Комбинация онколитического вируса с модуляторами иммунологических контрольных точек

Согласно настоящему изобретению предложена комбинация, содержащая по меньшей мере онколитический вирус и один или более чем один модулятор иммунологической контрольной точки для применения для лечения пролиферативного заболевания, такого как рак. Оно также относится к набору, содержащему указанный онколитический вирус и указанный один или более чем один модулятор иммунологической контрольной точки в отдельных контейнерах. Оно также касается фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество указанного онколитического вируса и указанного одного или более чем одного модулятора иммунологической контрольной точки. 2 н. и 19 з.п. ф-лы, 7 ил., 1 табл.

 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение, в общем, относится к области онколитической виротерапии и, более конкретно, к композициям и способам для лечения, предупреждения или ингибирования пролиферативных заболеваний, особенно рака. Воплощения включают онколитический вирус для применения для лечения рака в комбинации с одним или более чем одним модулятором иммунологической контрольной точки. Воплощения также включают набор, содержащий такие компоненты, и способ лечения с использованием указанного онколитического вируса с указанным одним или более чем одним модулятором иммунологической контрольной точки.

Каждый год во всем мире рак диагностируется у более чем 12 миллионов субъектов. В промышленно развитых странах приблизительно один человек из пяти умрет от рака. Несмотря на существование огромного числа химиотерапевтических средств, они часто являются неэффективными, особенно против злокачественных и метастатических опухолей, которые развиваются на очень ранней стадии заболевания. Кроме того, противоопухолевый иммунитет часто является неэффективным из-за того факта, что опухолевые клетки развили механизмы для того, чтобы избегать защиты хозяина. Одним из главных механизмов подавления иммунитета является процесс, известный как «истощение Т-клеток», который возникает из-за хронического воздействия антигенов и характеризуется повышающей регуляцией ингибирующих рецепторов. Данные ингибирующие рецепторы служат в качестве иммунологических контрольных точек для того, чтобы предотвращать неконтролируемые иммунные реакции. В литературе были описаны разные иммунологические контрольные точки, действующие на разных уровнях Т-клеточного иммунитета, включая белок 1 программируемой клеточной смерти (PD-1) и его лиганды PD-L1 и PD-L2, CTLA-4 (белок 4, ассоциированный с цитотоксическими Т-лимфоцитами), LAG3 (ген 3, активирующий лимфоциты), аттенюатор В- и Т-лимфоцитов, иммуноглобулин Т-клеток, белок 3, содержащий домен муцина (TIM-3) и иммуноглобулин-супрессор активации Т-клеток с V-доменом.

Каким бы ни был механизм действия, данные иммунологические контрольные точки могут ингибировать развитие эффективного противоопухолевого иммунного ответа. Имеется возрастающий интерес к возможной терапевтической пользе блокирования таких иммунологических контрольных точек в качестве средства ингибирования толерантности иммунной системы к опухолям и, таким образом, спасения истощенных противоопухолевых Т-клеток (Leach et al., 1996, Science 271: 1734-6). На протяжении последнего десятилетия было разработано большое число антагонистических антител (например, против Tim3, PD-L1, CTLA-4, PD1 и т.д.), и важнее всего то, что некоторые из них были ассоциированы с объективными клиническими ответами у раковых пациентов. Антитела, нацеленные на CTLA-4 (например, ипилимумаб, ервой, Bristol-Myers Squibb, BMS), уже распространяются на рынке против метастатической меланомы. BMS сообщала о том, что из 1800 пациентов с меланомой, которых лечили ипилимумабом, 22% все еще живы через 3 года. Также продолжаются терапии антителами против PD-L1 (например, MPDL3280A, Roche), против PD-1 (например, ниволумаб, BMS).

Другим терапевтическим подходом, который возникает в области рака, являются онколитические вирусы (Hermiston, 2006, Curr. Opin. Mol. Ther. 8: 322-30). Онколитические вирусы способны к селективной репликации в делящихся клетках (например, в раковой клетке), оставляя неделящиеся клетки (например, нормальные клетки) невредимыми. Поскольку инфицированные делящиеся клетки разрущаются лизисом, они высвобождают новые инфекционные вирусные частицы для инфицирования окружающих делящихся клеток. Раковые клетки представляют собой идеальных хозяев для многих вирусов, так как они имеют инактивированный противовирусный интерфероновый путь или имеют мутировавшие гены супрессоров опухолей, что обеспечивает беспрепятственный ход вирусной репликации (Chernajovsky et al., 2006, British Med. J. 332: 170-2). В настоящее время в качестве онколитических агентов был клинически испытан целый ряд вирусов, включая аденовирус, реовирус, вирус кори, вирус простого герпеса, вирус ньюкаслской болезни и вирус осповакцины.

Некоторые вирусы являются онколитическими в природе (такие как реовирус и пикорнавирус долины Сенека), тогда так другие являются генетически модифицированными для селективности в отношении опухоли посредством модифицирования генома вируса. Такие модификации включают функциональные делеции важных генов вируса, применение опухоле- или тканеспецифичных промоторов для контроля экспрессии гена вируса и модификации тропизма для перенаправления вируса к поверхности раковой клетки.

Первым онколитическим вирусом, подлежащим одобрению надзорным органом, был генетически модифицированный аденовирус, названный Н101 (Shanghai Sunway Biotech), который получил одобрение от Государственного управления Китая по контролю качества продуктов питания и лекарственных средств (SFDA) в 2005 году для лечения рака головы и шеи. Другой онколитический аденовирус, названный ONYX-015, находится на этапе клинических испытаний для лечения разных солидных опухолей (в фазе III для лечения рецидивирующего рака головы и шеи) (Cohen et al., 2001, Curr. Opin. Investig. Drugs 2: 1770-5). В качестве другого примера, онколитический вирус простого герпеса 1 (T-VEC) был генетически модифицирован для ослабления вирулентости вируса, увеличения селективности в отношении раковых клеток и усиления экспрессии противоопухолевого иммунного ответа (посредством GM-CSF (гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор)). Клиническая эффективность при нерезецируемой меланоме была продемонстрирована в клинических испытаниях фазы II и фазы III (Senzer et al, 2009, J. Clin. Oncol. 27: 5763-71).

Вирусы осповакцины (VV) обладают многими из ключевых характеристик, необходимых для применения в онколитической виротерапии, такими как природный тропизм в отношении опухолей, сильная литическая способность, короткий жизненный цикл с быстрым распространением от клетки к клетке, высокоэффективная экспрессия генов и большая способность к клонированию. Кроме того, их доставляли миллионам индивидов во время кампании по искоренению натуральной оспы без большой озабоченности относительно безопасности. В данном отношении VV (штамм Wyeth), экспрессирующий GM-CSF, с двойной делецией по ТК и VGF (названный JX-963) демонстрировал значимую селективность в отношении рака у мышей, несущих опухоль (Thorne et al., 2007, J Clin Invest. 117: 3350-8). На той же самой линии - JX-594 - VV (штамм Wyeth) с делецией ТК, снабженный GM-CSF, были показаны многообещающие клинические данные, и скоро ожидается начало рандомизированного исследования фазы III в печеночно-клеточной карциноме.

В литературе также были описаны комбинированные терапии. В WO 2010/014784 описана комбинация антитела против CTLA4 с химиотерапевтическими средствами, используемыми для лечения рака, такими как гливек, таксол и тому подобные. В WO 2014/047350 рассматривается рекомбинантный онколитический вирус с геном, кодирующим антитело против PD-1, вставленным в вирусный геном.

Техническая проблема

Можно ожидать, что рак продолжит быть серьезной глобальной угрозой для здоровья на много лет из-за большого числа причинных факторов, которые могут действовать совместно или по отдельности с инициацией или стимулированием развития рака. Кроме того, злокачественные и особенно метастатические опухоли часто являются устойчивыми к традиционным терапиям, объясняя значительный процент смертности от некоторых раковых заболеваний.

Таким образом, существует важная потребность в разработке более эффективных подходов для улучшения, предупреждения и лечения таких пролиферативных заболеваний и особенно комбинированных подходов.

Комбинированная терапия, при которой вводились и онколитический вирус, и один или более чем один модулятор иммунологической контрольной точки, давала синергетический иммунный ответ по сравнению с каждым подходом, использованным поодиночке. Неожиданно то, что комбинированное лечение, при котором онколитический вирус осповакцины вводили до введения антитела против контрольной точки, такого как антитело против PD-1 или против CTLA-4, улучшало противоопухолевый ответ, что подтверждается в подходящей животной модели, таким образом, потенциально предоставляя эффективную и мощную терапию против рака. Соответственно, воплощения, предложенные в данном документе, обеспечивают значительный успех в лечении и предупреждении пролиферативных заболеваний, таких как рак.

Данная техническая проблема решается предложением воплощений, как определено в формуле изобретения.

Другие и дополнительные аспекты, характеристики и преимущества настоящего изобретения будут очевидными из следующего описания предпочтительных в настоящее время воплощений изобретения. Данные воплощения приведены с целью раскрытия.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение касается синергетической комбинации онколитических вирусов с одним или более чем одним модулятором иммунологической контрольной точки для применения для лечения пролиферативных заболеваний, таких как раковые заболевания. Онколитический вирус предпочтительно выбран из группы, состоящей из реовируса, вируса ньюкаслской болезни (NDV), вируса везикулярного стоматита (VSV), вируса кори, вируса гриппа, вируса Синдбис, аденовируса, вируса группы оспы, вируса герпеса (HSV) и тому подобных. В одном воплощении онколитический вирус представляет собой вирус осповакцины. В предпочтительном воплощении вирус осповакцины генетически модифицирован таким образом, чтобы он не имел активности тимидинкиназы (ТК) (например, геном указанного W имеет инактивирующую мутацию в гене J2R или делецию гена с получением дефектного по ТК фенотипа). В качестве альтернативы или в комбинации, вирус осповакцины генетически модифицирован таким образом, чтобы он не имел активности рибонуклеотидредуктазы (RR) (например, геном указанного W имеет инактивирующую мутацию в гене I4L и/или F4L или делецию гена с получением дефектного по RR фенотипа).

В одном воплощении вирус осповакцины дополнительно экспрессирует по меньшей мере один терапевтический ген, в частности ген, кодирующий суицидный генный продукт и/или иммуностимулирующий белок.

В одном воплощении один или более чем один модулятор иммунологической контрольной точки представляет собой антагонистическую молекулу, которая оказывает антагонистиеский эффект на активность PD-1, PD-L1 или CTLA4 с конкретным предпочтением в отношении антитела против PD-1 и/или антитела против CTLA4.

В одном воплощении онколитический вирус предпочтительно приготовлен для внутривенного введения или введения в опухоль, и/или один или более чем один модулятор иммунологической контрольной точки предпочтительно приготовлен для внутривенного или внутрибрюшинного введения, или введения в опухоль.

В настоящем изобретении дополнительно предложен способ лечения пролиферативного заболевания, включая раковое заболевание, который включает введение млекопитающему, нуждающемуся в этом, синергетически эффективных количеств онколитического вируса, как описано в данном документе, и одного или более чем одного модулятора иммунологической контрольной точки, как описано в данном документе. В одном воплощении пролиферативное заболевание, которое лечат способом по изобретению, представляет собой рак и особенно меланому, рак почки, рак предстательной железы, рак молочной железы, колоректальный рак, рак легкого и рак печени. В одном воплощении данный способ включает дополнительную стадию, на которой указанному млекопитающему вводится фармацевтически приемлемое количество пролекарства. Введение указанного пролекартва предпочтительно происходит по меньшей мере через 3 суток после введения указанного онколитического вируса или композиции вируса.

Согласно настоящему изобретению дополнительно предложен набор, включающий онколитический вирус, как описано в данном документе, и один или более чем один модулятор иммунологической контрольной точки, предпочтительно в отдельных контейнерах.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение касается комбинации, содержащей по меньшей мере онколитический вирус, и один или более чем один модулятор иммунологической контрольной точки для применения для лечения пролиферативных заболеваний, таких как рак.

Определения

Термины, указывающие на единственное число, в том виде, в котором они используются везде во всей данной заявке, используются в том смысле, что они означают «по меньшей мере один», «по меньшей мере первый», «один или более чем один» или «множество» упоминаемых компонентов или стадий, если контекст явно не диктует иное. Например, термин «клетка» включает множество клеток, включая их смеси.

Термин «один или более чем один» относится либо к одному, либо к числу, превышающему один (например, 2, 3, 4, 5 и т.д.).

Термин «и/или» всякий раз, когда он используется в данном документе, включает значение «и», «или» и «все или любая другая комбинация элементов, соединенных указанным термином».

Термин «примерно» или «приблизительно» в том виде, как он используется в данном документе, означает в пределах 20%, предпочтительно в пределах 10% и более предпочтительно в пределах 5% от данного значения или интервала.

Термин «содержащий» (и любая форма содержащего, такая как «содержать» и «содержит»), «имеющий» (и любая форма имеющего, такая как «иметь» и «имеет»), «включающий» (и любая форма включающего, такая как «включает» и «включать») в том виде, как они используются в данном документе, при использовании для определения продуктов, композиций и способов, являются открытыми и не исключают дополнительных, неперечисленных элементов или стадий способа. Таким образом, полипептид «содержит» аминокислотную последовательность, когда аминокислотная последовательность может быть частью конечной аминокислотной последовательности полипепида. Такой полипептид может иметь вплоть до нескольких сотен дополнительных аминокислотных остатков. Фраза «по существу состоящий из» означает исключение других компонентов или стадий, имеющих какую-либо существенную значимость. Таким образом, композиция, по существу состоящая из перечисленных компонентов, не исключала бы следовые примеси и фармацевтически приемлемые носители. Полипептид «по существу состоит из» аминокислотной последовательности, когда такая аминокислотная последовательность присутствует с фактически лишь несколькими дополнительными аминокислотными остатками. «Состоящий из» означает исключение более чем следовых элементов других компонентов или стадий. Например, полипептид «состоит из» аминокислотной последовательности, когда данный полипептид не содержит любых аминокислот, кроме перечисленной аминокислотной последовательности.

Термины «полипептид», «пептид» и «белок» относятся к полимерам из аминокислотных остатков, которые содержат по меньшей мере девять или более чем девять аминокислот, связанных посредством пептидных связей. Полимер может быть линейным, разветвленным или циклическим и может содержать встречающиеся в природе аминокислоты и/или аналоги аминокислот, и он может прерываться неаминокислотами. В качестве общего указания, если аминокислотный полимер состоит из более чем 50 аминокислотных остатков, он предпочтительно называется полипептидом или белком, тогда как, если он имеет длину 50 аминокислот или менее, он называется «пептидом».

В контексте настоящего изобретения термины «нуклеиновая кислота», «молекула нуклеиновой кислоты», «полинуклеотид» и «нуклеотидная последовательность» используются взаимозаменяемо и определяют полимер любой длины одного из полидезоксирибонуклеотидов (ДНК) (например, кДНК (комплементарная ДНК), геномная ДНК, плазмиды, векторы, вирусные геномы, выделенная ДНК, зонды, праймеры и их любая смесь) или полирибонуклеотидов (РНК) (например, мРНК (матричная РНК), антисмысловая РНК, миРНК (малая интерферирующая РНК)), или смешанных полирибо-полидезоксирибонуклеотидов. Они охватывают одно- или двухцепочечные, линейные или кольцевые, природные или синтетические, модифицированные или немодифицированные полинуклеотиды. Кроме того, полинуклеотид может содержать не встречающиеся в природе нуклеотиды и может прерываться ненуклеотидными компонентами.

Термин «аналог» в том виде, как он используется в данном документе, относится к молекуле (полипептиду или нуклеиновой кислоте), демонстрирующей одну или более чем одну модификацию по отношению к нативному аналогу.

Может(гут) рассматриваться любая(бые) модификация(ции), включающая(щие) замену, вставку и/или делецию одного или более чем одного нуклеотида/аминокислотного остатка. Предпочтительными являются аналоги, которые сохраняют степень идентичности последовательности по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90% и даже более предпочтительно по меньшей мере 98% идентичности с последовательностью нативного аналога.

В общем, термин «идентичность» относится к соответствию аминокислоты аминокислоте или нуклеотида нуклеотиду между двумя последовательностями полипептидов или нуклеиновых кислот. Процентная доля идентичности между двумя последовательностями представляет собой функцию числа идентичных положений, которые имеют последовательности, принимая во внимание число пробелов, которые необходимо вводить для оптимального выравнивания, и длину каждого пробела. Для определения процентной доли идентичности между аминокислотными последовательностями в данной области доступны разные компьютерные программы и математические алгоритмы, такие как, например, программа Blast, доступная в NCBI (Национальный центр биотехнологической информации) или ALIGN в Атласе последовательности и структуры белка (Dayhoffed, 1981, Suppl., 3: 482-9). В специализированных базах данных также доступны программы для определения идентичности между нуклеотидными последовательностями (например, Genbank, the Wisconsin Sequence Analysis Package, программы BESTFIT, FASTA и GAP). Для иллюстративных целей «по меньшей мере 80%-ная идентичность» означает 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%.

