Препарат, содержащий фактор viii и пептиды фактора фон виллебранда

Авторы патента:

ВИНГЕ Стефан (SE)

СОЛЕЦКА Барбара (DE)

КАННИХТ Кристоф (DE)

КОЛА Гвидо (DE)

C07K14/755 - факторы VIII

C07K14/745 - факторы коагуляции или фибринолиза крови

A61P7/04 - кровоостанавливающие средства; прокоагулянты; гемостатические агенты; антифибринолитические агенты

A61K38/37 - факторы VIII

A61K38/36 - факторы свертывания или фибринолиза крови

A61K2121/00 - Лекарства и медикаменты для терапевтических, стоматологических или гигиенических целей (изготовление специальных лекарственных форм A61J; химические аспекты или использование материалов для дезодорации воздуха, для дезинфекции или стерилизации или для бандажей, перевязочных средств, впитывающих прокладок или хирургических приспособлений A61L; соединения как таковые C01, C07,C08,C12N; мыла C11D; микроорганизмы как таковые C12N)

Владельцы патента RU 2714154:

ОКТАФАРМА АГ (CH)

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к композиции, содержащей комплекс Фактора VIII и одного или более пептидов Фактора фон Виллебранда, где пептиды Фактора фон Виллебранда содержат по меньшей мере аминокислоты 764-1035 и 1691-1905 из SEQ ID NO: 1, но не содержат аминокислоты 2255-2645 из SEQ ID NO: 1, и может быть использовано в медицине. Указанная композиция используется для эффективного лечения гемофилии. 2 н. и 10 з.п. ф-лы, 14 ил., 9 пр.

Настоящее изобретение относится к фармацевтическим препаратам для лечения нарушений свертываемости крови.

Уровень техники

Фактор VIII («FVIII») представляет собой гликопротеин плазмы крови с молекулярной массой, составляющей приблизительно 280 кДа. Он участвует в каскаде реакций коагуляции, которые приводят к свертываемости крови. Наиболее распространенное расстройство свертываемости крови, гемофилия А, обусловлено дефицитом функционального Фактора VIII. Лечится путем замены Фактора VIII либо на основе плазмы, либо рекомбинантным. Фактор VIII используется для неотложного и профилактического лечения кровотечений у пациентов с гемофилией А.

Аминокислотная последовательность Фактора VIII организована в три структурных домена: утроенный домен А из 330 аминокислот, один B-домен из 980 аминокислот и дублированной домен С из 150 аминокислот. B-домен не имеет гомологии с другими белками и обеспечивает 18 из 25 потенциальных аспарагин(N)-связанных сайтов гликозилирования этого белка. B-домен не имеет по-видимому никакой функции в коагуляции. Молекулы Фактора VIII с делетированным В-доменом обладают неизменной прокоагулянтной активностью по сравнению с полноразмерным Фактором VIII. Некоторые препараты рекомбинантного Фактора VIII (rFVIII) являются делетированными по B-домену.

В плазме Фактор VIII стабилизирован ассоциацией с белком Фактора фон Виллебранда («vWF»), который, как представляется, ингибирует клиренс Фактора VIII, например, с помощью протеолиза или рецептор-опосредованного клиренса через LRP-рецептор. В кровотоке, Фактор фон Виллебранда присутствует в 50-кратном молярном избытке по отношению к Фактору VIII в нормальных физиологических условиях.

Фактор фон Виллебранда является мультимерным адгезивным гликопротеином, присутствующим в плазме у млекопитающих, который обладает многочисленными физиологическими функциями. Во время первичного гемостаза, Фактор фон Виллебранда выступает в качестве посредника между специфическими рецепторами на поверхности тромбоцитов и компонентами внеклеточного матрикса, такими как коллаген. Кроме того, Фактор фон Виллебранда служит в качестве носителя и стабилизирующего белка для прокоагулянтного фактора VIII. Фактор фон Виллебранда синтезируется в эндотелиальных клетках и мегакариоцитах в виде молекулы-предшественника из 2813 аминокислот. Полипептид-предшественник, пре-про-Фактор фон Виллебранда, состоит из сигнального пептида из 22 остатков, про-пептида из 741 остатка и полипептида из 2050 остатков, обнаруженного в зрелом факторе фон Виллебранда в плазме (Fischer et al., FEBS Lett. 351: 345-348, 1994). После секреции в плазме Фактор фон Виллебранда циркулирует в форме различных видов с различными молекулярными размерами. Эти молекулы Фактора фон Виллебранда состоят из олиго- и мультимеров зрелой субъединицы, содержащей 2050 аминокислотных остатков. Фактор фон Виллебранда может, как правило, быть обнаружен в плазме в виде мультимеров с размером в диапазоне приблизительно от 500 до 20000 кДа (Furlan, Ann Hematol. 1996 Jun;72(6):341-8).

