Способы снижения и/или удаления fxi и fxia из растворов, содержащих указанные факторы свертывания


C07K1/22 - Пептиды (пептиды в пищевых составах A23, например получение белковых композиций для пищевых составов A23J, препараты для медицинских целей A61K; пептиды, содержащие бета-лактамовые кольца, C07D; циклические дипептиды, не содержащие в молекуле любого другого пептидного звена, кроме образующего их кольцо, например пиперазин-2,5-дионы, C07D; алкалоиды спорыньи циклического пептидного типа C07D519/02; высокомолекулярные соединения, содержащие статистически распределенные аминокислотные единицы в молекулах, т.е. при получении предусматривается не специфическая, а случайная последовательность аминокислотных единиц, гомополиамиды и блоксополиамиды, полученные из аминокислот, C08G 69/00; высокомолекулярные продукты, полученные из протеинов, C08H 1/00; получение

Владельцы патента RU 2649363:

ОКТАФАРМА АГ (CH)

Группа изобретений относится к биотехнологии и медицине. Предложены способы снижения и/или удаления FXI и FXIa из раствора источника, содержащего указанные факторы свертывания и иммуноглобулины в качестве основных компонентов. Осуществляют контактирование раствора источника с аффинным хроматографическим гелем, где гепарин или гепаран связаны с веществом матрицы. Обеспечивают адсорбцию FXI и FXIa. Выделяют обедненную по FXI и FXIa жидкость из адсорбирующей среды. Дополнительно элюируют FXI и FXIa из адсорбирующей среды буфером, содержащим 0,2 - 1,4 М NaCl, или буферами эквивалентной ионной силы с обеспечением элюата FXI и FXIa. В другом варианте способа дополнительно также проводят по меньшей мере один этап инактивации вирусов с применением три-N-бутилфосфата и детергента и этап концентрирования с получением содержащего иммуноглобулин-γ концентрата. Все стадии указанных способов проводят в отсутствие Polybrene® (гексадиметрина бромида) и бензамидина. Изобретения позволяют единым способом получать раствор иммуноглобулина, обедненный по FXI и FXIa, и избирательно элюировать FXI и FXIa из насыщенного антитромбином аффинного геля. При этом оба продукта не содержат Polybrene® и бензамидин, нежелательные для терапевтических препаратов. 2 н. и 11 з.п. ф-лы, 3 табл., 2 пр.

 

Настоящее изобретение относится к способу снижения и/или удаления FXI и FXIa из растворов, содержащих указанные факторы свертывания, концентрату, содержащему FXI и FXIa, получаемому способом по изобретению, и фармацевтической композиции, содержащей FXI и FXIa, получаемой способом по изобретению.

Хорошо известно, что фактор свертывания XI (FXI) представляет собой участвующий в свертывании крови белок и отражает одну из сторон внутреннего пути системы свертывания. FXI является предшественником активированного FXI (FXIa), который представляет собой активное соединение при свертывании. Таким образом, необходимо удалять FXIa из фармацевтических препаратов, предназначенных для внутривенного введения пациентам, т.к. указанный FXIa может непреднамеренно активировать свертывание, приводящее к опасным для жизни тромбическим нарушениям. С другой стороны, концентрат FXI и/или FXIa может быть благоприятным для пациентов, страдающих заболеванием, связанным с дефицитом или недостаточной активностью FXI, или для пациентов, перенесших большую потерю крови, при которой жизненно важным является быстрое и эффективное свертывание. Такой концентрат также может быть благоприятным для пациентов, имеющих ингибиторные антитела к факторам свертывания, таким как при гемофилии A и B. Такие ингибиторы могут провоцировать случаи кровотечения, таким образом, пациентам необходимы средства для поддержания свертывания и закрытия раны.

Таким образом, целью настоящего изобретения является удаление или по меньшей мере снижение FXI и/или FXIa в растворах, которые содержат FXI и/или FXIa. Другой целью настоящего изобретения является получение предоставленным способом терапевтически применимого концентрата FXI, FXIa или терапевтически применимого концентрата, содержащего смесь FXI и FXIa.