Термин «выделенный» в том виде, как он используется в данном документе, относится к белку, полипептиду, пептиду, полинуклеотиду, вектору и т.д., который удаляется из его природного окружения (например, отделяется от по меньшей мере одного другого компонента, с которым он ассоциирован в природе или обнаруживается в природе). Например, нуклеотидная последовательность является выделенной, когда она отделяется от последовательностей, обычно ассоциированных с ней в природе (например, выделяется из генома), но она может быть ассоциирована с гетерологичными последовательностями.

Термин «полученный из», «происходящий» или «происходить» используется для идентификации исходного источника компонента (например, полипептида, молекулы нуклеиновой кислоты), но подразумевается, что он не ограничивается способом, посредством которого получается компонент, который может представлять собой, например, химический синтез или способы генной инженерии.

Термин «клетка-хозяин» в том виде, как он используется в данном документе, следует понимать в широком смысле без какого-либо ограничения, касающегося конкретной организации в ткани, органе или выделенных клетках. Такие клетки могут представлять собой уникальный тип клеток или группу разных типов клеток, таких как линии культивируемых клеток, первичные клетки и делящиеся клетки. В контексте данного изобретения термин «клетки-хозяева» включает прокариотические клетки, клетки низших эукариот, таких как дрожжи, и другие эукариотические клетки, такие как клетки насекомых, растительные клетки и клетки млекопитающих (например, человека или млекопитающего, не являющегося человеком), а также клетки, способные продуцировать онколитический вирус и/или модулятор(ры) иммунологической контрольной точки для применения в данном изобретении. Данный термин также включает клетки, которые могут быть или были реципиентом векторов, описанных в данном документе, а также потомство таких клеток.

Термин «онколитический вирус» в том виде, как он используется в данном документе, относится к вирусу, способному селективно реплицироваться в делящихся клетках (например, в пролиферирующей клетке, такой как раковая клетка) с целью замедления роста и/или лизирования указанной делящейся клетки, либо in vitro, либо in vivo, при демонстрации отсутствия репликации или минимальной репликации в неделящихся клетках. Типично онколитический вирус содержит вирусный геном, упакованный в вирусную частицу (или вирион), и является инфекционным (т.е. способным инфицировать и поступать в клетку-хозяина или субъекта).

Термин «лечение» (и любая форма лечения, такая как «осуществлять лечение», «лечить») в том виде, как он используется в данном документе, охватывает профилактику (например, предупредительные меры у субъекта, подверженного риску наличия патологического состояния, подлежащего лечению) и/или терапию (например, у субъекта, у которого поставлен диагноз наличия патологического состояния), в конечном счете, в ассоциации с традиционными терапевтическими способами воздействия. Результатом лечения является замедление, излечение, уменьшение интенсивности или контроль развития целевого патологического состояния. Например, субъекта успешно лечат против рака, если после введения онколитического вируса и одного или более чем одного модулятора иммунологической контрольной точки, как описано в данном документе, субъект демонстрирует наблюдаемое улучшение его клинического статуса.

Термин «осуществление введения» (или любая форма термина «введение», такая как «введенный») в том виде, как он используется в данном документе, относится к доставке субъекту терапевтического агента, такого как описанные в данном документе онколитический вирус и/или модулятор(ры) иммунологической контрольной точки.

Термин «пролиферативное заболевание» в том виде, как он используется в данном документе, охватывает любое заболевание или состояние, возникающее в результате неконтролируемого роста и распространения клеток, включая раковые заболевания, а также заболевания, ассоциированные с повышенной активностью остеокластов (например, ревматоидный артрит, остеопороз и т.д.), и сердечнососудистые заболевания (рестеноз, который возникает из-за пролиферации гладкомышечных клеток стенки кровеносного сосуда и т.д.). Термин «рак» можно использовать взаимозаменяемо с любым из терминов «опухоль», «злокачественное образование», «новообразование» и т.д. Подразумевается, что данные термины включают любой тип ткани, органа или клетки, любую стадию развития злокачественного образования (например, от предопухолевой стадии до стадии IV).

Термин «субъект» обычно относится к организму, для которого нужен или может быть полезен любой продукт и способ по изобретению. Типично организм представляет собой млекопитающее, в частности млекопитающее, выбранное из группы, состоящей из домашних животных, сельскохозяйственных животных, спортивных животных и приматов. Предпочтительно субъект представляет собой человека, которому был поставлен диагноз наличия или подверженности риску наличия пролиферативного заболевания, такого как рак. Термины «субъект» и «пациент», при отнесении к человеческому организму, могут использоваться взаимозаменяемо и охватывают субъектов мужского и женского пола. Субъект, подлежащий лечению, может быть новорожденным, ребенком в возрасте до 2 лет, молодым взрослым или взрослым.

Термин «комбинация» в том виде, как он используется в данном документе, относится к любому возможному сочетанию разных компонентов (например, онколитического вируса и модулятора(ров) иммунологической контрольной точки). Такое сочетание включает смесь по меньшей мере одного онколитического вируса с одним или более чем одним модулятором иммунологической контрольной точки в форме полипептидов (например, рекомбинантное антитело или смесь рекомбинантных антител) или молекулы(кул) нуклеиновой кислоты (например, которые несет один или более чем один вектор, сконструированный для экспрессии такого одного или более чем одного модулятора иммунологической контрольной точки), а также смесь полипептида(дов) и молекулы(кул) нуклеиновой кислоты (например, рекомбинантное антитело и экспрессионный вектор). Настоящее изобретение охватывает комбинации, содержащие эквимолярные концентрации каждого модулятора иммунологической контрольной точки, при использовании более чем одного модулятора, а также комбинации с очень разными концентрациями. Понятно, что оптимальная концентрация каждого компонента данной комбинации может быть определена квалифицированным специалистом в данной области. Предпочтительно комбинация является синергетической, обеспечивающей более высокую эффективность, чем каждый элемент поодиночке.

Термин «модулятор иммунологической контрольной точки» относится к молекуле, способной позитивно или негативно модулировать функцию белка иммунологической контрольной точки (в частности, взаимодействие между антигенпрезентирующей клеткой (АРС), такой как раковая клетка, и иммунологической эффекторной Т-клеткой). Термин «иммунологическая контрольная точка» относится к белку, прямо или опосредованно участвующему в иммунологическом пути, который при нормальных физиологических условиях является решающим для предупреждения неконтролируемых иммунных реакций и, таким образом, для поддержания аутотолерантности и/или защиты ткани. Один или более чем один модулятор иммунологической контрольной точки, используемый в данном документе, может независимо действовать на любой стадии опосредованного Т-клетками иммунитета, включая клональный отбор антигенспецифичных клеток, активацию Т-клеток, пролиферацию, транспорт к сайтам антигена и воспаления, выполнение непосредственной эффекторной функции и сигнализацию через цитокины и мембранные лиганды. Каждая из данных стадий регулируется посредством уравновешивания стимулирующих и ингибирующих сигналов, которые осуществляют точную настройку ответа. В контексте настоящего изобретения данный термин охватывает модулятор иммунологической контрольной точки, способный, по меньшей мере частично, к понижающей регуляции функции ингибиторной иммунологической контрольной точки (антагониста) и/или модулятора(ров) иммунологической контрольной точки, способного(ных), по меньшей мере частично, к повышающей регуляции функции стимулирующей иммунологической контрольной точки (агониста).

Онколитический вирус

Онколитический вирус для применения в настоящем изобретении может быть получен от любого идентифицированного в настоящее время члена семейства вируса, при условии, что он является онколитическим по его склонности к селективной репликации и умерщвлению делящихся клеток, по сравнению с неделящимися клетками. Он может представлять собой нативный вирус, который является онколитическим в природе, или может быть подвергнут генетической модификации посредством модифицирования одного или более чем одного вирусного гена таким образом, чтобы увеличить селективность в отношении опухоли и/или предпочтительную репликацию в делящихся клетках, как, например, генов, участвующих в репликации ДНК, метаболизме нуклеиновых кислот, тропизме хозяина, прикреплении к поверхности, вирулентности, лизисе и распространении (см., например, Kirn et al., 2001, Nat. Med. 7: 781; Wong et al., 2010, Viruses 2: 78-106). Также можно рассматривать помещение одного или более чем одного вирусного гена под контроль регулирующих элементов (например, промотора), специфичных в отношении события или ткани.

Типичные онколитические вирусы включают, без ограничения, реовирус, вирус долины Сенека (SW), вирус везикулярного стоматита (VSV), вирус ньюкаслской болезни (NDV), вирус простого герпеса (HSV), морбилливирус, ретровирус, вирус гриппа, вирус Синдбис, вирус группы оспы, аденовирус или тому подобные.

В одном воплощении онколитический вирус для применения в настоящем изобретении получают из реовируса. Типичный пример включает реолизин (разрабатывается Oncolytics Biotech; NCT01166542).

В одном воплощении онколитический вирус для применения в настоящем изобретении получают из вируса долины Сенека; Типичный пример включает NTX-010 (Rudin et al., 2011, Clin. Cancer. Res. 17(4): 888-95).

В одном воплощении онколитический вирус для применения в настоящем изобретении получают из вируса везикулярного стоматита (VSV). Типичные примеры для применения в данном изобретении описаны в литературе (например, Stojdl et al., 2000, Nat. Med. 6(7): 821-5; Stojdl et al., 2003, Cancer Cell 4(4): 263-75).

В одном воплощении онколитический вирус для применения в настоящем изобретении получают из вируса ньюкаслской болезни. Типичные примеры для применения в данном изобретении включают, без ограничения, штаммы 73-Т PV701 и HDV-HUJ, а также штаммы, описанные в литературе (например, Phuangsab et al., Cancer Lett. 172(1): 27-36; Lorence et al., 2007, Curr. Cancer Drug Targets 7(2): 157-67; Freeman et al., 2006, Mol. Ther. 13(1): 221-8).

В одном воплощении онколитический вирус для применения в настоящем изобретении получают из вируса простого герпеса (HSV). Herpesviridae представляют собой большое семейство ДНК вирусов, которые все имеют общую структуру и состоят из относительно больших геномов на основе двухцепочечной линейной ДНК, кодирующей 100-200 генов, заключенных в икосаэдрическом капсиде, который заключен в мембрану на основе липидного бислоя. Хотя онколитический вирус герпеса и может происходить из разных типов HSV, особенно предпочтительными являются HSV1 и HSV2. Вирус герпеса может быть генетически модифицирован таким образом, чтобы ограничивать вирусную репликацию опухолями или уменьшать его цитотоксичность в неделящихся клетах. Например, может быть инактивирован любой вирусный ген, участвующий в метаболизме нуклеиновой кислоты, такой как тимидинкназа (Martuza et al., 1991, Science 252: 854-6), рибонуклеотидредуктаза (RR) (Boviatsis et al., 1994, Gene Ther. 1: 323-31; Mineta et al., 1994, Cancer Res. 54: 3363-66) или урацил-N-гликозилаза (Pyles et al., 1994, J. Virol. 68: 4963-72). Другой аспект включает мутантов вирусов с дефектами в функции генов, кодирующих факторы вирулентности, таких как ген ICP34.5 (Chambers et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 1411-5). Типичные примеры онколитического вируса герпеса включают NV1020 (например, Geevarghese et al., 2010, Hum. Gene Ther. 21(9): 1119-28) и T-VEC (Andtbacka et al., 2013, J. Clin. Oncol. 31, номер реферата LBA9008).

В одном воплощении онколитический вирус для применения в настоящем изобретении получают из морбилливируса, который может быть получен из семейства парамиксовирида, с конктретным предпочтением в отношении вируса кори. Типичные примеры подходящих онколитических вирусов кори включают, без ограничения, MV-Edm (McDonald et al., 2006; Breast Cancer Treat. 99(2): 177-84) и HMWMAA (Kaufmann et al., 2013, J. Invest. Dermatol. 133(4): 1034-42).

В одном воплощении онколитический вирус для применения в настоящем изобретении получают из аденовируса. В данной области доступны способы для генетической модификации онколитических аденовирусов. Полезная стратегия включает замену вирусных промоторов опухолеселективными промоторами или модификации продукта(тов) гена аденовируса Е1 с инактивацией его/их функции связывания с р53 или белком ретинобластомы (Rb), которые изменяются в опухолевых клетках. В природном контексте ген аденовируса E1B55kDa кооперируется с другим аденовирусным продуктом для инактивации р53 (р53 часто неправильно регулируется в раковых клетках), таким образом, предотвращая апоптоз. Типичные примеры онколитического аденовируса включают ONYX-015 (например, Khuri et al., 2000. Nat. Med 6(8): 879-85) и H101, также именуемый Oncorine (Xia et al., 2004, Ai Zheng 23(12): 1666-70).

В одном воплощении онколитический вирус для применения в настоящем изобретении представляет собой вирус группы оспы. Термин «вирус группы оспы» в том виде, как он используется в данном документе, относится к вирусу, принадлежащему к семейству Poxviridae, с конкретным предпочтением в отношении вируса группы оспы, принадлежащего к подсемейству Chordopoxviridae, и более предпочтительно - в отношении рода Orthopoxvirus. Последовательности генома разных вирусов группы оспы, например, геномов вируса осповакцины, вируса коровьей оспы, вируса оспы птиц, вируса оспы мышей, вируса миксомы, доступны в данной области и специализированных базах данных, таких как Genbank (номера доступа NC-006998, NC_003663, NC_005309, NC_004105, NC_001132 соответственно).

Желательно онколитический вирус группы оспы представляет собой онколитический вирус осповакцины. Вирусы осповакцины являются членами семейства вируса оспы, характеризуемыми геномом в 200 т.п.н. на основе двухцепочечной ДНК, который кодирует многочисленные вирусные ферменты и факторы, которые обеспечивают независимую репликацию вируса от аппарата клетки-хозяина. Большинство частиц вируса осповакцины являются внутриклеточными (IMV - для внутриклеточного зрелого вириона) с одиночной липидной оболочкой, и они остаются в цитозоле инфицированных клеток до лизиса. Другой инфекционной формой является частица с двойной оболочкой (EEV - для внеклеточного оболочечного вириона), которая отпочковывается от инфицированной клетки без ее лизирования.

Несмотря на то, что он может происходить от любого штамма вируса осповакцины, штаммы Elstree, Wyeth, Copenhagen и Western Reserve являются особенно предпочтительными. Использованная в данном документе номенклатура генов представляет собой номенклатуру штамма вируса осповакцины Copenhagen. Она также используется в данном документе для гомологичных генов других Poxviridae, если не указано иное. Однако номенклатура генов может быть другой, согласно штамму вируса оспы, но соответствие между штаммом Copenhagen и другими штаммами вируса осповакцины обычно доступно в литературе.

Предпочтительно онколитический вирус осповакцины для применения в настоящем изобретении модифицирован посредством изменения одного или более чем одного вирусного гена. Указанная(ные) модификация(ции) предпочтительно приводит(дят) к синтезу (или отсутствию синтеза) дефектного белка, не способного обеспечивать активность белка, продуцированного при нормальных условиях немодифицированным геном. Модификации охватывают делецию, мутацию и/или замену одного или более чем одного нуклеотида (смежного или нет) в пределах вирусного гена или его регуляторных элементов. Модификацию(ции) можно делать целым рядом способов, известных специалистам в данной области, с использованием традиционных методик генной инженерии. Типичные модификации раскрываются в литературе с конкретным предпочтением в отношении модификаций, изменяющих вирусные гены, участвующие в метаболизме ДНК, вирулентности хозяина и пути IFN (интерферон) (см., например, Guse et al., 2011, Expert Opinion Biol. Ther. 11(5): 595-608).

Более предпочтительно онколитический вирус группы оспы для применения в настоящем изобретении модифицирован посредством изменения гена, кодирующего тимидинкиназу (локус J2R). Фермент ТК участвует в синтезе дезоксирибонуклеотидов. ТК необходима для вирусной репликации в нормальных клетках, так как данные клетки обычно имеют низкую концентрацию нуклеотидов, тогда как она является необязательной в делящихся клетках, которые содержат высокую концентрацию нуклеотидов.

Альтернативно или в комбинации онколитический вирус группы оспы для применения в настоящем изобретении модифицируется посредством изменения по меньшей мере одного гена или обоих генов, кодирующих рибонуклеотидредуктазу (RR). В природном контексте данный фермент катализирует восстановление рибонуклеотидов до дезоксирибонуклеотидов, что представляет собой решающую стадию в биосинтезе ДНК. Вирусный фермент является аналогичным по субъединичной структуре ферменту млекопитающих, состоящему из двух гетерологичных субъединиц, обозначенных R1 и R2, кодируемых локусом I4L и F4L соответственно. Последовательности генов I4L и F4L и их положения в геноме разных вирусов группы оспы доступны в общедоступных базах данных, например, через номера доступа DQ437594, DQ437593, DQ377804, АН015635, AY313847, AY313848, NC_003391, NC_003389, NC_003310, М-35027, AY243312, DQ011157, DQ011156, DQ011155, DQ011154, DQ011153, Y16780, Х71982, AF438165, U60315, AF410153, AF380138, U86916, L22579, NC_006998, DQ121394 и NC_008291. В контексте данного изобретения могут быть инактивированы либо ген I4L (кодирующий большую субъединицу R1), либо ген F4L (кодирующий малую субъединицу R2), либо оба.

