Штамм bradyrhizobium diazoefficiens ccm gs-4 (вкпм в-12660) - ризобиальный компонент микробного биопрепарата для предпосевной обработки сои

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен штамм клубеньковых бактерий Bradyrhizobium diazoefficiens CCM GS-4, который обладает способностью образовывать клубеньки с растениями сои. Штамм Bradyrhizobium diazoefficiens депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ В-12660 и может быть использован для получения микробиологического удобрения. Изобретение позволяет повысить продуктивность сои. 1 ил., 5 табл.

 

Изобретение относится к биотехнологии и сельскому хозяйству и касается нового штамма клубеньковых бактерий Bradyrhizobium diazoefficiens ССМ GS-4 для получения микробиологического удобрения, повышающего продуктивность сои.

В настоящее время для повышения урожайности бобовых культур используют бактериальные удобрения, изготовляемые на основе азотфиксирующих клубеньковых бактерий. Существует ряд ранее запатентованных штаммов клубеньковых бактерий, которые применялись в качестве монокомпонентных биопрепаратов под сою, согласно авторским свидетельствам и патентам на изобретение в период с 1979 по 2013 гг., а именно: Rhizobium japonicum 626а, Rhizobium japonicum 646, Rhizobium japonicum 614a, Rhizobium japonicum 634б, Rhizobium japonicum 24108 (71 т), Bradyrhizobium japonicum M-8, Bradyrhizobium japonicum КН 10, Bradyrhizobium japonicum T66, Bradyrhizobium japonicum 36, Bradyrhizobium japonicum 46, Bradyrhizobium japonicum 206, Bradyrhizobium japonicum ВКМ B-2629D (MM-117), Bradyrhizobium japonicum БМ-85к, Bradyrhizobium japonicum 859, Bradyrhizobium japonicum См-42к.

Однако остается нерешенным вопрос стабильности и эффективности таких биопрепаратов на практике. Главным образом, это обусловлено созданием так называемых "универсальных биопрепаратов", при разработке которых не учитывается зависимость растительно-микробного симбиоза от ряда параметров: сорт-штаммовой специфичности, влияния почвенной микробиоты, агроклиматических условий возделывания бобовой культуры и агрофона, на котором проводилась селекция используемых сортов растений. И самое главное - зачастую не проводится оценка влияния компонентов таких биопрепаратов на почвенный биоценоз, оценка остаточного эффекта интродуцированных штаммов-инокулятов на местные популяции клубеньковых бактерий, в том числе сохранность их после первого года вегетации растений-хозяев. Поэтому для создания эффективного симбиоза так важен принцип "комплементарности пар", базирующийся на знаниях биоразнообразия партнеров.

Краткое описание чертежа

Биоразнообразие микросимбионтов сои главным образом представлено 6 генетически удаленными группами штаммов: 3 группы вида В. japonicum: USDA 123 - к этой группе относятся конкурентоспособные, но малоэффективные штаммы клубеньковых бактерий; USDA 6Т - типовая группа штаммов данного вида, эффективных в симбиозе с соей, в нее попадают производственные штаммы 626а, 46 и КН-10; USDA 4 - группа эффективных штаммов, к которой относятся производственные штаммы 36 и М-8; 1 группа вида В. diazoefficiens USDA 110, к которой относится производственный штамм 634б и предложенный в настоящей заявке штамм ССМ GS-4; и штаммы видов В. liaoningense, В. elkanii. На чертеже представлено филогенетическое дерево, построенное на основе данных мультилокусного секвенирования (MLSA) нуклеотидных последовательностей клубеньковых бактерий рода Bradyrhizobium sp. с использованием алгоритма Neighbor-Joining. Масштаб соответствует 1 замене на 100 пар оснований (эволюционным расстояниям). Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления (в %), определенная с помощью «bootstrap» - анализа 1000 альтернативных деревьев.

Реализация принципа «комплементарности пар» основана на коэволюции штаммов определенных групп с сортами растений-хозяев, обусловленной агрофоном, на котором проводилась селекция используемых сортов растений и агроклиматическими условиями возделывания. Предложенный штамм В. diazoefficiens ССМ GS-4 представляет собой медленнорастущие клубеньковые бактерии, обладающие большей эффективностью на современных сортах сои отечественной селекции по сравнению с применяемыми ранее штаммами, в том числе 634б.

