает способностью непрерывно индуцировать иммунный ответ.

Живым организмом, в который вводят иммуногенную композицию, может быть или человек, или животное, не являющееся человеком, и живой организм предпочтительно представляет собой человека; или представляет собой свинью, корову, птицу, овцу, лошадь, осла, козу, верблюда, собаку, кошку, хорька, кролика, обезьяну, крысу, мышь или морскую свинку, которые содержатся в качестве сельскохозяйственных животных, домашних животных или экспериментальных животных.

ПРИМЕРЫ

Ниже представлены примеры, однако настоящее изобретение не ограничивается этими примерами.

Пример 1

Синтез декстран-поли(молочной-со-гликолевой кислоты) (PLGA)

(1-1) Синтез TMS-декстрана (соединение (1))

Декстран (Nacalai Tesque; специальной чистоты по стандартам Nacalai; значение средней молекулярной массы 13000; 5,0 г), добавляли к формамиду (100 мл), и полученную смесь нагревали до 80°C. К полученному раствору добавляли по каплям в течение 20 минут 1,1,1,3,3,3-гексаметилдисилазан (100 мл). Затем полученную смесь перемешивали при 80°C в течение 2 часов. После завершения реакции, реакционному раствору давали возможность охладиться до комнатной температуры, и два слоя отделяли друг от друга с использованием делительной воронки. Верхний слой концентрировали при пониженном давлении, и добавляли метанол (300 мл), с последующим фильтрованием и сушкой полученных твердых веществ, с получением TMS-декстрана (соединение (1)) (11,4 г) в виде белого сухого вещества.

(1-2) Синтез PLGA-декстрана (соединение (2))

Соединение (1) (0,5 г) и трет-бутоксид калия (35 мг) сушили в течение 2 часов при высокой температуре при пониженном давлении, и добавляли тетрагидрофуран (10 мл), с последующим перемешиванием полученной смеси в течение 1,5 часов при комнатной температуре. К полученному раствору добавляли по каплям раствор (DL)-лактида (0,56 г) и гликолида (0,9 г) в тетрагидрофуране (15 мл), и полученную смесь перемешивали в течение 5 минут, с последующим добавлением 2 капель уксусной кислоты для остановки реакции. После завершения реакции, раствор концентрировали при пониженном давлении, и очищали переосаждением с использованием системы хлороформ-метанол и системы хлороформ-диэтиловый эфир, с получением белого твердого вещества, которое затем растворяли в хлороформе (9 мл). К полученному раствору добавляли трифторуксусную кислоту (1,0 мл), и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре течение 30 минут. После завершения реакции, растворитель выпаривали при пониженном давлении, и остаток растворяли в хлороформе (10 мл), с последующим добавлением полученного раствора по каплям в диэтиловый эфир, который был предварительно охлажден до 0°C, и полученный продукт фильтровали, с получением амфифильного полимера декстран-PLGA в виде белого твердого вещества (соединение (2)). 1H-ЯМР было определено, что значение средней молекулярной массы присоединенных цепей PLGA в декстран-PLGA составляет 5571, и количество присоединенных цепей составляет 30.

Пример 2

Получение иммуногенных микрочастиц (частицы (1)-(10) и сравнительных частиц (1) и (2))

В 100 мкл диметилкарбоната растворяли 5 мг соединения декстран-поли(молочную-со-гликолевую кислоту) (PLGA) по примеру 1 (соединение (2)), с получением 50 мг/мл раствора (B) амфифильного полимера. К раствору (B) амфифильного полимера добавляли 20 мкл трет-бутанола, и к полученному раствору добавляли по каплям 50 мкл 0,025% (масс./объем) водный CEA (карциноэмбриональный антиген) (COSMO BIO Co., Ltd.) раствор (A), с последующим перемешиванием полученной смеси в вихревом миксере, с получением обратнофазной эмульсии.

Обратнофазную эмульсию подвергали предварительному замораживанию жидким азотом и сушили сублимацией в течение 24 часов с использованием сублимационной сушилки (EYELA, FREEZE DRYER FD-1000) при температуре охлаждения в ловушке -45°C и вакууме на уровне 20 Па. Полученные твердые вещества диспернировали в 200 мкл диметилкарбоната, с получением дисперсии (C). Дисперсию (C) добавляли по каплям к 2 мл водного раствора, содержащего 10% (масс./объем) поверхностного модификатора (поливиниловый спирт или плюроник F-68), как показано в таблице 1, и полученную смесь перемешивали и эмульгировали с использованием вихревого миксера, с получением эмульсии S/O/W. Из эмульсии S/O/W удаляли диметилкарбонат выпариванием растворителя, с получением суспензии иммуногенных микрочастиц. Суспензию переносили в пробирки на 15 мл и подвергали центрифугированию при 8000 обор./мин. в течение 10 минут для осаждения частиц. После удаления супернатанта, частицы ресуспендировали в 10 мл дистиллированной воды, и полученную суспензию подвергали центрифугированию в таких же условиях, как описано выше для переосаждения частиц. Операцию отмывки повторяли еще раз, и после удаления супернатанта частицы суспендировали в 200 мкл водного раствора, содержащего 5% (масс./объем) маннита, 0,5% (масс./объем) натрийкарбоксиметилцеллюлозы и 0,1% (масс./объем) полисорбата 80. Полученную суспензию подвергали предварительному замораживанию жидким азотом и сушили сублимацией в течение 24 часов с использованием сублимационной сушилки (EYELA, FREEZE DRYER FD-1000) при температуре охлаждения в ловушке -45°C и вакууме на уровне 20 Па, с получением иммуногенных микрочастиц.