Альтернативно или в комбинации, для дальнейшего увеличения опухолеспецифичности вируса также можно следовать другим стратегиям. Типичный пример подходящих модификаций включает разрушение гена, кодирующего VGF, из вирусного генома. VGF (обозначает фактор роста VV) представляет собой секретируемый белок, который экспрессируется на раннем этапе после инфекции клетки, и его функция, по-видимому, является важной для распространения вируса в нормальных клетках. Другим примером является разрушение гена A56R, кодирующего гемагглютинин, в конечном счете, в комбинации с делецией ТК (Zhang et al., 2007, Cancer Res. 67: 10038-46). Также полезным может быть разрушение гена(нов), модулирующего(щих) интерферон (например, гена B8R или B18R), или гена ингибитора каспазы-1 B13R.

В предпочтительном воплощении онколитический вирус для применения в данном изобретении представляет собой вирус осповакцины, дефектный по ТК, в результате инактивирующих мутаций в гене J2R. В другом предпочтительном воплощении онколитический вирус для применения в данном изобретении представляет собой вирус осповакцины, дефектный по активностям и ТК, и RR, в результате инактивирующих мутаций и в гене J2R, и в гене(нах) I4L и/или F4L, которые несет вирусный геном (например, как описано в WO 2009/065546 и Foloppe et al., 2008, Gene Ther., 15: 1361-71).

Терапевтические гены

В одном воплощении онколитический вирус для применения в данном изобретении дополнительно экспрессирует по меньшей мере один терапевтический ген, вставленный в вирусный геном. «Терапевтический ген» кодирует продукт, способный обеспечивать биологическую активность, при введении субъекту подходящим образом, что, как ожидается, вызовет полезное влияние на ход или симптом патологического состояния, подлежащего лечению, либо посредством потенцирования противоопухолевой эффективности, либо усиления онколитической природы вируса. В контексте данного изобретения терапевтический ген может иметь или не иметь человеческое происхождение (например, бактериальное, дрожжевое или вирусное происхождение). Предпочтительно терапевтический ген не является геном или последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей модулятор иммунологической контрольной точки, как описано в данном документе.

В контексте данного изобретения может рассматриваться широкий спектр терапевтических генов, таких как гены, кодирующие полипептиды, которые могут компенсировать дефектные или дефицитные белки у субъекта, или гены, которые действуют через токсические эффекты, лимитируя или удаляя вредоносные клетки из организма, или гены, которые кодируют полипептиды, дающие иммунитет. Они могут представлять собой нативные гены или гены, полученные из последних посредством мутации, делеции, замены и/или добавления одного или более чем одного нуклеотида.

Преимущественно онколитический вирус, применяемый в настоящем изобретении, несет терапевтический ген, выбранный из группы, состоящей из генов, кодирующих суицидные генные продукты и иммуностимулирующие белки.

Суицидный ген

Термин «суицидный ген» относится к гену, кодирующему белок, способный к превращению предшественника лекарственного средства в цитотоксическое соединение. Суицидные гены включают гены, кодирующие белок, имеющий цитозиндезаминазную активность, тимидинкиназную активность, урацилфосфорибозилтрансферазную активность, активность фосфорилазы пуриновых нуклеозидов и тимидилаткиназную активность, но не ограничиваются ими. Примеры суицидных генов и соответствующих предшественников лекарственного средства, содержащих одну группировку нуклеинового основания, раскрыты в следующей таблице.

Желательно суицидный ген кодирует белок, имеющий по меньшей мере активность цитозиндезаминазы (ЦДазы). У прокариотов и низших эукариотов (она отсутствует у млекопитающих) ЦДаза участвует в метаболическом пути пиримидина, посредством чего экзогенный цитозин превращается в урацил посредством гидролитического дезаминирования. ЦДаза также дезаминирует аналог цитозина, т.е. 5-фторцитозин (5-FC), образуя, посредством этого, 5-фторурацил (5-FU), соединение, которое является высокоцитотоксическим при его превращении в 5-фтор-UMP (5-фтор-уридинмонофосфат, 5-FUMP). Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая ЦДазу, может быть получена из любых прокариотов и низших эукариотов, таких как Saccharomyces cerevisiae (ген FCY1), Candida albicans (ген FCA1) и Escherichia coli (ген codA). Последовательности генов и кодируемых белков ЦДаз были опубликованы и доступны в специализированных банках данных (SWISSPROT EMBL, Genbank, Medline и тому подобные). Также можно использовать функциональные аналоги данных генов. Такие аналоги предпочтительно имеют последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую степень идентичности по меньшей мере 70%, преимущественно по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 90% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 95% с последовательностью нуклеиновой кислоты нативного гена.

Альтернативно или в комбинации, онколитический вирус, используемый в изобретении, несет в его вирусном геноме суицидный ген, кодирующий полипептид, имеющий урацилфосфорибозилтрансферазную (УФРТаза) активность. У прокариотов и низших эукариотов урацил превращается в UMP посредством действия УФРТазы. Данный фермент превращает 5-FU в 5-FUMP. В качестве иллюстрации в контексте данного изобретения можно использовать последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие УФРТазы из Е. coli (Andersen et al., 1992, European J. Biochem. 204: 51-56), из Lactococcus lactis (Martinussen et al., 1994, J. Bacteriol. 176: 6457-63), из Mycobacterium bovis (Kim et al., 1997, Biochem. Mol. Biol. Internat. 41: 1117-24) и из Bacillus subtilis (Martinussen et al., 1995, J. Bacteriol. 177: 271-4). Однако предпочтительнее всего использовать дрожжевую УФРТазу и, в частности, УФРТазу, кодируемую S. cerevisiae (ген FUR1), последовательности которого раскрыты в Kern et al. (1990, Gene 88: 149-57). Также можно использовать функциональные аналоги УФРТазы, такие как мутант FUR1, усеченный на N-конце, описанный в ЕР998568 (с делецией 35 первых остатков вплоть до второго остатка Met, присутствующего в положении 36 в нативном белке), который демонстрирует более высокую УФРТазную активность, чем активность нативного фермента.

Предпочтительно суицидный ген, вставленный в вирусный геном онколитического вируса, для применения в настоящем изобретении кодирует полипептид, имеющий ЦДазную и УФРТазную активности. Такой полипептид может быть сконструирован посредством слияния двух ферментативных доменов - одного, имеющего ЦДазную активность, и второго, имеющего УФРТазную активность. Типичные полипептиды включают, без ограничения, слитые полипептиды codA::upp, FCY1::FUR1 и FCYI::FURI[дельта]105 (FCU1) и FCU1-8, описанные в WO 096/16183, ЕР 998568 и WO 2005/07857. Особый интерес представляет суицидный ген FCU1 (или слияние FCY1::FUR1[дельта]105), кодирующий полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную идентификатором последовательности SEQ ID NO: 1 WO 2009/065546. Настоящее изобретение охватывает аналоги таких полипептидов, при условии, что они сохраняют ЦДазную и/или УФРТазную активности. Для специалиста в данной области доступно выделение молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих ЦДазу и/или УФРТазу, из опубликованных данных, в конечном счете конструирование их аналогов и тестирование ферментативной активности в бесклеточной или клеточной системе согласно традиционным методикам (см., например, ЕР 998568).

Иммуностимулирующие терапевтические гены

Термин «иммуностимулирующий белок» в том виде, как он используется в данном документе, относится к белку, который имеет способность стимулировать иммунную систему, специфичным или неспецифичным способом. В данной области известно огромное число белков за их способность оказывать иммуностимулирующий эффект. Примеры подходящих иммуностимулирующих белков в контексте данного изобретения включают, без ограничения, цитокины, с особым предпочтением в отношении интерлейкинов (например, IL-2, IL-6, IL-12, IL-15, IL-24), хемокинов (например, CXCL10, CXCL9, CXCL11), интерферонов (например, IFN-гамма, IFN-альфа), фактора некроза опухолей (TNF), колониестимулирующих факторов (например, GM-CSF, C-CSF, M-CSF …), белков, экспонируемых АРС (антигенпрезентирующая клетка) (например, В7.1, В7.2 и тому подобные), факторов роста (трансформирующий фактор роста - TGF, фактор роста фибробластов - FGF, фактор роста эндотелия сосудов - VEGF и тому подобные), антигенов главного комплекса гистосовместимости (МНС) класса I или II, индукторов или ингибиторов апоптоза (например, Вах, Bcl2, BclX …), цитостатических агентов (р21, р16, Rb …), иммунотоксинов, антигенов (антигенные полипептиды, эпитопы и тому подобное) и маркеров (бета-галактозидаза, люцифераза …). Предпочтительно иммуностимулирующий белок представляет собой интерлейкин или колониестимулирующий фактор, с особым предпочтением в отношении GM-CSF.

Экспрессия терапевтических генов

Терапевтический ген может быть легко получен посредством клонирования, посредством ПЦР или посредством химического синтеза согласно традиционным методикам. Кроме того, терапевтический ген может быть оптимизирован для обеспечения высокого уровня экспрессии в конкретной клетке-хозяине или субъекте. В самом деле, наблюдали то, что картины использования кодонов организмов являются в значительной степени не случайными, и использование кодонов может быть заметно отличным между разными хозяевами. Поскольку терапевтический ген может происходить от бактерии или низшего эукариота (например, суицидный ген), он может иметь неподходящую картину использования кодонов для эффективной экспрессии в высших эукариотических клетках (например, человеческих). Типично оптимизация кодонов осуществляется посредством замены одного или более чем одного «нативного» (например, бактериального или дрожжевого) кодона, соответствующего кодону, не часто используемому в интересующем организме-хозяине, одним или более чем одним кодоном, кодирующим такой же аминокислотный остаток, который используется чаще. Нет необходимости заменять все нативные кодоны, соответствующие не часто используемым кодонам, поскольку повышенная экспрессия может достигаться даже с частичной заменой.

Кроме оптимизации использования кодонов, экспрессия в клетке-хозяине или в субъекте может дополнительно улучшаться посредством дополнительных модификаций последовательности гена. Например, последовательность терапевтического гена может быть модифицирована таким образом, чтобы предотвращать кластеризацию редких, неоптимальных кодонов, присутствующих в концентрированных областях, и/или подавить, или модифицировать «негативные» элементы последвательности, которые, как ожидается, отрицательно влияют на уровни экспрессии. Такие негативные элементы последовательности включают, без ограничения, области, имеющие очень высокое (больше 80%) или очень низкое (меньше 30%) содержание GC; обогащенные AT или обогащенные GC отрезки; нестабильные прямые или инвертированные последовательности повторов; вторичные структуры R А; и/или внутренние скрытые регуляторные элементы, такие как внутренние ТАТА-боксы, chi-сайты, сайты посадки рибосомы и/или донорные/акцепторные сайты сплайсинга.

Согласно настоящему изобретению терапевтический(кие) ген(ны), вставленный(ные) в геном онколитического вируса, для применения в изобретении, связан(ны) функциональным образом с подходящими регуляторными элементами для его экспрессии в клетке-хозяине или субъекте. Термин «регуляторные элементы» или «регуляторная последовательность» в том виде, как он используется в данном документе, относится к любому элементу, который обеспечивает, способствует или модулирует экспрессию терапевтического(ких) гена(нов) в данной клетке-хозяине или субъекте, включая репликацию, дупликацию, транскрипцию, сплайсинг, трансляцию, стабильность и/или транспорт нуклеиновой(вых) кислоты(лот) или ее производного (т.е. мРНК). Фраза «связанный функциональным образом» в том виде, как она используется в данном документе, означает то, что связанные элементы организованы таким образом, что они согласованно функционируют в их намеченных целях. Например, промотор связан с молекулой нуклеиновой кислоты функциональным образом, если промотор осуществляет транскрипцию от сайта инициации транскрипции до терминатора указанной молекулы нуклеиновой кислоты в пермиссивной клетке-хозяине.

Специалистам в данной области будет понятно, что выбор регуляторных последовательностей может зависеть от таких факторов, как сам ген, вирус, в который он вставляется, клетка-хозяин или субъект, желательный уровень экспрессии и т.д. Промотор является особенно важным. В контексте данного изобретения он может быть конститутивным, управляющим экспрессией терапевтического(ких) гена(нов) во многих типах клеток-хозяев или специфичным для определенных клеток-хозяев (например, регуляторные последовательности, специфичные для печени) или регулируемым в ответ на специфические события или экзогенные факторы (например, посредством температуры, питательной добавки, гормона и т.д.), или согласно фазе вирусного цикла (например, поздней или ранней). Также можно использовать промоторы, которые репрессируются во время стадии продуцирования в ответ на специфические события или экзогенные факторы для того, чтобы оптимизировать продуцирование вируса и обойти потенциальную токсичность экспрессируемого(мых) полипептида(дов).

Промоторы, подходящие для конститутивной экспрессии в клетках млекопитающих, включают немедленный ранний промотор цитомегаловируса (CMV) (US 5168062), промотор RSV, главный поздний промотор аденовируса, промотор фосфоглицерокиназы (PGK) (Adra et al., 1987, Gene 60: 65-74), промотор тимидинкиназы (ТК) вируса простого герпеса (HSV)-1 и промотор полимеразы Т7 (WO 98/10088), но не ограничиваются ими. Промоторы вируса осповакцины являются особенно адаптированными для экспрессии в онколитических вирусах группы оспы. Типичные примеры включают, без ограничения, промотор вируса осповакцины 7.5K, H5R, 11K7.5 (Erbs et al., 2008, Cancer Gene Ther. 15(1): 18-28), TK, p28, p11 и K1L, а также синтетические промоторы, такие как описанные у Chakrabarti et al. (1997, Biotechniques 23: 1094-7; Hammond et al, 1997, J. Virol Methods 66: 135-8; и Kumar and Boyle, 1990, Virology 179: 151-8), а также ранние/поздние химерные промоторы. Подходящие для онколитического вируса кори промоторы включают, без ограничения, любой промотор, управляющий экспрессией транскрипционных единиц кори (Brandler and Tangy, 2008, CIMID 31: 271).

Специалистам в данной области будет понятно, что регуляторные элементы, контролирующие экспрессию терапевтического(ких) гена(нов), могут, кроме того, содержать дополнительные элементы для правильной инициации, регуляции и/или терминации транскрипции (например, полиА последовательности терминации транскрипции), транспорта мРНК (например, сигнальные поседовательности ядерной локализации), процессинга (например, сигналы сплайсинга) и стабильности (например, интроны и некодирующие последовательности 5' и 3'), трансляции (например, инициирующий Met, трехкомпонентные лидерные последовательности, сайты связывания рибосомы IRES, сигнальные пептиды и т.д.).

Терапевтический ген может быть вставлен в любом положении вирусного генома, с особым предпочтением в отношении несущественного локуса. Например, ген TK является особенно подходящим для вставки в онколитический вирус осповакцины.

В предпочтительном воплощении онколитический вирус для применения в изобретении представляет собой вирус осповакцины (предпочтительно из штамма Copenhagen), дефектный по активностям и TK, и RR (например, в результате инактивирующих мутаций в обоих вирусных генах J2R и I4L). Более предпочтительно указанный вирус осповакцины снабжен суицидным геном с конкретным предпочтением в отношении суицидного гена FCU1, описанного в данном документе. Даже более предпочтительно суицидный ген (например, FCU1) находится под транскрипционным контролем промотора вируса осповакцины р11K7.5. Еще более предпочтительно FCU1, размещенный под контролем промотора вируса осповакцины, вставляется в локус ТК вирусного генома.

В альтернативном и также предпочтительном воплощении онколитический вирус для применения в изобретении представляет собой вирус осповакцины (предпочтительно из штамма Wyeth), дефектный в отношении активности TK (в результате инактивирующих мутаций в гене J2R вируса). Более предпочтительно указанный вирус осповакцины снабжен иммуностимулирующим терапевтическим геном с особым предпочтением в отношении человеческого гена GM-CSF, описанного в данном документе. Даже более предпочтительно терапевтический ген (например, GM-CSF) находится под транскрипционным контролем синтетического раннего-позднего промотора вируса осповакцины и предпочтительно вставлен в локус TK.

Типично онколитический вирус для применения согласно настоящему изобретению продуцируется в подходящей линии клеток-хозяев с использованием традиционных методик, включающих культивирование трансфицированных или инфицированных клеток-хозяев при подходящих условиях таким образом, чтобы обеспечить продуцирование инфекционных вирусных частиц и выделение продуцированных инфекционных вирусных частиц из культуры указанных клеток, и возможно очистку указанных выделенных инфекционных вирусных частиц. Подходящие клетки-хозяева для продуцирования онколитического вируса включают, без ограничения, человеческие линии клеток, такие как HeLa (АТСС (Американская коллекция типовых клеточных культур)), клетки 293 (Graham et al., 1997, J. Gen. Virol. 36: 59-72), HER96, PER-C6 (Fallaux et al., 1998, Human Gene Ther. 9: 1909-17), клетки птиц, такие как клетки, описанные в WO 2005/042728, WO 2006/108846, WO 2008/129058, WO 2010/130756, WO 2012/001075 и т.д., линии клеток хомяка, такие как BHK-21 (клетки почки новорожденного хомяка-21) (АТСС CCL-10), а также первичные фибробласты эмбриона цыпленка (CEF), полученные из эмбрионов цыплят, полученных из оплодотворенных яиц. Онколитический вирус может быть по меньшей мере частично выделен до применения согласно настоящему изобретению. Можно рассматривать разные стадии очистки, включая осветление, ферментативную обработку (например, бензоназа, протеаза), стадии хроматографии и фильтрования. Подходящие способы описаны в данной области (например, WO 2007/147528; WO 2008/138533, WO 2009/100521, WO 2010/130753, WO 2013/022764).