Штамм бактерий В. diazoefficiens CCM GS-4 был получен С.В. Дидович и Н.З. Толкачевым в 2003 г. методом аналитической селекции. Штамм характеризуется следующими морфолого-культуральными и физиолого-биохимическими признаками: клетки 7-суточной культуры штамма имеют форму палочек, размером 0.4-1.2 мкм в ширину и 1.5-2.0 мкм в длину, подвижные благодаря полярному жгутику (монотрихи). Штамм грамотрицательный, спор не образует, облигатный аэроб. Рост бактерий при посеве штрихом на агаризованной гороховой среде с глюкозой или маннитом слабый, штрих беловатый, слизистый. Относятся к медленнорастущим клубеньковым бактериям, колонии появляются на поверхности агара на 7-8 сутки, имеют округлую форму, до 1 мм в диаметре, выпуклые, блестящие, слизистые. Штамм активно усваивают глюкозу, фруктозу, арабинозу, рафинозу, ксилозу, рамнозу, мальтозу, маннит, сорбит, дульцит. Отсутствие фермента инвертазы не дает возможность усваивать сахарозу. Как источник азота использует аммонийный, нитратный, амидный азот. На средах с органическим азотом (МПА) штамм не растет. Молоко с лакмусом подщелачивает, не пептонизует. Желатин не разрежает, не имеет протеолитического фермента желатиназы, не гидролизует крахмал, казеин, агар, не имеет амилазной и оксидазной активности, характеризуется денитрифицирующей способностью, уреазной и каталазной активностью. Штамм имеет активную нитратредуктазу и восстанавливает нитраты. Прототроф, чувствителен к антибиотикам. Флуоресцирующих и феназиновых пигментов не образует. Штамм синтезирует аммоний из азота воздуха в симбиозе с растением-хозяином, синтезирует ростстимулирующие вещества типа фитогормонов. Температурный интервал роста штамма на плотных и в жидких средах составляет 18-37°C, а температурный оптимум - 25-28°C, штаммы отнесены к мезофилам. Рост бактерий наблюдается в диапазоне pH 4.5-8.5, оптимальной для развития клеток штамма является близкая к нейтральной реакция среды pH 6.5-7.5, штамм отнесен к нейтрофилам. Признаки штамма стойкие.

Штамм В. diazoefficiens ССМ GS-4 образует активные клубеньки с современными сортами сои (Glycine max (L.) Merr.) отечественной селекции. На фасоли, нуте, люпине, горохе, бобах, эспарцете, люцерне, козлятнике, клевере, лядвенце клубеньков не образует.

Для хранения и культивирования штамма В. diazoefficiens ССМ GS-4 в лабораторных условиях используют маннитно-дрожжевой агар (МДА) с добавлением глюкозы при pH 6,8±0,2 следующего состава, г/л:

маннит - 10 г

глюкоза - 10 г

дрожжевой экстракт - 1 г

К2НРО4×4Н20 - 0.5 г

MgSO4×7H2O - 0,2 г

NaCl - 1 г, CaCO3 - 3 г

агар - 20 г

вода дистиллированная - 1 л

Хранение штамма при 4-6°C. Пересев 1 раз в полгода.

Для промышленного культивирования штамма В. diazoefficiens ССМ GS-4 используют среду при pH 6,8±0,2 следующего состава, на л: кукурузный экстракт - 7 г, дрожжи пекарские - 0.5 г, глюкоза - 12 г, (NH4)2SO4 - 1 г, К3РO4×3Н2O - 0.35 г, MgSO4 - 0,2 г, CaCO3 - 1 г. Посевная доза - 5% от объема питательной среды. Культивирование осуществляют при 28°C в течение 3 суток.

Эффективность штамма бактерий В. diazoefficiens CCMGS-4 определяли:

- в вегетационных опытах по симбиотическим показателям (кол-во, масса и азотфиксирующая активность клубеньков - ацетиленовый метод определения азотфиксирующей активности /Hardy et al., 1968/) на сортах украинской селекции, используемых в качестве тестовых для первичного анализа;

- в полевых опытах по продуктивности растения-хозяина (урожайность семян; кол-во сырого протеина в семенах - метод Кьельдаля /ГОСТ 10846-91 «Зерно и продукты его переработки»/)) на производственных сортах российской селекции.