В качестве поверхностно-активного вещества, полисорбат 80, полисорбат 20, триолеат сорбитана или моноолеат сорбитана (для всех изготовитель Kanto Chemical Co., Inc.) или полиоксиэтилен гидрогенизированного касторового масла (изготовитель Nikko Chemicals Co., Ltd.) растворяли в водном растворе CEA (A), растворе амфифильного полимера (B) или в дисперсии (C), как показано в таблице 1, в количестве 500 мкг, которые соответствовали 10%-ой концентрации (масс./масс.) относительно количества амфифильного полимера.

Таблица 1
Способ получения иммуногенных микрочастиц (частицы (1)-(10) и сравнительные частицы (1) и (2))
Частица No. Раствор, к которому добавлено поверхностно-активное вещество Тип поверхностно-активного вещества Тип модификатора поверхности
Частица (1) Дисперсия (C) Полисорбат 80 Поливиниловый спирт
Частица (2) Дисперсия (C) Триолеат сорбитана Поливиниловый спирт
Частица (3) Дисперсия (C) Полисорбат 80 Плюроник F68
Частица (4) Дисперсия (C) Триолеат сорбитана Плюроник F68
Частица (5) Дисперсия (C) Полисорбат 20 Плюроник F68
Частица (6) Дисперсия (C) Моноолеат сорбитана Плюроник F68
Частица (7) Дисперсия (C) Полиоксиэтилен гидрогенизированного касторового масла Плюроник F68
Частица (8) Водный раствор CEA (A) Полисорбат 80 Плюроник F68
Частица (9) Раствор амфифильного полимера (B) Полисорбат 80 Плюроник F68
Частица (10) Дисперсия (C) Полисорбат 80 Плюроник F68
Сравни-тельная частица (1) - - Поливиниловый спирт
Сравни-тельная частица (2) - - Плюроник F68

Пример 3

Измерения уровня инкапсуляции антигена в иммуногенной микрочастице

Способ

Каждый тип иммуногенных микрочастиц, полученных способом примера 2 (частицы (3)-(7) и сравнительная частица (2)), растворяли в 200 мкл забуференного фосфатом физиологического солевого раствора, с получением суспензии частиц. В пробирку эппендорфа помещали 100 мкл суспензии частиц, и добавляли 1 мл дистиллированной воды, с последующим центрифугированием полученной смеси при 13000 обор./мин. в течение 10 минут, для осаждения частиц. После удаления супернатанта, частицы ресуспендировали в 1 мл дистиллированной воды, и полученную суспензию подвергали центрифугированию в таких же условиях, как описано выше, для переосаждения частиц. После удаления супернатанта, частицы растворяли в 0,5 мл смешанного раствора 1:3 метиленхлорида и ацетона. Полученный раствор частиц подвергали центрифугированию при 13000 обор./мин. в течение 10 минут для осаждения CEA. После удаления супернатанта, осадок растворяли в 0,5 мл указанного смешанного раствора, и центрифугирование осуществляли в указанных выше условиях для осаждения CEA. После удаления супернатанта, осуществляли центробежную сушку в течение 30 минут для сушки осажденного CEA. Буфер для проведения гель-электрофореза проб (изготовитель TEFCO) добавляли к осадку CEA, и осадок растворяли при 95°C в течение 3 минут, с последующим проведением гель-электрофореза с использованием полиакриламидного геля (изготовитель TEFCO). Затем гель окрашивали с использованием набора для коллоидного окрашивания CBB (изготовитель TEFCO), и вычисляли уровень инкапсуляции CEA в частицы. Результаты показаны в таблице 2.

Результаты

Уровни инкапсуляции антигена (CEA) в иммуногенные микрочастицы показаны в таблице 2, а также было показано, что уровень инкапсуляции был почти одинаковый для любой из иммуногенных микрочастиц, содержащих поверхностно-активное вещество (частицы (3)-(7)), и частицей, не содержащей поверхностно-активного вещества (сравнительная частица (2)). Таким образом, было показано, что поверхностно-активные вещества не имеют негативного воздействия на величину инкапсуляции антигена в иммуногенную микрочастицу.

Таблица 2
Уровень инкапсуляции CEA в иммуногенные микрочастицы (частицы (3)-(7) и сравнительная частица (2))
Частица No. Тип поверхностно-активного вещества Уровень инкапсуляции CEA
Частица (3) Полисорбат 80 65%
Частица (4) Триолеат сорбитана 46%
Частица (5) Полисорбат 20 62%
Частица (6) Моноолеат сорбитана 71%
Частица (7) Полиоксиэтилен гидрогенизированного касторового масла 66%
Сравнительная частица (2) - 55%

Пример 4

Подкожное введение мышам иммуногенной композиции, содержащей CEA (1)

Способ

Каждый тип иммуногенных микрочастиц, полученных в примере 2, содержащих полисорбат 80 или триолеат сорбитана (частицы (1) и (2)), суспендировали в 200 мкл забуференного фосфатом физиологического солевого раствора, с получением раствора для введения. Полученный раствор вводили подкожно в виде однократной инъекции в спину самцов мышей Balb/C 7-недельного возраста (Japan SLC, Inc) в дозе 5 мкг, из расчета на CEA, на одно животного. В качестве сравнительных примеров использовали частицы, не содержащие поверхностно-активного вещества (сравнительная частица (1)), или раствор, полученный смешиванием 50 мкл раствора CEA с 50 мкл "Imject Alum" (изготовитель Thermo Scientific), далее также называемый "Alum", в качестве адъюванта, которые вводили подкожно в виде однократной инъекция в спину самцов мышей Balb/C 7-недельного возраста (Japan SLC, Inc) в дозе 5 мкг, из расчета на CEA, на одно животное. Введение для каждого случая проводили 5 отдельным мышам. Изменения титра антител во времени показано на фиг.1.