Средний период полужизни человеческого Фактора VIII в кровотоке человека in vivo составляет приблизительно 12 часов. Фактор фон Виллебранда может уменьшить возможные иммунные реакции против Фактора VIII, будучи в комплексе с Фактором VIII, экранируя FVIII от известных потенциальных сайтов ингибирующих антител на тяжелой цепи (домен А2) и легкой цепи (A3/C2 домен) (Ragni, J Thromb. Haemost. 10: 2324-2327, 2012) или на других потенциальных ингибирующих сайтах антител на молекуле фактора VIII.

Другое нарушение свертываемости крови у человека представляет собой болезнь фон Виллебранда (БВ). В зависимости от тяжести симптомов кровотечения, БВ можно лечить с помощью заместительной терапии с использованием концентратов, содержащих Фактор фон Виллебранда, в основном, полученного из плазмы, но рекомбинантный Фактор фон Виллебранда, также находится на стадии разработки. Фактор фон Виллебранда, как известно, стабилизирует Фактор VIII in vivo, и, таким образом, играет ключевую роль в регуляции уровня Фактора VIII в плазме и, как следствие, является центральным фактором для контроля первичного и вторичного гемостаза.

До сегодняшнего дня, стандартное лечение гемофилии А и БВ включало в себя частые внутривенные инфузии препаратов Фактора VIII и концентратов Фактора VIII/Фактора Виллебранда. Эти заместительные терапии, как правило, эффективны, однако, например, пациентам с тяжелой формой гемофилии А, подвергающихся профилактическому лечению, Фактор VIII необходимо вводить внутривенно (i.v.) примерно 3 раза в неделю из-за короткого периода полужизни Фактора VIII в плазме, составляющего примерно 12 часов. Уже при достижении уровня Фактора VIII выше 1% в нормальной человеческой плазмы, соответствующему повышению уровня Фактора VIII на 0,01 ед/мл, тяжелая гемофилия А превращается в умеренную гемофилию А. При профилактической терапии, схема дозирования разрабатывается таким образом, чтобы уровень активности Фактора VIII не опускается ниже уровня 2-3% от активности Фактора VIII у не страдающих гемофилией.

Введение Фактора VIII с помощью внутривенного введения (i.v.) является трудоемким, связанным с болью и влечет за собой риск инфекции, особенно если это делается в домашних условиях самими пациентами или родителями детей с диагнозом гемофилии А. Кроме того, частые внутривенные инъекции неизбежно приводят к образованию рубцов, препятствующих будущим инфузиям. Кроме того, i.v. лечение может потребоваться в чрезвычайной ситуации или при хирургическом вмешательстве, то есть когда высокий уровень Фактора VIII будет необходим немедленно.

Подкожное введение (s.c.) был предложено для Фактора VIII, например, в WO 95/01804 А1 и WO 95/026750 А1. Однако требовалось введение очень высоких доз Фактора VIII для достижения приемлемой биодоступности.

Другой подход к улучшению биодоступности при не внутривенном введении состоял в использовании альбумин-слитого Фактора VIII (WO 2011/020866 А2).

В WO 2013/057167 А1 предложено введение Фактора VIII в комбинации с сульфатированными гликозаминогликанами посредством не внутривенного введения, необязательно вместе с Фактором фон Виллебранда.

В WO 2008/151817 А1 описано общее применение нерасщепленных мультимеров Фактора фон Виллебранда для стабилизации Фактора VIII, полученного из плазмы или рекомбинантного (полноразмерного и делеционных мутантов), предназначенных для экстраваскулярного лечения.

В WO 2013/160005 А1 описано общее применение рекомбинантного Фактора фон Виллебранда или рекомбинантных фрагментов Фактора фон Виллебранда для улучшения биодоступности после s.c.-лечения для очень специфичных молекул Фактора VIII, где указанные молекулы Фактора VIII содержат укороченный B-домен размером 100-400 аминокислот. В соответствии с WO 2013/160005 A1 молекулы Фактора VIII с укороченными доменами B от 100 до 400 аминокислот, обладают более высокой биодоступностью Фактора VIII по сравнению с Фактором VIII, содержащим полный домен B, или с молекулами Фактора VIII, содержащими укороченный домен В, в котором нет или содержится несколько аминокислот.

Все еще существует потребность в препаратах Фактора VIII, демонстрирующих улучшенную биодоступность, стабильность и/или меньший риск для выработки антител, избегая таким образом недостатки предшествующего уровня техники.

