Высокоэффективные фармацевтические композиции панкреатина

Группа изобретений относится к химико-фармацевтической промышленности и представляет собой высокоэффективную фармацевтическую композицию, содержащую уменьшенную дозировочную форму частиц, включающих высокоактивный панкреатин, в которой указанный панкреатин обладает удельной липазной активностью по меньшей мере 120 USP (Фармакопея США) МЕ/мг и присутствует в дозе 100-110 мг активного фармацевтического ингредиента (АФИ) на дозировочное количество. Изобретения также включают способ получения высокоактивного панкреатина и способ лечения пациента, подверженного физиологическому состоянию, связанному с недостаточностью панкреатических ферментов, посредством применения упомянутой высокоэффективной фармацевтической композиции. Группа изобретений позволяет получить панкреатин с липазной активностью по меньшей мере 120 МЕ/мг, для которого доза составляет 100-110 мг на дозировочную форму, что позволяет снизить биологическую нагрузку. 3 н. и 39 з.п. ф-лы, 21 табл., 9 пр.

 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА СМЕЖНЫЕ ЗАЯВКИ

Данная заявка претендует на приоритет согласно 35 USC §119(e) в отношении предварительной заявки на патент №61/856,952, поданной 22 июля 2013 г., описание которой полностью включено в настоящий документ посредством ссылки для всех целей.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение направлено на высокоэффективные фармацевтические композиции, содержащие ферменты высокоактивного панкреатина (ВА панкреатина). Изобретение также направлено на способ получения ферментов ВА панкреатина и их композиций или дозированных форм и на способы их применения.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

В недостаточность экзокринной функции поджелудочной железы (EPI), которой по оценкам Управления по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств (FDA) страдает более 200000 американцев, вовлечено физиологическое расстройство, при котором индивидуумы неспособны правильно переваривать пищу вследствие недостаточности пищеварительных ферментов, производимых их поджелудочной железой. Эта потеря пищеварительных ферментов приводит к расстройствам, таким как недостаточность пищеварения и недостаточность абсорбции питательных веществ, что приводит к недостаточности питания и к другим сопутствующим и нежелательным физиологическим состояниям, связанным с ними. Эти расстройства характерны для людей, страдающих муковисцидозом (cystic fibrosis, CF) и другими состояниями, которые нарушают экзокринную функцию поджелудочной железы, такими как рак поджелудочной железы, панкреатэктомия и панкреатит. Нарушение питания может быть угрожающим для жизни, если остается без лечения, особенно в случае детей и пациентов с CF. Это расстройство может приводить к ухудшенному росту, нарушению иммунного ответа и сокращению продолжительности жизни.

Чтобы по меньшей мере частично вылечить EPI, можно вводить пищеварительные ферменты, такие как ферменты панкрелипазы и другие препараты панкреатических ферментов (PEP; pancreatic enzyme products). Введенные панкреатические ферменты дают возможность пациентам более эффективно переваривать их пищу.

Ферменты панкрелипазы, применяемые для лечения EPI, в основном, представляют собой комбинацию ферментов трех классов: липазы, амилазы и протеазы - вместе с другими ферментами, включающими среди прочего эластазы, фосфолипазы и холестеразы, и различных кофакторов и коферментов с другими различными кофакторами и коферментами; уровни или эффективность в ферментных препаратах перечислены.

Эти ферменты продуцируются естественным путем в поджелудочной железе и важны для переваривания жиров, белков и углеводов. Ферменты катализируют гидролиз жиров до глицерина и жирных кислот, крахмала до декстрина и Сахаров и белков до аминокислот и производных веществ. Пищеварение, однако, является комплексным процессом, в который вовлечены многие другие ферменты и субстраты, которые участвуют в корректировании функционирования пищеварения и в продуцировании полного диапазона продуктов пищеварения.

Ферменты панкрелипазы в характерном случае получают из свиных поджелудочных желез. Другие источники панкрелипазы включают бычьи поджелудочные железы или панкреатические соки. Из природных источников этих ферментов млекопитающих в результате получают продукт с композицией ферментов, которая подобна композиции ферментов, секретируемой поджелудочной железой человека. Можно также применять другие источники, отличающиеся от млекопитающих, например, описанные в US 6051220, US 2004/0057944, 2001/0046493 и WO 2006044529.

Хотя препараты, содержащие панкрелипазу, могут обеспечить эффективную терапию, вместе с тем существуют проблемы. Необходимость приема множества (4-9) относительно больших капсул (высокая таблеточная нагрузка) при каждом приеме пищи приводит к уменьшению строгого соблюдения дозирования пациентом. Вследствие высокой таблеточной нагрузки также отмечены нежелательные потенциальные микробные и вирусные загрязняющие вещества. Все эти проблемы связаны с тем, что экстракт ферментов является недостаточно чистым. Проблема чистоты является следствием методик экстракции ферментов, существующих в течение многих лет, и в которые вовлечено формирование крупнозернистой водной смеси или суспензии, осаждение спиртом, центрифугирование и фильтрование. В результате таких способов экстракции получают конечные продукты, которые могут состоять лишь максимум из 25% белка. Липаза, являющаяся важным ферментом в отношении эффективности в этих экстрактах панкрелипазы, имеет активность, находящуюся в области 100 Международных единиц (ME) по Фармакопее США (Фарм. США)/мг. Это значение противоречит активности чистой свиной липазы, которая имеет активность приблизительно 25000 МЕ/мг (например, чистой свиной липазы, доступной от компании Sigma Aldrich). При использовании этого приближения в качестве основы для вычисления эти препараты можно оценивать как содержащие менее 0,5% активной липазы. Кроме того, дополнительные последствия присутствия избыточного неактивного материала состоят в том, что любое инфекционное загрязнение может неизбежно составлять часть объема лекарственного средства и, следовательно, также проглатывается вместе с желаемыми активными компонентами смеси. Избыток неактивных веществ также препятствует методам, нацеленным на снижение биологической нагрузки, например, вследствие закупоривания мембранных фильтров или фильтрационных колонок и экранирования экстракта от ионизирующего излучения, полезного для уменьшения его потенциальной инфекционной нагрузки.

В клиническую разработку для лечения EPI поступил ряд отдельных чистых ферментов и в одном случае смесь из трех отдельных ферментов. Они представляют собой рекомбинантную липазу, активируемую солями желчных кислот (bile salt stimulated lipase; BSSL) (Exinalda™/Kiobrina®), рекомбинантную липазу человека, содержащуюся в женском молоке; Merispase®, рекомбинантную липазу желудка собак; рекомбинантную липазу MS1819; и липротамазу, смесь, состоящую из рекомбинантной бактериальной липазы, протеазы и амилазы, поперечно сшитых химическим путем, экстрагированных из микробных источников. До сих пор все эти экспериментальные терапии были неспособны показать уровень эффективности лечения, сравнимый с уровнем для коммерческих ферментных экстрактов из свиной поджелудочной железы, таких как Zenpep® или Ultresa®. Подобным образом, на заседании консультативного совета FDA 12 января 2011 г. проголосовали против одобрения липротамазы в связи с ее низкой эффективностью в отношении увеличения коэффициента абсорбции жиров (coefficient of fat absorption; CFA) по сравнению с коэффициентом, полученным ранее для экстракционных препаратов панкрелипазы.

Существует явная необходимость в препарате, который является более концентрированным и очищенным по сравнению с существующими препаратами, содержащими панкрелипазу, но все же сохраняющим свою эффективность для лечения EPI, поскольку это дало бы возможность получать лучшие, более удобные и потенциально безопасные препараты. В литературе имеется ряд публикаций, в которых описано применение панкрелипазы в качестве исходного материала для изолирования протеаз, липаз или амилаз; тем не менее, отсутствуют публикации о панкрелипазе типа, обнаруживаемого в PEP или подобных препаратах, которые очищают в целях создания усовершенствованного препарата для терапевтического применения. В каждом случае до изобретения, описанного в настоящем документе, цель состояла в очистке конкретного фермента или ферментной фракции от других или в удалении определенных компонентов без существенного увеличения общей активности фермента. Во всех случаях также отсутствовала направленность на получение препарата ВА панкреатина для применения в качестве терапевтического средства.

Предшествующий уровень техники, описывающий очистку белка, нацелен либо на экстракцию и изолирование простой фракции, богатой белком, примером которой является панкрелипаза, либо на разделение отдельных белков или отдельных классов белков, например, липаз или протеаз.

Например, в статье Hwang (Ind. Eng. Chem. Res. 2007, 46, 4289) описано отношение между растворимостью панкреатических ферментов и полярностью растворителя и сообщается о селективном осаждении липазы, протеазы и амилазы из панкреатических белков. Автором Hwang показано, что осаждение панкреатина усиливается при использовании растворителя со сниженной полярностью и что оно достигает максимума, когда растворитель имеет параметр растворимости Гильдебранда ниже 28 (МПа)^0,5; селективное осаждение амилазы и протеазы увеличивается при снижении полярности растворителя ниже 34 (МПа)^0,5, тогда как селективное осаждение липазы независимо от полярности растворителя, выделяется не более 65% липазы, присутствующей в смеси. Исходя из этих результатов, для получения ВА панкреатина нет причины, побуждающей очищать широкий ряд панкреатических ферментов вместе, и для специалистов в данной области техники нет причины, побуждающей сохранить смесь классов ферментов во время очистки. Тот факт, что не было ни одной попытки очистить панкрелипазу, которую использовали в терапевтических препаратах в течение целых 60 лет, является сильным показателем того, что преимущества этого действия не предполагали или не оценивали. Все попытки усовершенствовать препараты панкрелипазы сосредоточены на отдельных ферментах из не панкреатических источников, что дополнительно подчеркивает, что применение панкрелипазы в качестве источника для более чистых и/или более концентрированных ферментов для изготовления усовершенствованных препаратов ранее не оценивали.