Известно несколько способов получения концентрата FXI. Bouma и Griffin опубликовали в The Journal of Biological Chemistry, 1977, vol. 252, no. 18, pp. 6432-6437, способ очистки FXI из плазмы человека хроматографией в пять этапов. Хроматографические вещества, используемые в хронологическом порядке, представляют собой DEAE-Sephadex®, QAE-Sephadex®, SP-Sephadex® (дважды) и в заключении Concanavalin A, связанный с Sepharose®. Все используемые буферы содержат Polybrene® и бензамидин.

M. Burnouf-Radosevich и T. Burnouf опубликовали в Transfusion, 1992, 32, pp. 861-867, получение лиофилизата FXI фильтрацией криосупернатантной плазмы через отрицательно заряженный фильтр (Zeta plus 50S), который адсорбирует FXI, элюированием адсорбированного FXI и хроматографией элюата на катионообменной смоле (Sulfate-Sepharose® Fast Flow). Элюат FXI формулировали с антитромбином и гепарином до лиофилизации.

Hiroshi Mashiko и Hidenobu Takahashi описали в Biol. Chem. Hoppe Seyler., 1994, vol. 375, pp. 481-484, способ получения FXI и FXIa свиньи аффинной хроматографией на основе высокомолекулярного кининогена и хроматографией на Q-Sepharose®. Для предотвращения контактной активации и решения проблемы протеолитического расщепления они добавляли Polybrene® и бензамидин к используемым буферам. Они также опубликовали, что им не удалось очистить FXI аффинной хроматографией на Heparin-Sepharose®.

В другой статье Hiroshi Mashiko и Hidenobu Takahashi в Agents and actions supplements,(Birkhaeuser Verlag, Bfse, CH), 1992, vol. 38, part 2, pp. 249-256, описали способ получения FXI и FXIa свиньи на основе хроматографии с содержащимися в буферах высокомолекулярным кининогеном, Q-Sepharose® и Protein A-Superose® с Polybrene® и бензамидином.

Tait и Fujikawa в Journal of Biological Chemistry, 1981, vol. 262, no. 24, pp. 11651-11656, описали способ очистки FXI и прекалликреина из плазмы человека хроматографией в три этапа и с использованием Polybrene® и бензамидина в буферах. Синтетический пептид, представляющий собой один участок легкой цепи высокомолекулярного кининогена, иммобилизовали на носителе и использовали для выделения прекалликреина, FXI и некоторого переноса IgG из плазмы. Затем прекалликреин и FXI разделяли хроматографией на гепарине-агарозе и в дальнейшем обрабатывали CM-Sephadex® с получением практически чистых фракций FXI и прекалликреина.

Saito et al. в The Journal of Clinical Investigation, vol. 52, pp. 850-861, 1973, описал способ очистки FXI, состоящий из адсорбции плазмы на Ca3(PO4)2, многократного фракционирования сульфата аммония и последующей хроматографии на QAE-Sephadex® (дважды), Sephadex®-G150 и SP-Sephadex® с Polyprene®, содержащимся для предотвращения активации FXI.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способу снижения содержания FXI, FXIa или их смеси в растворе, содержащем указанные белки и иммуноглобулины в качестве основного компонента. Это получают адсорбцией указанных белков на адсорбирующем веществе, выбранном из силикатов (в частности, диоксида кремния, перлитов, цеолитов или диатомовой земли), гидроксида алюминия (Al2(OH)3), оксигидроксида алюминия (AlO(OH)), оксида алюминия (Al2O3) или веществ, подходящих для аффинной хроматографии. Указанные подходящие для аффинной хроматографии вещества состоят из полисахаридов, например декстрана, гепарина или гепарана, связанных с веществом матрицы (например, цеолитов или полимеров, таких как акрилаты и сахариды), в частности геля, используемого для аффинной хроматографии на гепарине, такого как, например, Heparin Sepharose(TM) FF или Toyopearl AF Heparin 650 M(TM).

Содержащие источник растворы могут представлять собой любые жидкости, содержащие FXI и/или FXIa, получаемые из крови или плазмы крови, или жидкости, получаемые биотехнологическими способами. Известные, но неограничивающие примеры таких растворов представляют собой криосупернатантную плазму, промежуточные соединения способа по Коэну (например, восстановленную пасту I+II+III) и их производные, промежуточные соединения способа по Кистлер-Нитшман (например, восстановленный осадок A) и их производные или растворы, получаемые в результате экспрессии рекомбинантного белка, а также растворы, которые преимущественно состоят из других белков, где FXI или FXIa содержатся в виде примеси, что может быть в случае растворов иммуноглобулина гамма (IgG).