Мышей после введения содержали в окружающей среде, где имелся свободный доступ к корму и воде, и в это время у них периодически отбирали пробы крови из хвостовой вены. К собранной крови добавляли гепарин до конечной концентрации 3,3 Ед/мл и центрифугировали при 5000 обор./мин. в течение 5 минут для сбора плазмы крови, с последующим измерением титра антител против CEA в плазме крови. Титр антител против CEA измеряли следующим способом. В 96-луночный микропланшет (MaxiSorp, изготовитель Nunc), добавляли 100 мкл раствора PBS, содержащего 1 мкг/мл белка CEA, и пластину оставляли для хранения в течение ночи при 4°C. После удаления раствора, в планшеты добавляли 400 мкл раствора PBS, дополненного 0,5% BSA, с последующей блокировкой при комнатной температуре в течение 2 часов. Лунки промывали 400 мкл промывающего раствора (PBS, дополненный 0,05% твин 20), и в лунки вносили 100 мкл пробы плазмы крови, которую разводили от 1000 до 100000 раз растворяющей жидкостью (PBS, дополненный 0,25% BSA и 0,05% твин 20), и затем обеспечивали протекание реакции при комнатной температуре в течение 40 минут при встряхивании. Лунки промывали три раза промывным раствором, и в лунки добавляли 100 мкл раствора (10000-кратный раствор в растворяющей жидкости) мышиного антитела IgG, меченного HRP (пероксидаза хрена), (Zymed), и обеспечивали протекание последующей реакции при комнатной температуре в течение 20 минут при встряхивании. Лунки промывали три раза промывным раствором, и в лунки добавляли 100 мкл окрашивающей жидкости (0,1М буфер ацетат/цитрат натрия (pH 4,5), содержащий 0,006% пероксид водорода и 0,2 мг/мл тетраметилбензидин), с последующим обеспечением протекания реакции при комнатной температуре в течение 10 минут при встряхивании. Реакцию останавливали добавлением 100 мкл 1н серной кислоты, и измеряли спектральное поглощение в области 450 нм, используя микропланшет-ридер. Серию последовательных разведений моноклонального антитела против CEA (MA1-5308, изготовитель Affinity Bioreagents) использовали в качестве стандартной пробы при получении калибровочной кривой, и количество антитела в каждой пробе вычисляли в единицах массовой концентрации (нг/мл).

Результаты

Изменения среднего значения титра антител против CEA в плазме крови во времени показаны на фиг.1. Частица (1), содержащая полисорбат 80, и частица (2), содержащая триолеат сорбитана, показали непрерывный эффект увеличения титра антител в течение 8 недель, и этот эффект был намного выше, чем в случае сравнительного примера, где вводили Alum с антигеном. Титр антител был еще выше, чем в случае сравнительной частицы (1), не содержащей поверхностно-активного вещества, и было показано, что иммуногенная микрочастица проявляет более высокую адъювантную способность за счет включения поверхностно-активного вещества.

Пример 5

Подкожное введение мышам иммуногенной композиции, содержащей CEA (2)

Способ

Каждый тип иммуногенных микрочастиц, полученных в примере 2 (частицы (3)-(7)), вводили подкожно в виде однократной инъекции в спину самцов мышей Balb/C 7-недельного возраста (Japan SLC, Inc) в дозе 5 мкг, из расчета на CEA, на одно животное, способом, описанным в примере 4. В качестве сравнительного примера использовали частицы, не содержащие поверхностно-активного вещества (сравнительная частица (2)), которые вводили подкожно в виде однократной инъекция в спину самцов мышей Balb/C 7-недельного возраста (Japan SLC, Inc) в дозе 5 мкг, из расчета на CEA, на одно животное. Введение для каждого случая выполняли 5 отдельным мышам. Среднее значение титра антител показано на фиг.2. Отбор крови и измерение титра антител выполняли способами, описанными в примере 4.

Результаты

Среднее значение титра антител против CEA в плазме крови через четыре недели после введения показано на фиг.2. Так же как и в случае частиц, содержащих полисорбат 80 или триолеат сорбитана (частицы (3) и (4)), описанных в примере 4, частицы, содержащие полисорбат 20, моноолеат сорбитана или полиоксиэтилен гидрогенизированного касторового масла (частицы (5)-(7)), также показали более высокие значения титра антител по сравнению со сравнительной частицей (2), не содержащий поверхностно-активного вещества. Таким образом, было показано, что иммуногенная микрочастица показывает более высокую адъювантную способность за счет включения поверхностно-активного вещества.

Пример 6

Подкожное введение мышам иммуногенной композиции, содержащей CEA (3)

Способ

Каждый тип иммуногенных микрочастиц, полученных в примере 2 (частицы (8)-(10)), вводили подкожно в виде однократной инъекции в спину самцов мышей Balb/C 7-недельного возраста (Japan SLC, Inc) в дозе 5 мкг, из расчета на CEA, на одно животное, способом, описанным в примере 4. В качестве сравнительного примера использовали частицы, полученные смешиванием 50 мкл раствора антигена и 50 мкл раствора Alum, которые вводили подкожно в виде однократной инъекции в спину самцов мышей Balb/C 7-недельного возраста (Japan SLC, Inc) в дозе 5 мкг, из расчета на CEA, на одно животное. Введение для каждого случая выполняли 5 отдельным мышам. Среднее значение титра антител показано на фиг.3. Отбор крови и измерение титра антител осуществляли способами, описанными в примере 4.

Результаты

Среднее значение титра антител против CEA в плазме крови через две недели после введения показано на фиг.3. Для всех типов частиц (частицы (8)-(10)), где использовались различные растворы для растворения полисорбата 80 в процессе получения, титр антител был существенно выше, чем в случае введения антигена и Alum по сравнительному примеру. Таким образом, было показано, что у иммуногенной микрочастицы также имеется сильная адъювантная способность в случаях, когда поверхностно-активное вещество было растворено в любом из водного раствора CEA (A), раствора амфифильного полимера (B) и дисперсии (C).