Нет причин или соображений, побуждающих к многократной очистке панкрелипазы, используемой в настоящее время в областях применения в фармацевтике и при очистке, для получения препарата, имеющего по существу подобный качественный и количественный профиль ферментативной активности. Действительно, современные препараты адекватно выполняют свои роли и как таковые остались по существу неизмененными на протяжении более 60 лет, и, как оказалось, описания значительно усовершенствованных препаратов или соответствующих способов получения, описанных в настоящем документе, отсутствуют. Все эти препараты, содержащие чистые ферменты для лечения EPI, основаны на отдельных ферментах или в одном случае на смеси трех чистых и химически модифицированных отдельных ферментов, полученных с помощью рекомбинантной технологии или из микробных источников. Не было ни одной попытки очистить из грубых экстрактов поджелудочной железы смесь, содержащую протеазу, липазу и амилазу, которую применяют для лечения EPI, очистки и переваривания ткани. Также не было побудительного мотива или сообщений о ферментах из панкреатического источника, очищаемых индивидуально и впоследствии снова объединенных; причем, такой подход противоположен цели получения изолированного фермента или класса ферментов.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение направлено на ферменты ВА панкреатина и их высокоэффективные фармацевтические композиции или дозированные формы. Изобретение также направлено на способ получения ВА панкреатина с высоким выходом и способы применения такого препарата.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение направлено на препарат (ВА (высокоактивный) панкреатин), содержащий основные классы ферментов, который имеет эффективную и значимо высокую терапевтическую активность, более конкретно также имеющий сниженную биологическую нагрузку в виде излишних биологических компонентов и/или нежелательных потенциально инфекционных компонентов. Изобретение также направлено на способ получения ВА панкреатина, более конкретно с очень высоким выходом. ВА панкреатин также дает возможность получить препарат в виде меньших и более удобных дозированных форм, в частности, дозированных форм, которые можно доставлять в виде отдельной пилюли, дозированных форм в виде мелких частиц для суспензии и дозированных форм, которые можно комбинировать с другими терапевтическими или полезными ингредиентами в отдельной единице дозирования. Эта инновация обладает особой ценностью для пациентов, страдающих EPI, таких как пациенты с муковисцидозом. Изобретение также полезно для получения препаратов, где возраст или состояние пациента может требовать альтернативных форм введения, отличающихся от капсулы, например, суспензии, частиц. Для данной группы пациентов большой ценностью обладала бы более концентрированная и, следовательно, более мелкая дозированная форма, единица или частица. Изобретение также дает возможность применения технологий, предназначенных для уменьшения или устранения излишних или нежелательных биологических составных частей, таких как микроорганизмы и какие-либо связанные с ними токсины, из соображений, изложенных выше.

Настоящее изобретение направлено на ферменты ВА панкреатина (ВА панкреатин) и его высокоэффективную фармацевтическую композицию. В конкретном воплощении изобретения ВА панкреатин имеет свиное происхождение. ВА панкреатин содержит липазу, протеазы, амилазу и имеет удельную липазную активность по меньшей мере приблизительно 120, или по меньшей мере приблизительно 150, или по меньшей мере приблизительно 200, или по меньшей мере приблизительно 400, или по меньшей мере приблизительно 500 МЕ/мг.

Термин "пищеварительный фермент", используемый в настоящем документе, означает фермент в пищеварительном тракте, расщепляющий компоненты пищи так, чтобы они могли поглощаться или абсорбироватья организмом. Неограничивающие примеры пищеварительных ферментов включают ферменты панкрелипазы (также называемые панкрелипазой или панкреатином), липазу, колипазу, трипсин, химотрипсин, химотрипсин В, панкреатопептидазу, карбоксипептидазу А, карбоксипептидазу В, гидролазу сложного эфира глицерина, фосфолипазу, гидролазу сложного эфира стерина, эластазу, кининогеназу, рибонуклеазу, дезоксирибонуклеазу, α-амилазу, папаин, химопапаин, глютеназу, бромелаин, фицин, β-амилазу, целлюлазу, β-галактозидазу, лактазу, сахаразу, изомальтазу и их смеси.

Термин "панкреатический фермент", используемый в настоящем документе, относится к любому из типов ферментов, присутствующих в панкреатическом секрете, такому как амилаза, липаза, протеаза, или к их смесям или к любому экстракту панкреатического происхождения, имеющему ферментативную активность, такому как панкреатин.

Термины "ферменты панкрелипазы" или "панкрелипаза" или "панкреатин" означают смесь нескольких типов ферментов, включающих ферменты амилазу, липазу и протеазу. Фермент панкрелипаза имеется в продаже, например от компаний Nordmark Arzneimittel GmbH или Scientific Protein Laboratories LLC.

Термин "активный фармацевтический ингредиент (АФИ)" используют в настоящем документе для обозначения "пищеварительных ферментов" или "ферментов панкрелипаз" или "панкреатина".

Термин "липаза" означает фермент, который катализирует гидролиз липидов до глицерина и простых жирных кислот. Примеры липаз, подходящих для настоящего изобретения, включают без ограничения липазу животных (например, свиную липазу), бактериальную липазу (например, липазу Pseudomonas и/или липазу Burkholderia), липазу грибов, липазу растений, рекомбинантную липазу (например, продуцируемую с помощью технологии рекомбинантных ДНК подходящей клеткой-хозяином, выбранной из любой из бактериальных, дрожжевых, грибных, растительных клеток, клеток насекомых или млекопитающих в культуре, или рекомбинантные липазы, которые включают аминокислотную последовательность, гомологичную или по существу идентичную встречающейся в природе последовательности, липазы, кодируемые нуклеиновой кислотой, гомологичной или по существу идентичной встречающейся в природе нуклеиновой кислоте, кодирующей липазу, и т.д.), синтетическую липазу, химически модифицированную липазу и их смеси. Термин "липиды" в широком смысле включает встречающиеся в природе молекулы, включающие жиры, воски, стерины, жирорастворимые витамины (такие как витамины A, D, Е и К), моноглицериды, диглицериды, триглицериды, фосфолипиды и т.д.).

Термин "амилаза" относится к ферментам гликозидгидролазам, которые расщепляют крахмал, например, α-амилазы, β-амилазы, γ-амилазы, кислые α-гликозидазы, амилазы слюны, такие как птиалин, и т.д. Амилазы, подходящие для применения в настоящем изобретении, включают без ограничения амилазы животных, бактериальные амилазы, грибные амилазы (например, амилазу Aspergillus, например, амилазу Aspergillus oryzae), амилазы растений, рекомбинантные амилазы (например, продуцируемые с помощью технологии рекомбинантных ДНК подходящей клеткой-хозяином, выбранной из любой из бактериальных, дрожжевых, грибных, растительных клеток-хозяев, клеток-хозяев насекомых или млекопитающих в культуре, или рекомбинантные амилазы, которые включают аминокислотную последовательность, гомологичную или по существу идентичную встречающейся в природе последовательности, амилазы, кодируемые нуклеиновой кислотой, гомологичной или по существу идентичной встречающейся в природе нуклеиновой кислоте, кодирующей амилазу, и т.д.), химически модифицированные амилазы и их смеси.

Термин "протеаза" в целом относится к ферментам (например, к протеиназам, пептидазам или протеолитическим ферментам), которые расщепляют пептидные связи между аминокислотами белков. Протеазы в целом идентифицируют по их протеолитическому типу, например, аспартатные протеазы, цистеиновые (тиольные) пептидазы, металлопептидазы, сериновые пептидазы, треониновые пептидазы, щелочные или полущелочные протеазы, нейтральные пептидазы и пептидазы неизвестного каталитического механизма. Неограничивающие примеры протеаз, подходящих для применения в настоящем изобретении, включают сериновые протеазы, треониновые протеазы, цистеиновые протеазы, аспартатные протеазы (например, плазмепсин), металлопротеазы и глутаматные протеазы. Кроме того, протеазы, подходящие для применения в настоящем изобретении, включают без ограничения протеазы животных, бактериальные протеазы, грибные протеазы (например, протеазу Aspergillus melleus), протеазы растений, рекомбинантные протеазы (например, продуцируемые с помощью технологии рекомбинантных ДНК подходящей клеткой-хозяином, выбранной из любой из бактериальных, дрожжевых, грибных, растительных клеток-хозяев, клеток-хозяев насекомых или млекопитающих в культуре, или рекомбинантные протеазы, которые включают аминокислотную последовательность, гомологичную или по существу идентичную встречающейся в природе последовательности, протеазы, кодируемые нуклеиновой кислотой, гомологичной или по существу идентичной встречающейся в природе нуклеиновой кислоте, кодирующей протеазу, и т.д.), химически модифицированные протеазы и их смеси.

Ферменты панкрелипазы композиции по настоящему изобретению могут включать одну или более липаз (то есть одну липазу, или две, или более липаз), одну или более амилаз (то есть одну амилазу, или две, или более амилаз), одну или более протеаз (то есть одну протеазу, или две, или более протеаз) и смеси этих ферментов в различных комбинациях и соотношениях.

Липазные активности в композициях, полезных для настоящего изобретения, могут составлять от приблизительно 650 до приблизительно 100000 ME (способ Фарм. США). Они могут составлять от приблизительно 675 до приблизительно 825 ME, от приблизительно 2500 до приблизительно 2800 ME, от приблизительно 2700 до приблизительно 3300 ME, от приблизительно 4500 до приблизительно 5500 ME, от приблизительно 8000 до приблизительно 11000 ME, от приблизительно 13500 до приблизительно 16500 ME и от приблизительно 18000 до приблизительно 22000 ME, от приблизительно 22500 до приблизительно 27500 ME, от приблизительно 36000 до приблизительно 44000 ME и все диапазоны и поддиапазоны между ними.

Композиции по изобретению предпочтительно содержат по меньшей мере приблизительно 650 ME (способ Фарм. США), по меньшей мере приблизительно 9000, еще более предпочтительно они содержат приблизительно 20000, приблизительно 40000, приблизительно 60000, приблизительно 80000 или приблизительно 100000 единиц липазы по Фарм. США на лекарственную форму.

Композиция ВА панкреатина согласно настоящему изобретению может находиться в форме порошка или может находиться в уплотненной форме, например, таблетки, либо может содержать множество покрытых и/или непокрытых частиц. Частицы могут содержать сердцевину, покрытую по меньшей мере одним кишечнорастворимым покрытием, где такое покрытие содержит кишечнорастворимый полимер. Вышеописанная композиция, кроме покрытых частиц, может также содержать непокрытые частицы панкрелипазы. В частности, частицы представляют собой минитаблетки, микротаблетки, микрочастицы, микросферы, микрокапсулы, микропеллеты. Частицы могут иметь диаметр вплоть до приблизительно 5 мм. Они могут иметь любой подходящий размер или форму частиц. Например, частицы могут иметь диапазон размера частицы приблизительно 25-5000 мкм, например, они могут находиться в форме "минитаблеток", которые имеют номинальный диаметр частицы в диапазоне приблизительно 2-5 мм, либо они могут представлять собой "микротаблетки", которые имеют номинальные диаметры частицы менее чем приблизительно 2 мм, например, приблизительно 1-2 мм. Частицы могут иметь средний размер частицы менее чем приблизительно 800 мкм, предпочтительно менее 500 мкм, более предпочтительно менее 200 мкм. Частицы могут иметь объемный диаметр (d(v,0.1)) (определяемый как диаметр, где 10% объемного распределения находится ниже этого значения, и 90% находится выше этого значения) не менее 400 мкм и объемный диаметр d(v,0.9) (определяемый как диаметр, где 90% объемного распределения находится ниже этого значения, и 10% находится выше этого значения) не более 800 мкм.