Способ снижения и/или удаления FXI и FXIa из растворов, содержащих указанные факторы свертывания и иммуноглобулины в качестве основного компонента, включает следующие этапы:

a) контактирование раствора, содержащего FXI и/или FXIa, с аффинным хроматографическим гелем, где гепарин или гепаран связаны с веществом матрицы;

b) обеспечение адсорбции FXI и/или FXIa; и

c) выделение обедненной по FXI и/или FXIa жидкости из адсорбирующей среды.

Также возможно модифицировать этап a) таким образом, что активные центры матрицы или геля являются уже насыщенными или их насыщают антитромбином во время нагрузки матрицы или геля FXI и/или FXIa.

Адсорбцию можно проводить как статическую адсорбцию, где раствор источника смешивают с адсорбентом, перемешивают и нагруженные на адсорбент FXI и/или FXIa удаляют из супернатанта известными способами, такими как седиментация, фильтрация или центрифугирование. Альтернативный способ представляет собой помещение адсорбирующего материала в хроматографическую колонку и применение раствора источника для нагрузки адсорбента FXI и/или FXIa.

В одном из вариантов осуществления изобретения силикаты, выбранные из группы из диоксида кремния, перлитов, цеолитов или диатомовой земли, можно дополнительно использовать в качестве адсорбентов FXI и/или FXIa.

В дополнительном варианте осуществления можно использовать дополнительную адсорбционную среду, выбранную из группы из гидроксида алюминия, оксигидроксида алюминия или оксида алюминия.

Также возможно комбинировать адсорбцию, проводимую в статической режиме, например, с диатомовой землей или гидроксидом алюминия в качестве адсорбирующего вещества, с адсорбцией, проводимой на хроматографической колонке с Heparin Sepharose(TM) в качестве адсорбента.

В другом варианте осуществления изобретения одну адсорбцию на гепарине или гепаране, связанным с веществом матрицы, проводят после предварительной обработки хроматографического вещества антитромбином III.

Нагруженный адсорбент тщательно промывают промывочным буфером для предотвращения десорбции FXI и/или FXIa и получаемый промывной раствор можно добавлять к фильтрату и/или супернатанту для дополнительной обработки и для оптимизации выхода других представляющих интерес соединений, таких как иммуноглобулины, в частности IgG, в этом обедненном FXI/FXIa растворе. Обработанный Heparin Sepharose(TM) обедненный FXI/FXIa раствор, как правило, содержит менее 0,15 МЕд/мл FXI, в частности менее 0,1 МЕд/мл FXI, даже более предпочтительно от 0,00 до 0,05 МЕд/мл FXI. Выраженное в международных единицах (МЕд) содержание FXIa такого обедненного раствора, как правило, составляет менее 10 мЕд/мл FXIa, в частности менее 5 мЕд/мл FXIa, даже более предпочтительно от 0,0 до 1,0 мЕд/мл FXIa.

Дополнительную обработку обедненного по FXI/FXIa раствора можно включать в один или более этапов инактивации вирусов, где приводимые примеры представляют собой обработку растворителем/детергентом (обработку S/D), УФ-облучение, пастеризацию, инкубацию при низком pH, осаждение или нанофильтрацию каприлатами. Другие этапы включают этапы хроматографии, концентрирования для получения концентрата фармацевтически активного соединения, формулирование и наполнение, которые известны из способов получения различных белков, таких как иммуноглобулины, в частности IgG, альбумина, фибриногена, антитромбина или альфа-1-антитрипсина, и являются обязательными для получения фармацевтических композиций и зависят от продукта, который необходимо получать.

FXI и/или FXIa можно элюировать из нагруженного адсорбента, в частности, если адсорбент представляет собой аффинный хроматографический гель с гепарином или гепараном, связанным с матрицей. Элюирование FXI и/или FXIa из аффинного хроматографического геля проводят элюирующим буфером, состоящим из 0,2-1,4 M NaCl, в частности 0,25-1,0 M NaCl, даже более конкретно 0,25-0,5 M NaCl и 0,003-0,03 M фосфата, или эквивалентной ионной силы. Получаемый таким образом раствор, содержащий FXI и/или FXIa, также можно подвергать инактивации вирусов указанными выше способами и концентрировать ультрафильтрацией/диафильтрацией с получением концентрата, содержащего FXI, FXIa или оба белка. Указанный концентрат можно дополнительно формулировать с адъювантами для получения фармацевтической композиции, обеспечивающей лечение заболеваний, связанных с дефицитом или недостаточной активностью FXI или FXIa.