Схема проведенных опытов предполагала сравнение влияния предложенного штамма В. diazoefficiens ССМ GS-4 с применяемыми техническими штаммами, показавшими лучшие результаты по исследуемым показателям при предыдущих селекциях, на различных сортах сои (табл. 1, 2). Эффективность бобово-ризобиального симбиоза связана со специфичностью растительно-микробных взаимодействий. Данный штамм В. diazoefficiens проявляет большую специфичность по отношению к сое, что позволяет использовать его в качестве активного компонента для микробиологического препарата.

Примечание: Н.А. - нитрогеназная активность

В мелкоделяночном опыте были проведены испытания на производственных сортах российской селекции Зуша и Красивая Меча, в качестве инокулятов были использованы по 2 штамма из каждой генетически удаленной группы симбионтов сои (табл. 4). Отрицательным контролем служил вариант опыта без микробной обработки. Как видно из таблицы 4, в почве отсутствовали местные популяции клубеньковых бактерий сои, поэтому полученные данные являются следствием различной эффективности бобово-ризобиального симбиоза с интродуцированными штаммами.

Для последующей стадии полевых испытаний на производственных сортах российской селекции Зуша и Красивая Меча был отобран штамм В. diazoefficiens ССМ GS-4, образующий наибольшее количество активных (розовых) клубеньков и производственные штаммы сравнения - В. diazoefficiens 634б и В. japonicum 36. Испытания проводились в Орловской области на базе ФГБНУ «ВНИИ зернобобовых и крупяных культур» (табл. 5 и 6).

В результате проведенных полевых испытаний было показано, что предложенный в настоящей заявке штамм В. diazoefficiens ССМ GS-4 обеспечивает максимальную прибавку урожайности сортов Зуша и Красивая Меча - 3,5 ц/га (16,5%) и 3,9 ц/га (18,4%) в сравнении с контролем, соответственно. При этом наблюдается повышение содержания белка в семенах сои сорта Зуша - на 1,2% и сорта Красивая Меча - на 1,4%. Таким образом, при обработке семян сои современных сортов отечественной селекции эффективность биоудобрений, полученных на основе указанного штамма В. diazoefficiens ССМ GS-4, превышала на 7,5-8% по показателю урожайности семян, а по содержанию сырого протеина в семенах - на 0,6-1,2% аналогичные показатели производственного штамма В. japonicum 634б.

Все изложенное указывает на возможность использования штамма клубеньковых бактерий В. diazoefficiens ССМ GS-4 для изготовления препаратов - удобрений для предпосевной обработки семян сои в виде концентрата бактериальной суспензии с титром не менее 109 КОЕ/мл.

Штамм бактерий Bradyrhizobium diazoefficiens ВКПМ В-12660, повышающий урожайность сои.



 

Похожие патенты:

Предложены штамм мицелиального гриба Trichoderma Longibrachiatum TW-14-220T - продуцент комплекса ферментов эндоглюканаз, бета-глюканаз и ксиланаз, разрушающих некрахмальные полисахариды, и способ получения кормового ферментного препарата с использованием штамма мицелиального гриба Trichoderma longibrachiatum TW-14-220T.

Изобретение относится к области биохимии, генной инженерии и биотехнологии, в частности к способу получения гетеротетрамерного рекомбинантного стрептавидина. Настоящий способ предусматривает создание двух плазмид, одна из которых кодирует стрептавидин мутантного типа, а другая – стрептавидин дикого типа, трансформацию указанными плазмидами клеток E.coli, индукцию синтеза стрептавидинов, выделение периплазматической фракции клеток и очистку гетеротетрамерного стрептавидина на аффинном сорбенте.

Группа изобретений относится к микроорганизму рода Corynebacterium, обладающему повышенной путресцин-продуцирующей способностью, и способу получения путресцина с его использованием.

Изобретение относится к области биохимии, генной инженерии и биотехнологии, в частности к генетической конструкции для обеспечения экспрессии целевых гомологичного и гетерологичного генов в клетках реципиентного гриба Penicillium verruculosum.

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к получению рекомбинантных белков человека, и может быть использовано для получения и очистки рекомбинантного белка GAGE1 человека.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ определения способности микобактерий туберкулеза к размножению в альвеолярных макрофагах пациентов после противотуберкулезной терапии.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложен способ ферментативного получения серусодержащих аминокислот, включающий стадии, на которых: а) получают микроорганизм семейства Enterobacteriaceae или микроорганизм семейства Corynebacteriaceae, в котором происходит сверхэкспрессия гена, кодирующего полипептид с активностью тиосульфат-сульфотрансферазы; б) ферментируют микроорганизм, полученный на стадии а), в среде, которая содержит неорганический источник серы, выбранный из группы, включающей соль тиосерной кислоты или смесь соли тиосерной кислоты и соли серной кислоты, получая ферментационный бульон, и в) концентрируют серусодержащую аминокислоту в ферментационном бульоне, полученном на стадии б).