В воплощениях, где ядра панкрелипазы окружены кишечнорастворимым покрытием, это покрытие действует в качестве барьера, защищающего лекарственное средство от кислотной среды желудка и по существу предотвращающего высвобождение лекарственного средства, прежде чем оно достигнет тонкого кишечника. Для обеспечения желаемого типа контроля над высвобождением лекарственного средства или терапевтическими эффектами можно использовать подходящие комбинации композиций кишечнорастворимого покрытия с другими композициями покрытия. Кишечнорастворимое покрытие включает по меньшей мере один кишечнорастворимый полимер и дополнительные эксципиенты. Выражение "кишечнорастворимый полимер" означает полимер, который защищает пищеварительные ферменты от содержимого желудка, например, полимер, который стабилен при кислом рН, но может быстро расщепляться при более высоком рН, или полимер, скорость гидратации или эрозии которого является достаточно медленной, чтобы гарантировать, что контакт содержимого желудка с пищеварительными ферментами относительно мал при его нахождении в желудке в отличие от остального желудочно-кишечного тракта.

Неограничивающими примерами кишечнорастворимых полимеров являются ацетофталат целлюлозы, фталат гидроксипропилметилцеллюлозы, ацетосукцинат гидроксипропилметилцеллюлозы, поливинилацетофталат, сополимеры метакриловой кислоты, сложные эфиры метилметакрилата, сополимеры метилметакрилата и сополимеры метакриловой кислоты/метилметакрилата, сополимер метакриловой кислоты и этилакрилата (1:1), шеллак и этилцеллюлоза. Эти полимеры имеются в продаже под различными торговыми названиями, такими как: Целлацефат (ацетофталат целлюлозы), Eudragit® L100, S100, L30D, FS30D, L100-55, L30D55 (сополимеры метакриловой кислоты), Aquateric® (ацетофталат целлюлозы), Aqoal® (ацетосукцинат гидроксипропилметилцеллюлозы) и НР55® (фталат гидроксипропилметилцеллюлозы). Кишечнорастворимое покрытие может дополнительно содержать другие эксципиенты, такие как тальк. Предпочтительно кишечнорастворимое покрытие содержит 10-20 масс. % по меньшей мере одного кишечнорастворимого полимера, где каждое указанное значение в масс. % основано на общей массе покрытых частиц. Покрытие может дополнительно содержать липофильный агент, такой как С6-С30 липофильная молекула низкой молекулярной массы, выбранная из алифатических карбоновых кислот и спиртов, предпочтительно С14-С18 карбоновая кислота или спирт, например, стеариновая кислота, миристиновая кислота, миристиновый спирт или стеариловый спирт. Другими необязательными ингредиентами покрытия являются пластификатор, вещества, препятствующие прилипанию (такие как тальк, стеарат магния, коллоидный диоксид кремния и их комбинации; кроме того, необязательно этилцеллюлоза низкой вязкости). Неограничивающие примеры подходящих пластификаторов включают триацетин, трибутилцитрат, триэтилцитрат, ацетилтри-н-бутилцитрат, диэтилфталат, дибутилсебацат, полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль, касторовое масло, ацетилированные моно- и диглицериды, цетиловый спирт и их смеси. Предпочтительным пластификатором является нефталатный пластификатор или их смеси.

Покрытые или непокрытые частицы ВА панкреатина могут быть получены в соответствии с известными способами. Например, ядра микропеллеты могут быть получены путем добавления подходящего связующего вещества к ВА панкреатину с последующей экструзией в присутствии подходящего растворителя, а затем сферонизацией. Контролируемую сферонизацию можно применять для образования частиц ВА панкреатина малого размера. Для получения гранул посредством покрытия инертной сердцевины можно использовать технологии покрытия, наносимого распылением, наслоения порошка и псевдоожиженного слоя. Способы коацервации могут быть также полезны для получения покрытых частиц панкрелипазы.

Для получения уплотненных таблеток, не содержащих эксципиенты, можно использовать прямое прессование. В некоторых случаях таблетка может проявлять резистентность к действию желудочного сока благодаря формированию in situ слоя гидрофобного покрытия при контакте с желудочными жидкостями.

Композиции, содержащие ВА панкреатин, могут находиться в любой форме, подходящей для дозирования терапевтического средства, содержащего пищеварительные ферменты, например, они могут находиться в форме порошка, пеллет, микросфер, капсул, саше, таблеток, жидких суспензий и жидких растворов.

В одном из воплощений настоящего изобретения могут быть получены дозированные формы, которые содержат ВА панкреатин, в частности, меньшие и/или отдельные дозированные формы, содержащие ВА панкреатин. Доступность ВА панкреатина дает возможность уменьшить размер капсулы и/или даже доставлять дозу в виде уменьшенного числа капсул на прием пищи по сравнению с обычной композицией препарата в виде капсулы 20000 единиц активности размера 0 Zenpep®, которую заполняют 250-275 мг АФИ. Взрослый пациент может принимать от 4 до 10 таких капсул на прием пищи. Сейчас для общей суточной дозы 200000 ед. Фарм. США липазы пациент принимает 10 капсул, и прием лекарственного препарата составляет приблизительно 2500-2750 мг. Очистка по меньшей мере в 2 раза, а тем более, более высокие степени очистки, является значимым усовершенствованием. Действительно, фармацевтическая дозированная форма ВА панкреатина, которая принимает форму капсулы, вводимой перорально, может содержать 100-110 мг АФИ (по сравнению с 250-275 мг) и, следовательно, для общей суточной дозы липазы 200000 ед. Фарм. США прием лекарственного препарата пациентом составляет приблизительно 1000-1100 мг (по сравнению с 2500-2750 мг). Кроме того, можно использовать капсулу ВА панкреатина размера 2 (по сравнению с размером 0), что, таким образом, также значительно уменьшает общее число вводимых капсул, или в качестве альтернативы сохранить размер 0 капсулы и правильно модулировать ее содержимое, таким образом, значительно уменьшая суточный прием. Лечение EPI представляет собой постоянное лечение, которое часто начинается в раннем детстве. Возможность получения препарата панкрелипазы так, чтобы она могла содержаться в меньших единицах дозирования и/или ее можно было принимать в виде уменьшенного числа единиц дозирования на прием пищи, составляет значительную пользу для пациентов.

Новые дозированные формы по настоящему изобретению могут также включать дозированные формы в виде мелких частиц. Препарат панкрелипазы с повышенной эффективностью на единицу объема позволил бы преодолеть значительные проблемы, касающиеся уменьшения размера гранул. Большинство имеющихся в продаже дозированных форм панкрелипазы представляет собой капсулы, которые заполняют гранулами панкрелипазы, покрытыми кишечнорастворимым полимером. Покрытие наносят в связи с тем, что панкреатическая липаза необратимо инактивируется в кислой среде. Капсулы можно открывать и высыпать гранулы на определенные пищевые продукты, и это предоставляет важную возможность для пациентов младшего возраста или пациентов, имеющих трудности при глотании, или для преодоления большого количества принимаемых пациентом единиц дозирования препарата. Тем не менее, эта возможность не распространяется на нужды всех пациентов, поскольку гранулы имеют приемлемый диаметр, который может составлять вплоть до 2 мм. Это означает, что эти гранулы невозможно легко суспендировать в жидкостях для младенцев или для пациентов, которым требуется питание через зонд. Попытки уменьшить размеры гранул приводят в результате к большим увеличениям общей площади поверхности и, следовательно, для эффективного покрытия увеличенной площади поверхности частиц необходимо значительно большее количество кишечнорастворимого полимера. Это значительно увеличивает объем дозированной формы и количество проглатываемого полимера до той точки, где объем дозированной формы дополнительно увеличивает количество принимаемых пациентом единиц дозирования препарата, и уровни эксципиентов покрытия могут превышать установленные пределы, налагаемые на их ежесуточный прием.

Доступность ВА панкреатина со значительно уменьшенным объемом не только дает возможность содержания всей дозы в одной единице дозирования или в уменьшенном числе единиц дозирования, но также обеспечивает комбинирование панкрелипазы с другими соединениями. Например, буферный агент, нейтрализующий кислоту, такой как бикарбонат натрия, и ВА панкреатин можно комбинировать в одной единице дозирования, при этом такую комбинацию панкреатических ферментов и агента, который повышает рН желудка, было бы невозможно рассматривать при использовании имеющейся в настоящее время панкрелипазы, поскольку это резко увеличило бы уже слишком большое количество принимаемых пациентом единиц дозирования препаратов, поскольку потребовались бы дополнительные капсулы/таблетки и/или эти капсулы/таблетки имели бы избыточный размер.

ВА панкреатин также обеспечивает возможность обеспечения диспергируемой дозированной формы без кишечнорастворимого покрытия, поскольку буфер предотвратил бы инактивацию липазного компонента панкреатина кислотой. Кроме того, добавление бикарбоната может также обеспечить терапевтическую пользу, поскольку секреция бикарбоната, как правило, снижена у пациентов с EPI. Эту новую дозированную форму можно готовить для быстрого или отсроченного высвобождения и диспергировать в жидкой среде. Данное последнее свойство обеспечивает значительное преимущество для пациентов, которым требуется жидкая пища, поскольку компоненты можно было бы легко диспергировать в пище или в другой удобной среде. Эти комбинации можно доставлять в ряде традиционных форм представления, таких как капсулы, таблетки, саше, гранулы и жидкости. Как упомянуто выше, необходимость в покрытии дозированных форм панкрелипазы кишечнорастворимым полимером является следствием нестабильности фермента липазы в кислой среде; тем не менее, продемонстрировано, что при повышении рН желудка посредством применения ингибиторов протонной помпы, липаза остается активной предположительно в связи с тем, что она не подвергается воздействию уровней рН, достаточно низких, чтобы инактивировать липазу. Данный подход не является ни удобным, ни безусловно желательным с медицинской точки зрения, поскольку он увеличивает количество принимаемых пациентом единиц дозирования препаратов и использует дополнительную постоянную лекарственную терапию, чтобы преодолеть недостатки другой. рН желудка можно временно нейтрализовать простыми средствами, нейтрализующими кислоту, такими как бикарбонат натрия, и для которых показана эффективность при защите лекарственных средств, неустойчивых к кислоте, такими как ингибитор протонной помпы (ИПП) омепразол, который является компонентом лекарственного средства Zegerid®. Уровень бикарбоната натрия в этом лекарственном средстве составляет 1,1 г, и уровень омепразола составляет либо 20 мг, либо 40 мг, и эти компоненты содержатся в капсуле с твердой оболочкой.