Неожиданно было обнаружено, что уровни FXI и FXIa элюата хроматографического геля на основе гепарина ниже предела детекции указанных белков, несмотря на то, что антитромбин проходил. Ожидалось, что FXI и FXIa будут замещены антитромбином, в частности изоформой антитромбин-β, т.к. известно, что он прочно связывается с аффинными гелями на основе гепарина и гепарана. Даже более удивительным было то, что удалось избирательно элюировать FXI и FXIa из насыщенного антитромбином аффинного геля на основе гепарина элюирующими буферами с от низкой до средней ионной силой, в основном содержащими 0,2-1,4 M NaCl, или буферами эквивалентной ионной силы, в то время как антитромбин III (AT-III) необходимо элюировать буферами с высокой ионной силой, в основном содержащими более 1,5 M NaCl, в частности приблизительно 2,0 M NaCl. Это свойство позволяет даже избирательно элюировать FXI/FXIa с последующим элюированием AT-III или совместно элюировать смесь, содержащую FXI, FXIa и AT-III при элюировании буфером с достаточно высокой ионной силой также для элюирования AT-III.

Даже более удивительным было обнаружить, что добавление Polybrene® и бензамидина к буферам не является необходимым, как обычно указано в литературе известного уровня техники для предотвращения контактной активации и решения проблемы протеолитического расщепления.

Одну из целей настоящего изобретения с наиболее значительным преимуществом осуществляют путем предварительной обработки аффинных хроматографических гелей декстраном, гепарином или гепараном, связанными с матрицей вещества антитромбином III (AT-III). Предварительную обработку можно проводить до такой степени, что активные центры хроматографического вещества являются насыщенными AT-III. Этот способ является особенно эффективным, т.к. связывающая способность аффинного геля в отношении FXI и FXIa является улучшенной, и связывание других факторов свертывания предотвращено или по меньшей мере в значительной степени пространственно-затрудненно. Таким образом, возможно, избирательно удалять FXI и FXIa из сопутствующих белков и получать раствор FXI и FXIa, не содержащий другие факторы свертывания после элюирования из аффинного геля.

Также объектом изобретения является концентрат фармацевтически активного компонента, получаемый способом по изобретению, а также получаемая, как указано выше, фармацевтическая композиция.

В концентрате фармацевтически активный компонент по изобретению или фармацевтически активный компонент фармацевтической композиции по изобретению представляет собой IgG.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способу снижения содержания FXI, FXIa или смеси обоих белков в растворе, содержащем указанные белки и иммуноглобулины в качестве активного компонента. Это получают адсорбцией указанных белков на адсорбирующем веществе, выбранном из силикатов (в частности, диатомовой земли), или подходящих для аффинной хроматографии веществ, в частности геля, используемого для аффинной хроматографии на гепарине или гепаране, такого как, например, Heparin Sepharose (TM) FF или Toyo-pearl AF Heparin 650 M(TM).

Содержащий источник раствор может представлять собой любую жидкость, содержащую FXI и/или FXIa, полученную из крови или плазмы крови или жидкости, полученных биотехнологическими способами. Известные, но неограничивающие примеры таких растворов представляют собой криосупернатантную плазму, промежуточные соединения способа по Коэну (например, восстановленную пасту I+II+III) и их производные, промежуточные соединения способа по Кистлер-Нитшман (например, восстановленный осадок A) и их производные или растворы, получаемые в результате экспрессии рекомбинантного белка, а также растворы, которые преимущественно состоят из других белков, где FXI или FXIa содержатся в виде примеси, что может быть в случае растворов иммуноглобулина гамма (IgG).

Способ снижения и/или удаления FXI и FXIa из растворов, содержащих указанные факторы свертывания и иммуноглобулины в качестве основного компонента, включает следующие этапы:

a) контактирование раствора, содержащего FXI и/или FXIa, с аффинным хроматографическим гелем, где гепарин или гепаран связаны с веществом матрицы;

b) обеспечение адсорбции FXI и/или FXIa; и

c) выделение обедненной по FXI и/или FXIa жидкости из адсорбирующей среды.