Пример 7

Измерение поверхностно-активного вещества, содержащегося в иммуногенной микрочастице

Способ

Иммуногенные микрочастицы (частицы (1)), содержащие полисорбат 80, полученные в примере 2, суспендировали в 1 мл дистиллированной воды и осаждали центрифугированием при 13000 обор./мин. в течение 10 минут. Частицы, после удаления супернатанта, ресуспендировали в 1 мл дистиллированной воды и подвергали центрифугированию в таких же условиях, как описано выше, чтобы повторно осадить частицы. Частицы, после удаления супернатанта, растворяли в 100 мкл этилацетата. К полученному раствору частиц добавляли 300 мкл этанола, и полученную смесь подвергали центрифугированию при 13000 обор./мин. в течение 10 минут, для осаждения амфифильного полимера. Супернатант удаляли, и растворитель удаляли выпариванием при пониженном давлении, с последующим растворением остатка в 100 мкл дистиллированной воды, с получением экстракта частиц. Экстракт частиц подвергали анализу высокоэффективной жидкостной хроматографии (изготовитель Shimadzu Corporation), с использованием колонки с обращенной фазой (YMC-Pack PROTEIN-RP, изготовитель YMC), для измерения содержания полисорбата 80, находящегося в иммуногенной микрочастице.

Результаты

Анализом, с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии, было найдено, что экстракт частиц содержал 0,24% (масс./объем) полисорбата 80. Основываясь на этом результате, было показано, что иммуногенная микрочастица содержит полисорбат 80 в количестве 4,8% (масс./масс.) относительно исходного количества амфифильного полимера, составляющего иммуногенную микрочастицу, и было показано, что в иммуногенной микрочастице содержатся 48% (масс./масс.) полисорбата 80, добавленного в способе получения по примеру 2.

Пример 8

Получение иммуногенных микрочастиц, содержащих CEA (частицы (11)-(15) и сравнительные частицы (3)-(5))

В 100 мкл диметилкарбоната растворяли 5 мг декстран-поли(молочную-со-гликолевую кислоту) (PLGA), (соединение (2)) полученную в примере 1, с получением раствора (B), содержащего 50 мг/мл амфифильного полимера. К раствору амфифильного полимера (B) добавляли 20 мкл трет-бутанола и по каплям добавляли 50 мкл 0,025% (масс./объем) водного CEA (карциноэмбриональный антиген) (COSMO BIO Co., Ltd) раствора (А), с последующим перемешиванием полученной смеси в вихревом миксере, с получением обратнофазной эмульсии.

Обратнофазную эмульсию подвергали предварительному замораживанию жидким азотом и сушили сублимацией в течение 24 часов, с использованием сублимационной сушилки (EYELA, FREEZE DRYER FD-1000) при температуре охлаждения в ловушке -45°C и вакууме на уровне 20 Па. Полученные твердые вещества диспергировали в 200 мкл диметилкарбоната, с получением дисперсии (C). Дисперсию (C) добавляли по каплям к 2 мл водного раствора (D), содержащего 10% (масс./объем) поверхностного модификатора (плюроник F-68), и полученную смесь перемешивали и эмульгировали вихревым миксером, с получением эмульсии S/O/W. Диметилкарбонат удаляли из эмульсии S/O/W выпариванием растворителя, с получением суспензии иммуногенных микрочастиц. Суспензию переносили в пробирку на 15 мл и подвергали центрифугированию при 8000 обор./мин. в течение 10 минут для осаждения частиц. После удаления супернатанта, частицы ресуспендировали в 10 мл дистиллированной воды, и полученную суспензию подвергали центрифугированию в таких же условиях, как описано выше, для переосаждения частиц. Операцию промывки повторяли еще раз, и после удаления супернатанта, частицы суспендировали в 200 мкл водного раствора (раствор для инъекций (E)), содержащего 5% (масс./объем) маннита, 0,5% (масс./объем) натрийкарбоксиметилцеллюлозы и 0,1% (масс./объем) полисорбата 80. Полученную суспензию подвергали предварительному замораживанию жидким азотом и сушили сублимацией в течение 24 часов, с использованием сублимационной сушилки (EYELA, FREEZE DRYER FD-1000) при температуре охлаждения в ловушке при -45°C и вакууме на уровне 20 Па, с получением иммуногенных микрочастиц.

Полисорбат 80, используемый в качестве поверхностно-активного вещества, растворяли в водном растворе CEA (A), растворе амфифильного полимера (B) или дисперсии (C), как показано в таблице 3, в количествах, соответствующих 10% (масс./масс.), 1%-ому (масс./масс.) или 0,1% (масс./масс.), относительно количества амфифильного полимера, с получением частиц (11)-(15). Кроме того, исходя из того, что для сравнительных частиц полисорбат 80 растворяли в водном растворе (D), содержащем поверхностный модификатор, или в растворе для инъекций (E), в количестве, соответствующем 10% (масс./масс.) относительно количества амфифильного полимера, с получением: сравнительной частицы (3), в которой поверхностно-активное вещество связано с поверхностью микрочастиц; сравнительной частицы (4), в которой поверхностно-активное вещество и иммуногенные микрочастицы находятся в не связанном друг с другом состоянии; и сравнительной частицы (5), где поверхностно-активное вещество не добавляли в ходе процесса получения иммуногенных микрочастиц.

