Способ получения и культивирования фибробластоподобных клеток из пуповины новорожденного

Авторы патента:

Кулагина Лариса Николаевна (RU)

Волова Лариса Теодоровна (RU)

Российская Виктория Викторовна (RU)

Болтовская Виолетта Викторовна (RU)

C12N5/00 - Недифференцированные клетки человека, животных или растений, например клеточные линии; ткани; культивирование или сохранение их; питательные среды для них (размножение растений из тканевых культур A01H 4/00)

A61K35/51 - Лекарственные препараты, содержащие вещества или продукты реакции неизвестного строения

Владельцы патента RU 2710263:

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Самарский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (RU)

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для получения и культивирования фибробластоподобных клеток из пуповины новорожденного. Для этого проводят забор пуповины у здоровых женщин после рождения ребенка путем кесарева сечения. Пуповину трижды отмывают стерильным раствором Хенкса с антибиотиком от сгустков крови и слизи. Удаляют кровеносные сосуды. Оставшуюся ткань измельчают, переносят материал в центрифужные пробирки и заливают 0,2% раствором коллагеназы. Пробирки помещают в термошейкер при температуре +37°С, скорости вращения 100 об/мин на 16 часов. Фильтруют содержимое в новые пробирки. Вносят в них стерильный 0,02% раствор Версена в соотношении 1:1 и центрифугируют пробирки в холодовой центрифуге в течение 20 минут. Осадок клеток ресуспендируют в полной питательной среде и подсчитывают количество выделенных жизнеспособных клеток. Высевают клетки в культуральный флакон. Культивирование проводят в СО₂-инкубаторе и смену среды проводят каждые 5 суток культивирования. По достижении 80% конфлюентности клеточного монослоя проводят пересев клеток из расчета 1:2. Изобретение позволяет получать фибробластоподобные клетки без риска контаминации условно-патогенной флорой. 1 табл.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к технологии выделения, культивирования фибробластоподобных клеток из пуповины.

Известен способ получения фибробластов из пуповины новорожденного, полученной при нормальных родах женщин на 39-40 недели гестации [1]. Недостатками способа являются: риск контаминации донорского материала условно-патогенной флорой, которая содержится в родовых путях, сложный технологический процесс по получению суспензии клеток из донорского материала.

Известен способ получения фибробластоподобных клеток из пупочного канатика новорожденного, полученного при нормальных родах на 39-40 недели гестации [2]. После отмывки донорского материала от крови и слизи, разрезают пупочный канатик ручным способом на фрагменты, повторно промывают их раствором Хенкса, измельчают фрагменты гомогенизатором до однородной массы; проводят ферментативную обработку, используя 0,075% коллагеназу I типа и коллагеназу IV типа (соотношение концентраций ферментов 1:1 в объемной пропорции 1:5) в течение 8-10 часов при 37° и периодически помешивая содержимое пробирок; пропускают в новую центрифужную пробирку полученный субстрат через двойное сито для клеток; центрифугируют в течение 8 минут при 1000 об./мин; получают осадок фибробластоподобных клеток, который ресуспендируют в культуральной среде с добавлением основного фактора роста фибробластов; подсчитывают общее количество полученных клеток в камере Горяева, вносят клетки в чашки Петри в посевной дозе 8-15×10³/см²; при достижении 70-80% конфлюентности монослоя, клетки пересевают, культивируют до 4-6 пассажа, при этом клетки сохраняют свой диплоидный кариотип и высокую пролиферативную активность. Данный способ взят за прототип.

Недостатками прототипа являются: риск контаминации донорского материала условно-патогенной флорой, которая содержится в родовых путях, сложный технологический процесс получения суспензии клеток с использованием ручного труда; применение в процессе обработки пупочного канатика ферментов нескольких типов; недостаточная инактивация ферментов при отмывке; расчет посевной дозы, исходя от общего числа полученных клеток, а не от жизнеспособных.