В настоящем изобретении также раскрыты отдельные дозированные формы, содержащие комбинацию ВА панкреатина и по меньшей мере одного другого активного соединения, такого как ингибиторы протонной помпы, представляющие собой антагонисты рецептора Н₂, или соли желчных кислот.

В настоящем изобретении получено усовершенствование препарата. Действительно, препарат ВА панкреатина приводит в результате к снижению биологической нагрузки просто в результате уменьшения количества вещества, несущего данную биологическую нагрузку. Кроме того, однако, методики, применяемые для способа получения, также способны снизить биологическую нагрузку и в результате получить значительно менее обремененный препарат. Кроме того, удаление больших количеств неактивного материала из препарата дает возможность использовать методы стерилизации, которые используют для применения инъекционных биопрепаратов, например, фильтрование, облучение ультрафиолетовым (УФ) светом. Это, опять же, представляет значительное и неожиданное усовершенствование характеристик препарата.

ВА панкреатин, присутствующий в композициях или пероральных дозированных формах по настоящему изобретению, получают в соответствии с описанным ниже способом.

Исходный материал представляет собой панкреатин. В настоящем изобретении авторы также могут ссылаться на него, используя термины "АФИ" или "исходный панкреатин", либо "исходные панкреатические ферменты", либо "нативный панкреатин", "исходная панкрелипаза" или "нативная панкрелипаза".

Удобным исходным материалом является панкрелипаза свиного происхождения, имеющаяся в продаже, например, от компании Nordmark Arzneimittel GmbH или Scientific Protein Laboratories LLC. Можно также использовать подобные экстракты из источников, представляющих собой быка или других млекопитающих. Предпочтительным исходным материалом является панкрелипаза свиного происхождения. Методики экстракции, используемые для получения грубого экстракта, можно суммировать как включающие следующие стадии: влажное измельчение поджелудочных желез свиней; добавление "активатора" панкрелипазы; обработка "неочищенной суспензии ферментов" холодным и горячим изопропанолом для осаждения белков и удаления липидов; стадии центрифугирования и фильтрования для удаления волокон и для уплотнения и концентрирования; вакуумная сушка "влажного кека"; удаление комков и измельчение "влажного кека" до насыпной плотности и размера частиц. Этот сухой препарат представляет собой панкреатин, используемый в современных препаратах.

ВА панкреатин по изобретению получают путем дополнительной обработки исходного панкреатина; это сохраняет элементы, которые являются ключевыми для эффективности препаратов на основе панкреатических ферментов, и удаляет элементы, которые являются несущественными.

Материал, полученный в результате способа по изобретению, представляет собой ВА панкреатин.

ВА панкреатин, имеющий удельную липазную активность по меньшей мере приблизительно 120 МЕ/мг, получают с использованием способа, включающего обработку панкреатина растворителем, где упомянутый растворитель имеет параметр растворимости Гильдебранда (ПР) от 28 до 45 (МПа)^0,5, и где упомянутый растворитель представляет собой органический растворитель, либо смесь органических растворителей, либо смесь по меньшей мере одного органического растворителя и водного растворителя, и способ выполняют при низкой температуре, предпочтительно при температуре ниже комнатной температуры.

В одном воплощении изобретения ВА панкреатин, имеющий удельную липазную активность по меньшей мере приблизительно 120 МЕ/мг, получают с использованием способа, включающего обработку панкреатина растворителем, где упомянутый растворитель имеет параметр растворимости Гильдебранда (ПР) от 28 до 38 (МПа)^0,5, и где упомянутый растворитель представляет собой органический растворитель, либо смесь органических растворителей, либо смесь по меньшей мере одного органического растворителя и водного растворителя, и способ выполняют при низкой температуре, предпочтительно при температуре ниже комнатной температуры.

В одном конкретном воплощении изобретения ВА панкреатин, имеющий удельную липазную активность по меньшей мере приблизительно 120 МЕ/мг, получают с использованием способа, включающего обработку панкреатина растворителем, где упомянутый растворитель имеет параметр растворимости Гильдебранда (ПР) от 28 до 34 (МПа)^0,5, и где упомянутый растворитель представляет собой органический растворитель, либо смесь органических растворителей, либо смесь по меньшей мере одного органического растворителя и водного растворителя, и способ выполняют при низкой температуре, предпочтительно при температуре ниже комнатной температуры.

В другом конкретном воплощении изобретения ВА панкреатин, имеющий удельную липазную активность по меньшей мере приблизительно 120 МЕ/мг, получают с использованием способа, включающего обработку панкреатина растворителем, где упомянутый растворитель имеет параметр растворимости Гильдебранда (ПР) от 34 до 38 (МПа)^0,5, и где упомянутый растворитель представляет собой органический растворитель, либо смесь органических растворителей, либо смесь по меньшей мере одного органического растворителя и водного растворителя, и способ выполняют при низкой температуре, предпочтительно при температуре ниже комнатной температуры.

В другом воплощении изобретения ВА панкреатин, имеющий удельную липазную активность по меньшей мере приблизительно 120 МЕ/мг, получают с использованием способа, включающего обработку панкреатина растворителем, где упомянутый растворитель имеет параметр растворимости Гильдебранда (ПР) от 34 до 45 (МПа)^0,5, и где упомянутый растворитель представляет собой органический растворитель, либо смесь органических растворителей, либо смесь по меньшей мере одного органического растворителя и водного растворителя, и способ выполняют при низкой температуре, предпочтительно при температуре ниже комнатной температуры.

В одном конкретном воплощении изобретения ВА панкреатин, имеющий удельную липазную активность по меньшей мере приблизительно 120 МЕ/мг, получают с использованием способа, включающего обработку панкреатина растворителем, где упомянутый растворитель имеет параметр растворимости Гильдебранда (ПР) от 38 до 45 (МПа)^0,5, и где упомянутый растворитель представляет собой органический растворитель, либо смесь органических растворителей, либо смесь по меньшей мере одного органического растворителя и водного растворителя, и способ выполняют при низкой температуре, предпочтительно при температуре ниже комнатной температуры.

ВА панкреатин может иметь удельную липазную активность по меньшей мере приблизительно 120, либо по меньшей мере приблизительно 150, либо по меньшей мере приблизительно 200, либо по меньшей мере приблизительно 400, либо по меньшей мере приблизительно 500 МЕ/мг.

Параметр растворимости Гильдебранда представляет собой числовое значение, который указывает на свойство относительной растворяющей способности конкретного растворителя. Его выводят из плотности энергии когезии растворителя, которую, в свою очередь, выводят из теплоты парообразования. Значения Гильдебранда доступны из литературных источников, например, из кн. Barton Handbook of Solubility Parameters, CRC Press, 1983. Растворитель согласно способу по изобретению представляет собой органический растворитель или смесь большего числа органических растворителей или смесь по меньшей мере одного органического растворителя и водного растворителя; смесь органического растворителя и водного растворителя может содержать один или более органических растворителей и один или более водных растворителей. Растворитель может иметь следующие значения растворимости: 45, 42, 40, 38, 36, 35, 34 и 28.

Органический растворитель может быть выбран из группы растворителей, содержащей н-пентан, н-гексан, н-гептан, диэтиловый эфир, циклогексан, тетрахлорид углерода, этилацетат, тетрагидрофуран, хлороформ, трихлорэтилен, ацетон, диметилформамид, н-пропанол, изопропанол, этанол, диметилсульфоксид, бутиловый спирт, метанол, ацетонитрил, диоксан и метиленхлорид. Предпочтительными органическими растворителями являются ацетон, изопропанол и этанол.

Водный растворитель может быть выбран из группы, состоящей из воды или буферных растворов. Предпочтительные буферы имеют рН 7 или рН 4, они могут представлять собой соответственно рН 7: 10 мМ фосфатный буфер и рН 4,0: 10 мМ ацетатный буфер.

В одном из воплощений изобретения растворитель представляет собой смесь, содержащую один или более органических растворителей и один водный растворитель, где упомянутая смесь имеет параметр растворимости Гильдебранда от 28 до 45 (МПа)^0,5. В воплощении изобретения растворитель представляет собой смесь, содержащую один или более органических растворителей и один водный растворитель, где упомянутая смесь имеет параметр растворимости Гильдебранда от 28 до 38 (МПа)^0,5. В одном конкретном воплощении изобретения растворитель представляет собой смесь, содержащую один или более органических растворителей и один водный растворитель, где упомянутая смесь имеет параметр растворимости Гильдебранда от 28 до 34 (МПа)^0,5. В одном конкретном воплощении изобретения растворитель представляет собой смесь, содержащую один или более органических растворителей и один водный растворитель, где упомянутая смесь имеет параметр растворимости Гильдебранда от 34 до 38 (МПа)^0,5. В другом воплощении изобретения растворитель представляет собой смесь, содержащую один или более органических растворителей и один водный растворитель, где упомянутая смесь имеет параметр растворимости Гильдебранда от 34 до 45 (МПа)^0,5. В одном конкретном воплощении изобретения растворитель представляет собой смесь, содержащую один или более органических растворителей и один водный растворитель, где упомянутая смесь имеет параметр растворимости Гильдебранда от 38 до 45 (МПа)^0,5. ПР смеси растворителей вычисляют, используя параметры растворителей Гильдебранда.

В одном воплощении изобретения растворитель имеет ПР 38 (МПа)^0,5 и представляет собой смесь органического растворителя с водным растворителем. Несколькими примерами такого бинарного растворителя, имеющего ПР 38, являются:

ацетон-буфер: волюметрическое отношение ацетона к буферу с pH 7 составляет 35:65; волюметрическое отношение ацетона к буферу с pH 4,0 составляет 35:65; где ПР (ацетон) равен 20,2, ПР (буфер) равен 47,9;

этанол-буфер: волюметрическое отношение этанола к буферу с pH 7 составляет 45:55; волюметрическое отношение этанола к буферу с pH 4,0 составляет 45:55; где ПР (этанол) равен 26,0, ПР (буфер) равен 47,9.

В другом воплощении изобретения бинарный растворитель с ПР=34 (МПа)^0,5 представляет собой ацетон-буфер: волюметрическое отношение ацетона к буферу с pH 7 составляет 50:50; где ПР (ацетон) равен 20,2, ПР (буфер) равен 47,9.

В еще одном другом воплощении изобретения бинарный растворитель с ПР равным 35 (МПа)^0,5 представляет собой ацетон-буфер: волюметрическое отношение ацетона к буферу с pH 7 составляет 45:55; где ПР (ацетон) равен 20,2, ПР (буфер) равен 47,9.

В одном воплощении настоящего изобретения (одностадийный способ) обработка панкреатина растворителем, имеющим ПР 28-45 (МПа)^0,5, включает следующие стадии: а1) суспендирование панкреатина в растворителе при перемешивании; а2) отделение нерастворимой части (осадка) от растворимой части (супернатанта) смеси со стадии а2; а3) высушивание нерастворимой части, полученной на стадии а1; и где стадии а1-а3 выполняют при температуре ниже комнатной температуры. Подходящая температура для выполнения способа составляет 4°C.