Также возможно модифицировать этап a) таким образом, что активные центры матрицы или геля являются уже насыщенными или их насыщают антитромбином во время нагрузки матрицы или геля FXI и/или FXIa.

Альтернативный способ представляет собой помещение адсорбирующего вещества в хроматографическую колонку и применение раствора источника для нагрузки адсорбента FXI и/или FXIa.

Этапы a) и b) проводят, нагружая белками в буфере с электропроводностью 10-18 мС, в частности с электропроводностью 14-17 мС, хроматографическую смолу (Heparin-Sepharose™ FF). Нагруженный адсорбент тщательно промывают промывающим буфером аналогичной электропроводности для предотвращения десорбции FXI и/или FXIa и получаемый промывной раствор можно добавлять к фильтрату и/или к супернатанту для дополнительной обработки и оптимизации выхода IgG, содержащегося в фильтрате в качестве обедненного по FXI/FXIa раствора. Обработанный Heparin Sepharose™ обедненный по FXI/FXIa раствор, как правило, содержит менее 0,1 МЕд/мл FXI, даже более конкретно от 0,00 до 0,05 МЕд/мл FXI. Выраженное в международных единицах (МЕд) содержание FXIa такого обедненного раствора, как правило, составляет менее 5 мЕд/мл FXIa, даже более конкретно от 0,0 до 1,0 мЕд/мл FXIa.

Дополнительную обработку обедненного FXI/FXIa раствора можно включать в один или более этапов инактивации вирусов, где приводимые примеры представляют собой обработку растворителем/детергентом (обработку S/D), как описано в EP-A-131740, включенной посредством ссылки, УФ-облучение, пастеризацию, инкубацию при низком pH, осаждение или нанофильтрацию каприлатами. Другие этапы включают этапы хроматографии, концентрирования для получения концентрата фармацевтически активного соединения, формулирование и наполнение, которые известны из способов получения различных белков, таких как иммуноглобулины, в частности IgG, альбумина, фибриногена, антитромбина или альфа-1-антитрипсина, и являются обязательными для получения фармацевтических композиций и зависят от продукта, который необходимо получать.

FXI и/или FXIa можно элюировать из нагруженного адсорбента элюирующим буфером, состоящим из 0,36 M NaCl и 0,01M фосфата, или эквивалентной ионной силы. Получаемый таким образом раствор, содержащий FXI и/или FXIa, также можно подвергать инактивации вирусов указанными выше способами и концентрировать ультрафильтрацией/диафильтрацией с получением концентрата, содержащего FXI, FXIa или оба белка. Указанный концентрат можно дополнительно формулировать с адъювантами для получения фармацевтической композиции, обеспечивающей лечение заболеваний, связанных с дефицитом или недостаточной активностью FXI или FXIa.

ПРИМЕРЫ

Анализ активности фактора XIa

Рекомбинант фактор свертывания IX (без FIXa) активировался до FIXa содержащимся в образце FXIa. В присутствии фосфолипидов и ионов кальция FIXa образует ферментный комплекс с активированным тромбином FVIII:C, который в избытке содержится в анализируемом растворе. Затем этот ферментный комплекс активирует FX, который также содержится в анализируемом образце, до фактора Xa (FXa). Образуемое количество FXa измеримо коммерчески доступными субстратами и прямо пропорционально концентрации FXIa в образце. Количественное определение проводили посредством сравнения с калибровочной кривой.

Стоит отметить, что этот анализ показывает активности FIXa и FXa, когда образцы измеряют на ранних стадиях процесса фракционирования плазмы, такой как криосупернатантная плазма. Таким образом, понятно, что для таких образцов указаны суммарные активности FXIa, FIXa и FXa с условием, что в образце содержатся FIXa и Fxa.

Пример 1

Исходное вещество обрабатывали Heparin Sepharose FF, помещенным в колонку, для обеспечения адсорбции FXI и FXIa на хроматографическом веществе. Содержащий IgG фильтрат приводили в контакт с Hyflo, т.е. диатомовой землей, центрифугировали для удаления нагруженного Hyflo, а затем содержащий IgG супернатант обрабатывали промежуточной пастой I+II+III. Восстановлением таким образом полученного промежуточного вещества было выявлено 0,02 МЕд/мл FXI и менее 1 мЕд/мл FXIa.