Целью изобретения является создание способа получения и культивирования фибробластоподобных клеток из пуповины новорожденного.

Эта цель достигается тем, что забор пуповины проводят у здоровых женщин после рождения ребенка путем кесарева сечения, пуповину трижды отмывают стерильным раствором Хенкса с антибиотиком от сгустков крови и слизи, удаляют кровеносные сосуды, оставшуюся ткань измельчают при помощи лабораторного миксера; переносят материал в центрифужные пробирки и заливают 0,2% раствором коллагеназы из гепатопанкреаса краба ООО «БиолоТ» в соотношении 1:1; пробирки помещают в термошейкер при температуре +37°С, скорости вращения 100 об./мин на 16 часов; фильтруют содержимое в новые пробирки через фильтры для клеток с размером пор 70 мкм; вносят в них стерильный 0,02% раствор Версена в соотношении 1:1; центрифугируют пробирки в холодовой центрифуге при температуре +4°С, скорости вращения 1200 об./мин в течение 20 минут; надосадочную жидкость утилизируют; осадок клеток ресуспендируют в полной питательной среде, включающей αМЕМ с глютамином, 10% FBS, 8 мкг/мл гентамицина; подсчитывают количество выделенных жизнеспособных клеток в камере Горяева, используя 0,4% раствор трипанового синего; высевают клетки в дозе 1×10⁵ жизнеспособных кл./см² в культуральный флакон с аналогичной полной питательной средой; культивирование проводят в CO₂-инкубаторе при температуре +37°С, 5% СО₂ и постоянной влажности; смену среды проводят каждые 5 суток культивирования, при этом кондиционированную культуральную среду из флакона с клетками полностью отбирают пипеткой; центрифугируют ее в холодовой центрифуге при температуре +4°С, скорости вращения 1500 об./мин в течение 10 минут, после чего возвращают в культуральный флакон и добавляют свежую среду в соотношении 1:1; по достижении 80% конфлюентности клеточного монослоя проводят пересев клеток из расчета 1:2.

Забор пуповины у обследованных женщин после рождения ребенка путем кесарева сечения проводят для того, чтобы исключить контаминацию донорского материала условно-патогенной флорой, которая содержится в родовых путях. Лабораторный миксер применяют в процессе измельчения донорского материала для того, чтобы исключить трудоемкий ручной процесс по измельчению пуповины. 0,2% коллагеназу из гепатопанкреаса краба ООО «БиолоТ» применяют в процессе ферментативной обработки пуповины потому, что она обладает высокой коллагенолитической активностью (до 750 ЕД/мг по Мандлу) и не уступает по своему действию нескольким ферментам.

Термошейкер в процессе ферментативной обработки тканей применяют для того, чтобы она проходила при постоянном равномерном перемешивании среды и лучшем взаимодействии тканей с коллагеназой, создавая при этом оптимальные условия для выхода клеток. Кроме того, использование термошейкера исключает ручной труд по перемешиванию среды. Холодовое центрифугирование позволяет поддержтвать заданную температуру и не оказывает повреждающего воздействия на клетки. Подсчет полученных клеток в камере Горяева проводят для того, чтобы рассчитать посевную дозу жизнеспособных клеток для внесения их в культуральный флакон.

Кондиционированную среду используют при пересевах в процессе культивирования добавляя ее к свежей потому, что она содержит физиологически активные продукты жизнедеятельности культивируемых в ней клеток, данная среда оптимизирует процессы пролиферации клеток на ранних этапах культивирования, обеспечивает накопление клеток в необходимом количестве.