Целью настоящего изобретения является предложение альтернативных препаратов Фактора VIII. Предпочтительно, эти препараты должны демонстрировать повышенную стабильность, улучшенную биодоступность и/или уменьшенный риск для иммунологических реакций.

В одном воплощении, эту задачу решают с помощью композиции, содержащей комплекс Фактора VIII и одного или нескольких пептидов Фактора фон Виллебранда, где пептиды Фактора фон Виллебранда содержат, по меньшей мере аминокислоты 764-1035 и 1691-1905 из SEQ ID No. 1, но не содержат аминокислоты 2255-2645 из SEQ ID NO 1.

Согласно настоящему изобретению, предлагается препарат Фактора VIII, содержащий пептиды Фактор фон Виллебранда. Фактор VIII образует комплекс с содержанием пептидов Фактора фон Виллебранда.

Используемый в настоящем изобретении Фактор VIII охватывает полноразмерный Фактор VIII, где B-домен заменен на искусственный линкер или фрагмент естественного B-домена или их комбинацию, то есть B-домен имеет отличный размер по сравнению с полноразмерным Фактором VIII. Он охватывает также Фактор VIII с ограниченным числом модификаций, включающих вставки, делеции или замены, особенно Фактор VIII, адаптированный к гаплотипам, как описано у K.R. Viel, et al. New England J Med 2009; 360: 1618-1627. Предпочтительно, гомология последовательности с Фактором VIII (как определено в аминокислотах 20-2351 P00451 из SwissProt 21 июля, 1986), но без учета гомологии в B-домене, составляет 99% согласно FASTA, реализованной с помощью FASTA версии 36 на основе WR Pearson (1996) «Effective protein sequence comparison» Meth. Enzymol. 266:227-258. Другими словами, при вычислении гомологии последовательностей, В-домен не включают в сравнение обоих белков. Также охвачены модифицированный Фактор VIII, типа сшитых белков HES-Фактор VIII или ПЭГ-Фактор VIII или Фактор VIII Fc, и сшитые белки Фактора VIII с альбумином, как это описано в Oldenburg, Haemophilia (2014), 20 (Suppl. 4), 23-28.

Фактор VIII по настоящему изобретению может быть получен из плазмы или может быть рекомбинантным Фактором VIII. Когда используют рекомбинантный Фактор VIII, то предпочтительно он экспрессируется в человеческой клеточной линии, чтобы имитировать человеческий профиль гликозилирования (Casademunt, Eur J Haematol 2012; 89:. 165-76), или, как описано в публикации WO 2010/020690.

Пептиды Фактора фон Виллебранда, используемые в настоящем документе, представляют собой пептиды, содержащие, по меньшей мере, аминокислоты 764-1035 из SEQ ID NO:1 и 1691-1905 из SEQ ID NO:1 в одной аминокислотной цепи. Эти аминокислоты могут быть частью более длинной последовательности, содержащей обе эти последовательности вместе. Другими словами, пептиды фон Виллебранда согласно изобретению содержат как SEQ ID NO: 5, так и SEQ ID NO: 6. Они могут содержать дополнительные части Фактора фон Виллебранда, за исключением всех аминокислот 2255-2645 (SEQ ID NO: 7). Пептиды фон Виллебранда могут содержать другие последовательности, которые являются частью последовательности SEQ ID NO: 1, или последовательности, которые не являются частью SEQ ID NO: 1, например, аминокислотные линкеры или тому подобное. Предпочтительно, общее количество аминокислот, которые не являются частью SEQ ID NO: 1, составляет не более чем 50, не более чем 20 или не более чем 10 аминокислот.

Один из важных аспектов изобретения состоит в том, что аминокислоты 2255-2645 из SEQ ID No. 1 не являются частью пептидов Фактора фон Виллебранда. Другими словами, пептиды Фактора фон Виллебранда не содержат какой-либо последовательности, которая имеет, по меньшей мере, 90% гомологии с SEQ ID NO: 7, в соответствии с FASTA, описанной ниже.

SEQ ID NO: 1 представляет собой последовательность P04275 базы данных Swiss Prot по состоянию на 11 января 2011 года.

Пептиды Фактор фон Виллебранда в композиции по настоящему изобретению могут представлять собой пептиды, имеющие ту же последовательность, или могут представлять собой смесь пептидов, имеющих последовательности, как это определено выше.

Обычно молекулярное соотношение Фактора VIII и пептидов Фактора фон Виллебранда будет находиться в диапазоне от 1:1 до 1:20, предпочтительно от 1:2 до 1:10. Если пептиды Фактора Виллебранда представлены в форме димеров или мультимеров, то молекулярное соотношение рассчитывается на одной аминокислотной цепи, т.е. комплекс молекулы Фактора VIII с димером пептидов Фактора фон Виллебранда будет иметь соотношение 1:2.