Пример 2

Пасту I+II+III получали аналогичным образом, как в примере 1, за исключением связывания FXI/FXIa диатомовой землей. Определением FXI и FXIa выявлено содержание 0,05 МЕд/мл FXI и 3,5 мЕд/мл FXIa.

В таблицах 1-3 представлены аналитические данные образцов до и после хроматографии, где измерения 2-5 проводили при уменьшенной нагрузке исходного материала для геля на основе гепарина по сравнению с измерением 1.

Таблица 1
Анализ исходного вещества
Образец A - исходное вещество Уменьшенная нагрузка колонки
измерение 1 измерение 2 измерение 3 измерение 4 измерение 5
IgG [г/л] 7,12 6,94 6,65 5,47 7,02
Фактор XI [МЕд/мл] 1,03 1,00 1,00 0,94 0,92
Фактор XIa [мЕд/мл] 2,5 1,6 1,6 1,9 1,6

Таблица 2
Анализ образца нескольких экспериментов в соответствии с примерами 1 (измерение 1, измерение 4 и измерение 5) и 2 (измерение 2 и измерение 3)
Образец B - после хроматографии на гепарине-сефарозе. Уменьшенная нагрузка колонки
измерение 1 измерение 2 измерение 3 измерение 4 измерение 5
IgG [г/л] 6,42 6,5 6,38 5,66 6,95
Фактор XI [МЕд/мл] 0,05 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01
Фактор XIa [мЕд/мл] 3,5 <1,0 <1,0 <1,0 <1,0

Таблица 3
Анализ образца нескольких экспериментов в соответствии с примером 1
Образец C - после обработки гепарином-сефарозой и Hyflo Уменьшенная нагрузка колонки
измерение 1 измерение 2 измерение 3 измерение 4 измерение 5
IgG [г/л] 4,79 - - 4,98 4,43
Фактор XI [МЕд/мл] 0,02 - - <0,01 <0,01
Фактор XIa [мЕд/мл] <1,0 - - <1,0 <1,0

1. Способ снижения и/или удаления FXI и FXIa из раствора источника, содержащего указанные факторы свертывания и иммуноглобулины в качестве основных компонентов, включающий следующие этапы:

a) контактирование раствора источника с аффинным хроматографическим гелем, где гепарин или гепаран связаны с веществом матрицы;

b) обеспечение адсорбции FXI и FXIa и

c) выделение обедненной по FXI и FXIa жидкости из адсорбирующей среды, и

d) необязательно, элюирование FXI и FXIa из адсорбирующей среды элюирующим буфером, содержащим 0,2 - 1,4 М NaCl, или буферами эквивалентной ионной силы с обеспечением элюата FXI и FXIa,

где указанный способ проводят в отсутствие Polybrene® (гексадиметрина бромида) и бензамидина.

2. Способ по п.1, где активные центры аффинного хроматографического геля являются уже насыщенными или обеспечивают их насыщение антитромбином.

3. Способ по п.1 или 2, где обедненную по FXI и FXIa жидкость далее подвергают дополнительной стадии адсорбции, используя в качестве адсорбентов FXI и FXIa силикаты, выбранные из группы из диоксида кремния, перлитов, цеолитов или диатомовой земли.

4. Способ по п.1 или 2, где обедненную по FXI и FXIa жидкость далее подвергают дополнительной стадии адсорбции, используя дополнительную адсорбирующую среду, выбранную из группы из гидроксида алюминия, оксигидроксида алюминия или оксида алюминия.

5. Способ по п.1 или 2, где одну адсорбцию на гепарине или гепаране, связанным с веществом матрицы, проводят после обработки хроматографического вещества антитромбином III.

6. Способ по п.1 или 2, где раствор источника преимущественно содержит иммуноглобулин-γ.

7. Способ по п.1 или 2, где обедненную по FXI и FXIa жидкость дополнительно подвергают по меньшей мере одному этапу инактивации вирусов, выбранному из обработки растворителем/детергентом, УФ-облучения, пастеризации, инкубации при низком pH, осаждения или нанофильтрации каприлатами с получением обеденного по FXI и FXIa раствора, содержащего инактивированные вирусы.