Таблица 3
Способ получения иммуногенных микрочастиц, содержащих CEA (частицы (11)-(15) и сравнительных частиц (3)-(5))
Частица No. Раствор, к которому добавлено поверхностно-активное вещество Количество добавленного поверхностно-активного вещества
Частица (11) Водный раствор CEA (A) 10% (масс./масс.)
Частица (12) Раствор амфифильного полимера (B) 10% (масс./масс.)
Частица (13) Дисперсия (C) 10% (масс./масс.)
Частица (14) Водный раствор CEA (A) 1% (масс./масс.)
Частица (15) Водный раствор CEA (A) 0,1% (масс./масс.)
Сравнительная частица (3) Водный раствор (D), содержащий модификатор поверхности 10% (масс./масс.)
Сравнительная частица (4) Раствор для инъекций (E) 10% (масс./масс.)
Сравнительная частица (5) - -

Пример 9

Подкожное введение мышам иммуногенной композиции, содержащей CEA (4)

Способ

Каждый тип иммуногенных микрочастиц, полученных в примере 8 (частицы (11)-(13)), вводили подкожно в виде однократной инъекции в спину самцов мышей Balb/C 7-недельного возраста (Japan SLC, Inc) в дозе 5 мкг, из расчета на CEA, на одно животное, способом, описанным в примере 4. В качестве сравнительных примеров использовали частицы, в которых поверхностно-активное вещество добавляли по-разному (сравнительные частицы (3) и (4)), и которые вводили подкожно в виде однократной инъекции в спину самцов мышей Balb/C в дозе 5 мкг, из расчета на CEA, на одно животное. Введение для каждого случая проводили 5 отдельным мышам. Среднее значение титра антител показано на фиг.4. Отбор крови и измерение титра антител осуществляли способами, описанными в примере 4.

Результаты

Среднее значение титра антител против CEA в плазме крови через пять недель после введения показаны на фиг.4. В случаях, когда поверхностно-активное вещество было добавлено к водному раствору CEA (A), к раствору полимера (B) или к дисперсии (C) (частицы (11)-(13)), поверхностно-активное вещество находится в форме эмульсии S/O/W, когда поверхностно-активное вещество инкапсулировано в микрочастице. С другой стороны, в случае добавления частиц (сравнительная частица (3)) к водному раствору (D), содержащему поверхностный модификатор, полисорбат 80 присутствует вне эмульсии S/O/W, при этом поверхностно-активное вещество связано с поверхностью микрочастицы. В случае добавления частиц (сравнительная частица (4)) к раствору для инъекции (E), поверхностно-активное вещество и микрочастицы находятся в не связанном друг с другом состоянии. Так как иммуногенные микрочастицы (частицы (11)-(13)), в которые было инкапсулировано поверхностно-активное вещество, показали более высокие титры антител по сравнению с частицей (сравнительная частица (3)), где поверхностно-активное вещество связано с поверхностью, и по сравнению с частицей (сравнительная частица (4)), где поверхностно-активное вещество не связано с поверхностью, то показано, что инкапсулирование поверхностно-активного вещества в иммуногенную микрочастицу является важным для настоящего изобретения.

Пример 10

Подкожное введение мышам иммуногенной композиции, содержащей CEA (5)

Способ

Каждый тип иммуногенных микрочастиц, полученных в примере 8 (частицы (11), (14) и (15)), вводили подкожно в виде однократной инъекции в спину самцов мышей Balb/C 7-недельного возраста (Japan SLC, Inc) в дозе 5 мкг, из расчета на CEA, на одно животное, способом, описанным в примере 4. В качестве сравнительных примеров использовали частицы, которые не содержали поверхностно-активного вещества (сравнительная частица (5)), и которые вводили подкожно в виде однократной инъекции в спину самцов мышей Balb/C в дозе 5 мкг, из расчета на CEA, на одно животное. Введение для каждого случая проводили 5 отдельным мышам. Среднее значение титра антител показано на фиг.5. Отбор крови и измерение титра антител осуществляли способами, описанными в примере 4.

Результаты

Среднее значение титра антител против CEA в плазме крови через три недели после введения показаны на фиг.5. Частицы, где поверхностно-активное вещество было инкапсулировано (частицы (11), (14) и (15)) показали более высокие титры антител по сравнению с частицей, не содержащей поверхностно-активного вещества (сравнительная частица (5)). Кроме того, среди частиц, где поверхностно-активное вещество было инкапсулировано, большее количество добавленного поверхностно-активного вещества приводило к большему титру антител. Таким образом, было показано, что эффект частиц повышается в соответствии с увеличением количества инкапсулированного поверхностно-активного вещества.

Пример 11

Измерение поверхностно-активного вещества, содержащегося в иммуногенной микрочастице (2)

Способ

Иммуногенные микрочастицы, полученные в примере 8 (частицы (11)-(13) и сравнительная частица (3)), использовали для измерения содержания полисорбата 80, содержащегося в иммуногенных микрочастицах, способом, описанным в примере 7.

Результаты

Содержание полисорбата 80 относительно исходного количества амфифильного полимера, входящего в иммуногенную микрочастицу или относительно количества поверхностно-активного вещества, используемого в способе получения микрочастиц, было проанализировано высокоэффективной жидкостной хроматографией. Результаты показаны в таблице 4. В частицах, где поверхностно-активное вещество в процессе их получения добавляли к водному раствору CEA (A), к раствору амфифильного полимера (B) или к дисперсии (C) (частицы (11)-(13)), поверхностно-активное вещество было инкапсулировано в микрочастицы. Соответственно было показано, что приблизительно 30% (масс./масс.) поверхностно-активного вещества, добавленного в способе получения по примеру 8, находится в частицах. С другой стороны, в случае частиц (сравнительная частица (3)), полученных способом, когда поверхностно-активное вещество добавляли к водному раствору (D), содержащему поверхностный модификатор, то поверхностно-активное вещество было связано с поверхностью микрочастиц, и было показано, что только приблизительно 3% поверхностно-активного вещество, добавленного в процессе получения, содержались в этих частицах.