Комплекс, используемый в данном документе, относится к нековалентному связыванию Фактора VIII с одним или несколькими пептидами Фактора фон Виллебранда.

В предпочтительном воплощении настоящего изобретения, пептиды фактора фон Виллебранда являются фрагментами фактора фон Виллебранда, т.е. N-концевыми и/или С-концевыми укороченными формами фактора фон Виллебранда.

В одном воплощении, фрагменты содержат аминокислоты 764-1905 SEQ ID NO: 1.

Следующее воплощение изобретения представляет собой композицию, содержащую комплекс фактора VIII и один или несколько пептидов Фактора Виллебранда, которые являются фрагментами фактора фон Виллебранда и имеют аминокислотную последовательность, которая соответствует аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, начиная от аминокислоты 764 и заканчивая между аминокислотами 1905 и 2153 при наличии до 20 или до 10 модификаций, выбранных из аминокислотных делеций, вставок или замен.

Предпочтительные пептиды Фактор фон Виллебранда представляют собой:

Пептиды, имеющие последовательность 764-1905 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1906 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1907 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1908 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764 -1909 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1910 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764 -1911 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764 -1912 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764 -1913 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764 -1914 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764 -1915 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1916 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764 -1917 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764 -1918 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764 -1919 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764 -1920 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764 -1921 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764 -1922 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764 -1923 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764 -1924 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1925 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1926 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1927 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1928 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1929 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1930 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1931 SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1932 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1933 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1934 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1935 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1936 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1937 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1938 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1939 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1940 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1941 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1942 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1943 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1944 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1945 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1946 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1947 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1948 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1949 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1950 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1951 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1952 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1953 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1954 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764 -1955 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1956 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1957 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1958 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1959 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1960 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1961 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1962 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1963 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1964 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1965 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1966 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1967 SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1968 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1969 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1970 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1971 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1972 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1973 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1974 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1975 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1976 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1977 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1978 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1979 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1980 SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1981 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1982 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1983 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1984 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1985 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1986 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1987 SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1988 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1989 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1990 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1991 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1992 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1993 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1994 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1995 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1996 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1997 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1998 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-1999 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2000 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2001 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2002 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2003 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2004 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2005 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2006 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2007 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2008 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2009 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2010 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2011 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2012 в SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2013 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2014 в SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2015 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2016 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2017 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2018 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2019 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2020 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2021 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность с 764-2022 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2023 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2024 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2025 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2026 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2027 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2028 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2029 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2030 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2031 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2032 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2033 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2034 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2035 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2036 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2037 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2038 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2039 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2040 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2041 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2042 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2043 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2044 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2045 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2046 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2047 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2048 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2049 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2050 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2051 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2052 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2053 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2054 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2055 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2056 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2057 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2058 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2059 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2060 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2061 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2062 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2063 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2064 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2065 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2066 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2067 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2068 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2069 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2070 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2071 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2072 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2073 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2074 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2075 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2076 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2077 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2078 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2079 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2080 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2081 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2082 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2083 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2084 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2085 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2086 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2087 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2088 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2089 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2090 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2091 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2092 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2093 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2094 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2095 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2096 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2097 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2098 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2099 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2100 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2101 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2102 SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2103 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2104 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2105 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2106 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2107 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2108 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2109 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2110 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2111 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2112 SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2113 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2114 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2115 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2116 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2117 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2118 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2119 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2120 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2121 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2122 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2123 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2124 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2125 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2126 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2127 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2128 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2129 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2130 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2131 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2132 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2133 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2134 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2135 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2136 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2137 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2138 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2139 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2140 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2141 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2142 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2143 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2144 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2145 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2146 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2147 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2148 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2149 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2150 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2151 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2152 из SEQ ID NO: 1

Пептиды, имеющие последовательность 764-2153 из SEQ ID NO: 1

Следующее воплощение изобретения представляет собой композицию, содержащую комплекс Фактора VIII с одним или несколькими пептидами Фактора фон Виллебранда, где

- пептиды Фактора фон Виллебранда являются фрагментами фактора фон Виллебранда

- Комплекс фактора VIII и фрагментов Фактора фон Виллебранда демонстрирует уменьшенное связывание с фосфолипидами мембран по сравнению с Фактором VIII индивидуально

- Комплекс Фактора VIII и фрагментов Фактора фон Виллебранда демонстрирует уменьшенное связывание с коллагеном III по сравнению с комплексом фактора VIII и полноразмерного Фактора фон Виллебранда

- Комплекс Фактора VIII и фрагментов Фактора фон Виллебранда демонстрирует уменьшенное связывание с гепарином по сравнению с комплексом Фактора VIII и полноразмерного Фактора фон Виллебранда.