Модулятор(ры) иммунологической контрольной точки

Иммунологические контрольные точки и их модуляторы, а также способы применения таких соединений описаны в литературе. Согласно данному изобретению один или более чем один модулятор иммунологической контрольной точки может представлять собой, независимо, полипептид или молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид; причем указанный полипептид содержит домен, способный к связыванию с целевой иммунологической контрольной точкой и/или ингибирующий связывание лиганда с указанной целевой иммунологической контрольной точкой таким образом, чтобы осуществлять антагонистическую функцию (т.е. имеющий способность оказывать антагонистический эффект на ингибирующий сигнал, опосредованный иммунологической контрольной точкой) или агонистическую функцию (т.е. имеющий способность наращивать стимулирующий сигнал, опосредованный иммунологической контрольной точкой). Такой один или более чем один модулятор иммунологической контрольной точки может быть независимо выбран из группы, состоящей из пептидов (например, пептидные лиганды), растворимых доменов природных рецепторов, РНКи (интерферирующая РНК), антисмысловых молекул, антител и белковых каркасов.

В предпочтительном воплощении модулятор иммунологической контрольной точки представляет собой антитело. В контексте изобретения термин «антитело» («Ab») используется в самом широком смысле и охватывает встречающиеся в природе и сконструированные человеком, а также полноразмерные антитела или их функциональные фрагменты или аналоги, которые способны к связыванию с целевой иммунологической контрольной точкой или эпитопом (таким образом, сохраняющие часть, связывающуюся с мишенью). Антитело, используемое в данном изобретении, может иметь любое происхождение, например, может быть человеческим, гуманизированным, животным (например, антитело грызуна или верблюдового) или химерным. Оно может иметь любой изотип с особып предпочтением в отношении изотипа IgG1 или IgG4. Кроме того, оно может быть гликозилированным или негликозилированным. Термин антитело также включает биспецифичные или мультиспецифичные антитела, при условии, что они демонстрируют специфичность связывания, описанную в данном документе.

Для иллюстративных целей полноразмерные антитела представляют собой гликопротеины, содержащие по меньшей мере две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи, взаимосвязанные дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (VH) и константной области тяжелой цепи, которая составлена из трех доменов СН1, СН2 и СН3 (в конечном счете, с шарнирной областью между СН1 и СН2). Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (VL) и константной области легкой цепи, которая содержит один домен CL. Области VH и VL содержат гипервариабельные области, именуемые областями, определяющими комплементарность (CDR), с вкраплением более консервативных областей, названных каркасными областями (FR). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR в следующем порядке: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. Области CDR тяжелой и легкой цепей являются детерминантами для специфичности связывания.

Термин «гуманизированное антитело» в том виде, как он используется в данном документе, относится к антителу, не являющемуся человеческим (например, мышиному, верблюжьему, крысиному и т.д.), последовательность белка которого была модифицирована для увеличения его сходства с человеческим антителом (т.е. продуцированным в природе у человека). Способ гуманизации хорошо известен в данной области (см., например, Presta et al., 1997, Cancer Res. 57(20): 4593-9; US 5225539; US 5530101; US 6180370; WO 2012/110360). Например, моноклональное антитело, разработанное для применения у человека, может быть гуманизировано посредством замены одного или более чем одного остатка областей FR для того, чтобы они выглядели подобно последовательности человеческого иммуноглобулина, тогда как подавляющее большинство остатков вариабельных областей (особенно CDR) не модифицируется и соответствует остаткам иммуноглобулина, не являющегося человеческим. Относительно общего руководства, число данных замен аминокислот в областях FR типично составляет не более 20 в каждой вариабельной области VH или VL.

Термин «химерное антитело» в том виде, как он используется в данном документе, относится к антителу, содержащему один или более чем один элемент одного вида и один или более чем один элемент другого вида, например, антитело, не являющееся человеческим, содержащее по меньшей мере часть константной области (Fc) человеческого иммуноглобулина.

Для применения в комбинации по изобретению могут быть сконструированы многие формы антитела. Показательные примеры включают, без ограничения, Fab, Fab', F(ab')2, dAb, Fd, Fv, scFv, ди-scFv, диатело и т.д. Более конкретно:

(i) фрагмент Fab, представленный одновалентным фрагментом, состоящим из доменов VL, VH, CL и СН1;

(ii) фрагмент F(ab')2, представленный двухвалентным фрагментом, содержащим два фрагмента Fab, связанных по меньшей мере одним дисульфидным мостиком в шарнирной области;

(iii) фрагмент Fd, состоящий из доменов VH и СН1;

(iv) фрагмент Fv, состоящий из доменов VL и VH одного плеча антитела;

(v) фрагмент dAb, состоящий из фрагмента в виде единичного вариабельного домена (домена VH или VL);

(vi) одноцепочечный Fv (scFv), состоящий из двух доменов фрагмента Fv -VL и VH, которые слиты друг с другом, в конечном счете, с использованием линкера с получением одной белковой цепи (см., например, Bird et al., 1988, Science 242: 423-6; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-83; US 4946778; US 5258498); и

(vii) любое другое искусственное антитело.

Способы получения антител, их фрагментов и аналогов известны в данной области (см., например, Harlow and Lane, 1988, Antibodies - A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY). Можно упомянуть, например, методику гибридомы (как описано в Kohler and Milstein, 1975, Nature 256: 495-7; Cote et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2026-30; Cole et al. в Monoclonal antibodies and Cancer Therapy; Alan Liss pp77-20 96), методики генной инженерии (например, с использованием способов фагового дисплея), синтез пептидов и ферментативное расщепление. Фрагменты антител можно получать методикой генной инженерии, как описано в данном документе. Их также можно получать протеолитическим расщеплением такими ферментами, как папаин - с получением фрагментов Fab, или пепсин - с получением фрагментов F(ab)'2, как описано в литературе (см., например, Wahl et al., 1983, J. Nucl. Med. 24: 316-25). Аналоги (или их фрагмент) могут быть получены традиционными способами молекулярной биологии (ПЦР, методики мутагенеза). При необходимости такие фрагменты и аналоги могут быть подвергнуты скринингу на функциональность тем же самым способом, что и интактные антитела (например, посредством стандартного анализа ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ).

В предпочтительном воплощении по меньшей мере один из одного или более чем одного модулятора иммунологической контрольной точки для применения в настоящем изобретении представляет собой моноклональное антитело, с конкретным предпочтением в отношении человеческого (в котором обе каркасные области происходят из последовательностей иммуноглобулина человеческой зародышевой линии) или гуманизированного антитела согласно хорошо известному способу гуманизации.

Желательно один или более чем один модулятор иммунологической контрольной точки, используемый в настоящем изобретении, оказывает по меньшей мере частичный антагонистический эффект (например, более чем на 50%) на активность ингибирующей(щих) иммунологической(ких) контрольной(ных) точки(чек), в частности, иммунологических контрольных точек, опосредованных любым из следующих: PD-1, PD-L1, PD-L2, LAG3, Tim3, KIR, BTLA и CTLA4, с конкретным предпочтением в отношении моноклонального антитела, которое специфично связывается с любым из таких белков-мишеней. Термин «специфично связывается с» относится к способности к специфичности связывания и аффинности в отношении конкретной мишени или эпитопа, даже в присутствии гетерогенной популяции других белков и биологических агентов. Таким образом, при обозначенных условиях анализа антитело, используемое в данном изобретении, предпочтительно связывается с его мишенью и не связывается в значимом количестве с другими компонентами, присутствующими в анализируемом образце или субъекте. Предпочтительно такое антитело демонстрирует высокоаффинное связывание с его мишенью с равновесной константой диссоциации, равной или меньшей 1×10^-6 (например, по меньшей мере 0,5×10^-6, 1×10^-7, 1×10^-8, 1×10^-9, 1×10^-10 и т.д.). В качестве альтернативы, один или более чем один модулятор иммунологической контрольной точки, используемый в настоящем изобретении, имеет агонистическую функцию в том смысле, что он способен стимулировать или усиливать стимулирующие сигналы, в частности, сигналы, опосредованные CD28, с особым предпочтением в отношении любой из иммунологических контрольных точек ICOS, CD137 (или 4-1 ВВ), ОХ40, CD27, CD40 и GITR. Стандартные анализы для оценки способности антител к связыванию в отношении иммунологических контрольных точек известны в данной области, включая, например, ELISA, вестерн-блоттинг, RIA (радиоиммуноанализ) и проточную цитометрию. Кинетику связывания (например, аффинность связывания) антител также можно оценивать стандартными анализами, известными в данной области, такими как анализ Biacore.

В предпочтительном воплощении по меньшей мере один или более чем один модулятор контрольной точки для применения в данном изобретении включает человеческое или гуманизированное антитело, способное оказывать антагонистический эффект на иммунологическую контрольную точку, участвующую в ответе, опосредованном Т-клетками. Предпочтительный пример модулятора иммунологической контрольной точки представлен модулятором, способным оказывать антагонистический эффект, по меньшей мере частично, на белок программируемой смерти 1 (PD-1), и особенно антителом, которое специфично связывается с человеческим PD-1. PD-1 является частью надсемейства генов иммуноглобулинов (Ig) и членом семейства CD28. Он представляет собой 55 кДа трансмембранный белок типа 1, экспрессируемый на «обученных» антигеном клетках (например, на активированных В-клетках, Т-клетках и миелоидных клетках) (Agata et al., 1996, Int. Immunol. 8: 765-72; Okazaki et al., 2002, Curr. Opin. Immunol. 14: 391779-82; Bennett et al., 2003, J. Immunol 170: 711-8). В нормальном контексте он действует посредством ограничения активности Т-клеток во время воспалительного ответа, защищая, посредством этого, нормальные ткани от разрушения (Topalian, 2012, Curr. Opin. Immunol. 24: 207-12). Для PD-1 были идентифицированы два лиганда, соответственно PD-L1 (лиганд программируемой смерти 1) и PD-L2 (лиганд программируемой смерти 2) (Freeman et al., 2000, J. Exp. Med. 192: 1027-34; Carter et al., 2002, Eur. J. Immunol. 32: 634-43). PD-L1 был идентифицирован при 20-50% человеческих раковых заболеваний (Dong et al., 2002, Nat. Med. 8: 787-9). Взаимодействие между PD-1 и PD-L1 приводило к уменьшению числа инфильтрующих опухоль лимфоцитов, уменьшению пролиферации, опосредованной рецептором Т-клеток, и ускользанию раковых клеток от иммунологического надзора (Dong et al., 2003, J. Mol. Med. 81: 281-7; Blank et al., 2005, Cancer Immunol. Immunother. 54: 307-314). Полные нуклеотидную и аминокислотную последовательности PD-1 можно найти под № доступа GenBank U64863 и NP_005009.2. В данной области доступен целый ряд антител против PD1 (см., например, антитела, описанные в WO 2004/004771; WO 2004/056875; WO 2006/121168; WO 2008/156712; WO 2009/014708; WO 2009/114335; WO 2013/043569 и WO 2014/047350). Предпочтительные антитела против PD-1 в контексте данного изобретения одобрены FDA (Управление США по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств) или находятся на продвинутой стадии клинической разработки, и, в частности, можно использовать антитело против PD-1, выбранное из группы, состоящей из ниволумаба (также называется BMS-936558, разрабатывается Bristol Myer Squibb), пембролизумаба (также называется ланбролизумаб или МК-3475; разрабатывается Merck) и пидилизумаба (также называется СТ-011; разрабатывается CureTech).

Другой предпочтительный пример модулятора иммунологической контрольной точки представлен модулятором, способным оказывать антагонистический эффект, по меньшей мере частично, на лиганд PD-1, именуемый PD-L1, и особенно антителом, которое распознает человеческий PD-L1. В данной области доступен целый ряд антител против PD-L1 (см., например, антитела, описанные в ЕР 1907000). Предпочтительные антитела против PD-L1 одобрены FDA или находятся на продвинутой стадии клинической разработки (например, MPDL3280A, разрабатывается Genentech/Roche, и BMS-936559, разрабатывается Bristol Myer Squibb).

Еще один предпочтительный пример модулятора иммунологической контрольной точки представлен модулятором, способным оказывать антагонистический эффект, по меньшей мере частично, на белок CTLA-4, и особенно антителом, которое распознает человеческий CTLA-4. CTLA4 (антиген 4, ассоциированный с цитотоксическими Т-лимфоцитами), также известный как CD152, был идентифицирован в 1987 году (Brunet et al., 1987, Nature 328: 267-70) и кодируется геном CTLA4 (Dariavach et al., Eur. J. Immunol. 18: 1901-5). CTLA4 является членом надсемейства рецепторов иммуноглобулинов. Он экспрессируется на поверхности Т-клеток-хелперов, где он, в первую очередь, регулирует амплитуду ранних этапов активации Т-клеток. Недавняя работа свидетельствовала о том, что CTLA-4 может функционировать in vivo посредством захвата и удаления В7-1 и В7-2 из мембран антигенпрезентирующих клеток, делая их, таким образом, недоступными для запуска CD28 (Qureshi et al., Science, 2011, 332: 600-3). Полная последовательность нуклеиновой кислоты CTLA-4 может быть найдена под № доступа GenBank LI 5006. В данной области доступен целый ряд антител против CTLA-4 (см., например, антитела, описанные в US 8491895). Предпочтительные антитела против CTLA-4 в контексте данного изобретения одобрены FDA или находятся на продвинутой стадии клинической разработки. Более конкретно можно упомянуть ипилимумаб, распространяемый на рынке Bristol Myer Squibb под названием ервой (см., например, US 6984720; US 8017114), тремелимумаб, разрабатываемый Pfizer (см., например, US 7109003 и US 8143379), и одноцепочечные антитела против CTLA4 (см., например, WO 97/20574 и WO 2007/123737).

Модулятор иммунологической контрольной точки для оказания антагонистического эффекта на рецептор LAG3 также можно использовать в комбинации с настоящим изобретением (см., например, US 5773578).

Другой пример модулятора иммунологической контрольной точки представлен агонистом ОХ40, таким как агонист лиганда ОХ40 (OX40L) (см., например, US 5457035, US 7622444; WO 03/082919), или антителом, направленным на рецептор ОХ40 (см., например, US 7291331 и WO 03/106498).

Другие примеры модуляторов иммунологической контрольной точки представлены антителом против KIR или против CD96, нацеленным на ингибирующие рецепторы, которые имеют Т-клетки CD8+ или клетки NK (природный киллер).

Настоящее изобретение охватывает комбинацию, содержащую более чем один модулятор иммунологической контрольной точки. Предпочтительный пример включает, без ограничения, применение антитела против CTLA-4 и антитела против PD-1 в комбинации с онколитическим вирусом, как описано в данном документе.

Продуцирование модулятора иммунологической контрольной точки

Один или более чем один модулятор иммунологической контрольной точки для применения в данном изобретении может быть получен способами генной инженерии с использованием подходящих экспрессионных векторов и клеток-хозяев.

Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие релевантную(ные) часть(ти) желательного модулятора иммунологической контрольной точки, могут быть получены с использованием стандартных методик молекулярной биологии (например, ПЦР-амплификация, клонирование кДНК, химический синтез), используя данные о последовательностях, доступные в данной области, и предложенную в данном документе информацию. Например, кДНК, кодирующие легкие и тяжелые цепи антитела или их CDR, могут быть выделены из продуцирующих гибридом, библиотек генов иммуноглобулинов или любого доступного источника.

В одном воплощении молекулу(лы) нуклеиновой кислоты, кодирующую(щие) модулятор(ры) иммунологической контрольной точки, может(гут) быть клонированы в подходящем векторе и экспрессированы в клетке-хозяине с получением указанного модулятора иммунологической контрольной точки посредством способов генной инженерии. Вставку в экспрессионный вектор можно проводить посредством традиционных методик молекулярной биологии, например, как описано в Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory). Вставку в аденовирусный вектор или вектор на основе вируса группы оспы можно проводить посредством гомологичной рекомбинации, как описано у Chartier et al. (1996, J. Virol. 70: 4805-10) и Paul et al. (2002, Cancer gene Ther. 9: 470-7) соответственно. Как описано в данном документе в связи с терапевтическим геном, молекула(лы) нукеиновой кислоты, кодирующая(щие) модулятор(ры) иммунологической контрольной точки, также может(гут) быть оптимизирована(ны) для увеличения уровней экспрессии.

Для экспрессии одного или более чем одного модулятора иммунологической контрольной точки для применения в настоящем изобретении может быть использовано или сконструировано множество систем хозяин-вектор, включая прокариотические организмы, такие как бактерии (например, Е. coli или Bacillus subtilis); дрожжи (например, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pombe, Pichia pastoris); системы на основе клеток насекомых (например, клетки Sf 9 и бакуловирус); системы на основе растительных клеток (например, вирус мозаики цветной капусты, CaMV; вирус мозаики тобака, TMV) и системы на основе клеток млекопитающих (например, культивируемые клетки). Типично такие векторы имеются в продаже (например, у Invitrogen, Stratagene, Amersham Biosciences, Promega и т.д.) или доступны в организациях-депозитариях, таких как Американская коллекция типовых клеточных культур (АТСС, Rockville, Md.), или были темой многочисленных публикаций, описывающих их последовательность, организацию и способы продуцирования, позволяя специалисту применять их.