Способ осуществляется следующим образом. Забор пуповины проводят у здоровых женщин после рождения ребенка путем кесарева сечения. Пуповину трижды отмывают стерильным раствором Хенкса с антибиотиком от сгустков крови и слизи, удаляют кровеносные сосуды, оставшуюся ткань измельчают на фрагменты при помощи лабораторного миксера. Измельченную ткань переносят в центрифужные пробирки и заливают 0,2% раствором коллагеназы из гепатопанкреаса краба ООО «БиолоТ» в соотношении 1:1. Пробирки помещают в термошейкер при температуре +37°С, скорости вращения 100 об./мин на 16 часов. Фильтруют содержимое в новые пробирки через фильтры для клеток с размером пор 70 мкм. Вносят в них стерильный 0,02% раствор Версена в соотношении 1:1. Центрифугируют пробирки в холодовой центрифуге при температуре +4°С, скорости вращения 1200 об./мин в течение 20 минут. Надосадочную жидкость утилизируют. Осадок клеток ресуспендируют в полной питательной среде, включающей αМЕМ с глютамином, 10% FBS, 8 мкг/мл гентамицина. Подсчитывают количество выделенных жизнеспособных клеток в камере Горяева, используя 0,4% раствор трипанового синего. Высевают клетки в дозе 1×105 жизнеспособных кл./см2 в культуральный флакон с аналогичной полной питательной средой. Культивирование проводят в СО₂-инкубаторе при температуре +37°С, 5% СО₂ и постоянной влажности. Смену среды проводят каждые 5 суток культивирования, при этом кондиционированную культуральную среду из флакона с клетками полностью отбирают пипеткой. Эту среду центрифугируют в холодовой центрифуге при температуре +4°С, скорости вращения 1500 об./мин в течение 10 минут, после чего возвращают в культуральный флакон и добавляют свежую аналогичную среду в соотношении 1:1. По достижении 80% конфлюентности клеточного монослоя проводят пересев клеток из расчета 1:2.

Способ иллюстрируется клиническим примером. У здоровых женщин после рождения детей путем кесарева сечения забирали фрагменты пуповин (7-10 см). Получение и культивирование фибробластоподобных клеток из донорского материала было выполнено по разработанному способу. Характеристика полученных линий фибробластоподобных клеток приведена в таблице 1. Клеток имели высокий индекс адгезии (88±0,2% - 90,5±0,5%), относительно одинаковый индекс пролиферации (1,5±0,3), процент жизнеспособных клеток в культуре был от 89,5 до 97,8%. Клетки использовали для создания клеточно-тканевых трансплантатов.

Способ получения и культивирования фибробластоподобных клеток из пуповины новорожденных может использоваться в специализированных лабораториях культур клеток для получении клеточных продуктов для регенераторной медицины:, в исследовательских целях для тестирования in vitro.

Информационные источники

1. Патент RU 22308957. от 27.10.2007 «Способ получения препарата для мезотерапии и препарат, полученный этим способом» Ярыгин К.Н.

2. Патент RU 2384618 от 27.03.2008 «Способ получения фибробластоподобных клеток из пупочного канатика новорожденного» Сабурина И.Н, Исаев А.А., Киселев С.Л., Лагарькова М.А., Кошелева Н.В., Мелихова B.C., Приходько А.В.