Предпочтительно, пептиды Фактора фон Виллебранда имеют молекулярную массу <500 кДа, предпочтительно <400 кДа. Поскольку Фактор фон Виллебранда часто образует олигомеры или мультимеры, то пептиды по настоящему изобретению также могут быть представлены в виде мультимеров или олигомеров.

В предпочтительном воплощении, пептиды по настоящему изобретению обладают, по меньшей мере, одним свойством, выбранным из группы, состоящей из

(i) константа аффинного связывания для гепарина K_D> 1 нМ, предпочтительно ≥ 2,43 нМ

(ii) константа аффинного связывания для коллагена III в K_D> 5 нМ, предпочтительно ≥ 17,02 нМ

(iii) константа аффинного связывания для Фактора VIII K_D <100 нМ или <10 нМ, предпочтительно ≤ 6,19 нМ и

(iv) ингибирование связывания Фактора VIII с фосфолипидами составляет, по меньшей мере, 70%, предпочтительно по меньшей мере, 80% или, по меньшей мере, 90%.

Пептиды Фактора фон Виллебранда по изобретению предпочтительно демонстрируют уменьшенное связывание с гепарином, более низкую аффинность к коллагену (например, коллагену III), более низкую аффинность к фосфолипидам, но при этом сильное связывание с Фактором VIII.

Удивительно, но слабое связывание с фосфолипидами и коллагеном повышает скорость высвобождения в случае не внутривенного введения, особенно подкожного.

Измерение соответствующих констант аффинности связывания описано в экспериментальной части.

В одном воплощении, пептиды фактора фон Виллебранда являются производными от фактора фон Виллебранда с помощью протеолитического или химического расщепления. Если используется протеолитическое расщепление, то особенно предпочтительна протеаза V-8 S. aureus.

Предпочтительно, композиция по настоящему изобретению включает, по меньшей мере, одно из следующих свойств:

(i) пептиды Фактор фон Виллебранда экранируют Фактор VIII от связывания с антителами с минимизацией образования ингибитора у пациента

(ii) стабилизирует Фактор VIII для обеспечения остаточной активности Фактора VIII, составляющей, по меньшей мере, 90% после хранения в течение 12 месяцев в замороженном виде в жидком состоянии при-70 °C

(iii) стабилизирует Фактор VIII для обеспечения остаточной активности Фактора VIII, составляющей, по меньшей мере, 90% после хранения в течение 24 месяцев в лиофилизированной форме при температуре 5 °C

(iv) стабилизирует Фактор VIII для обеспечения остаточной активности Фактора VIII, составляющей, по меньшей мере, 90% после хранения в течение 12 месяцев в лиофилизированной форме при 25 °C

(v) пролонгирует период полужизни Фактора VIII в естественных условиях, по меньшей мере, на 20% и

(vi) уменьшает образование ингибитора у ранее не получавших лечение пациентов до менее чем 20%, предпочтительно до менее чем 10% после обработки композицией в течение 6 месяцев.

Удивительно, что пептиды Фактора фон Виллебранда, оказывается, увеличивают стабильность Фактора при хранении (срок годности), и/или уменьшают образование ингибиторов у пациентов. Образование ингибиторов является одной из основных проблем при лечении хронических нарушений свертываемости.

Композиция по настоящему изобретению является особенно полезной при лечении или профилактике нарушения свертываемости крови.

Таким образом, еще одним воплощением изобретения является способ лечения нарушения свертываемости крови, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества композиции по настоящему изобретению.

Количество зависит от заболевания или состояния, подлежащего лечению, и может быть выбрано специалистом в данной области техники. Для длительного лечения, как правило, подходит количество, составляющее 20-40 МЕ/кг массы тела на применение. В чрезвычайной ситуации, количество может составлять примерно 10-50 МЕ/кг массы тела.

Композиция по изобретению может применяться путем внутривенного или не внутривенного введения. Не внутривенное введение может представлять собой подкожную инъекцию, внутрикожную инъекцию или внутримышечное введение.

Одним из преимуществ способа по настоящему изобретению является возможность использования нанофильтрации для удаления вирусов. Фактор фон Виллебранда из-за его размера не может быть подвергнут нанофильтрации с использованием нанофильтров с малым размером пор для удаления вирусов. Поскольку размер пептидов Фактора фон Виллебранда намного меньше полноразмерной молекулы Фактора Виллебранда, то нанофильтрация с использованием малого размера пор становится возможной. Нанофильтрацию осуществляют при таком размере пор и при таких условиях, которые приводят к уменьшению концентрации одного из самых маленьких известных вирусов - парвовируса свиней, по меньшей мере, в 100 раз (2 log), предпочтительно по меньшей мере в 1000 (3 log) и, наиболее предпочтительно, до концентрация ниже предела обнаружения теста на парвовирус, необязательно с использованием одного или нескольких нанофильтров последовательно. Для этого теста, парвовирус свиней выкалывали в образец и анализировали после фильтрации.