В одном воплощении настоящего изобретения (одностадийный способ) обработка панкреатина растворителем, имеющим ПР 34-38 (МПа)^0,5 включает следующие стадии: а1) суспендирование панкреатина в растворителе при перемешивании; а2) отделение нерастворимой части (осадка) от растворимой части (супернатанта) смеси со стадии а2; a3) высушивание нерастворимой части, полученной на стадии а1; и где стадии а1-a3 выполняют при температуре ниже комнатной температуры. Подходящая температура для выполнения способа составляет 4°C.

Стадию а1 предпочтительно выполняют в течение приблизительно 60 минут; предпочтительная температура составляет 4°C. Стадию отделения (стадию а2) можно выполнять различными способами, такими как центрифугирование, седиментация или фильтрование. Стадию высушивания (a3) можно выполнять, например, в сушилке высокой эффективности, вакуумном насосе или сушилке для сублимационной сушки; можно также использовать другие способы. Концентрация панкреатина в растворителе на стадии а1 предпочтительно представляет собой количество от 0,050 до 0,3 мг/мл, предпочтительно от 0,065 до 0,1 мг/мл, предпочтительно оно составляет 0,065 или 0,1 мг/мл.

В одном конкретном воплощении одностадийного способа растворитель имеет ПР 38 (МПа)^0,5 и представляет собой смесь ацетона и буфера с pH 7 (такого как 10 мМ фосфат), и панкреатин на стадии а1 находится в концентрации 10 г/мл.

В другом воплощении настоящего изобретения (двухстадийный способ), где растворитель представляет собой смесь органического растворителя и водного растворителя, где панкреатин сначала суспендируют в водном растворителе, а затем к этому добавляют водный растворитель. В данном воплощении изобретения стадия а1 включает следующие стадии: а1.1 (суспензия) суспендирование панкреатина в водном растворителе при перемешивании; а1.2 (осаждение) добавление к суспензии со стадии а1 органического растворителя или их смеси. Смесь со стадии а1.1 держат при статическом состоянии. Продолжительность времени стадии а1.1 составляет от приблизительно 10 до приблизительно 30 минут в зависимости от масштаба и оборудования; продолжительность времени стадии а1.2 составляет приблизительно 30 минут.

Панкреатин в водном растворителе предпочтительно находится в количестве от 0,050 до 0,3 мг/мл, предпочтительно от 0,1 до 0,3 мг/мл, предпочтительно 0,1 или 0,3 мг/мл, органический растворитель предпочтительно представляет собой либо этанол, либо ацетон, и водный растворитель предпочтительно представляет собой буфер с pH 4,0 (такой как 10 мМ ацетатный буфер) или буфер с pH 7 (такой как 10 мМ фосфат).

В одном конкретном воплощении одностадийного способа растворитель имеет ПР 38 (МПа)^0,5 и представляет собой смесь ацетона и буфера с pH 7 (такого как 10 мМ фосфат), и панкреатин на стадии а1 находится в концентрации 0,1 мг/мл.

В другом конкретном воплощении одностадийного способа растворитель имеет ПР 38 (МПа)^0,5 и представляет собой смесь ацетона и буфера с pH 4 (такого как 10 мМ ацетатный буфер), и панкреатин на стадии а1 находится в концентрации 0,1 мг/мл.

В еще одном другом воплощении изобретения (многостадийный способ), когда растворитель представляет собой смесь органического растворителя и водного растворителя, панкрелипазу сначала диспергируют в водном растворителе, а затем к растворимой части водной дисперсии добавляют органический растворитель. В данном воплощении изобретения стадия а1 способа включает следующие стадии: а 1.1) (суспензия) суспендирование панкреатина в водном растворителе при перемешивании; а1.2) (отделение) отделение растворимой части (супернатанта) со стадии а1.1 от нерастворимой части (осадка); а1.3) (осаждение) добавление к растворимой части со стадии а1.2 органического растворителя или их смеси.

Стадию а1.1 предпочтительно выполняют в течение приблизительно 30 минут; смесь со стадии а1.3 выдерживают в статическом состоянии в течение приблизительно 15 минут; предпочтительная температура для этих стадий составляет 4°C.

Панкреатин в водном растворителе предпочтительно находится в количестве от 0,05 до 0,3 мг/мл, предпочтительно от 0,1 до 0,3 мг/мл, предпочтительно 0,1 или 0,3 мг/мл. ПР используемого растворителя предпочтительно составляет 38. Органический растворитель предпочтительно представляет собой либо этанол, либо ацетон, и водный растворитель предпочтительно представляет собой буфер с pH 4,0 (такой как 10 мМ ацетатный буфер) или буфер с pH 7 (такой как 10 мМ фосфат).

В одном конкретном воплощении многостадийного способа растворитель имеет ПР 38 (МПа)^0,5 и представляет собой смесь ацетона и буфера pH 4,0 (такого как 10 мМ ацетатный буфер), и панкреатин на стадии а1 находится в концентрации 0,3 мг/мл.

В еще одном другом воплощении многостадийного способа растворитель имеет ПР 38 (МПа)^0,5 и представляет собой смесь этанола и буфера с pH 4,0 (такой как 10 мМ ацетатный буфер), и панкреатин на стадии а1 находится в концентрации 0,3 мг/мл.

В еще одном другом воплощении многостадийного способа растворитель имеет ПР 38 (МПа)^0,5 и представляет собой смесь этанола и буфера с pH 4,0 (такой как 10 мМ ацетатный буфер), и панкреатин на стадии а1 находится в концентрации 0,1 мг/мл.

В еще одном другом воплощении многостадийного способа растворитель имеет ПР 38 (МПа)^0,5 и представляет собой смесь ацетона и буфера с pH 7 (такого как 10 мМ фосфат), и панкреатин на стадии а1 находится в концентрации 0,3 мг/мл.

Стадии отделения (стадии а2 и а1.2) можно выполнять различными способами, такими как центрифугирование или фильтрование. Все стадии способа получения ВА панкреатина выполняют при контроле температуры, которая всегда ниже комнатной температуры, предпочтительно составляет приблизительно 4°C; влажность можно также контролировать.

Способ по изобретению может также включать стерилизацию и инактивацию вирусов или снижение вирусной нагрузки ВА панкреатина, которую можно выполнять, например, путем фильтрования, нагревания, облучения (ультрафиолетовым излучением, рентгеновским излучением, бета-излучением и гамма-излучением), обработки высоким давлением и/или алкилирования нуклеиновых кислот, например, использования бета-пропиолактона (BPL). Нагревание при температуре, например, выше 85°C, предпочтительно от 85°C до 100°C в течение подходящего периода времени, например, выше 18 часов и предпочтительно от 18 до 48 часов, еще более предпочтительно от 18 до 30 часов, также эффективно при снижении вирусных загрязнений. Нагревание при более низкой температуре (84°C, предпочтительно 80°C) можно выполнять на твердом ВА панкреатине с остаточной влажностью 0,5 масс. % или менее.

Из вышеописанного ясно, что подход, раскрытый в настоящем изобретении, имеет много преимуществ. Он сохраняет природный спектр и природный источник пищеварительных ферментов, которые присутствуют в пищеварительных соках, и сохраняет пищеварительные свойства исходного материала. Он удаляет те материалы, не требующиеся для пищеварения, которые остаются в результате способа грубой экстракции, что, таким образом, уменьшает объем АФИ. Он обеспечивает снижение или устранение бактериального или вирусного загрязнений. Он дает возможность контроля отношений смешанных классов ферментов друг к другу. Кроме того, он дает возможность получения препарата АФИ в ряде дозированных форм высокой эффективности.

Изобретение, описанное в настоящем документе, приводит в результате к лучшему препарату по сравнению с современными препаратами и представляет значительный прогресс в терапии в связи с вышеизложенными соображениями.

Экспериментальный раздел

Материалы

Панкрелипаза (АФИ, исходная панкрелипаза или панкреатин, нативная панкрелипаза или панкреатин) предложена компанией Nordmark. Ее экстрагируют из поджелудочной железы свиней, и в характерном случае она содержит приблизительно 30% белков (количественно определяют методом Бредфорда) и имеет липазную активность (Л) 94,4 МЕ/мг, протеазную активность (П) 253,2 МЕ/мг, амилазную активность (А) 420,3 МЕ/мг; отношение П/Л составляет 2,7, отношение А/Л составляет 4,5; содержание воды составляет 0,3. Данный материал анализируют с помощью одно- и двумерного электрофореза с последующей характеристикой времяпролетной масс-спектрометрией с ионизацией лазерной десорбцией с использованием матрицы (MALDI-TOF), чтобы идентифицировать составные части панкрелипазы (Mario Negri Institute, Милан, Италия). Двумерный электрофорез этого экстракта показывает наличие по меньшей мере 50 зон белка/пептида во фракции, которая очевидно легко растворима в воде, и 30 зон белка/пептида во фракции, которая очевидно хуже растворима в воде. Определения растворимости усложняются тем фактом, что активные ферменты могут адсорбироваться на нерастворимых в воде компонентах панкрелипазы или иначе улавливаться ими. Растворимость также зависит от рН. Зоны, соответствующие индивидуальным белкам в смеси, и изображения гелей, полученные с использованием фракций большей растворимости и меньшей растворимости, анализируют после вырезания и расщепления основных пятен бычьим трипсином и анализируют времяпролетной масс-спектрометрией с ионизацией лазерной десорбцией с использованием матрицы (MALDI-TOF) и зимографией. Фингерпринтинги масс пептидов сравнивают с таковыми из библиотечных эталонов и идентифицируют амилазу, липазу, колипазу, карбоксипептидазу А1 и В, эластазу 2А и 1, химотрипсин, трипсин и фосфолипазу А2. Экстракт и является относительно неочищенным, и содержит многие посторонние белки в дополнение к ряду активных молекул ферментов.

Кишечная формула: Peptamen® Junior 1.0 Cal (Nestle, упаковка 250 мл): содержание жира: 3,8 г/100 мл, содержание белка: 3 г/100 мл, содержание жира и углеводов: 20,4 г/мл.