Подходящие векторы для применения в прокариотических системах включают, без ограничения, pBR322 (Gibco BRL), pUC (Gibco BRL), pbluescript (Stratagene), p Poly (Lathe et al., 1987, Gene 57: 193-201), pTrc (Amann et al., 1988, Gene 69: 301-15); pET lid (Studier et al., 1990, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185: 60-89); pIN (Inouye et al., 1985, Nucleic Acids Res. 13: 3101-9; Van Heeke et al., 1989, J. Biol. Chem. 264: 5503-9); и векторы pGEX, где молекула нуклеиновой кислоты может экспрессироваться в слиянии с глутатион-S-трансферазой (GST) (Amersham Biosciences Product).

Подходящие векторы для экспрессии в дрожжах (например, S. cerevisiae) включают pYepSed (Baldari et al., 1987, EMBO J. 6: 229-34), pMFa (Kujan et al., 1982, Cell 30: 933-43), pJRY88 (Schultz et al., 1987, Gene 54: 113-23), pYES2 (Invitrogen Corporation) и pTEF-MF (Dualsystems Biotech Product), но не ограничиваются ими.

Подходящие плазмидные векторы для экспрессии в клетках-хозяевах млекопитающих включают, без ограничения, pREP4, рСЕР4 (Invitrogene), pCI (Promega), pCDM8 (Seed, 1987, Nature 329: 840) и pMT2PC (Kaufman et al., 1987, EMBO J. 6: 187-95), pVAX и pgWiz (Gene Therapy System Inc; Himoudi et al., 2002, J. Virol. 76: 12735-46).

Системы экспрессии на основе вирусов, которые также могут быть использованы в контексте изобретения, происходят из множества разных вирусов (например, бакуловирус, ретровирус, аденовирус, AAV, вирус группы оспы, вирус кори и тому подобное). Термин «вирусный вектор» в том виде, как он используется в данном документе, охватывает ДНК вектора, а также вирусные частицы, полученные на ее основе. Вирусные векторы предпочтительно являются дефектными по репликации или имеют ослабленную репликацию.

Кроме того, экспрессионный вектор, используемый в контексте настоящего изобретения, также может содержать один или более чем один дополнительный элемент, обеспечивающий поддержание, размножение или экспрессию молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей модулятор иммунологической контрольной точки в клетке-хозяине. Такие дополнительные элементы включают, без ограничения, маркерный(ные) ген(ны) для того, чтобы облегчать идентификацию и выделение рекомбинантных клеток-хозяев (например, посредством комплементации ауксотрофии клетки или посредством устойчивости к антибиотику), стабилизирующие элементы (например, последовательность сег, как описано в Summers and Sherrat, 1984, Cell 36: 1097-103 и систему DAP, как описано в US 5198343), и интегративные элементы (например, вирусные последовательности LTR (длинные концевые повторы) и транспозоны).

Подходящие маркерные гены для экспрессии в прокариотических клетках-хозяевах включают гены устойчивости к тетрациклину и ампициллину. Также для экспрессии в клетках-хозяевах млекопитающих можно использовать гены устойчивости, такие как ген дигидрофолатредуктазы (dhfr), который придает устойчивость к метотрексату (Wigler et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 3567; O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527); gpt, который придает устойчивость к микофеноловой кислоте (Mulligan and Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072); neo, который придает устойчивость к аминогликозиду G-418 (Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150: 1); zeo, который придает устойчивость к зеомицину, капа, который придает устойчивость к канамицину, и hygro, который придает устойчивость к гигромицину (Santerre et al., 1984, Gene 30: 147). Гены URA3 и LEU2, которые обеспечивают комплементацию дрожжевых мутантов ura3 или leu2, можно использовать для экспрессии в дрожжевых системах.

Экспрессионный вектор, когда это является подходящим, может быть объединен с одним или более чем одним веществом, которое улучшает трансфекционную эффективность и/или стабильность вектора. Данные вещества широко задокументированы в литературе. Показательные примеры трансфекционных реактивов, способных облегчать введение вектора в клетку-хозяина, включают, без ограничения, поликатионные полимеры (например, хитозан, полиметакрилат, PEI (полиэтиленимин), катионные липиды (например, DC-Chol/DOPE, трансфектам, липофектин, теперь доступные у Promega) и липосомы.

Методики генной инженерии также можно использовать для улучшения экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине, например, посредством применения векторов с большим числом копий, замены или модифицирования одной или более чем одной регуляторной последовательности транскрипции (например, промотора, энхансера и тому подобного), оптимизации использования кодона для клетки-хозяина и подавления негативных последовательностей, которые могут дестабилизировать транскрипт.

Предпочтительно молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая модулятор иммунологической контрольной точки, находится в подходящей форме для ее экспрессии в клетке-хозяине, что означает то, что данная молекула нуклеиновой кислоты помещается под контроль одной или более чем одной регуляторной последовательности, подходящей для вектора, в клетку-хозяина и/или имеет желательный уровень экспрессии, как описано в связи с терапевтическим геном.

Подходящие для экспрессии в клетке-хозяине Е. coli промоторы включают промотор pL бактериофага лямбда, промоторы lac, TRP или индуцируемый IPTG (изопропилтиогалактозид) промотор рТАС, но не ограничиваются ими. Подходящие для экспрессии в дрожжах промоторы включают промоторы TEF (Mumberg et al., 1995, Gene 156: 119-22), PGK (Hitzeman et al., 1983, Science 219: 620-5), MF альфа (Inokuchi et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 3185-93), CYC-1 (Guarente et al, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2199), GAL-1, GAL4, GAL10, PHO5, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAP или GAPDH) и алкогольдегидрогеназы (ADH) (Denis et al., 1983, J. Biol. Chem. 25: 1165). Также можно использовать индуцибельные эукариотические промоторы, регулируемые подаваемыми экзогенно соединениями, включая, без ограничения, индуцируемый цинком промотор металлотионеина (МТ) (Мс Ivor et al., 1987, Mol. Cell Biol. 7: 838-48), индуцируемый дексаметазоном (Dex) промотор мышиного вируса опухоли молочной железы (MMTV), экдизоновый промотор насекомых (No et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 3346-51), репрессируемый тетрациклином промотор (Gossen et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547-51), индуцируемый тетрациклином промотор (Kim et al., 1995, J. Virol. 69: 2565-73), индуцируемый RU486 промотор (Wang et al., 1997, Nat. Biotech. 15: 239-43) и индуцируемый рапамицином промотор (Magari et al., 1997, J. Clin. Invest. 100: 2865-72). Наконец, промоторы, описанные для экспрессии терапевического гена, также являются подходящими, особенно для экспрессии одного или более чем одного модулятора иммунологической контрольной точки, особенно в клетках млекопитающих.

Согласно настоящему изобретению модулятор иммунологической контрольной точки может быть модифицирован. Могут рассматриваться разные модификации, такие как модифицирующие аминокислотную последовательность, а также модификации, нацеленные на увеличение его биологического времени полужизни, его аффинности или его стабильности.

Например, сигнальный пептид может быть включен для облегчения секреции модулятора иммунологической контрольной точки в культуре клеток. Сигнальный пептид типично вставлен на N-конце белка непосредственно после Met инициатора. Выбор сигнальных пептидов является широким, и он доступен специалистам в данной области.

В качестве дополнительного примера также может быть добавлена пептидная метка (типично короткая пептидная последовательность, которая может быть распознана доступными антисыворотками или соединениями) для облегчения очистки рекомбинантного модулятора иммунологической контрольной точки. В контексте данного изобретения может быть использован широкий спектр пептидных меток, включая, без ограничения, метку РК, октапептид FLAG, метку MYC, метку HIS (обычно отрезок из 4-10 остатков гистидина) и е-метку (US 6686152). Пептидная(ные) метка(ки) может(гут) быть независимо расположена(ны) на N-конце белка или, в качестве альтернативы, на его С-конце, или, в качестве альтернативы, внутри или в любом из данных положений при использовании нескольких меток. Пептидные метки могут быть выявлены посредством иммунодетектирующих анализов с использованием антител против метки.

В качестве другого примера, может быть изменено гликозилирование модулятора иммунологической контрольной точки таким образом, чтобы увеличить его аффинность в отношении его мишени. Такие модификации можно осуществлять, например, посредством мутирования одного или более чем одного остатка в пределах сайта(тов) гликозилирования. В качестве альтернативы, можно модифицировать тип гликозилирования, например, посредством экспрессии в клетке-хозяине с измененным аппаратом гликозилирования. Для иллюстративных целей негликозилированный белок можно экспрессировать в Е. coli, тогда как модулятор, не имеющий фукозы на его углеводах, может быть продуцирован в других клетках, таких как клетки, описанные в US 2004-0110704 (не имеющие активности альфа-(1,6)-фукозилтрансферазы). Было описано, что такие измененные картины гликозилирования увеличивают способность антител стимулировать ADCC (антителозависимая клеточная цитотоксичность).

Другой модификацией является ПЭГилирование, например, для увеличения биологического периода полужизни антитела. Способы ПЭГилирования белков известны в данной области (см., например, ЕР 154316; ЕР 401384; WO 98/15293, WO 01/23001 и т.д.).

Другим подходом, которому можно следовать в контексте настоящего изобретения, является связывание модулятора иммунологической контрольной точки с внешним агентом, таким как радиосенсибилизирующий агент, цитотоксический агент и/или метящий агент. Связывание может быть ковалентным или нет. Термин «радиосенсибилизатор» в том виде, как он используется в данном документе, относится к молекуле, которая делает клетки более чувствительными к лучевой терапии. Радиосенсибилизатор включает метронидазол, мисонидазол, десметилмисонидазол, пимонидазол, этанидазол, ниморазол, митомицин С, RSU 1069, SR 4233, Е09, RB 6145, никотинамид, 5-бромдезоксиуридин (BUdR), 5-йоддезоксиуридин (IUdR), бромдезоксиуридин, фтордезоксиуридин (FUdR), гидроксимочевина и цисплатин, но не ограничивается ими.

Термин «цитотоксический агент» в том виде, как он используется в данном документе, относится к соединению, которое является непосредственно токсичным для клеток, предотвращая их репродукцию или рост, как, например, токсины (например, ферментативно активный токсин бактериального, грибного, растительного или животного происхождения, или его фрагменты). Термин «метящий агент» в том виде, как он используется в данном документе, относится к выявляемому соединению. Метящий агент может быть выявляемым сам по себе (например, метки на основе радиоактивных изотопов или флуоресцентные метки) или, в случае ферментативной метки, может катализировать химическую модификацию соединения-субстрата, которое является выявляемым.

Способы рекомбинантного продуцирования модулятора иммунологической контрольной точки являются традиционными в данной области. Типично такие способы включают (а) введение экспрессионного вектора, описанного в данном документе, в подходящую клетку-продуцент с получением трансфицированной или инфицированной клетки-продуцента, (б) культивирование in vitro указанной трансфицированной или инфицированной клетки-продуцента при подходящих условиях для ее роста, (в) выделение модулятора иммунологической контрольной точки из культуры клеток и (г) возможно очистку выделенного модулятора иммунологической контрольной точки. В контексте данного изобретения клетки-продуценты включают прокариотические клетки, низшие эукариотические клетки, такие как дрожжи, и другие эукариотические клетки, такие как клетки насекомых, растений и млекопитающих (например, человеческие и не являющиеся человеческими). Предпочтительные клетки Е. coli включают, без ограничения, Е. coli BL21 (Amersham Biosciences). Предпочтительные дрожжевые клетки-продуценты включают, без ограничения, S. cerevisiae, S. pombe, Pichia pastoris. Предпочтительные клетки-продуценты млекопитающих включают, без ограничения, BHK-21 (клетки почки новорожденного хомяка), CV-1 (линия клеток почки африканской зеленой мартышки), клетки COS (например, COS-7), клетки яичника китайского хомяка (СНО), мышиные клетки NIH/3T3, мышиные миеломные клетки NSO, клетки HeLa, клетки Vero, клетки HEK293 и клетки PERC.6, а также соответствующие гибридомные клетки.

Клетки-продуценты можно культивировать в традиционных ферментационных биореакторах, колбах и чашках Петри. Культивирование можно проводить при температуре, рН и содержании кислорода, подходящих для данной клетки-хозяина. В данном документе не будет сделано попыток подробного описания разных способов, известных для продуцирования белков в прокариотических и эукариотических клетках. Продуцирование модулятора иммунологической контрольной точки может быть периплазматическим, внутриклеточным или, предпочтительно, он может секретироваться наружу из кетки-продуцента (например, в культуральную среду).

При необходимости, особенно когда модулятор иммунологической контрольной точки не секретируется наружу из кетки-продуцента, или когда он совсем не секретируется, он может быть выделен стандартными методиками лизиса, включающими замораживание/оттаивание, обработку ультразвуком, механическое разрушение, применение лизирующих агентов и тому подобное. При секреции он может быть выделен непосредственно из культуральной среды.

Модулятор иммунологической контрольной точки можно затем очищать хорошо известными способами очистки, включающими осаждение сульфатом аммония, кислотную экстракцию, гель-электрофорез, фильтрование и хроматографические способы (например, хроматография с обращенной фазой, гель-фильтрация, ионообменная, аффинная, на фосфоцелюлозе, на основе гидрофобных взаимодействий или на гидроксиапатите и т.д.). Использованные для очистки конкретного белка условия и технология будут зависеть от таких факторов, как нетто заряд, молекулярная масса, гидрофобность, гидрофильность и будут очевидными для специалистов в данной области. Кроме того, уровень очистки будет зависеть от намеченного применения. Также понятно то, что, в зависимости от клетки-продуцента, белки-модуляторы иммунологических контрольных точек могут иметь разные картины гликозилирования или могут быть негликозилированными (например, при продуцировании в бактериях), как описано в данном документе.

Желательно модулятор иммунологической контрольной точки, применяемый в настоящем изобретении, по меньшей мере частично очищают в том смысле, что он по существу не содержит других антител, имеющих отличные антигенные специфичности и/или другой клеточный материал. Кроме того, модулятор иммунологической контрольной точки может быть приготовлен согласно условиям, традиционно используемым в данной области (например, WO 2009/073569).

Другой аспект данного изобретения относится к применению молекулы(кул) нуклеиновой кислоты, кодирующей(щих) модулятор(ры) иммунологической контрольной точки, описанный(ные) в данном документе. Например, модулятор иммунологической контрольной точки может быть доставлен субъекту в форме вектора, экспрессирующего один или более чем один модулятор иммунологической контрольной точки. В данном контексте можно использовать любой из векторов, описанных в данном документе.

Комбинированная терапия

Онколитический вирус и один или более чем один модулятор иммунологической контрольной точки можно вводить совместно в одной композиции или сопутствующе в отдельных композициях, возможно содержащих фармацевтически приемлемый носитель, помимо терапевтически эффективного количества такого(ких) активного(ных) агента(тов). Одиночная композиция охватывает случай, когда онколитический вирус и указанный один или более чем один модулятор иммунологической контрольной точки смешиваются вместе (например, смесь онколитического вируса и одного или более чем одного антитела, или смесь онколитического вируса и одного или более чем одного вектора для экспрессии одного или более чем одного антитела). Отдельные композиции онколитического вируса и указанного одного или более чем одного модулятора иммунологической контрольной точки можно вводить в то же самое время или последовательно, один раз каждую или несколько раз (раздельно или перемежающим способом) и посредством одинакового или разных путей.

«Терапевтически эффективное количество» соответствует количеству каждого активного агента (онколитический вирус и один или более чем один модулятор иммунологической контрольной точки), содержащегося в комбинации или в композиции по изобретению, которое является достаточным для получения одного или более чем одного полезного результата. Такое терапевтически эффективное количество может варьировать как функция разных параметров, в частности, способа введения; болезненного состояния; возраста и массы субъекта; способности субъекта отвечать на лечение; вида сопутствующего лечения; частоты лечения и/или потребности в профилактике или терапии. Когда рассматривается пофилактическое применение, комбинация вводится в достаточной дозе для предупреждения или для задержки начала и/или установления, и/или рецидива патологического состояния (например, пролиферативного заболевания, такого как рак), особенно у субъекта, подверженного риску. Для «терапевтического» применения комбинация вируса и модулятора(ров) иммунологической контрольной точки вводится субъекту, у которого поставлен диагноз наличия патологического состояния (например, пролиферативного заболевания, такого как рак), с целью лечения заболевания, в конечном счете, в ассоциации с одним или более чем одним традиционным терапевтическим воздействием. В частности, терапевтически эффективное количество могло бы представлять собой то количество, которое необходимо для того, чтобы вызвать наблюдаемое улучшение клинического статуса по сравнению с исходным статусом или по сравнению с ожидаемым статусом в отсутствие лечения, например, уменьшение числа опухолей; уменьшение размера опухолей, уменьшение числа или степени метастазов, увеличение продолжительности ремиссии, стабилизация (т.е. не усугубление) состояния заболевания, задержка или замедление прогрессирования заболевания или увеличения его тяжести, уменьшение интенсивности или временное облегчение болезненного состояния, пролонгированное выживание, лучший ответ на стандартное лечение, улучшение качества жизни, пониженная смертность и т.д. Терапевтически эффективное количество также могло бы быть количеством, необходимым для вызова развития эффективного неспецифичного (врожденного) и/или специфичного противоопухолевого ответа. Типично развитие иммунного ответа в конкретном ответе Т-клеток можно оценивать in vitro, в подходящих животных моделях или с использованием биологических образцов, отобранных у субъекта. Например, для осуществления наблюдения за опухолью можно использовать методики, традиционно используемые в лабораториях (например, проточная цитометрия, гистология). Также можно использовать разные доступные антитела таким образом, чтобы идентифицировать разные популяции иммунных клеток, участвующих в противоопухолевом ответе, которые присутствуют у подвергнутых лечению субъектов, такие как цитотоксические Т-клетки, активированные цитотоксические Т-клетки, клетки-природные киллеры и активированные клетки-природные киллеры. Улучшение клинического статуса можно легко оценивать посредством любого релевантного клинического измерения, типично используемого врачами или другим квалифицированным персоналом системы здравоохранения.