Таким образом, следующее воплощение изобретения представляет собой способ уменьшения количества вируса, включающий стадию нанофильтрации пептидов Фактора фон Виллебранда до или после комбинации с Фактором VIII, в результате чего количество парвовируса свиней будет уменьшено, по меньшей мере, в 2 log.

Предпочтительный буфер для введения композиции по изобретению содержит мелизитозу, предпочтительно в количестве до 1000 мМ, конкретно, примерно от 10 мМ примерно до 200 мМ, конкретно, примерно от 10 мМ примерно до 100 мМ.

Следующее воплощение изобретения представляет собой способ получения пептидов Фактора фон Виллебранда, включающий следующие стадии:

Инкубация Фактора фон Виллебранда с протеазой V-8 S. aureus в течение 2-16 часов при массовом соотношении фермента к Фактору фон Виллебранда масс./масс., составляющем 1:5-1:100

Связывание и очищение на анионообменной смоле и сбор целевых очищенных пептидов VWF во фракцию, поступающую из анионообменной смолы с применения увеличенного количества концентрации соли.

Краткое описание чертежей

На Фигуре 1 представлена очистка фрагмента III (SPIII) из pdVWF, гидролизованных с помощью протеазы V8 S. aureus. A - MonoQ Хроматограмма профиля фрагмента III (показан стрелкой). B - SDS-PAGE-гель очищенного фрагмента; сниж.- снижается; н.с.- не снижается.

На Фигуре 2 представлена очистка фрагмента I (III-Т4) из фрагмента III, гидролизованного трипсином. MonoQ хроматограмма профиля элюирования фрагмента I (показано стрелкой). Изображение SDS-PAGE очищенного фрагмента в не восстанавливающих условиях показано на вставке.

На Фигуре 3 представлена очистка фрагмента II от фрагмента III после второго гидролиза протеазой V8 S. aureus. A - MonoQ хроматограмма профиля элюирования фрагмента II (показано стрелкой), второго продукта расщепления, а также протеазы V8. B - хроматограмма второй MonoQ хроматографии, необходимой для полного удаления протеазы. Изображение SDS-PAGE очищенного фрагмента в восстанавливающих условиях показано на вставке.

На Фигуре 4 представлено связывание pdVWF фрагментов II и III с rFVIII. A, B, C Сенсограммы связывания (серые кривые), а также выравнивание кривой (черные кривые), репрезентативное для взаимодействия между иммобилизованным rFVIII и pdVWF/очищенными фрагментами II и III. Концентрации и тип образца указаны на диаграмме. C- константы диссоциации (K_D) выражены как среднее и SEM; n=8.

На Фигуре 5 представлено связывание rFVIII с фосфолипидным монослоем в SPR и ингибирование с помощью pdVWF. А - сенсограмма связывания rFVIII и rFVIII в присутствии либо 108 нМ БСА (бычий сывороточный альбумин), либо 47,6 нМ pdVWF; каждый образец в трех экземплярах. B - среднее и SD уровня связывания, измеренного через 120 сек после окончания инъекции аналита, выраженное в процентах от связывания rFVIII; n=3.

На Фигуре 6 представлено ингибирование взаимодействия rFVIII-фосфолипид с помощью фрагментов, производных от Фактора фон Виллебранда, по измерениям в SPR. Связывание rFVIII с фосфолипидным монослоем проводили в присутствии трех различных концентраций трех фрагментов, производных от Фактора фон Виллебранда (концентрации и тип фрагмента обозначены на графике). График представляет собой среднее и SD уровней связывания, измеренных через 120 сек после окончания инъекции аналита, выраженные в процентах от связывания rFVIII; n=3.

На Фигуре 7 представлено зависимое от концентрации ингибирование связывания rFVIII с фосфолипидным монослоем фрагмента III. А - сенсограммы связывания rFVIII с фосфолипидным монослоем в присутствии различных концентраций фрагмента III (концентрации указаны на графике), каждый образец в трех экземплярах. B - среднее и SD уровней связывания, измеренных через 120 сек после окончания инъекции аналита, выраженные в процентах от связывания rFVIII; n=3.

На Фигуре 8 показаны связывания из pdVWF и фрагмента III с коллагеном типа III. A, B - сенсограммы связывания (серые кривые), а также выравнивание кривой (черные кривые), репрезентативное для взаимодействия между иммобилизованным коллагеном типа III и pdVWF/очищенного фрагмента III. Концентрации и тип образца указаны на диаграмме. C- константы диссоциации (K_D) выражены как среднее и SEM; n=9.