Методы

Липолитическая активность. Измерение выполняют способом, основанным на фармакопейном методике анализа липазы, описанном в монографии Фарм. США ферментов панкрелипазы, который основан на титровании с помощью рН-статного способа свободных жирных кислот, образовавшихся в результате гидролиза этерифицированных жирных кислот в используемом субстрате (оливковом масле). Он основан на следующем принципе: липаза катализирует гидролиз триглицеридов, который приводит к образованию свободных жирных кислот (СЖК). Титрование образующихся СЖК по времени обеспечивает определение ферментативной липазной активности, которая может быть выражена в единицах: ME равно 1 мкмоль образовавшихся СЖК в минуту. Реакция происходит путем поддержания стабильного значения pH посредством экспериментальной системы, которая обеспечивает добавление NaOH (титрующего раствора), когда значение pH изменяется по сравнению с фиксированным значением (рН-статный способ). Количество добавленного титрующего раствора по времени соответствует количеству СЖК, образующихся под действием липазы на триглицериды. На основании наклона кривой {добавленный титрующий раствор равен f (объем (мл)/время (минуты))} получают ферментативную липазную активность.

Липазная активность (ЛА), указанная в настоящем документе ниже, всегда выражена в ME Фарм. США.

Удельная липазная активность (ЛУА), указанная в настоящем документе ниже, всегда выражена в USP МЕ/мг.

Протеолитическая и амилолитическая активность. Измерение выполняют в соответствии с фармакопейным способом, описанным в монографии Фарм. США ферментов панкрелипазы. Удельная ферментативная активность (УА), указанная в настоящем документе ниже, всегда выражена в USP МЕ/мг.

Содержание воды измеряют с помощью термогравиметрического анализа (ТГА) при 80°C в течение 4 часов (образцы 18, 19 и 20) или способом Карла Фишера (образцы 26, 27 и 28).

Триглицериды экстрагируют смесью гексан:изопропанол (3:2), используя холестерилпальмитат в качестве внутреннего стандарта, и анализируют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ); пики идентифицируют путем сравнения всех значений времени удерживания со стандартным раствором триолеина.

Анализ белка. Общее содержание белка количественно определяют методом Бредфорда.

Анализ углеводов: 1) Короткоцепочечные сахара анализируют с помощью ВЭЖХ с использованием ксилита в качестве внутреннего стандарта; пики идентифицируют путем сравнения всех значений времени удерживания со стандартами сахаров, то есть мальтозы. 2) Мальтодекстрины экстрагируют в присутствии раствора Карреза I и раствора Карреза II и анализируют с помощью ВЭЖХ; пики идентифицируют путем сравнения всех значений времени удерживания со стандартами мальтодекстринов, то есть моногидрата мальтозы, мальтотриозы, мальтотетраозы, мальтопентаозы, мальтогексаозы и мальтогептаозы.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Получение ВА панкреатина; 0,1 г/мл; в несколько стадий: суспендирование, отделение, осаждение; (ПР равно 38: соотношение ацетон : водный растворитель равно 35:65; соотношение этанол : водный растворитель равно 45:55)

Стадия а1.1 - Суспендирование: исходную панкрелипазу диспергируют в водном растворителе в концентрации 0,1 г/мл при 4°C и выдерживают при перемешивании в течение 30 минут. Эксперименты проводят в лабораторном масштабе с использованием либо 650 мг (когда органический растворитель представляет собой ацетон), либо 550 мг (когда органический растворитель представляет собой этанол) исходной панкрелипазы. Для суспензии панкрелипазы тестируют четыре различных водных растворителя: 1) буфер с pH 4,0 (10 мМ ацетатный буфер); 2) буфер с pH 7,0 (10 мМ фосфат); 3) деионизированную воду (ДВ); 4) буфер с pH 4,0 (10 мМ ацетат) с NaCl (0,5 М).

Стадия а1.2 - Отделение: суспензию со стадии а1.1 центрифугируют (10 минут, 4°C, приблизительно 11000 g), и супернатант (СН) отделяют от осадка.

Стадия а1.3 - Осаждение: органический растворитель добавляют к супернатанту со стадии а1.2, и смесь выдерживают при 4°C в течение 15 минут в статическом состоянии. Органический растворитель представляет собой либо ацетон, либо этанол. Ацетон добавляют в количестве 35 частей (объем) на каждые 65 частей (объем) водного растворителя; этанол добавляют в количестве 45 частей (объем) на каждые 55 частей (объем) водного растворителя.

Стадия а2 - Отделение: смесь центрифугируют (10 минут, 4°C, приблизительно 11000 g) для отделения супернатанта от осадка, которая содержит ферменты панкрелипазы. Осадок ресуспендируют в водном растворителе, используемом на стадии а1.1 (ЛА в осадках после ресуспендирования, осаждения).

Материалы различных стадий анализируют. Измеряют количество панкрелипазы, выраженное в виде липазной активности (ЛА):

- в суспензии со стадии а1 (ЛА в суспензии; ЛА-С а1.1);

- в супернатанте, полученном на стадии а2 (ЛА в СН, осаждение, ЛА-СН);

- в осадках, полученных на стадии а2, а затем ресуспендированных в исходной среде (ЛА в осадках, осаждение, ЛА-О).

Результаты представлены в таблицах 1, 2, 3 и 4.

В таблице 1 показано, что осаждение панкрелипазы (стадия а1.3) дает возможность для хорошего восстановления липазной активности в осадочной части (осадке), которая находится в диапазоне от приблизительно 67 до приблизительно 77%. Выход представляет собой % общей липазной активности со стадии а2 (осадок и супернатант) по отношению к липазной активности исходной суспендированной панкрелипазы, выраженной в виде липазной активности в суспензии со стадии а1.1 (С а1.1): (ЛА-СН+ЛА-O)/(ЛА-С а1.1).

Выход способа находится в диапазоне от приблизительно 37 до приблизительно 56%. Выход % представляет собой общую липазная активность в осадке и в супернатанте со стадии а2 по отношению к теоретической липазной активности панкрелипазы, используемой на стадии а1.1, которую вычисляют путем факторизации удельной активности необработанного сырьевого материала (то есть USP МЕ/мг, определенной в соответствии с нормативным способом Фармакопеи США) и его исходной массы.

Коэффициент обогащения (независимый от рН) определяют путем вычисления отношения между липазной активностью в осадке со стадии а2 и липазной активностью исходного панкреатина (которая составляет 94,4 МЕ/мг). При данном способе получают коэффициент обогащения вплоть до 2,5. Обогащение также подтверждено с помощью анализа профиля по ВЭЖХ.

Что касается других пищеварительных ферментов, содержание амилазы в конечном осадке (осадок со стадии а2) ниже, чем содержание амилазы в исходной панкрелипазе.

Пример 2. Получение ВА панкреатина; 0,3 г/мл; в несколько стадий: суспедирование, отделение, осаждение (ПР=38: ацетон водный растворитель =35:65; этанол : водный растворитель =45:55)

Стадия а1.1 - Суспендирование: панкрелипазу (АФИ) диспергируют в водном растворителе в концентрации 0,3 г/мл при 4°C и выдерживают при перемешивании в течение 30 минут. Эксперименты проводят в лабораторном масштабе с использованием либо 650 мг (когда органический растворитель представляет собой ацетон), либо 550 мг (когда органический растворитель представляет собой этанол) исходной панкрелипазы. Проводят два эксперимента, каждый в различном водном растворителе: 1) буфер с pH 4,0 (10 мМ ацетатный буфер); 2) буфер с pH 7,0 (10 мМ фосфат).

Стадия а1.2 - Отделение: суспензию со стадии а1 центрифугируют (10 минут, 4°C, приблизительно 11000 g), и супернатант (СН) отделяют от осадка.

Стадия а1.3 - Осаждение: органический растворитель добавляют к супернатанту со стадии а1.2, и смесь выдерживают при 4°C в течение 15 минут в статическом состоянии. Органический растворитель представляет собой либо ацетон, либо этанол. Ацетон добавляют в количестве 35 частей (объем) на каждые 65 частей (объем) водного растворителя; этанол добавляют в количестве 45 частей (объем) на каждые 55 частей (объем) водного растворителя.

Стадия а2 - Отделение: смесь центрифугируют (10 минут, 4°C, приблизительно 11000 g) для отделения супернатанта от осадка, который содержит ферменты панкрелипазы. Осадок ресуспендируют в исходном водном растворителе (ЛА в осадках после ресуспендирования, осаждения).

Стадия а3 - Высушивание: осадок со стадии а2 высушивают.

Материалы различных стадий анализируют. Количество панкрелипазы выражают в виде липазной активности (ЛА) и измеряют:

- в суспензии со стадии а1.1 (ЛА в суспензии; ЛА-С а1.1);

- в супернатанте, полученном на стадии а2 (ЛА в СН, осаждение, ЛА-СН);

- в осадках, полученных на стадии а2, а затем ресуспендированных в исходной водной среде (ЛА в осадках, осаждение, ЛА-О).

Результаты представлены в таблицах 4, 5 и 6.

В таблице 4 показано, что восстановление после осаждения является очень хорошим (73-92%).

Общий выход многостадийного способа, выполняемого при концентрации панкрелипазы 0,3 г/мл, находится в диапазоне от приблизительно 56 до приблизительно 64.

Коэффициент обогащения определяют путем вычисления отношения между липазной активностью в осадке со стадии а2 и липазной активностью исходного панкреатина со стадии а1.1 (которая составляет 94,4 МЕ/мг). Коэффициент обогащения находится в диапазоне от 1,9 до 3,0.

Пример 3. Получение ВА панкреатина; 0,1 г/мл; в две стадии: суспендирование, осаждение (ПР равно 38: соотношение ацетон : водный растворитель составляет 35:65; соотношение этанол : водный растворитель составляет 45:55, где ПР (ацетон) равно 20,2, ПР (этанол) равно 26,0, ПР (буфер) равно 47,9).

Стадия а1.1 - Суспендирование: панкрелипазу диспергируют в водном растворителе в концентрации 0,1 г/мл при 4°C и выдерживают при перемешивании в течение 30 минут. Эксперименты проводят в лабораторном масштабе с использованием либо 650 мг (когда органический растворитель представляет собой ацетон), либо 550 мг (когда органический растворитель представляет собой этанол) исходной панкрелипазы. Проводят два эксперимента, каждый в различном водном растворителе: 1) буфер с pH 4,0 (10 мМ ацетатный буфер); 2) pH 7,0; 10 мМ фосфатный буфер.

Стадия а1.2 - Осаждение: органический растворитель добавляют к суспензии со стадии а1.1, и эту смесь выдерживают при 4°C в течение 15 минут. Органический растворитель представляет собой либо ацетон, либо этанол. Ацетон добавляют в количестве 35 частей (объем) на каждые 65 частей (объем) водного растворителя. Этанол добавляют в количестве 45 частей (объем) на каждые 55 частей (объем) водного растворителя.

Стадия а2 - Отделение: смесь центрифугируют (10 минут, 4°C, приблизительно 11000 g) для отделения супернатанта от осадка, который содержит панкреатические ферменты. Осадок ресуспендируют в исходном водном растворителе (ЛА в осадках после ресуспендирования, осаждения).