Таблица 4
Количество поверхностно-активного вещества, содержащегося в иммуногенных микрочастицах (частицы (11)-(13) и сравнительная частица (3))
Частица No. Содержание поверхностно-активного вещества по отношению к амфифильному полимеру Содержание поверхностно-активного вещества по отношению к добавленному количеству
Частица (11) 3,90% (масс./масс.) 39,0% (масс./масс.))
Частица (12) 3,03% (масс./масс.) 30,3% (масс./масс.))
Частица (13) 2,89% (масс./масс.) 28,9% (масс./масс.))
Сравнительная частица (3) 0,23% (масс./масс.) 2,3% (масс./масс.))

Пример 12

Получение иммуногенных микрочастиц, содержащих OVA (частицы (16)-(18) и сравнительная частица (6))

В 100 мкл диметилкарбоната растворяли 5 мг декстран-поли(молочную-со-гликолевую кислоту) (PLGA), (соединение (2)), полученное в примере 1, с получением раствора амфифильного полимера (B), содержащего 50 мг/мл полимера. К раствору амфифильного полимера (B), добавляли 20 мкл трет-бутанола и затем добавляли по каплям 50 мкл 0,25% (масс./объем) водного OVA (овальбумин, изготовитель SIGMA) раствора (A) (количество введенного OVA составило 125 мг), с последующим перемешиванием полученной смеси вихревым миксером, с получением обратнофазной эмульсии.

Обратнофазную эмульсию подвергали предварительному замораживанию жидким азотом и сушили сублимацией в течение 24 часов, с использованием сублимационной сушилки (EYELA, FREEZE DRYER FD-1000) при температуре охлаждения в ловушке при -45°C и вакууме на уровне 20 Па. Полученные твердые вещества диспергировали в 200 мкл диметилкарбоната, с получением дисперсии. Дисперсию добавляли по каплям к 2 мл водного раствора (C), содержащего 10% (масс./объем) поверхностного модификатора (плюроник F-68), и полученную смесь перемешивали и эмульгировали вихревым миксером, с получением эмульсии S/O/W. Диметилкарбонат удаляли из эмульсии S/O/W выпариванием растворителя, с получением суспензии иммуногенных микрочастиц. Суспензию переносили в колбу в форме баклажана и подвергали предварительному замораживанию жидким азотом, с последующей сублимационной сушкой в течение 24 часов, с использованием сублимационной сушилки (EYELA, FREEZE DRYER FD-1000) при температуре охлаждения в ловушке -45°C и вакууме на уровне 20 Па, с получением иммуногенных микрочастиц.

Как показано в таблице 5, поверхностно-активное вещество, представляющее собой полисорбат 80, моноолеат сорбитана (они производятся Kanto Chemical Co., Inc.) или полиоксиэтилен гидрогенизированного касторового масла (изготовитель Nikko Chemicals Co., Ltd.), растворяли в водном растворе OVO (A) или в растворе амфифильного полимера (B), в количестве 500 мкг, что соответствует 10% (масс./масс.) относительно количества амфифильного полимера.

Таблица 5
Способ получения иммуногенных микрочастиц, содержащих OVA (частицы (16)-(18) и сравнительная частица (6))
Частица No. Раствор, к которому добавлено поверхностно-активное вещество Тип поверхностно-активного вещества
Частица (16) Водный раствор CEA (A) Полисорбат 80
Частица (17) вор амфифильного полимера (B) Полисорбат 80
Частица (18) Водный раствор CEA (A) Полиоксиэтилен гидрогенизированного касторового масла
Сравнительная частица (6) - -

Пример 13

Тест стимуляции макрофагов брюшной полости мышей иммуногенными композициями, содержащими OVA, in vitro

Способ

Тест стимуляции макрофагов брюшной полости мышей in vitro осуществляли следующим образом. Самцам мышей Balb/c в возрасте 12 недель интраперитонеально вводили 5 мл тиогликолятной среды (GIBCO), в качестве стимулирующей жидкости, с использованием иглы для инъекций 26-G (Terumo Corporation), и мышь оставляли в покое в течение 72 часов в окружающей среде со свободным доступом к корму. Затем мышь подвергали эвтаназии с использованием сухого льда, и 10 мл раствора PBS (0°C, фильтрованный) интраперитонеально вводили мыши, с использованием иглы для инъекции 26-G, затем в течение 5 минут проводили массаж живота мыши, находящейся в состоянии покоя. Затем, используя микропипетку, собирали раствор, содержащий клетки брюшной полости.

Собранный раствор подвергали центрифугированию, используя центрифугу с охлаждением (изготовитель Hitachi, Ltd., модель himacCF16RX) при 400 g в течение 5 минут при температуре 4°C, для осаждения клеток брюшной полости мыши, и затем супернатант удаляли, с последующим добавлением 10 мл среды RPMI1640 (GIBCO) (далее называемой промывным раствором) для ресуспендирования клеток. Центрифугирование осуществляли еще раз при 400 g в течение 5 минут при температуре 4°C с удалением супернатанта, и клетки помещали в 24-луночный планшет (микропланшеты модели Flat Bottom Tissue culture Treated, изготовитель Iwaki, материал полистирол) таким образом, чтобы каждая лунка содержала 8×105 клеток вместе с 1 мл среды RPMI1640, дополненной 5% FBS (SIGMA), 100 Ед/мл пенициллина (Invitrogen) и 100 Ед/мл стрептомицина (Invitrogen) (далее называемой культуральной средой). Затем планшеты с пробами инкубировали в инкубаторе под CO2 (NAPCO) при 5% CO2 и 37°C в условиях 100%-ой влажности (условия культуры макрофагов) в течение 3 часов, и клетки подвергали интенсивному суспендированию с использованием микропипетки, для удаления клеток, которые не прилипли к планшету, с тем, чтобы получить только макрофаги брюшной полости мыши, которые прилипли к планшету. К клеткам добавляли культуральную среду, и клетки инкубировали в условиях культуры макрофагов в течение 5 дней, для получения клеток, предназначенных для использования в эксперименте.