8. Способ по п.1 или 2, где обедненную по FXI и FXIa жидкость, необязательно содержащую инактивированные вирусы, концентрируют с получением фармацевтически активного компонента, который необязательно составляют для получения фармацевтической композиции.

9. Способ по п.1 или 2, где:

i) на стадии а) раствор источника наносят на аффинный хроматографический гель в загрузочном буфере с электропроводностью 10-18 мС;

ii) после стадии с) гель промывают буфером с электропроводностью 10-18 мС и объединяют фильтрат (i) и элюат после промывания с обедненной по FXI и FXIa жидкостью;

и также проводят по меньшей мере один этап инактивации вирусов с применением три-N-бутилфосфата и детергента;

iii) с последующим этапом концентрирования; и

iv) необязательно формулированием полученного содержащего иммуноглобулин-γ концентрата.

10. Способ по п.1, где FXI и FXIa элюируют из адсорбирующей среды элюирующим буфером, состоящим из 0,36 М NaCl и 0,01 М фосфата.

11. Способ по любому из пп.1, 2 или 10, где элюат FXI и FXIa подвергают стадии инактивации вируса.

12. Способ по любому из пп.1, 2 или 10, где элюат FXI и FXIa концентрируют, в частности, путем ультрафильтрации/диафильтрации с получением концентрата, содержащего FXI, FXIa или оба этих фактора свертывания.

13. Способ получения содержащего иммуноглобулин-γ концентрата, включающий проведение способа по п.1, в котором дополнительно:

i) на стадии а) раствор источника наносят на аффинный хроматографический гель в загрузочном буфере с электропроводностью 10-18 мС;

ii) после стадии с) гель промывают буфером с электропроводностью 10-18 мС и объединяют фильтрат (i) и элюат после промывания с обедненной по FXI и FXIa жидкостью;

и также проводят по меньшей мере один этап инактивации вирусов с применением три-N-бутилфосфата и детергента;

iii) с последующим этапом концентрирования с получением содержащего иммуноглобулин-γ концентрата.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биохимии. Описан способ получения in vitro композиции, содержащей секреторноподобный иммуноглобулин, включающий стадии получения белковой композиции, выделенной из крови, содержащей иммуноглобулин, имеющий в составе J-цепь, в неочищенном виде, и смешивания композиции стадии (а) с секреторным компонентом.
Изобретение относится к способу получения композиции IgG из раствора IgG, частично очищенного от человеческой плазмы и имеющего содержание IgG более чем 95% по отношению к сумме белков.

Группа изобретений относится к биотехнологии, а именно к получению иммуноглобулиновой композиции со сниженным уровнем тромбогенных агентов. Способы включают фракционирование плазмы крови по Кону и/или по Кистлеру-Ничманну с получением содержащего иммуноглобулин раствора.

Изобретение относится к области биохимии. Описано изобретение, включающее применение иммобилизованного нековалентного комплекса неонатального Fc-рецептора и бета-2-микроглобулина (b2m), связанного с хроматографическим материалом, в качестве лиганда для аффинной хромотографии при аффинной хромотографии с восходящим линейным градиентом рН, где нековалентный комплекс неонатального Fc-рецептора (FcRn) и бета-2-микроглобулина (b2m) биотинилирован, а хроматографический материал модифицирован стрептавидином.

Предложенная группа изобретений относится к области медицины. Предложен препарат антитела, содержащий IgG, IgA и, по меньшей мере, 5% антител IgM по массе от общего количества антител, обладающий специфической активностью активации комплемента, где в анализе in vitro препарат антитела по существу не образует С5а и/или по существу не образует С3а.

Изобретение относится к области биохимии. Описана группа изобретений, включающая способ получения иммуноглобулина человека и препарат иммуноглобулина человека, полученный вышеуказанным способом.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ получения содержащей IgM композиции иммуноглобулинов из фракции плазмы.

Изобретение относится к области биохимии. Описано изобретение, включающее способ получения антитела против IGF-1R при помощи катионной хроматографии.