Материалы различных стадий анализируют. Количество панкрелипазы, выраженное в виде липазной активности, измеряют на протяжении всего способа:

- в суспензии со стадии а1.1 (ЛУА в суспензии; ЛА-С а1.1);

- в супернатанте, полученном на стадии а2 (ЛА в СН, осаждение, ЛА-СН);

- в осадках, полученных на стадии а2, а затем ресуспендированных в исходной среде (ЛА в осадках, осаждение, ЛА-О).

Результаты представлены в таблицах 7, 8 и 9.

Восстановление после осаждения является высоким, при двухстадийном способе достигнуто почти полное восстановление.

Общий выход способа находится в диапазоне от 73,1 до 84,5, который является более высоким, чем полученный при многостадийном способе. Выход в % представляет собой общую липазная активность в осадке и в супернатанте со стадии а2 по отношению к теоретической липазной активности панкреатина, используемого на стадии а1.1, которую вычисляют путем факторизации удельной активности исходного материала (то есть 94,4 USP МЕ/мг, как определено в соответствии с нормативным способом Фарм. США) и его исходной массы.

Результаты показывают, что использование водного буфера при pH 7 и ацетона в двухстадийном способе обеспечивает интересующий выход (общий выход способа приблизительно 76%), и коэффициент обогащения находится в диапазоне от 2,1 до 4,2.

Пример 4. Получение ВА панкреатина; 0,1 г/мл; в две стадии: суспендирование, осаждение; масштабирование (ПР равно 38; соотношение ацетон : водный растворитель составляет 35:65)

Стадия а1.1 - Суспендирование: 6,5 г исходной панкрелипазы (61400 ед. липазы) диспергируют в 45 мл буферного раствора с pH 7,0 (10 мМ фосфатный буфер) при 4°C и перемешивают (Ultraturrax, 3 цикла) в течение 1 минуты на каждый цикл, мешалку промывают два раза 10 мл холодного буфера с целью выделения остаточной панкрелипазы.

Стадия а1.2 - Осаждение: 35 мл ацетона добавляют к суспензии со стадии а1.1, и смесь выдерживают при 4°C в течение 30 минут в статическом состоянии.

Стадия а2 - Отделение: смесь центрифугируют (15 минут, 4°C, приблизительно 2700 g) для отделения супернатанта от осадка, который содержит панкреатические ферменты.

Стадия а3 - Высушивание: осадок высушивают в соответствии с двумя различными протоколами; средняя масса высушенного осадка составляет 1,55 г, липазная активность (ЛА) составляет 365000 ME липазы, и удельная активность (ЛУА) составляет 235 USP МЕ/мг.

В таблице 10 приведены удельные липазной активности (Л), протеазы (П) и амилазы (А), измеренные для каждого материала, полученного с помощью двух протоколов. Липазная активность в пеллетах (измеряемую после их суспендирования в 1 мл буфера) также измеряют перед их обработкой высушиванием. Она составляет вплоть до 233,7 USP МЕ/мг.

Анализ показывает, что сам по себе процесс высушивания не влияет на ЛУА, и что различные протоколы приводят к материалам с одинаковыми ферментативными активностями. Коэффициент обогащения, вычисленный, как в предыдущих примерах, также всегда выше 2 и является постоянным для различных протоколов, он составляет: 2,5 (образец 18), 2,7 (образец 19); 2,3 (образец 10), среднее значение составляет 2,5. Липазная активность в 5 пеллетах, измеренная перед обработкой высушиванием, составляет вплоть до 233,7 USP МЕ/мг (образец 18).

Профили ВЭЖХ образцов, полученных при различных протоколах, сопоставимы. Релевантное количественное отличие от профиля ВЭЖХ исходного вещества не наблюдали.

Пример 5. Получение ВА панкреатина; 0,1 г/мл; в две стадии: суспендирование, осаждение; масштабирование (ПР равно 38: соотношение этанол : водный растворитель (рН 7) составляет 45:55, образец 21); (ПР равно 34: соотношение ацетон : водный растворитель (рН 7) составляет 50:50, образец 22); (ПР равно 35: соотношение ацетон : водный растворитель (рН 7) составляет 45:55, образец 23)

Способ получения Примера 4 в данном примере применили к другому количеству исходной панкрелипазы, другому объему буферного раствора и другому объему ацетона (Растворимость по Гильдебранду (ГР) составляет 34 или 35) или объему этанола (ГР равно 38). Протокол высушивания представляет собой 24 ч, 6-8°C, 0,2 мбар, все остальные параметры и условия являются такими же, как в примере 4.

Результаты представлены в таблицах 13 и 14.

Эти данные показывают, что сам по себе процесс высушивания не влияет на ЛУА, и что различные протоколы приводят к материалам с одинаковыми ферментативными активностями. Коэффициент обогащения, вычисленный, как в предыдущих примерах, составляет: 1,6 (образец 21), 1,3 (образец 22); 1,7 (образец 23).

В таблице 14 показаны ферментативные активности конечного очищенного материала, полученного с помощью примененного в данном примере масштабированного способа, и ферментативный выход.

Профили ВЭЖХ образцов, полученных при различных протоколах сублимационной сушки, сопоставимы. Релевантное количественное отличие от профиля ВЭЖХ исходного вещества не наблюдали.

Образцы 25 и 26, полученные с помощью другого протокола, показывают более низкую удельную ЛА и более высокую ПА и АА по сравнению с образцом 24, полученным с помощью протокола (ГР равно 38).

Пример 6. Получение ВА панкреатина; 0,065 и 0,1 г/мл; в одну стадию; лабораторный масштаб (ПР равно 38, соотношение ацетон : водный растворитель составляет 35:65)

Стадия а1 - Суспендирование - осаждение: 650 мг (образец 24) или 1000 мг (образец 25) нативной панкрелипазы диспергируют в 10 мл смеси 65:35 буфера (рН=7 10 мМ фосфат) и ацетона (65 объемов буфера и 35 объемов ацетона) при перемешивании в течение 30 минут при 4°C.

Стадия а2 - Отделение: смесь со стадии а1 центрифугируют (10 мин при 10000 g при 4°C) для отделения супернатанта от осадка, который содержит панкреатические ферменты.

Стадия а3 - Высушивание: осадки высушивают с помощью высокоэффективного насоса при 0,2 мбар.

Материал анализируют. Количество панкрелипазы, выраженное в виде липазной активности, измеряют на протяжении всего способа:

- в супернатанте, полученном на стадии а2 (ЛА в СН, отделение, ЛА-СН);

- в осадках, полученных на стадии а2, а затем ресуспендированных в исходной среде (ЛА в осадках, осаждение, ЛА-О);

- ЛА суспензии - стадия осаждения а1 (ЛА в суспензии; ЛА-СН) выражают в виде теоретического значения.

Результаты представлены в таблицах 15 и 16.

Одностадийный способ обеспечивает хороший выход и более высокий коэффициент обогащения, чем двухстадийный способ. Это представляет интерес для внедрения в промышленность, поскольку его осуществление является простым и непосредственным.

Пример 7. Получение ВА панкреатина; 0,1 г/мл; в одну стадию; пилотный масштаб (ПР равно 38 - соотношение ацетон : водный растворитель составляет 35:65)

Стадия а1 - Суспендирование - осаждение: 10 г нативной панкрелипазы диспергируют в 100 мл смеси растворителей буфера (рН 7, 10 мМ фосфат) и ацетона (65 объемов буфера и 35 объемов ацетона) при перемешивании в течение 60 минут при 4°C.

Стадия а2 - Отделение: смесь со стадии а1 центрифугируют (10 мин при 2700 g при 4°C) для отделения супернатанта от осадка, который содержит панкреатические ферменты.

Стадия а3 - Высушивание: осадки образца 26 наливают в чашки Петри, тогда как осадок образцов 28 и 29 выдерживают в центрифужных пробирках и непосредственно высушивают, используя высокоэффективный насос при 0,2 мбар.

Материал анализируют. Количество панкрелипазы, выраженное в виде липазной активности, измеряют на протяжении всего способа:

- в супернатанте, полученном на стадии а2 (ЛА в СН, отделение, ЛА-СН);

- в осадках, полученных на стадии а2, а затем ресуспендированных в исходной среде (ЛА в пеллетах, отделение, ЛА-О);

- ЛА суспензии - стадия осаждения а1 (ЛА в суспензии; ЛА-СН) выражают в виде теоретического значения.

Результаты представлены в таблицах 17 и 18.

Получили хорошую воспроизводимость в отношении липазной активности, протеазы и амилазы.

Получили очень высокий выход липазы, коэффициент обогащения также является высоким (выше 2): он составляет: 2,2 (образец 26), 2,4 (образец 27), 2,3 (образец 28).

Одностадийный способ обеспечивает хорошие выходы. Получено 4,2 г ВА панкреатина (42% исходной панкрелипазы), общее число единиц липазы составляет 940000 ME Фарм. США (99-100% исходной ЛА). Полученный ВА панкреатин имеет удельную активность 221 USP МЕ/мг.

Пример 8. Получение ВА панкреатина; 0,1 г/мл; несколько стадий: суспендирование, осаждение, отделение; сравнительный пример (ПР равно 38 - соотношение ацетон : вода составляет 35:65)

Стадия а1.1 - Суспендирование: панкрелипазу диспергируют в водном растворителе (дистиллированная вода в концентрации 0,045 мг/мл при 4°C (образец 29) в течение приблизительно 30 минут при перемешивании.

Стадия а1.2 - Осаждение: 80 мл смеси растворителей (соотношение ацетон : вода составляет 35:45) добавляют к 20 мл суспензии со стадии а1.1 (с получением ПР равно 38 (МПа)^0,5 в конечной смеси растворителей); смесь выдерживают при 25°C в течение 60 минут в статическом состоянии.

Стадия а2 - Отделение: смесь центрифугируют (10 мин при 3000 g при 25°C) для отделения супернатанта от осадка, который содержит панкреатические ферменты.

Материалы различных стадий анализируют. Количество панкрелипазы, выраженное в виде липазной активности, измеряют на протяжении всего способа:

- в суспензии со стадии а1.1 (ЛА в суспензии; ЛА-С а1.1);

- в супернатанте, полученном на стадии а2 (ЛА в СН, осаждение, ЛА-СН);

- в осадках, полученных на стадии а2, а затем ресуспендированных в исходной дистиллированной воде (ЛА в осадках, осаждение, ЛА-О).

Результаты представлены в таблицах 19-20. Результаты, полученные в двухстадийном и в одностадийном способах в предыдущих примерах, также представлены в данном примере в целях прямого сравнения.

Данный способ предшествующего уровня техники обеспечивает слабый выход, выражена инактивация ферментов, и, следовательно, обогащение липазы не получено.