Предложены коринеформный микроорганизм с улучшенной способностью продуцировать L-лизин и способ получения L-лизина с использованием указанного микроорганизма. Указанный коринеформный микроорганизм представляет собой Corynebacterium glutamicum, в котором инактивирован белок-инициатор формирования перегородки, где указанный белок-инициатор формирования перегородки представляет собой филаментный чувствительный к температуре белок В (FtsB).

Изобретение относится к биотехнологии, прикладной микробиологии и может быть использовано для получения эфирного масла. Предложен штамм гриба Eremothecium gossypii ВКПМ F-1321, являющийся продуцентом эфирного масла, аналогичного розовому маслу крымского происхождения.

Группа изобретений относится к микроорганизму рода Corynebacterium, обладающему повышенной путресцин-продуцирующей способностью, и способу получения путресцина с его использованием.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены композиция, включающая штаммы нескольких культур микроорганизмов, применение указанной композиции, способ нанесения композиции, способ предотвращения запаха, способ проверки запаха в системе кондиционирования воздуха транспортного средства, предусматривающие нанесение композиции на сердцевину испарителя в концентрации 104-108 КОЕ/г, а также 14 штаммов, относящихся к видам микроорганизмов, входящим в состав композиции.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложено применение полипептида с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1 в качестве гомосеринсукцинилтрансферазы или кодирующего его полинуклеотида, имеющего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2 или 3, для получения О-сукцинилгомосерина.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложено применение полипептида с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1 в качестве гомосеринсукцинилтрансферазы или кодирующего его полинуклеотида, имеющего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2 или 3, для получения О-сукцинилгомосерина.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложен способ ферментативного получения серусодержащих аминокислот, включающий стадии, на которых: а) получают микроорганизм семейства Enterobacteriaceae или микроорганизм семейства Corynebacteriaceae, в котором происходит сверхэкспрессия гена, кодирующего полипептид с активностью тиосульфат-сульфотрансферазы; б) ферментируют микроорганизм, полученный на стадии а), в среде, которая содержит неорганический источник серы, выбранный из группы, включающей соль тиосерной кислоты или смесь соли тиосерной кислоты и соли серной кислоты, получая ферментационный бульон, и в) концентрируют серусодержащую аминокислоту в ферментационном бульоне, полученном на стадии б).

Группа изобретений относится к вариантам штамма молочнокислых бактерий и их применению. Предложен штамм молочнокислых бактерий рода Lactobacillus DSM 25972, штамм молочнокислых бактерий рода Lactobacillus DSM 25987, штамм молочнокислых бактерий рода Lactobacillus 25988, штамм молочнокислых бактерий рода Lactobacillus DSM 25989 и штамм молочнокислых бактерий рода Lactobacillus DSM 25973.

Группа изобретений относится к вариантам штамма Streptococcus и их применению. Предложены штамм Streptococcus CECT 7746, штамм Streptococcus CECT 7747, штамм Streptococcus CECT 7773, штамм Streptococcus CECT 7775, полезные как агенты против ротовых патогенных Streptococci.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен экобиопрепарат «Центрум-MMS», представляющий собой ассоциацию микроорганизмов Pseudomonas fluorescens ВКМ В-6847 и Rhodococcus erythropolis ВКМ Ас-1769, который предложено применять для биодеградации несимметричного диметилгидразина.

Группа изобретений относится к биотехнологии и клинической микробиологии. Предложены сердечно-мозговая питательная среда для диагностики инфекции в кровотоке и способ ее получения.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения этанола, предусматривающий ферментацию содержащих СО газообразных субстратов с помощью ацетогенных бактерий.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм клубеньковых бактерий Sinorhizobium fredii АмБ-17 депонирован в ВКМ под регистрационным номером ВКМ B-3152D.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен штамм клубеньковых бактерий Bradyrhizobium diazoefficiens CCM GS-4, который обладает способностью образовывать клубеньки с растениями сои. Штамм Bradyrhizobium diazoefficiens депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ В-12660 и может быть использован для получения микробиологического удобрения. Изобретение позволяет повысить продуктивность сои. 1 ил., 5 табл.

Наверх