Способ получения и культивирования фибробластоподобных клеток из пуповины новорожденного, включающий забор и подготовку пуповины; ее механическое измельчение; ферментативную обработку; выделение суспензии клеток в результате процессов фильтрования и центрифугирования, отличающийся тем, что забор пуповины проводят у здоровых женщин после рождения ребенка путем кесарева сечения; пуповину трижды отмывают стерильным раствором Хенкса с антибиотиком от сгустков крови и слизи, удаляют кровеносные сосуды, оставшуюся ткань измельчают при помощи лабораторного миксера; переносят материал в центрифужные пробирки и заливают 0,2% раствором коллагеназы из гепатопанкреаса краба ООО «БиолоТ» в соотношении 1:1; пробирки помещают в термошейкер при температуре +37°С, скорости вращения 100 об/мин на 16 часов; фильтруют содержимое в новые пробирки через фильтры для клеток с размером пор 70 мкм; вносят в них стерильный 0,02% раствор Версена в соотношении 1:1; центрифугируют пробирки в холодовой центрифуге при температуре +4°С, скорости вращения 1200 об/мин в течение 20 минут; надосадочную жидкость утилизируют; осадок клеток ресуспендируют в полной питательной среде, включающей αМЕМ с глютамином, 10% FBS, 8 мкг/мл гентамицина; подсчитывают количество выделенных жизнеспособных клеток в камере Горяева, используя 0,4% раствор трипанового синего; высевают клетки в дозе 1×10⁵ жизнеспособных кл./см² в культуральный флакон с аналогичной полной питательной средой; культивирование проводят в СО₂-инкубаторе при температуре +37°С, 5% СО₂ и постоянной влажности; смену среды проводят каждые 5 суток культивирования, при этом кондиционированную культуральную среду из флакона с клетками полностью отбирают пипеткой; центрифугируют ее в холодовой центрифуге при температуре +4°С, скорости вращения 1500 об/мин в течение 10 минут, после чего возвращают в культуральный флакон и добавляют свежую среду в соотношении 1:1; по достижении 80% конфлюентности клеточного монослоя проводят пересев клеток из расчета 1:2.

Похожие патенты:

Новые иммуногенные пептиды // 2709711

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к иммуногенным пептидам, и может быть использовано для понижения или блокирования иммунного ответа к антигену, входящему в состав иммуногенного пептида.

Стабильная клеточная линия карциномы молочной железы человека skbr-kat // 2709675

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к стабильной клеточной линии карциномы молочной железы человека SKBR-kat, гиперэкспрессирующей онкомаркер HER2. Линия получена путем трансфекции клеток исходной линии SKBR-3 плазмидой, содержащей ген флуоресцентного белка Katushka.

Методика культивирования клеток // 2709378

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой среду для культивирования клеток, содержащую тирозин в концентрации от 4 до 50 мМ и поливиниловый спирт (PVA) в концентрации от 0,5 до 10 г/л и способ культивирования клеток, включающий приведение клеток млекопитающего в контакт со средой для культивирования клеток эмбриональной почки человека (293), клеток почки новорожденного хомячка (BHK), клеток яичника китайского хомячка (CHO), мышиных клеток Сертоли, клеток почки африканской зеленой мартышки (VERO-76), клеток рака шейки матки человека (HeLa), клеток почки собаки, клеток печени крысы линии Buffalo, клеток легкого человека, клеток печени человека, клеток опухоли молочной железы мыши, клеток TRI, клеток MRC 5, клеток FS4 или линии гепатомы человека (Hep G2).

Способ извлечения стволовых клеток костного мозга с применением способа культивирования с субфракционированием и их пролиферации // 2708987

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к культивированию стволовой клетки с субфракционированием. Способ включает культивирование клеток костного мозга, выделенных от индивидуума, перенос только супернатанта в новую емкость и культивирование указанного супернатанта.

Способы перфузионного культивирования и их применения // 2708919

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ культивирования клетки млекопитающего, при этом способ предусматривает: обеспечение многолуночного планшета, содержащего по меньшей мере одну лунку, содержащую клетку млекопитающего, помещенную в первую жидкую культуральную среду, причем первая жидкая культуральная среда занимает от приблизительно 5% до приблизительно 70% объема лунки; инкубирование многолуночного планшета в течение некоторого периода времени при от приблизительно 31°C до 40°C и с перемешиванием вращением со скоростью от приблизительно 320 оборотов в минуту (об/мин) до приблизительно 500 об/мин; и непрерывно или периодически, в течение этого периода времени, удаление первого объема первой жидкой культуральной среды и добавление к первой жидкой культуральной среде второго объема второй жидкой культуральной среды, причем первый и второй объемы являются приблизительно равными, где: многолуночный планшет инкубируют в течение периода времени более 7 дней и в 1-3 день инкубации, в каждый 24-часовой период, первый объем удаляемой первой жидкой культуральной среды и второй объем добавляемой второй жидкой культуральной среды составляют от приблизительно 30% до приблизительно 50% объема первой жидкой культуральной среды; в 4-6 день инкубации, в каждый 24-часовой период, первый объем удаляемой первой жидкой культуральной среды и второй объем добавляемой второй жидкой культуральной среды составляют от приблизительно 40% до приблизительно 70% объема первой жидкой культуральной среды; и в 7 день и при дальнейшей инкубации, в каждый 24-часовой период, первый объем удаляемой первой жидкой культуральной среды и второй объем добавляемой второй жидкой культуральной среды составляют от приблизительно 90% до приблизительно 150% объема первой жидкой культуральной среды.