Пример 9. Характеристика очищенного ВА панкреатина (образец 20).

ВА материал тестируют на его переваривающую способность и сравнивают с исходной панкрелипазой. Каждое из 20 мг ВА панкреатина и 50 мг исходной панкрелипазы (соответствует 2300 ME Фарм. США липазы) суспендируют в 1 мл деионизированной воды и добавляют к 50 мл энтеральной формулы Peptamen® Junior 1,0 при 37°C и перемешивают при 100 об/мин в течение 60, 120 и 240 минут. Тесты на переваривание выполняют через 1, 2 и 4 часа. Тест повторяли 6 раз для каждого образца панкрелипазы.

Липидные питательные вещества отслеживают путем измерения переваривания триолеина (снижение пика триолеина). Общее переваривание белка отслеживают способом Бредфорда. Амилолитический процесс отслеживают путем измерения образования короткоцепочечных Сахаров. Разность степени переваривания получают путем сравнения характеристик переваривания нативного и ВА материалов после 4 часов переваривания.

Разность активности вычисляют по формуле: (активность нативного панкреатина минус активность ВА панкреатина) деленное на активность нативной панкрелипазы

Разность переваривания вычисляют по следующей формуле: (% переваривания нативного панкреатина минус % переваривания ВА панкреатина)

Данный тест in vitro дает возможность анализировать липазу, переваривание белков и углеводов ВА панкреатина. Переваривание липазы крайне чувствительно к разности ферментативных активностей, присутствующих в реакционных сосудах, следовательно, 10% разности в активности соответствует 10% разности в количественном переваривании. Кинетика переваривания показывает подобные тенденции. Эти результаты позволяют предположить, что нативный и ВА панкреатин имеют сходный профиль переваривания липидов.

Профили переваривания белков являются почти сопоставимыми, что позволяет предположить, что активность протеазы ВА панкреатина ограничивает переваривание на уровне, аналогичном нативной панкрелипазе. Разность приблизительно 60% активности для протеазы не оказывает каких-либо воздействий на степень переваривания белка.

Профили переваривания углеводов различаются, поскольку продуцирование мальтозы ниже для ВА панкреатина. Сравнение разности активности амилазы и количества переваренных продуктов показывает, что ВА панкреатин также оказался амилолитическим.

1. Высокоэффективная фармацевтическая композиция, содержащая уменьшенную дозировочную форму частиц, включающих высокоактивный панкреатин (ВА панкреатин), в которой указанный ВА панкреатин обладает удельной липазной активностью по меньшей мере 120 USP (Фармакопея США) МЕ/мг и присутствует в дозе 100-110 мг активного фармацевтического ингредиента (АФИ) на дозировочное количество.

2. Высокоэффективная фармацевтическая композиция по п. 1, в которой ВА панкреатин обладает удельной липазной активностью по меньшей мере 150 USP МЕ/мг.

3. Высокоэффективная фармацевтическая композиция по п. 1, в которой ВА панкреатин обладает удельной липазной активностью по меньшей мере 200 USP МЕ/мг.

4. Высокоэффективная фармацевтическая композиция по п. 1, в которой ВА панкреатин обладает удельной липазной активностью по меньшей мере 500 USP МЕ/мг.

5. Высокоэффективная фармацевтическая композиция по п. 1, в которой ВА панкреатин присутствует в уменьшенной дозировочной форме в количестве 100-110 мг.

6. Высокоэффективная фармацевтическая композиция по п. 5, где панкреатин представляет собой панкреатин свиного происхождения.

7. Высокоэффективная фармацевтическая композиция по п. 5, которая содержит по меньшей мере 9000, 20000, 40000, 60000, 80000 или 100000 USP ME липазы на лекарственную форму.

8. Высокоэффективная фармацевтическая композиция по п. 7, содержащая множество покрытых частиц ВА панкреатина, где множество покрытых частиц содержит ядро, покрытое по меньшей мере одним кишечнорастворимым полимером.

9. Высокоэффективная фармацевтическая композиция по п. 5 в форме порошка, гранул, микросфер, капсул, саше, таблеток, жидких суспензий или жидких растворов.

10. Способ получения ВА панкреатина, обладающего удельной липазной активностью по меньшей мере 120 USP МЕ/мг, предназначенного для использования в фармацевтической композиции в дозе 100-110 мг активного фармацевтического ингредиента (АФИ) на дозировочное количество, включающий стадии:

а1) суспендирования панкреатина в растворителе, имеющем параметр растворимости Гильдебранда, составляющий от 28 до 45 (МПа)^0,5, где указанный растворитель представляет собой один органический растворитель, либо смесь органических растворителей, либо смесь по меньшей мере одного органического растворителя и водного растворителя;

а2) отделения нерастворимой части от растворимой части смеси со стадии а1;

а3) высушивания нерастворимой части, полученной на стадии а2,

где температура при осуществлении данного способа на стадиях (а1)-(а3) ниже комнатной температуры.

11. Способ по п. 10, где растворитель имеет параметр растворимости Гильдебранда, составляющий от 28 до 38 (МПа)^0,5.

12. Способ по п. 10, где растворитель имеет параметр растворимости Гильдебранда, составляющий от 28 до 34 (МПа)^0,5.

13. Способ по п. 10, где растворитель имеет параметр растворимости Гильдебранда, составляющий от 34 до 38 (МПа)^0,5.

14. Способ по п. 10, где растворитель имеет параметр растворимости Гильдебранда, составляющий от 34 до 45 (МПа)^0,5.

15. Способ по п. 10, где растворитель имеет параметр растворимости Гильдебранда, составляющий от 38 до 45 (МПа)^0,5.

16. Способ по п. 10 для получения панкреатина, имеющего удельную липазную активность по меньшей мере 150 USP МЕ/мг.

17. Способ по п. 10 для получения панкреатина, имеющего удельную липазную активность по меньшей мере 200 USP МЕ/мг.

18. Способ по п. 10 для получения панкреатина, имеющего удельную липазную активность по меньшей мере 250 USP МЕ/мг.

19. Способ по п. 10, в котором растворитель имеет параметр растворимости Гильдебранда от 34 до 45 (МПа)^0,5.

20. Способ по п. 19, где стадию а1) выполняют в течение 30 минут и температура при осуществлении данного способа составляет 4°С.

21. Способ по п. 20, где растворитель представляет собой смесь по меньшей мере одного органического растворителя и водного растворителя, и где стадия а1 включает следующие стадии:

а1.1) суспендирование панкреатина в водном растворителе при перемешивании;

а1.2) добавление к суспензии со стадии 1а одного органического растворителя или их смеси; и

где температура при осуществлении данного способа ниже комнатной температуры.

22. Способ по п. 21, где растворитель представляет собой смесь по меньшей мере одного органического растворителя и водного растворителя, и где стадия а1 включает:

а1.1) суспендирование панкреатина в водном растворителе при перемешивании;

а1.2) отделение растворимой части со стадии а1.1 от нерастворимой части;

а1.3) добавление к растворимой части со стадии а1.2 одного органического растворителя или их смеси; и

где температура при осуществлении данного способа ниже комнатной температуры.

23. Способ по п. 22, где стадию а1.3 выполняют в течение 30 минут и температура при осуществлении данного способа составляет 4°С.

24. Способ по п. 21, где панкреатин со стадии а1.1 находится в количестве от 0,05 до 0,3 мг/мл.

25. Способ по п. 19, где растворитель имеет параметр растворимости Гильдебранда 38 (МПа)^0,5.

26. Способ по п. 19, где органический растворитель выбран из группы, состоящей из н-пентана, н-гексана, н-гептана, диэтилового эфира, циклогексана, тетрахлорида углерода, этилацетата, тетрагидрофурана, хлороформа, трихлорэтилена, ацетона, диметилформамида, н-пропанола, изопропанола, этанола, диметилсульфоксида, бутилового спирта, метанола, ацетонитрила, диоксана и метиленхлорида.

27. Способ по п. 26, где органический растворитель выбран из группы, состоящей из ацетона, изопропанола и этанола.

28. Способ по п. 19, где водный растворитель представляет собой буферный раствор.

29. Способ по п. 19, где буферный раствор имеет рН 7 или рН 4.

30. Способ по п. 19, где органический растворитель представляет собой ацетон и водный растворитель представляет собой буферный раствор с рН 7.

31. Способ по п. 19, где органический растворитель представляет собой этанол и водный растворитель представляет собой буферный раствор с рН 7.

32. Способ по п. 19, где органический растворитель представляет собой ацетон и водный растворитель представляет собой буферный раствор с рН 4.

33. Способ по п. 19, где органический растворитель представляет собой этанол и водный растворитель представляет собой буферный раствор с рН 4.

34. Способ по п. 19, где растворитель имеет параметр растворимости Гильдебранда 38 (МПа)^0,5, и где растворитель представляет собой смесь ацетона и буферного раствора с рН 7, и панкреатин на стадии а1 находится в концентрации 0,1 мг/мл.

35. Способ по п. 22, где растворитель имеет растворимость Гильдебранда 38 (МПа)^0,5, и где растворитель представляет собой смесь ацетона и буферного раствора с рН 4, и панкреатин на стадии а1 находится в концентрации 0,1 мг/мл.

36. Способ по п. 22, где растворитель имеет растворимость Гильдебранда 38 (МПа)^0,5, и где растворитель представляет собой смесь этанола и буферного раствора с рН 4, и панкреатин на стадии а1 находится в концентрации 0,1 мг/мл.

37. Способ по п. 22, где растворитель имеет растворимость Гильдебранда 38 (МПа)^0,5, и где растворитель представляет собой смесь ацетона и буферного раствора с рН 7, и панкреатин на стадии а1 находится в концентрации 0,3 мг/мл.

38. Способ по п. 23, где растворитель имеет растворимость Гильдебранда 38 (МПа)^0,5, и где растворитель представляет собой смесь ацетона и буферного раствора с рН 4, и панкреатин на стадии а1 находится в концентрации 0,3 мг/мл.

39. Способ по п. 23, где растворитель имеет растворимость Гильдебранда 38 (МПа)^0,5, и где растворитель представляет собой смесь этанола и буферного раствора с рН 4, и панкреатин на стадии а1 находится в концентрации 0,3 мг/мл.

40. Способ по п. 22, дополнительно включающий стадию снижения микробной и/или вирусной нагрузки.

41. Способ по п. 40, где снижение бактериальной и/или вирусной нагрузки выполняют с помощью фильтрования, нагревания, ионизирующего излучения, высокого давления или с помощью алкилирования.

42. Способ лечения пациента, подверженного физиологическому состоянию, связанному с недостаточностью панкреатических ферментов, включающий введение указанному пациенту фармацевтически приемлемого количества композиции по п. 5.