В качестве частиц, которые добавляют к клеткам, использовали иммуногенные микрочастицы (частицы (16)-(18)), полученные в примере 12, когда инкапсулировали поверхностно-активное вещество, и микрочастицы были в высушенном за счет сублимации состоянии, при этом частицы использовали после предварительной обработки. Более конкретно, частицы в количестве, соответствующем 3 мг, исходя из количества амфифильного полимера, входящего в состав частиц, взвешивали и помещали в пробирки на 1,5 мл. В них добавляли промывной раствор, и полученную смесь предварительно охлаждали до 0°C, с последующей трехкратной отмывкой частиц при 8400 g в течение 10 минут. Затем частицы совместно с 500 мкл культуральной среды на одну лунку добавляли в 24-луночный планшет, в котором находились макрофаги брюшной полости мыши, которые прилипли к планшету. В качестве сравнительного примера, аналогично добавляли частицы, не содержащие поверхностно-активного вещества (сравнительная частица (6)).

Кроме того, как показано в таблице 6, в каждую лунку 24-луночного планшета, где находились макрофаги брюшной полости мыши, которые прилипли к планшету, совместно с 500 мкл культуральной среды на одну лунку добавляли в качестве других сравнительных примеров (сравнительные примеры (1)-(3)), OVA, в количестве 75 мкг (рассчитано на основании массового отношения между количествами исходно добавленного амфифильного полимера и исходно добавленного OVA), которое являлось таким же, как и количество OVA, содержащегося в частицах (16)-(18), и 300 мкг полисорбата 80, моноолеата сорбитана или полиоксиэтилена гидрогенизированного касторового масла. Кроме того, в качестве сравнительного примера (4) использовали 75 мкг OVA совместно с 500 мкл культуральной среды.

Таблица 6
Типы и количества поверхностно-активных веществ, добавленных в тестах стимуляции in vitro в сравнительных примерах (сравнительные примеры (1)-(4))
Сравнительный пример Тип поверхностно-активного вещества Количество добавленного поверхностно-активного вещества
Сравнительный пример (1) Полисорбат 80 300 мкг
Сравнительный пример (2) Моноолеат сорбитана 300 мкг
Сравнительный пример (3) Полиоксиэтилен гидрогенизированного касторового масла 300 мкг
Сравнительный пример (4) - -

Клетки, к которым добавляли частицы, культивировали в течение 24 часов, и затем выделяли среду, с последующим измерением количества TNFα в среде, с применением анализа ELISA. Измерение с применением анализа ELISA осуществляли с помощью набора, выпускаемого Thermo Scientific.

Результаты

Концентрация TNFα в среде показана на фиг.6. Частицы, где поверхностно-активное вещество было инкапсулировано (частицы (16)-(18)), показали концентрации TNFα выше, по сравнению с частицами (сравнительная частица (6)), где поверхностно-активное вещество не было инкапсулировано. TNFα является видом цитокина, который индуцирует иммунитет, и таким образом показано, что эффективная индукция иммунитета может быть достигнута за счет инкапсулирования поверхностно-активного вещества в частицу. Кроме того, в сравнительных примерах, где антиген не был представлен в форме частиц и был добавлен вместе с поверхностно-активным веществом (сравнительные примеры (1)-(4)), концентрация TNFα была ниже, чем в случаях, когда антиген был представлен в форме частиц. Таким образом, было показано, что формирование частиц важно для индукции иммунитета.

Промышленная применимость

Иммуногенная композиция настоящего изобретения может быть использована в качестве вакцины для терапии и/или профилактики инфекционных заболеваний, раковых образований и т.п.

1. Иммуногенная композиция, содержащая в качестве активных ингредиентов: иммуногенную микрочастицу, состоящую из микрочастицы комплекса адъювант-антиген, где антиген(ы), инкапсулирован(ы) в адъювантную микрочастицу, состоящую из амфифильного полимера(ов), у которого(ых) гидрофобный(е) сегмент(ы) представляет(ют) собой поли(гидроксикислоту); и молекулы поверхностно-активного вещества, включающие структуру эфира жирной кислоты, инкапсулированные в иммуногенную микрочастицу.

2. Иммуногенная композиция по п. 1, где указанная иммуногенная микрочастица представляет собой частицу, состоящую из микрочастиц комплекса адъювант-антиген, ассоциированных друг с другом.

3. Иммуногенная композиция по п. 1, где указанная адъювантная микрочастица имеет в своей внутренней части гидрофильную часть(и), состоящую(ие) из гидрофильного сегмента(ов) указанного амфифильного полимера(ов), и имеет внешний слой, состоящий из гидрофобной части(ей), состоящей(их) из гидрофобного сегмента(ов) указанного амфифильного полимера(ов).

4. Иммуногенная композиция по п. 1, где указанный гидрофильный сегмент указанного амфифильного полимера представляет собой полисахарид.

5. Иммуногенная композиция по п. 1, где указанный амфифильный полимер представляет собой привитый амфифильный полимер, состоящий из полисахаридного каркаса и присоединенной(ых) цепи(ей) поли(гидроксикислоты).

6. Иммуногенная композиция по п. 5, где указанный полисахарид представляет собой декстран.

7. Иммуногенная композиция по п. 1, где указанная поли(гидроксикислота) представляет собой сополимер молочной и гликолевой кислот.