Подразумевается, что термин «фармацевтически приемлемый носитель» включает все и любые носители, растворители, разбавители, эксципиенты, адъюванты, диспергирующие среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства, агенты для поглощения и тому подобное, совместимые с введением млекопитающим и, в частности, человеческим субъектам.

Каждый из онколитического вируса и одного или более чем одного модулятора иммунологической контрольной точки, или их композиции можно независимо помещать в растворитель или разбавитель, подходящий для применения у человека или животного. Растворитель или разбавитель предпочтительно является изотоничным, гипотоничным или слабо гипертоничным и имеет относительно низкую ионную силу. Показательные примеры включают стерильную воду, физиологический раствор (например, хлорид натрия), раствор Рингера, растворы глюкозы, трегалозы или сахарозы, раствор Хэнкса и другие водные физиологически сбалансированные солевые растворы (см., например, самое современное издание Remington: The Science and Practice of Pharmacy, A. Gennaro, Lippincott, Williams&Wilkins).

В других воплощениях каждая из композиции(ций) онколитического вируса и модулятора иммунологической контрольной точки подходящим образом буферизована для применения у человека. Подходящие буферы включают, без ограничения, фосфатный буфер (например, PBS (фосфатно-солевой буферный раствор)), бикарбонатный буфер и/или Tris буфер, способный поддерживать физиологический или слабоосновной рН (например, от приблизительно рН 7 до приблизительно рН 9).

Каждая из композиции(ций) онколитического вируса и/или модулятора иммунолоической контрольной точки также может содержать другие фармацевтически приемлемые эксципиенты для предоставления желательных фармацевтических или фармакодинамических свойств, включающих, например, осмолярность, вязкость, прозрачность, цвет, стерильность, стабильность, скорость растворения композиции, модифицированное или поддерживающееся высвобождение или поглощение у человеческого или животного субъекта, стимуляцию транспорта через гематоэнцефалический барьер или проникновения в конкретный орган.

Каждая из композиции(ций) онколитического вируса и модулятора иммунологической контрольной точки также может содержать один или более чем один адъювант, способный стимулировать иммунитет (особенно иммунитет, опосредованный Т-клетками) или облегчать инфекцию опухолевых клеток при введении, например, посредством Toll-подобных рецепторов (TLR), таких как TLR-7, TLR-8 и TLR-9, включая, без ограничения, квасцы, эмульсию на основе минерального масла, такую как полный и неполный (IFA) адъювант Фрейнда, липополисахарид или его производное (Ribi et al., 1986, Immunology and Immunopharmacology of Bacterial Endotoxins, Plenum Publ. Corp., NY, p407-419), сапонины, такие как QS21 (Sumino et al., 1998, J. Virol. 72: 4931; WO 98/56415), имидазо-хинолиновые соединения, такие как имиквимод (Suader, 2000, J. Am Acad Dermatol. 43:S6), S-27609 (Smorlesi, 2005, Gene Ther. 12: 1324), и родственные соединения, такие как соединения, описанные в WO 2007/147529, цитозинфосфат-гуанозиновые олигодезоксинуклеотиды, такие как CpG (Chu et al., 1997, J. Exp. Med. 186: 1623; Tritel et al., 2003, J. Immunol. 171: 2358), и катионные пептиды, такие как IC-31 (Kritsch et al., 2005, J. Chromatogr Anal. Technol. Biomed. Life Sci. 822: 263-70).

В одном воплощении онколитический вирус и один или более чем один модулятор иммунологической контрольной точки, содержащиеся в комбинации по настоящему изобретению, могут быть приготовлены с целью улучшения их стабильности, в частности, при условиях изготовления и долговременного хранения (т.е. в течение по меньшей мере 6 месяцев, предпочтительно в течение по меньшей мере двух лет) при замораживании (например, -70°С, -20°С), охлаждении (например, 4°С) или при температурах окружающей среды. В данной области доступны разные композиции вируса либо в замороженной, либо в жидкой, либо в лиофилизированной форме (например, WO 98/02522, WO 01/66137, WO 03/053463, WO 2007/056847 и WO 2008/114021, и т.д.). Твердые (например, в виде сухого порошка или лиофилизированные) композиции можно получать способом, включающим вакуумную сушку и лиофилизацию. Для иллюстративных целей стерильные гистидиновые, ацетатные, цитратные или фосфатные буферы, поверхностно-активное вещество, содержащее физиологический раствор, такое как полисорбат 80, и стабилизаторы, такие как сахароза или маннит, адаптированы для консервации рекомбинантных антител, и буферизованные композиции, включающие NaCl и/или сахар, являются особенно адаптированными для консервации вирусов (например, 10 мМ Tris, рН 8, с 5% сахарозой (масс/об.), 10 мМ глутамат натрия и 50 мМ NaCl или фосфатно-солевой буферный раствор с глицерином (10%) и NaCl).

В некоторых воплощениях модулятор иммунологической контрольной точки может быть приготовлен для обеспечения правильного распределения или замедленного высвобождения in vivo. Например, он может быть приготовлен в липосомах. Можно использовать биодеградируемые, биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота. Многие способы приготовления таких композиций описаны, например, J. R. Robinson в "Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems", ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

Подходящая дозировка онколитического вируса и модулятора(ров) иммунологической контрольной точки может быть адаптирована как функция разных параметров и может быть определена согласно установившейся практике практикующим специалистом в свете релевантных обстоятельств. Подходящая дозировка модулятора(ров) иммунологической контрольной точки варьирует от примерно 0,01 мг/кг до примерно 50 мг/кг, преимущественно от примерно 0,1 мг/кг до примерно 30 мг/кг, желательно от примерно 0,5 мг/кг до примерно 25 мг/кг, предпочтительно от примерно 1 мг/кг до примерно 20 мг/кг, более предпочтительно от примерно 2 мг/кг до примерно 15 мг/кг, с конкретным предпочтением в отношении доз от примерно 3 мг/кг до примерно 10 мг/кг (например, 3 мг/кг, 4 мг/кг, 5 мг/кг, 6 мг/кг, 7 мг/кг, 8 мг/кг, 9 мг/кг или 10 мг/кг) при системном использовании. Однако для местной(ных) внутриопухолевой(вых) инъекции(ций) модулятора(ров) иммунологической контрольной точки могут рассматриваться дозы, уменьшенные в 10-100 раз. Подходящая дозировка для онколитического вируса варьирует от приблизительно 10⁵ до приблизительно 10¹³ vp (вирусные частицы), iu (инфекционная единица) или pfu (бляшкообразующие единицы), в зависимости от вируса и использованной количественной методики. В качестве общего руководства, подходящими являются дозы вируса осповакцины от приблизительно 10⁵ до приблизительно 10¹³ pfu, предпочтительно от приблизительно 10⁶ pfu до приблизительно 10¹¹ pfu, более предпочтительно от приблизительно 10⁷ pfu до приблизительно 5×10⁹ pfu; причем дозы от приблизительно 10⁸ pfu до приблизительно 10⁹ pfu являются особенно предпочтительными (например, доза 10⁸, 2×10⁸, 3×10⁸, 4×10⁸, 5×10⁸, 6×10⁸, 7×10⁸, 8×10⁸, 9×10⁸ или 10⁹ pfu), особенно для применения у человека. По тому же самому принципу для местной(ных) внутриопухолевой(вых) инъекции(ций) онколитического вируса могут рассматриваться дозы, уменьшенные в 10-100 раз. Индивидуальные дозы от 10⁶ до 5×10¹² vp являются особенно подходящими для онколитического аденовируса, предпочтительно от 10⁷ до 10¹² vp, более предпочтительно от 10⁸ до 5×10¹¹ vp. Количество вируса, присутствующего в образце, можно определять общепринятыми методиками титрования, например, посредством подсчета числа бляшек после инъекции пермиссивных клеток с использованием пермиссивных клеток (например, BHK-21 или CEF), иммуноокрашивания (например, с использованием антител против вируса; Caroll et al., 1997, Virology 238: 198-211), посредством измерения поглощения при 260 нм (титры vp) или, кроме того, посредством количественной иммунофлуоресценции (титры iu).

Введение

Онколитический вирус и/или модулятор иммунологической контрольной точки можно вводить субъекту совместно или раздельно, и в одной дозе или во многих дозах. Введения можно осуществлять одинаковым или разными путями, и они могут иметь место в том же самом или в альтернативных сайтах.

В контексте данного изобретения для каждого из активных агентов, содержащихся в комбинации по изобретению, применимыми являются любые традиционные пути введения, включая парентеральный, местный пути или путь введения через слизистую. Парентеральные пути предназначены для введения в виде инъекции или инфузии и охватывают системный, а также местный пути. Обычными типами парентеральной инъекции являются внутривенная (в вену), внутриартериальная (в артерию), внутрикожная (в дерму), подкожная (под кожу), внутримышечная (в мышцу) и внутриопухолевая (в опухоль или в непосредственной близости от нее). Инфузии типично даются посредством внутривенного пути. Введения через слизистую включают, без ограничения, пероральный/алиментарный, интраназальный, внутритрахеальный, внутрилегочный, внутривагинальный или интраректальный пути. Местное введение также может осуществляться с использованием чрескожных средств (например, пластыря и тому подобного). При введениях могут использоваться традиционные шприцы и иглы (например, инъекционные иглы Quadrafuse) или любое соединение или устройство, доступное в данной области, способное облегчать или улучшать доставку активного(ных) агента(тов) субъекту. Предпочтительные пути введения для модулятора(ров) иммунологической контрольной точки включают внутривенный (например, внутривенная инъекция или инфузия), внутриопухолевый и внутрибрюшинный. Также могут рассматриваться чрескожные пластыри. Предпочтительные пути введения для онколитического вируса внуключают внутривенный и внутриопухолевый. Местные внутриопухолевые инокуляции онколитического вируса можно было бы преимущественно объединять с местными внутриопухолевыми инъекцями модулятора(ров) иммунологической контрольной точки, сопутствующе или с использованием другой схемы для того, чтобы ожидать оптимальных тормозящих эффектов на удаленные метастазы или опухолевые поражения. Это также может обеспечивать снижение эффективных количеств каждого продукта и также уменьшение нежелательных побочных эффектов.

В предпочтительном воплощении онколитический вирус и один или более чем один модулятор иммунологической контрольной точки можно вводить последовательно, таким образом, что первым вводится онколитический вирус, а модулятор(ры) иммунологической контрольной точки - вторым, или наоборот (модулятор(ры) иммунологической контрольной вводится(дятся) первым(ми), и онколитический вирус - вторым). При использовании более чем одного модулятора иммунологической контрольной точки (например, антител против PD-1 и против CTLA-4), они могут вводиться одновременно или последовательно, причем в данном случае дозировка каждого введенного антитела попадает в пределы интервалов, указанных в данном документе. Кроме того, если более чем одна доза комбинированной терапии вводится последовательно, порядок последовательного введения может быть обращен или поддерживаться в том же самом порядке в каждый момент времени введения. Кроме того, последовательные введения можно объединять с сопутствующими введениями. Также можно действовать посредством последовательных циклов введения, которые повторяются после периода отдыха. Интервалы между каждым введением могут составлять от нескольких часов до одного года (например, 24 ч, 48 ч, 72 ч, еженедельно, каждые две недели, ежемесячно или ежегодно). Интервалы также могут быть нерегулярными (например, после измерения уровней моноклональных антител в крови пациента). Дозы могут варьировать для каждого введения в пределах описанного выше интервала.

В контексте данного изобретения онколитический вирус может вводиться один или несколько раз (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 раз и т.д.) в дозе в пределах интервала от 10⁷ до 5×10⁹ pfu. Интервал времени между каждым введением вируса может варьировать от приблизительно 1 суток до приблизительно 8 недель, преимущественно от приблизительно 2 суток до приблизительно 6 недель, предпочтительно от приблизительно 3 суток до приблизительно 4 недель и даже более предпочтительно от приблизительно 1 недели до приблизительно 3 недель. В комбинации модулятор(ры) иммунологической контрольной точки вводится(дятся) один или несколько раз (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 раз и т.д.) в дозе в пределах интервала от 2 мг/кг до 15 мг/кг. Интервал времени между каждым введением модулятора(ров) иммунологической контрольной точки может варьировать от приблизительно 1 суток до приблизительно 8 недель, преимущественно от приблизительно 2 суток до приблизительно 6 недель, предпочтительно от приблизительно 3 суток до приблизительно 4 недель и даже более предпочтительно от приблизительно 3 суток до приблизительно 3 недель. Для иллюстративной цели предпочтительная схема введения для ипилимумаба составляет 3 мг/кг в виде внутривенной инфузии каждые 3 недели всего для четырех доз. В некоторых воплощениях одновременно вводятся два или более чем два моноклональных антитела с разными специфичностями связывания, причем в данном случае дозировка каждого введенного антитела попадает в пределы указанных интервалов. В предпочтительном воплощении онколитический вирус и модулятор(ры) иммунологической контрольной точки вводятся последовательно (раздельно или вперемежку), с конкретным предпочтением для первоначального введения вируса, с последующим введением модулятора(ров) иммунологической контрольной точки. Период времени между первым введением онколитического вируса и первым введением модулятора(ров) иммунологической контрольной точки может варьировать от приблизительно нескольких часов (по меньшей мере 6 часов) до нескольких недель. В предпочтительном воплощении способ по настоящему изобретению включает по меньшей мере одно введение онколитического вируса перед началом введения модулятора(ров) иммунологической контрольной точки, с конкретным предпочтением для по меньшей мере 2 введений вируса, с последующими 2-5 введениями модулятора(ров) иммунологической контрольной точки (например, с разделением второго введение вируса от первого введения модулятора иммунологической контрольной точки в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 суток). Другая предпочтительная терапевтическая схема включает от 2 до 5 (например, 3) внутривенных или внутриопухолевых введения 10⁸ или 10⁹ pfu онколитического вируса осповакцины с приблизительно 1- или 2-недельным интервалом, или вперемежку с 2-5 (например 3 или 4) внутривенными введениями 3-10 мг/кг антитела(тел) против иммунологической контрольной точки каждые 2 или 3 недели.

Настоящее изобретение также относится к способу лечения пролиферативного заболевания, такого как рак, включающему введение онколитического вируса и одного или более чем одного модулятора иммунологической контрольной точки субъекту, нуждающемуся в этом. В частности, комбинация онколитического вируса и одного или более чем одного модулятора иммунологической контрольной точки, как описано в данном документе, предназначена для применения для лечения пролиферативного заболевания и особенно для лечения рака у субъекта, имеющего или подверженного риску наличия ракового заболевания.

Настоящее изобретение также относится к способу ингибирования роста опухолевых клеток in vivo, включающему введение онколитического вируса и одного или более чем одного модулятора иммунологической контрольной точки субъекту, нуждающемуся в этом. В частности, комбинация онколитического вируса и одного или более чем одного модулятора иммунологической контрольной точки, как описано в данном документе, предназначена для применения для увеличения лизиса делящихся клеток.

Настоящее изобретение также относится к способу усиления иммунного ответа на опухолевые клетки, включающему введение онколитического вируса и одного или более чем одного модулятора иммунологической контрольной точки субъекту, нуждающемуся в этом. В частности, комбинация онколитического вируса и одного или более чем одного модулятора иммунологической контрольной точки, как описано в данном документе, предназначена для применения для увеличения числа и/или функциональности Т-лимфоцитов CD8+ и особенно инфильтрующих опухоль Т-лимфоцитов CD8+.

Настоящее изобретение также относится к аллогенной линии опухолевых клеток, инфицированных ex vivo онколитическим вирусом, описанным в данном документе, в комбинации с одним или более чем одним модулятором иммунологической контрольной точки, описанным в данном документе, а также к способу лечения ex vivo пролиферативного заболевания, такого как рак, включающему введение указанной аллогенной линии опухолевых клеток, инфицированных указанным онколитическим вирусом, с последующим введением указанного одного или более чем одного модулятора иммунологической контрольной точки субъекту, нуждающемуся в этом, таким образом, чтобы активировать у указанного субъекта иммунитет, индуцированный указанной инфицированной аллогенной линией опухолевых клеток.