Материал стволовых клеток, композиции и способы применения // 2708329

Изобретение относится к биотехнологии. Описана композиция для терапевтического применения, содержащая: кондиционированную мезенхимальными стволовыми клетками среду, причем кондиционированная среда содержит терапевтически эффективные количества: по меньшей мере двух факторов, которые оказывают противовоспалительное действие; по меньшей мере двух факторов, которые вызывают иммуномодулирующее действие; по меньшей мере двух факторов, которые участвуют в процессах васкулогенеза и ангиогенеза; и по меньшей мере двух факторов, которые стимулируют регенерацию ткани; один или более модификатор реологии; и один или более кондиционирующий агент; причем стволовые клетки, применяемые для кондиционирования среды, характеризуются положительной экспрессией маркеров CD29 и CD44 и отрицательной экспрессией маркеров CD11b и CD45.

Лечение рака с использованием химерного антигенспецифического рецептора на основе гуманизированного антитела против egfrviii // 2708032

Настоящее изобретение относится к иммунологии. Предложен связывающий домен против EGFRvIII, содержащий его химерный антигенный рецептор, кодирующие нуклеиновые кислоты, вектор, клетка, а также применения указанных изобретений в производстве лекарственного средства, способы создания клетки и получения популяции клеток, способ обеспечения иммунитета, способ лечения.

Способ нерегламентированного замораживания клеток-предшественников периферической крови при температуре минус 80ос под защитой диметилсульфоксида // 2707921

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к нерегламентирорванному замораживанию клеток-предшественников периферической крови. Способ включает приготовление раствора криоконсерванта, для чего берут раствор Dimethylsulfoxide («Sigma-Aldrich», France) высокой степени очистки (≥99,99%) с ПП 0,200-0,220, в условиях гипотермии добавляют его в раствор для инфузий из натрия хлорида 2,25 г и воды для инъекций до 250 мл в пластиковом контейнере до получения концентрации DMSO 10% и производят смешивание его с концентратом аферезных клеток-предшественников периферической крови в равных пропорциях, замораживание от плюс 17÷ плюс 25°С до минус 80°С в режиме трехступенчатой программы в электрических рефрижераторах с установленной контрольной температурой изотермической холодовой адаптации на каждом этапе замораживания.

Способ заморозки ооцитов крупного рогатого скота // 2707252

Изобретение относится к области биотехнологии. Данный способ витрификации ооцитов млекопитающих может быть успешно применён к сельскохозяйственным животным, в частности для крупного рогатого скота (КРС).

Способ обнаружения или выделения/получения циркулирующей опухолевой клетки, использующий метод пролиферации клеток // 2707083

Изобретение относится к медицине, а именно к способу обнаружения циркулирующей опухолевой клетки и/или циркулирующей опухолевой стволовой клетки из биологической циркулирующей жидкости организма.

Способ лечения и профилактики возраст-ассоциированных заболеваний // 2709488

Изобретение относится к области гериатрии, а именно к профилактике и лечению возраст-ассоциированных заболеваний, направленный на предотвращение, устранение или замедление развития гериатрических синдромов.