На Фигуре 9 представлено связывание pdVWF и фрагмента III с гепарином. A, B - сенсограммы связывания (серые кривые) и выравнивание кривой (черные кривые), репрезентативное для взаимодействия между иммобилизованным гепарином и pdVWF/очищенным фрагментом III. Концентрации и тип образца указаны на диаграмме. C - константы диссоциации (K_D) выражены как среднее и SEM; n=6.

На Фигуре 10 представлено сравнение значений времени свертывания цельной крови (WBCT), измеренных в образцах крови собак с гемофилией А, подвергнутых лечению подкожно с использованием FVIII индивидуально или в комбинации с фрагментом III VWF. WBCT, полученные после подкожного применения FVIII в комбинации с пятикратным молярным избытком фрагмента III VWF, применяли при 200 МЕ FVIII/кг массы тела. Горизонтальная пунктирная линия отмечает верхний предел времени свертывания крови у здоровых собак (12 минут).

На Фигуре 11 показана активность FVIII, измеренная с помощью теста хромогенной активности FVIII на образцах плазмы собак с гемофилией А, полученных после применения FVIII или FVIII в комбинации с фрагментом III VWF. А- FVIII, или FVIII с пятикратным молярным избытком фрагмента III VWF применяли подкожно при 200 МЕ FVIII/кг массы тела; площадь под кривой (AUC) для образца FVIII индивидуально составила 2,867, а для FVIII в комбинации с фрагментом III VWF-4,917. B- FVIII, или FVIII с пятикратным молярным избытком фрагмента III VWF применяли внутривенно в дозе 200 МЕ FVIII/кг массы тела. AUC для FVIII образца индивидуально составила 27,69, а для FVIII в комбинации с фрагментом III VWF-45,72.

На Фигуре 12 представлено связывание рекомбинантного мономера фрагмента III, рекомбинантного димера фрагмента III и VWF (flVWF) из плазмы с rFVIII. A, B, C - сенсограммы связывания (серые кривые), и выравнивание кривой (черные кривые), репрезентативное для взаимодействия между иммобилизованным VWF или рекомбинантными VWF-фрагментами и FVIII. Тип образца указан на диаграмме. Концентрация применяемого FVIII составили 0, 0,2, 0,6, 1,7, 5, 15, 45 и 135 нМ. D - константы диссоциации (K_D) выражены как среднее и SD; n=4.

На Фигуре 13 представлена стабилизация FVIII с помощью фрагмента III VWF. FVIII активность индивидуально или FVIII, в комплексе с фрагментом III VWF, инкубированном при 40 °С, измеряли в различные моменты времени.

На Фигуре14 представлено связывание с гепарином с использованием аффинной хроматографии с гепарином двух фрагментов VWF, как описано в Примере 9.

Примеры

Изобретение дополнительно поясняется следующими, не ограничивающими примерами.

Пример 1

Получение и очистка фрагментов, производных плазматического Фактора фон Виллебранда.

Получение и очистка фрагмента III (SPIII, ост. 764-2128) (Согласно Marti et al. Identification of disulfide-bridged substructures within human von Willebrand factor. Biochemistry 1987; 26:8099-8109 с модификациями) (SEQ. ID. No. 2):

SLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVA

LERCPCFHQGKEYAPGETVKIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKY

LFPGECQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNKGCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEVNV

KRPMKDETHFEVVESGRYIILLLGKALSVVWDRHLSISVVLKQTYQEKVCGLCGNFDGIQ

NNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKVSSQCADTRKVPLDSSPATCHNNIMKQTMVDSSCRIL

TSDVFQDCNKLVDPEPYLDVCIYDTCSCESIGDCACFCDTIAAYAHVCAQHGKVVTWRTA

TLCPQSCEERNLRENGYECEWRYNSCAPACQVTCQHPEPLACPVQCVEGCHAHCPPGKIL

DELLQTCVDPEDCPVCEVAGRRFASGKKVTLNPSDPEHCQICHCDVVNLTCEACQEPGGL

VVPPTDAPVSPTTLYVEDISEPPLHDFYCSRLLDLVFLLDGSSRLSEAEFEVLKAFVVDM

MERLRISQKWVRVAVVEYHDGSHAYIGLKDRKRPSELRRIASQVKYAGSQVASTSEVLKY

TLFQIFSKIDRPEASRITLLLMASQEPQRMSRNFVRYVQGLKKKKVIVIPVGIGPHANLK

QIRLIEKQAPENKAFVLSSVDELEQQRDEIVSYLCDLAPEAPPPTLPPDMAQVTVGPGLL

GVSTLGPKRNSMVLDVAFVLEGSDKIGEADFNRSKEFMEEVIQRMDVGQDSIHVTVLQYS

YMVTVEYPFSEAQSKGDILQRVREIRYQGGNRTNTGLALRYLSDHSFLVSQGDREQAPNL

VYMVTGNPASDEIKRLPGDIQVVPIGVGPNANVQELERIGWPNAPILIQDFETLPREAPD

LVLQRCCSGEGLQIPTLSPAPDCSQPLDVILLLDGSSSFPASYFDEMKSFAKAFISKANI

GPRLTQVSVLQYGSITTIDVPWNVVPEKAHLLSLVDVMQREGGPSQIGDALGFAVRYLTS

EMHGARPGASKAVVILVTDVSVDSVDAAADAARSNRVTVFPIGIGDRYDAAQLRILAGPA

GDSNVVKLQRIEDLPTMVTLGNSFLHKLCSGFVRICMDEDGNEKRPGDVWTLPDQCHTVT

CQPDGQTLLKSHRVNCDRGLRPSCPNSQSPVKVEETCGCRWTCPCVCTGSSTRHIVTFDG

QNFKLTGSCSYVLFQNKEQDLEVILHNGACSPGARQGCMKSIEVKHSALSVELHSDMEVT

VNGRLVSVPYVGGNMEVNVYGAIMHEVRFNHLGHIFTFTPQNNEFQLQLSPKTFASKTYG

LCGICDENGANDFMLRDGTVTTDWKTLVQEWTVQRPGQTCQPILE

Фрагмент III получали путем гидролиза выделенного из плазмы Фактора фон Виллебранда (pdVWF) с помощью протеазы V-8 S. aureus. Гидролиз проводили в течение 3 часов при температуре 37 °С в буфере 50 мМ Трис-HCl, 150 мМ NaCl, рН 7,8 при массовом соотношении фермента к белку, составляющем 1:40.

Очистку фрагмента проводили с использованием колонки с сильной анионообменной смолой (MonoQ). Рабочий буфер представляет собой 20 мМ Трис-HCl, рН 7,4, и элюирующий буфер (буфер В) 20 мМ Трис-HCl, 500 мМ NaCl, рН 7,4. V-8 протеаза S. aureus элюируется из анионообменной колонки при приблизительно 22 мСм/см (около 40% буфера В), поэтому длинная стадия промывки при 42% до элюирования фрагмента требуется для вымывания протеазы. В качестве альтернативы может быть проведена стадия SEC на Superose 6 10/300 GL для удаления протеазы.

Очистка фрагмента III и полученный продукт изображены на Фиг. 1. Последовательность, определенная Marti et al. 1987, была подтверждена с помощью анализа Масс-спектрометрии.

Получение и очистка фрагмента I (III-T4, ост. 764-1035) (Согласно Marti et al. 1987 с модификациями) (SEQ. ID. No. 3):

SLSCRPPMVKLVCPADNLRAEGLECTKTCQNYDLECMSMGCVSGCLCPPGMVRHENRCVA

LERCPCFHQGKEYAPGETVKIGCNTCVCQDRKWNCTDHVCDATCSTIGMAHYLTFDGLKY

LFPGECQYVLVQDYCGSNPGTFRILVGNKGCSHPSVKCKKRVTILVEGGEIELFDGEVNV

KRPMKDETHFEVVESGRYIILLLGKALSVVWDRHLSISVVLKQTYQEKVCGLCGNFDGIQ

NNDLTSSNLQVEEDPVDFGNSWKVSSQCADTR

Фрагмент I получали из фрагмента III (SPIII) с помощью гидролиза трипсином (обработанный ТРСК от крупного рогатого скота). Гидролиз проводили в течение 1,5 ч в буфере 100 мМ NH₄HCO₃ рН 8 при массовом соотношении фермента к белку 1:100.Гидролиз завершали путем добавления соевого ингибитора трипсина.

Очистку фрагмента I проводили с использованием колонки с сильной анионообменной смолой (MonoQ) с последующей SEC на Superose 6, 10/300 GL. Рабочий буфер для анионообменной колонки представляет собой 20 мМ Трис-HCl, рН 7,4, и элюирующий буфер (буфер В) 20 мМ Трис-HCl, 500 мМ NaCl, рН 7,4.Рабочий буфер для SEC представляет собой PBS (фосфатный буферный раствор) pH 7.

Очистка фрагмента I и полученный продукт изображены на Фиг. 2. Последовательность, определенная Marti et al. 1987, была подтверждена с помощью анализа MS.

Получение и очистка фрагмента II (ост. 764-1673) (SEQ. ID. No. 4):