8. Иммуногенная композиция по п. 1, где указанные молекулы поверхностно-активного вещества, включающие структуру эфира жирной кислоты, дополнительно включают моносахарид и/или структуру(ы) полиэтиленгликоля.

9. Иммуногенная композиция по п. 1, где указанное поверхностно-активное вещество представляет собой одно или более соединений, выбранных от группы, состоящей из полисорбата 80, полисорбата 20, моноолеата сорбитана, триолеата сорбитана и полиоксиэтилена гидрогенизированного касторового масла.

10. Иммуногенная композиция по п. 2, где указанная адъювантная микрочастица имеет в своей внутренней части гидрофильную часть(и), состоящую(ие) из гидрофильного сегмента(ов) указанного амфифильного полимера(ов), и имеет внешний слой, состоящий из гидрофобной части(ей), состоящей(их) из гидрофобного сегмента(ов) указанного амфифильного полимера(ов).

11. Иммуногенная композиция по п. 1, где указанная адъювантная микрочастица имеет в своей внутренней части гидрофильную часть(и), состоящую(ие) из гидрофильного сегмента(ов) указанного амфифильного полимера(ов), и имеет внешний слой, состоящий из гидрофобной части(ей), состоящей(их) из гидрофобного сегмента(ов) указанного амфифильного полимера(ов).

12. Иммуногенная композиция по п. 5, где указанный полисахарид представляет собой декстран.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биохимии. Представлено химерное, CDR-привитое, гуманизированное или рекомбинантное человеческое антитело или его фрагмент, который специфически связывается с человеческим EFNA4.
Группа изобретений относится к области пищевой промышленности, а именно к питательной композиции, которая не является человеческим молоком и содержит фукозиллактозу и бетагалактоолигосахариды, которые имеют структуру [галактоза]n-глюкоза, где n равно целому числу от 2 до 60, и имеют более 80% бета-1,4 и бета-1,6 связей; и к применению такой композиции для предоставления питания детям, пожилым и пациентам, болеющим раком, и/или пациентам, зараженным ВИЧ, а также для лечения и/или предотвращения развития вирусных инфекций, иммунных заболеваний и/или заболевания, которое может быть предотвращено и/или вылечено путем усиления Th1 ответа и/или Th1/Th2 баланса, и для усиления ответа на вакцинацию.

Настоящая группа изобретений относится к медицине, а именно к дерматологии, и касается лечения псориаза. Для этого вводят антитело к IL-17 в эффективных дозах в соответствии с разработанной схемой введения.

Изобретение относится к области биохимии. Заявлено антитело, связывающееся с рецептором клеточной поверхности DR5.

Группа изобретений раскрывает комбинации антитела к CD20 типа II, которое представляет собой созданное с помощью гликоинженерии гуманизированное антитело B-Ly1, где гуманизированное антитело B-Ly1 имеет вариабельную область тяжелой цепи (VH) SEQ ID No.

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для применения производного олигохитозана в качестве адъюванта для вакцин. Производное олигохитозана состоит из звеньев глюкозамина 91-98% и (N-ацил)глюкозамина 2-9% с молекулярной массой от 5 до 15 кДа.

Предложена группа изобретений, касающихся лечения злокачественных опухолей. Заявлены: применение 2-амид-1-({4-метил-5-[2-(2,2,2-трифтор-1,1-диметил-этил)пиридин-4-ил]тиазол-2-ил}амид) (S)-пирролидин-1,2-дикарбоновой кислоты или её соли для производства фармацевтических композиций для лечения злокачественной опухоли, комбинация данного соединения с EGFR-модуляторами в целях указанного использования, способ лечения указанного заболевания с помощью этого соединения, и фармацевтические композиции для лечения указанного заболевания.

Изобретение относится к области фармацевтики и биотехнологии, а именно касается новой стабильной композиции антитела, специфически связывающегося с HER2 рецепторами, как в лиофилизированной форме, которая может быть восстановлена растворителем, так и в виде концентрированного раствора, а также способа получения композиции.

Изобретение относится к биохимии. Описаны выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, где указанное антитело или фрагмент специфически связывается с I-доменом α2-интегрина человека, нуклеиновая кислота, кодирующая данное антитело, и клетка, содержащая данную нуклеиновую кислоту.

Изобретение относится к биохимии. Описано рекомбинантное антитело, его фрагмент, нейтрализующие VEGF человека, содержащие вариабельную область тяжелой цепи (VH), где VH содержит CDRH1, CDRH2 и CDRH3 последовательности SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 32 соответственно, и вариабельную область легкой цепи (VL), где VL содержит CDRL1, CDRL2 и CDRL3 последовательности SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 55 и SEQ ID NO: 66 соответственно и где вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 164 и вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 87.

Группа изобретений относится к медицине и касается композиции для предотвращения передачи ВИЧ, включающей поликлональные антитела или их фрагменты, способные связываться с белком вирусной оболочки (Env) вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) или его фрагментом, в которой поликлональные антитела или их фрагменты (i) способны связываться с белком Env из гетерологичного штамма ВИЧ и (ii) присутствуют в гипериммунном молоке животного или получены из гипериммунного молока животного, присутствуют в гипериммунном молозиве животного или получены из гипериммунного молозива животного или присутствуют в птичьем яйце или получены из птичьего яйца. Группа изобретений также касается применения указанной композиции для производства лекарственных препаратов, предназначенных для предотвращения передачи ВИЧ; способа предотвращения передачи ВИЧ, включающего топическое введение указанной композиции. Группа изобретений обеспечивает предотвращение передачи ВИЧ. 3 н. и 42 з.п. ф-лы, 12 пр., 6 ил., 6 табл.
Наверх