Способ хирургического лечения облитераций задней уретры // 2709146

Изобретение относится к медицине, в частности к урологии. Способ включает проведение эндоскопической реканализации задней уретры с введением в уретру суспензии фрагментированного аутотрансплантата буккальной слизистой и фибрин-тромбинового клея.

Способ получения ректальных пантовых суппозиториев для мужчин // 2709011

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способу получения ректальных пантовых суппозиториев. Способ получения ректальных пантовых суппозиториев для лечения мужских урологических и проктологических заболеваний, выбранных из воспалительных процессов в прямой кишке, трещин заднего прохода, простатита и аденомы предстательной железы, состоящих из масла какао, ланолина, пантогематогена сухого, прополиса, витамина РР, витамина Е, гуминовых кислот, экстракта красного корня, обладающего противовоспалительным эффектом, и экстракта крапивы, обладающего противовоспалительным эффектом, при определенных соотношениях компонентов, заключающийся в том, что в реактор с включенной мешалкой при 60°С подают масло какао и ланолин, перемешивают в течении 1 часа до полного растворения компонентов с получением основы, в полученную основу добавляют пантогематоген сухой, прополис, витамин РР, витамин Е, гуминовые кислоты и постоянно перемешивают при температуре 40°С в течение 0,5 часа до полного растворения компонентов смеси, в полученную смесь добавляют экстракт красного корня и экстракт крапивы при перемешивании и температуре при 40°С, смесь выливают в контурную ячейковую упаковку.

Способ сохранения продуктивных качеств и жизнеспособности цыплят-бройлеров при переходе на органическое птицеводство // 2708834

Изобретение относится к птицеводству и может быть использовано при выращивании цыплят-бройлеров. Способ сохранения продуктивных качеств и жизнеспособности цыплят-бройлеров предусматривает введение в состав рациона птицы комплекса СибМОС ПРО в дозе 1,5 кг/т корма и введение фитобиотика Концентрат витаминный хвойный в воду в дозе 1 мл/л воды.

Способ удлинения и утолщения полового члена с применением клеточной трансплантации // 2708788

Изобретение относится к медицине, в частности к пластико-реконструктивной хирургии, урологии, генитальной хирургии. Применяют клеточную трансплантацию, включающую введение аутологичных клеток и биодеградируемой матрицы на основе полилактогликолевой кислоты.

Способ мечения активированных лимфоцитов in vitro комплексным соединением // 2708458

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу мечения активированных лимфоцитов in vitro комплексным соединением. Способ включает инкубирование активированных лимфоцитов с РФП 99mTc-ТЕОКСИМ в объеме 2 мл активностью 350-500 МБк, с периодическим встряхиванием в течение в течение 20 минут, после инкубирования, в пробирку с клеточной массой вносят фосфатно-солевой буфер и доводят общий объем до 10 мл, затем пробирку центрифугируют в течение 5-6 минут при 1500-2000 об/мин, после этого надосадочную жидкость полностью удаляют, меченый 99mTc-теоксимом клеточный конгломерат ресуспендируют в 1 мл фосфатно-солевого буфера.

Способ лечения онкологической боли // 2707954

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии и может быть использовано для купирования онкологической боли у больных раком различной локализации с распространенным процессом.

Способ лечения рецидивирующих афт полости рта с применением диодного лазера и аппликаций порошкообразной формы тромбоцитарной аутологичной плазмы // 2707654

Изобретение относится к медицине, а именно к терапевтической стоматологии, и может быть использовано для лечения больных с рецидивирующими афтами полости рта. Для этого осуществляют обработку афт 0,06% раствором хлоргексидина.

Генетическая конструкция, кодирующая структуру т-клеточного химерного рецептора на основе одноцепочечных vhh-антител, специфичных опухолевому рецептору cd47, для нацеленной иммунотерапии злокачественных новообразований // 2707535

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению лентивирусного вектора для экспрессии химерного антигенного рецептора (CAR) на основе VHH-антитела к CD47 в Т-клетках человека, и может быть использовано в медицине.