Примеры пролиферативных заболеваний, которые можно лечить с использованием комбинации и способов по изобретению, включают рак кости, рак печени, рак поджелудочной железы, рак желудка, рак толстой кишки, рак пищевода, ротоглоточный рак, рак легкого, рак головы и шеи, рак кожи, меланому, рак матки, рак шейки матки, рак яичника, рак молочной железы, рак прямой кишки, рак анальной области, рак предстательной железы, лимфому, рак эндокринной системы, рак цитовидной железы, саркому мягкой ткани, хронические и острые лейкозы, рак мочевого пузыря, рак почки, новообразование центральной нервной системы (ЦНС), глиому и т.д. Настоящее изобретение также является полезным для лечения метастатических раковых заболеваний, особенно метастатических раковых заболеваний, при которых экспрессируется PD-L1 (Iwai et al., 2005, Int. Immunol. 17: 133-44). Предпочтительные раковые заболевания, которые можно лечить с использованием комбинированной терапии согласно изобретению, включают раковые заболевания, типично отвечающие на иммунотерапию. Неограничивающие примеры предпочтительных раковых заболеваний для лечения включают меланому (например, метастатическую злокачественную меланому), рак почки (например, светлоклеточный рак), рак предстательной железы (например, аденокарцинома предстательной железы, не поддающаяся лечению гормонами), рак молочной железы, колоретальный рак, рак легкого (например, немелкоклеточный рак легкого) и рак печени (например, гепатокарцинома).

Согласно преимущественному воплощению, особенно когда онколитический вирус снабжается суицидным геном, комбинированная терапия или способы согласно настоящему изобретению могут содержать дополнительную стадию, на которой субъекту вводятся фармацевтически приемлемые количества пролекарства, преимущественно аналога цитозина, в частности 5-FC. В качестве иллюстрации можно использовать дозу от 50 до 500 мг/кг/сутки, причем предпочтительной является доза 200 мг/кг/сутки или 100 мг/кг/сутки. В контексте настоящего изобретения пролекарство вводится согласно стандартной практике (например, перорально, системно и т.д.). Предпочтительно введение имеет место после введения онколитического вируса, предпочтительно по меньшей мере через 3 суток, более предпочтительно по меньшей мере через 4 суток и даже более предпочтительно по меньшей мере через 7 суток после введения вируса. Пероральный путь является предпочтительным. Можно вводить одну дозу пролекарства или дозы, которые повторяются в течение времени, которое является достаточно длительным для обеспечения продукции токсичного метаболита в организме- или клетке-хозяине.

Комбинация или способ согласно изобретению могут быть ассоциированы с одним или более чем одним веществом, эффективным в противораковой терапии. Среди фармацевтических веществ, эффективных в противораковой терапии, которые можно использовать в ассоциации или в комбинации с композициями согласно изобретению, можно более конкретно упомянуть:

- алкилирующие агенты, такие как, например, митомицин С, циклофосфамид, бусульфан, ифосфамид, изосфамид, мелфалан, гексаметилмеламин, тиотепа, хлорамбуцил или дакарбазин;

- антиметаболиты, такие как, например, гемцитабин, капецитабин, 5-фторурацил, цитарабин, 2-фтордезоксицитидин, метотрексат, идатрексат, томудекс или триметрексат;

- ингибиторы топоизомеразы II, такие как, например, доксорубицин, эпирубицин, этопозид, тенипозид или митоксантрон;

- ингибиторы топоизомеразы I, такие как, например, иринотекан (СРТ-11), 7-этил-10-гидрокси-камптотецин (SN-38) или топотекан;

- антимитотические лекарственные средства, такие как, например, паклитаксел, доцетаксел, винбластин, винкристин или винорелбин;

- производные платины, такие как, например, цисплатин, оксалиплатин, спироплатин или карбоплатин;

- ингибиторы рецепторов тирозинкиназы, такие как сунитиниб (Pfizer) и сорафениб (Bayer);

и

- антинеопластические антитела.

Комбинацию или способ согласно изобретению также можно использовать в ассоциации с одним или более чем одним другим агентом, включая иммуномодулирующие агенты, такие как, например, альфа-, бета- или гамма-интерферон, интерлейкин (в частности, IL-2, IL-6, IL-10 или IL-12) или фактор некроза опухолей; агенты, которые воздействуют на регуляцию рецепторов поверхности клетки, такие как, например, ингибиторы рецептора эпидермального фактора роста (в частности цетуксимаб, панитумумаб, залутумумаб, нимотузумаб, матузумаб, гефитиниб, эрлотиниб или лапатиниб) или ингибиторы рецептора-2 человеческого эпидермального фактора роста (в частности трастузумаб); и агенты, которые воздействуют на ангиогенез, такие как, например, ингибитор фактора роста эндотелия сосудов (в частности бевацизумаб или ранибизумаб), но не ограничиваясь ими.

Такие эффективные в противораковой терапии вещества можно вводить субъекту последовательно или сопутствующе с комбинацией или способом согласно изобретению.

Альтернативно или в комбинации, комбинацию или способ согласно изобретению также можно использовать в ассоциации с лучевой терапией.

Согласно настоящему изобретению также предложены наборы, включающие активный(ные) агент(ты) комбинации по изобретению в форме набора. В одном воплощении набор включает по меньшей мере онколитический вирус, как обсуждалось в данном документе, в одном контейнере (например, в стерильном стеклянном или пластмассовом флаконе) и один или более чем один модулятор иммунологической контрольной точки, как описано в данном документе, в другом конейнере (например, в стерильном стеклянном или пластмассовом флаконе). Предпочтительный набор содержит онколитический вирус осповакцины (например, вирус осповакцины, дефектный и по TK, и по RR активностям, снабженный суицидным геном) и модулятор(ры) иммунологической контрольной точки, который(рые) специфично связывается(ются) с CTLA-4 (например, антитело против CTLA-4, такое как ипилимумаб). Другой предпочтительный набор содержит онколитический вирус осповакцины (например, вирус осповакцины, дефектный и по TK, и по RR активностям, снабженный суицидным геном) и модулятор(ры) иммунологической контрольной точки, который(рые) специфично связывается(ются) с PD-1 (например, антитело против PD-1, такое как ниволумаб или ланбролизумаб). Другой предпочтительный набор содержит онколитический вирус осповакцины (например, вирус осповакцины, дефектный и по TK, и по RR активностям, снабженный суицидным геном) и модулятор(ры) иммунологической контрольной точки, который(рые) специфично связывается(ются) с PD-L1 (например, антитело против PD-L1, такое как MPDL3280A или BMS936559). Возможно данный набор может включать устройство для осуществления введения активных агентов. Набор также может включать листок-вкладыш в упаковке, включающий информацию, касающуюся композиций или индивидуального компонента и лекарственных форм в наборе.

Краткое описание графических материалов

Фиг. 1 А, Б и В иллюстрируют рост опухолей МСА205, имплантированных мышам, в разные моменты времени (D2 (сутки 2), D3 и D20 соответственно), которых лечили 2 внутриопухолевыми инъекциями 10⁷ pfu WRTG17137 в сутки 0 и 3, и 3 внутрибрюшинными инъекциями 250 мкг антитела против PD-1 в сутки 6, 9 и 12.

Фиг. 2 иллюстрирует процент выживания у мышей, которым были имплантированы 8×10⁵ опухолевых клеток МСА205, и которых лечили 2 внутриопухолевыми инъекциями WRTG17137 в сутки 0 и 3, и 3 внутрибрюшинными инъекциями антитела против PD-1 в сутки 6, 9 и 12.

Фиг. 3А, Б и В иллюстрируют рост опухолей МСА205, имплантированных мышам, в разные моменты времени (D3, D8 и D13 соответственно), которых лечили 2 внутриопухолевыми инъекциями 10⁷ pfu WRTG17137 в сутки 0 и 3, и 3 внутрибрюшинными инъекциями 100 мкг антитела против CTLA-4 в сутки 6, 9 и 12.

Фиг. 4 иллюстрирует процент выживания у мышей, которым были имплантированы 8×10⁵ опухолевых клеток, и которых лечили 2 внутриопухолевыми инъекциями WRTG17137 в сутки 0 и 3, и 3 внутрибрюшинными инъекциями антитела против CTLA-4 в сутки 6, 9 и 12.

Фиг. 5А и Б иллюстрируют рост опухолей МСА205, имплантированных мышам, которых лечили 2 внутриопухолевыми инъекциями возрастающих доз WRTG17137 (10⁵, 10⁶ или 10⁷ pfu) в сутки 0 и 3, и 3 внутрибрюшинными инъекциями 250 мкг антитела против PD-1 в сутки 6, 9 и 12. Прогрессирование опухоли измеряется в сутки 12 и 14. Черные и круглые точки представляют прогрессирование опухоли у мышей, которых лечили только вирусом, и серые и квадратные точки представляют прогрессирование опухоли у мышей, которых лечили вирусом и антителом против PD1.

Фиг. 6 иллюстрирует рост опухолей МСА205, имплантированных мышам, которых лечили 2 внутриопухолевыми инъекциями 10⁷ pfu WRTG17137 в сутки 0 и 3, и 3 внутрибрюшинными инъекциями 250 мкг антитела против PD-1 или изотипического контроля, причем первая инъекция антитела имеет место через 1, 3, 5 или 7 суток после второй инъекции вируса. Прогрессирование опухоли измеряется с течением времени. Черные круглые точки представляют прогрессирование опухоли у мышей, которых лечили вирусом и изотипическим контролем, тогда как точки, имеющие форму серых квадратов, треугольников, ромбов и шестиугольников, представляют прогрессирование опухоли у мышей, которых лечили вирусом и антителом против PD-1, в сутки 1, 3, 5 и 7 после второй инъекции вируса.

Фиг. 7 иллюстрирует рост опухолей МСА205, имплантированных мышам, которых лечили 2 внутриопухолевыми инъекциями 10⁷ pfu WRTG17137 в сутки 0 и 3, и 3 внутрибрюшинными инъекциями 100 мкг антитела против CTLA-4 или изотипического контроля, причем первая инъекция антитела имеет место через 1, 3, 5 или 7 суток после второй инъекции вируса. Прогрессирование опухоли измеряется с течением времени. Черные круглые точки представляют прогрессирование опухоли у мышей, которых лечили вирусом и изотипическим контролем, тогда как точки, имеющие форму серых квадратов, треугольников, ромбов и шестиугольников, представляют прогрессирование опухоли у мышей, которых лечили вирусом и антителом против CTLA-4, в сутки 1, 3, 5 и 7 после второй инъекции вируса.

ПРИМЕРЫ

Авторы изобретения излагают комбинирование подходов по блокированию иммунологических контрольных точек с векторами на основе онколитических вирусов осповакцины. Репликация вируса в опухолях приводила бы к гибели клеток, разрушению опухоли и высвобождению опухолевого антигена. Комбинирование онколитических вирусов с ингибиторами против иммунологических контрольных точек должно снимать тормоз с генерации Т-клеток и образующихся в результате опухолеспецифичных Т-клеток. Доклиническим доказательством синергетических эффектов блокаторов иммунологических контрольных точек, объединенных с вирусными векторами, была демонстрация в мышиных моделях опухолей. Это подразумевает применение i) специфичных для мышей антител против иммунологических контрольных точек и ii) онколитического вируса группы оспы, способного инфицировать мышиные клетки с высокой эффективностью.

Онколитический вирус, выбранный для данных исследований (WRTG17137) представляет собой штамм Western Reserve (WR) вируса осповакцины (W), дефектный по тимидинкиназе (TK^-) (локус J2R) и RR^- (локус I4L), что делает вирус нереплицируемым в здоровых (неделящихся) клетках. В отличие от этого, предполагается то, что VV TK^-RR^- селективно и эффективно реплицируется в опухолевых клетках. Он снабжен химерным геном FCU-1 дрожжевого происхождения, кодирующим фермент, превращающий пролекарство 5-фторцитозин (5-FC) в токсичные анаболиты 5-фторурацил (5-FU) и 5-фторуридин-5'-монофосфат (Erbs et al., 2000, Cancer Res., 60(14): 3813-22).

Два модулятора иммунологической контрольной точки, а именно моноклональные антитела против PD-1 и против CTLA4, тестировали индивидуально в комбинации с WRTG17137.

Комбинация онколитического VV с МАb (моноклональное антитело) против PD-1

Сначала было выбрано направленное воздействие на блокатор иммунологической контрольной точки - мышиный PD-1 (mPD-1) с использованием подходящего антитела. Крысиное антитело против mPD-1 RMP1-14 (BioXcell) было выбрано в качестве антитела против mPD-1. Было показано, что данное антитело блокирует взаимодействие mPD-1 с его лигандами (Yamazaki et al., 2005, J. Immunol. 175(3): 1586-92).

Комбинацию ингибиторов mPD-1 (имеющийся в продаже клон RMP1-14) с онколитическим вирусом WRTG17137 тестировали in vivo в мышиной модели МСА205 (Shu and Rosenberg, 1985, Cancer Res. 45(4): 1657-62). Экспериментировали с разными схемами введения.

В первой постановке мышам C57BL/6 подкожно инъецировали 8×10⁵ опухолевых клеток МСА205. В сутки 7 после инъекции опухолевых клеток внутрибрюшинно (в.б.) инъецировали 250 мкг антитела против mPD1 RMP1-14 или его изотипического контроля 2А3 в сутки 0, 3 и 6. Затем дважды внутриопухолево (в.о.) инъецировали вирус WRTG17137 (1×10⁷ pfu) в сутки 7 и 10. Тестировали четыре группы из 13 мышей: контрольную группу, получающую изотипический контроль (3 в.б. инъекции в сутки 0, 3 и 6), группу мышей, которых лечили mAb против PD-1 (3 в.б. инъекции в сутки 0, 3 и 6), группу мышей, которых лечили онколитическим вирусом (2 в.о. инъекции в сутки 7 и 10), и четвертую группу, получающую как mAb против PD-1 (3 в.б. инъекции в сутки 0, 3 и 6), так и 2 инъекции WRTG17137 (2 в.о. инъекции в сутки 7 и 10) через одни сутки после последней инъекции антитела. Прогрессирование опухоли и выживание мышей отслеживали на протяжении 40 суток.

Как и ожидалось, опухоль очень быстро увеличивалась в размере в контрольной группе, тогда как рост опухоли задерживался во всех трех других группах в той же самой степени, хотя в группе, получающей и антитело против mPD-1, и онколитический вирус, наблюдалось небольшое улучшение. Результаты по выживанию согласуются с приведенными выше данными, с 50%-ным выживанием, полученным в 16, 23, 24 и 26 суток соответственно в контрольной группе, группе, которую лечили антителом, группе, которую лечили WRTG17137, и в группе, которую лечили антителом плюс WRTG17137.

Во второй постановке мышам C57BL/6 подкожно инъецировали 8×10⁵ опухолевых клеток МСА205, как и ранее, и животных делили на четыре группы по 13 мышей: соответственно на контрольную группу, получающую изотипический контроль (3 в.б. инъекции в сутки 6, 9 и 12), группу мышей, которых лечили онколитическим вирусом (2 в.о. инъекции 1×10⁷ pfu WRTG17137 в сутки 0 и 3), группу мышей, которых лечили mAb против PD-1 (3 в.б. инъекции 250 мкг антитела против mPD1 RMP1-14 в сутки 6, 9 и 12), и четвертую группу, получающую как вирус (в сутки 0 и 3), так и антитело (3 в.б. инъекции каждые трое суток, т.е. в сутки 6, 9 и 12), через трое суток после вируса. Прогрессирование опухоли и выживание отслеживали на протяжении 40 суток.

Как и ожидалось, опухоли очень быстро увеличивались в размере в контрольной группе, тогда как рост опухоли задерживался во всех трех других группах. Однако, как проиллюстрировано на Фиг. 1, рост опухоли задерживается в одинаковой степени в группах, которых лечили только одним компонентом (антителом против mPD-1 или онколитическим вирусом), и данное замедление является более отчетливым в группе, получающий и антитело против mPD-1, и онколитический вирус, особенно в момент времени D13 и D20.

Как проиллюстрировано на Фиг. 2, в контрольной группе 50%-ное выживание получено в сутки 16. Увеличение выживания наблюдали из-за инъекции WRTG17137 (50%-ное выживание в сутки 22) или из-за инъекции mPD-1 (50%-ное выживание в сутки 20). Выживание дополнительно увеличивалось после введения WRTG17137, с последующим введением антитела (50%-ное выживание, измеряемое в сутки 28).

Комбинация ингибиторов против CTLA4

Комбинацию антитела против CTLA-4 (имеющийся в продаже клон 9D9) с онколитическим вирусом WRTG17137 тестировали in vivo в мышиной модели МСА205. Экспериментировали с разными схемами введения.

В первой постановке мышам C57BL/6 подкожно инъецировали 8×10⁵ опухолевых клеток (МСА205). В сутки 7 после инъекции опухолевых клеток в.б. инъецировали 100 мкг антитела против CTLA-4 9D9 (BioXcell) в сутки 0, 3 и 6. Дважды внутриопухолево инъецировали вирус WRTG17137 (1×10⁷ pfu) в сутки 7 и 10. Тестировали четыре группы из 6 мышей: соответственно, контрольную группу, получающую изотипический контроль МСР-11 (3 в.б. инъекции в сутки 0, 3 и 6), группу мышей, которых лечили mAb против CTLA-4 (3 в.б. инъекции в сутки 0, 3 и 6), группу, которую лечили онколитическим вирусом (2 в.о. инъекции в сутки 7 и 10), и четвертую группу, получающую как антитело против CTLA-4 (3 в.б. инъекции в сутки 0, 3 и 6), так и 2 инъекции WRTG17137 (2 в.о. инъекции в сутки 7 и 10) через одни сутки после последней инъекции антитела. Прогрессирование опухоли и выживание отслеживали на протяжении 35 суток.

Как и ожидалось, опухоль очень быстро увеличивалась в размере в контрольной группе, тогда как рост опухоли задерживался во всех трех других группах приблизительно в той же самой степени.

Во второй постановке мышам подкожно инъецировали 8×10⁵ опухолевых клеток МСА, как и ранее. Тестировали четыре группы из 6 мышей: контрольную группу, получающую изотипический контроль МСР-11 (3 в.б. инъекции в сутки 0, 3 и 6), группу мышей, которых лечили онколитическим вирусом (2 в.о. инъекции 1×10⁷ pfu WRTG17137 в сутки 0 и 3), группу мышей, которых лечили 100 мкг mAb против CTLA-4 9D9 (3 в.б. инъекции в сутки 6, 9 и 12), и четвертую группу, получающую как вирус (в сутки 0 и 3), так и антитело против CTLA-4 (3 в.б. инъекции каждые трое суток, т.е. в сутки 6, 9 и 12) через трое суток после последней инъекции вируса. Прогрессирование опухоли и выживание отслеживали на протяжении 35 суток.

Как и ожидалось, опухоли очень быстро увеличивались в размере в контрольных группах. Рост опухоли задерживался во всех трех других группах. Однако, как проиллюстрировано на Фиг. 3, объем опухоли уменьшается в группах, которые лечили только одним компонентом (антителом против CTLA-4 или онколитическим вирусом), замедление является значительно более отчетливым в группе, получающей и антитело против CTLA-4, и онколитический вирус.

Как проиллюстрировано на Фиг. 4, в контрольной группе 50%-ное выживание получено в сутки 18. Увеличение выживания наблюдали из-за инъекции WRTG17137 (50%-ное выживание в сутки 21) или из-за инъекции антитела против CTLA-4 (50%-ное выживание в сутки 20). Выживание дополнительно увеличивалось после введения WRTG17137, с последующим введением антитела (50%-ное выживание, измеряемое в сутки 32).

Эффекты дозы

Тот же самый эксперимент, что и ранее, был проведен с варьирующими дозами вируса. Четыре группы из шести мышей лечили после имплантации опухоли (8×10⁵ клеток опухоли МСА). Контрольная группа получала буфер для приготовления композиции вместо вируса и изотипический контроль вместо антитела. Вторую группу лечили 10⁵, 10⁶ или 10⁷ pfu WRTG17137 (2 в.о. инъекции в сутки 0 и 3), и третью группу - mAb против PD-1 (3 в.б. инъекции 250 мкг антитела против mPD-1 RMP1-14 в сутки 6, 9 и 12). Четвертая группа получала и вирус (10⁵, 10⁶ или 10⁷ pfu в сутки 0 и 3) и антитело (3 в.б. инъекции каждые трое суток, т.е. в сутки 6, 9 и 12) через трое суток после последнего введения вируса. Прогрессирование опухоли отслеживали на протяжении 15 суток.

На Фиг. 5 проиллюстрировано прогрессирование опухоли, наблюдаемое у мышей, которых лечили той же самой дозой одного вируса (черные и круглые точки) или в комбинации с антителом против PD-1 (серые и квадратные точки) через 12 и 14 суток после первой инъекции вируса. Какой бы ни была доза вируса, инъецированная в опухоль, рост опухоли задерживается у мышей, обработанных комбинацией вируса плюс антитело против PD-1, по сравнению с ростом, измеренным у мышей, которых лечили только онколитическим вирусом.

Данные результаты иллюстрируют терапевтическую и синергетическую противоопухолевую активность комбинации по изобретению, особенно при введении вируса до модулятора иммунологической контрольной точки.

Варьирование интервала времени между введениями вируса и антитела Комбинация антитела против PD1

Шестинедельным самкам мышей C57BL/6 в правые бока подкожно (п.к.) инъецировали 8×10⁵ опухолевых клеток МСА205. В сутки 0 (D0), когда объемы опухолей достигали 40-60 мм², животных рандомизировали и делили на 11 групп по 6 мышей: контрольную группу, получающую буфер (2 в.о. инъекции в сутки 0 и 3), группу мышей, которых лечили онколитическим вирусом (2 в.о. инъекции 1×10⁷ pfu WRTG17137 в сутки 0 и 3), группу, получающую и вирус (в сутки 0 и 3), и изотипический контроль (3 в.б. инъекции в сутки 6, 9 и 12), группу мышей, которых лечили и вирусом (в сутки 0 и 3), и mAb против PD-1 (3 в.б. инъекции 250 мкг антитела против mPD1 клона RMP1-14 в сутки 4, 7 и 10), группу мышей, которых лечили и вирусом (в сутки 0 и 3), и mAb против PD-1 (3 в.б. инъекции 250 мкг антитела против mPD1 клона RMP1-14 в сутки 6, 9 и 12), группу мышей, которых лечили и вирусом (в сутки 0 и 3), и mAb против PD-1 (3 в.б. инъекции 250 мкг антитела против mPD1 клона RMP1-14 в сутки 8, 11 и 14), группу мышей, которых лечили и вирусом (в сутки 0 и 3), и mAb против PD-1 (3 в.б. инъекции 250 мкг антитела против mPD1 клона RMP1-14 в сутки 10, 13 и 16), группу мышей, получающих и вирус (в сутки 0 и 3), и mAb против PD-1 (3 в.б. инъекции 100 мкг антитела против mPD1 клона RMP1-14 в сутки 4, 7 и 10), группу мышей, получающих и вирус (в сутки 0 и 3), и mAb против PD-1 (3 в.б. инъекции 100 мкг антитела против mPD1 клона RMP1-14 в сутки 6, 9 и 12), группу мышей, получающих и вирус (в сутки 0 и 3), и mAb против PD-1 (3 в.б. инъекции 100 мкг антитела против mPD1 клона RMP1-14 в сутки 8, 11 и 14), и группу мышей, получающих и вирус (в сутки 0 и 3), и mAb против PD-1 (3 в.б. инъекции 100 мкг антитела против mPD1 клона RMP1-14 в сутки 10, 13 и 16). Прогрессирование опухоли и выживание отслеживали с течением времени.

Как показано на Фиг. 6, рост опухоли задерживается у мышей, которых лечили комбинацией вируса и антитела против PD-1 (250 мкг/мышь), по сравнению с ростом опухоли, измеренным у мышей, которых лечили онколитическим вирусом и изотипическим антителом. Чем больше время между введениями вируса и введениями антитела, тем больше контролируется рост опухоли. Статистические различия между контрольной группой и группой вирус плюс анитело против PD-1 (D+7, т.е. 3 в.б. инъекции 250 мкг антитела против mPD1 клона RMP1-14 в сутки 10, 13 и 16) наблюдали в сутки 9 и 13 после обработки. Такую же тенденцию наблюдали в группах животных, которых лечили комбинацией WRTG17137 (1×10⁷ pfu/мышь) и антитела против PD-1 (100 мкг/мышь), хотя и без каких-либо статистических различий в отношении контрольной группы (1×10⁷ pfu/мышь плюс 100 мкг изотипического антитела/мышь).

Комбинация антитела против CTLA-4

Шестинедельным самкам мышей C57BL/6 в правые бока подкожно (п.к.) инъецировали 8×10⁵ опухолевых клеток МСА205. В сутки 0 (D0), когда объемы опухолей достигали 40-60 мм², животных рандомизировали и делили на 11 групп по 6 мышей: контрольную группу, получающую буфер (2 в.о. инъекции в сутки 0 и 3), группу мышей, которых лечили онколитическим вирусом (2 в.о. инъекции 1×10⁷ pfu WRTG17137 в сутки 0 и 3), группу, получающую и вирус (в сутки 0 и 3), и изотипический контроль (3 в.б. инъекции в сутки 6, 9 и 12), группу мышей, которых лечили и вирусом (в сутки 0 и 3), и mAb против CTLA4 (3 в.б. инъекции 100 мкг антитела против mCTLA4 клона 9D9 в сутки 4, 7 и 10), группу мышей, которых лечили и вирусом (в сутки 0 и 3), и mAb против CTLA4 (3 в.б. инъекции 100 мкг антитела против mCTLA4 клона 9D9 в сутки 6, 9 и 12), группу мышей, которых лечили и вирусом (в сутки 0 и 3), и mAb против CTLA4 (3 в.б. инъекции 100 мкг антитела против mCTLA4 клона 9D9 в сутки 8, 11 и 14), группу мышей, которых лечили и вирусом (в сутки 0 и 3), и mAb против CTLA4 (3 в.б. инъекции 100 мкг антитела против mCTLA4 клона 9D9 в сутки 10, 13 и 16), группу мышей, получающих и вирус (в сутки 0 и 3), и mAb против CTLA4 (3 в.б. инъекции 50 мкг антитела против mCTLA4 клона 9D9 в сутки 4, 7 и 10), группу мышей, получающих и вирус (в сутки 0 и 3), и mAb против CTLA4 (3 в.б. инъекции 50 мкг антитела против mCTLA4 клона 9D9 в сутки 6, 9 и 12), группу мышей, получающих и вирус (в сутки 0 и 3), и mAb против CTLA4 (3 в.б. инъекции 50 мкг антитела против mCTLA4 клона 9D9 в сутки 8, 11 и 14), и группу мышей, получающих и вирус (в сутки 0 и 3), и mAb против CTLA4 (3 в.б. инъекции 50 мкг антитела против mCTLA4 клона 9D9 в сутки 10, 13 и 16). Прогрессирование опухоли и выживание отслеживали с течением времени.

Как показано на Фиг. 7, рост опухоли задерживается у мышей, которых лечили комбинацией вируса и антитела против CTLA-4 (100 мкг/мышь), по сравнению с ростом опухоли, измеренным у мышей, которых лечили онколитическим вирусом и изотипическим антителом. Рост опухоли даже в большей степени задерживался при использовании короткого периода времени (сутки 1, 3 или 5 суток) между введениями вируса и введениями антитела со статистическими различиями, наблюдаемыми для данных 3 групп по отношению к контрольной группе в 6, 9 и 13 суток после лечения. Такую же тенденцию наблюдали в группах животных D+1, D+3 и D+5, которых лечили комбинацией WRTG17137 (1×10⁷ pfu/мышь) и антитела против CTLA-4 (50 мкг/мышь), хотя и без каких-либо статистических различий в отношении контрольной группы (1×10⁷ pfu/мышь плюс 100 мкг изотипического антитела/мышь).

Специалисты в данной области будут знать или смогут установить с использованием не более чем традиционного экспериментирования многочисленные эквиваленты конкретного способа и реактивов, описанных в данном документе, включая альтернативы, варианты, присоединения, делеции, модификации и замены. Такие эквиваленты считаются находящимися в пределах объема данного изобретения и охватываются следующей формулой изобретения.

1. Применение комбинации, содержащей

- онколитический вирус осповакцины, дефектный в отношении тимидинкиназы (TK) в результате инактивирующих мутаций в вирусном гене J2R, где указанные мутации выбраны из делеции, мутации и/или замены одного или более смежного или несмежного нуклеотида в пределах вирусного гена или его регуляторных элементов, и

- один или более чем один модулятор иммунологической контрольной точки, который оказывает по меньшей мере частичный антагонистический эффект на активность ингибиторной иммунологической контрольной точки, выбранный из моноклональных антител, которые специфично связываются с любым из PD-1, PD-L1, PD-L2, LAG3, Tim3, BTLA и CTLA4,

для лечения рака, где указанный онколитический вирус осповакцины и один или более чем один модулятор иммунологической контрольной точки вводятся последовательно таким образом, что первым вводится онколитический вирус осповакцины и вторым – модулятор(ры) иммунологической контрольной точки.

2. Применение по п. 1, где указанный вирус осповакцины дополнительно является дефектным в отношении активности рибонуклеотидредуктазы (RR) в результате инактивирующих мутаций в вирусном(ных) гене(нах) I4L и/или F4L.

3. Применение по п. 1, где указанный онколитический вирус осповакцины дополнительно экспрессирует по меньшей мере один терапевтический ген, вставленный в вирусный геном, где указанный терапевтический ген выбран из группы, состоящей из генов, кодирующих продукты суицидных генов, и генов, кодирующих иммуностимулирующие белки.

4. Применение по п. 3, где указанный суицидный ген выбран из группы, состоящей из генов, кодирующих белок, имеющий цитозиндезаминазную (ЦДазную) активность, тимидинкиназную активность, урацилфосфорибозилтрансферазную (УФРТазную) активность, фосфорилазную активность пуриновых нуклеозидов и тимидилаткиназную активность.

5. Применение по п. 4, где указанный продукт суицидного гена имеет ЦДазную и УФРТазную активности и предпочтительно выбран из группы, состоящей из полипептидов codA::upp, FCY1::FUR1 и FCY1::FUR1[дельта]105 (FCU1) и FCU1-8.

6. Применение по п. 4, где указанный онколитический вирус осповакцины является дефектным по активностям и TK и RR и содержит терапевтический суицидный ген FCU1, вставленный в его геном.

7. Применение по п. 3, где указанный иммуностимулирующий белок представляет собой интерлейкин или колониестимулирующий фактор с конкретным предпочтением в отношении GM-CSF.

8. Применение по п. 7, где указанный онколитический вирус осповакцины, дефектный в отношении активности TK, содержит терапевтический человеческий GM-CSF, вставленный в его геном.

9. Применение по п. 1, где композиция содержит от приблизительно 10⁷ pfu до приблизительно 5×10⁹ pfu указанного онколитического вируса осповакцины.

10. Применение по п. 1, где указанный один или более чем один модулятор иммунологической контрольной точки включает антитело, которое специфично связывается с человеческим PD-1, и, в частности, антитело против PD-1, выбранное из группы, состоящей из ниволумаба, ланбролизумаба и пидилизумаба.

11. Применение по п. 1, где указанный один или более чем один модулятор иммунологической контрольной точки включает антитело, которое специфично связывается с человеческим PD-L1, и, в частности, антитело против PD-L1, выбранное из группы, состоящей из MPDL3280A и BMS-936559.

12. Применение по п. 1, где указанный один или более чем один модулятор иммунологической контрольной точки включает антитело, которое специфично связывается с человеческим CTLA-4, и, в частности, антитело против CTLA4, выбранное из группы, состоящей из ипилимумаба, тремелимумаба и одноцепочечных антител против CTLA4.

13. Применение по п. 1, где композиция содержит от примерно 2 мг/кг до примерно 15 мг/кг указанного одного или более чем одного модулятора иммунологической контрольной точки.

14. Применение по п. 1, где указанный(ные) модулятор(ры) иммунологической контрольной точки вводится(дятся) посредством внутривенного, внутриопухолевого или внутрибрюшинного пути и в котором указанный онколитический вирус осповакцины вводится внутривенным или внутриопухолевым путем.

15. Применение по п. 1, включающее от 2 до 5 внутривенных или внутриопухолевых введений 10⁸ или 10⁹ pfu онколитического вируса осповакцины приблизительно с 1- или 2-недельным интервалом с последующими или перемежающимися 2-5 внутривенными введениями 3-10 мг/кг одного или более чем одного антитела против иммунологической контрольной точки каждые 2 или 3 недели.

16. Применение по п. 1, где указанный рак выбран из группы, состоящей из меланомы, рака почки, рака предстательной железы, рака молочной железы, колоректального рака, рака легкого и рака печени.

17. Применение набора, содержащего

- по меньшей мере онколитический вирус осповакцины, дефектный в отношении тимидинкиназы (TK) в результате инактивирующих мутаций в вирусном гене J2R, в одном контейнере и

- один или более чем один модулятор иммунологической контрольной точки, который оказывает по меньшей мере частичный антагонистический эффект на активность ингибиторной иммунологической контрольной точки, выбранный из моноклональных антител, которые специфично связываются с любым из PD-1, PDL1, PD-L2, LAG3, Tim3, BTLA и CTLA4, в другом контейнере,

для лечения рака, где указанный онколитический вирус осповакцины и один или более чем один модулятор иммунологической контрольной точки вводятся последовательно таким образом, что первым вводится онколитический вирус осповакцины и вторым – модулятор(ры) иммунологической контрольной точки.

18. Применение по п. 17, где указанный онколитический вирус осповакцины является таким, как определено в любом из пп. 2-9 и 14-15.

19. Применение по п. 17, где указанный модулятор иммунологической контрольной точки является таким, как определено в любом из пп. 10-15.

20. Применение по п. 18, где указанный модулятор иммунологической контрольной точки является таким, как определено в любом из пп. 10-15.

21. Применение по любому из пп. 17-20, где указанный рак выбран из группы, состоящей из меланомы, рака почки, рака предстательной железы, рака молочной железы, колоректального рака, рака легкого и рака печени.