Изобретение относится к области биотехнологии. Способ выделения мономерного антитела из состава, содержащего агрегаты антител с высокой молекулярной массой, предусматривает контактирование состава с гидроксиапатитовой смолой и элюирование очищенного антитела из смолы.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии. Способ улучшения производительности вирусного фильтра во время очистки белков предусматривает обработку композиции, содержащей белок, подлежащий очистке, на стадии катионного обмена и на стадии удаления эндотоксинов, одновременно или в любом порядке, перед пропусканием через указанный вирусный фильтр.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к композициям, содержащим рекомбинантные варианты человеческого фактора свертывания крови Ха, что может быть использовано в медицине.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению производных фактора свертывания крови VII и VIIa, их конъюгатов с полимерами, способными увеличивать время полувыведения из кровотока, комплексов с ними, полученных путем связывания носителя с конъюгатом, к генам, кодирующим производные, к экспрессирующим векторам, содержащим эти гены, трансформантам с введенными экспрессирующими векторами, к способам их получения, фармацевтическим композициям и способам лечения, и может быть использовано в медицине для предупреждения или лечения гемофилии или улучшения свертываемости крови.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способу улучшения прокоагулянтных свойств тканевого фактора (TF), экспрессированного в эукариотических клетках, и может быть использовано в медицине.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способу выделения очищенного концентрата тромбина. Способ получения концентрата тромбин, свободного от вирусов, заключающийся в криофракционировании свежезамороженной плазмы донорской крови человека, выделении протромбинового комплекса на анионообменном сорбенте DEAE Sepharose Fast Flow, активации протромбина раствором СаСl2 в составе протромбинового комплекса с получением тромбина, вирусной инактивации сольвент-детергентным методом и очистке полученного тромбина на катионообменном сорбенте Fractogel EMD-SO3 с последующей стерильной фильтрацией и лиофилизацией.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению модифицированного фактора FVII, и может быть использовано в медицине. Полипептид FVII модифицируют путем замены аминокислотного остатка, выбранной из D196L, D196I, D196Y, К197Е, K197D, K197L, К197М, K197I, K197V, K197F, K197W, K197Y, K199D и K199E, в аминокислотной последовательности FVII, представленной в виде SEQ ID NO: 3, или в соответствующих остатках его предшественника с SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к увеличивающим гемостаз вариантам фактора Ха, кодирующим их нуклеиновым кислотам, получению и применению фактора Xa для лечения расстройств, связанных с гемостазом.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к гематологии и может быть использована при лечении расстройств, ассоциированных с кровотечением. Способ по изобретению включает введение субъекту химерного полипептида фактора VIIa, где указанный химерный полипептид фактора VIIa включает домен EGF-2 и каталитический домен фактора VII; домен GLA, выбранный из группы, состоящей из домена GLA фактора VII, домена GLA фактора IX и домена GLA белка S; и домен EGF-1, выбранный из группы, состоящей из домена EGF-1 фактора IX и домена EGF-1 белка S.

Изобретение относится к очистке различных гамма-карбоксилированных форм полипептида с использованием ионообменной хроматографии. В частности, согласно изобретению предложен способ очистки полипептида, имеющего желаемое содержание гамма-карбоксиглутаминовой кислоты, из образца, содержащего смесь вариантов указанного полипептида, имеющих различные содержания гамма-карбоксиглутаминовой кислоты, при этом указанный способ включает стадии: (а) загрузки указанного образца на анионообменный хроматографический материал; (b) элюирования указанного полипептида с использованием раствора при рН менее чем 9,0, содержащего по меньшей мере одну соль, выбранную из ацетата аммония, хлорида аммония и ацетата натрия; и (с) отбора фракции, полученной после указанного элюирования, при этом полипептиды в данной фракции имеют желаемое содержание гамма-карбоксиглутаминовых кислот.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ контроля аутоактивации фактора VII или его аналога и способ предотвращения расщепления активированного фактора VII или его аналога.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту c биспецифическим связыванием с CD40. Также раскрыты иммуноконъюгат, включающий указанное антитело или антигенсвязывающий фрагмент, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая указанное антитело или его фрагмент, экспрессионный вектор, содержащий указанную нуклеиновую кислоту, клетка-хозяин, содержащая указанный вектор, фармацевтическая композиция, содержащая указанное антитело или его фрагмент.

Группа изобретений относится к биотехнологии и медицине. Предложены способы снижения иили удаления FXI и FXIa из раствора источника, содержащего указанные факторы свертывания и иммуноглобулины в качестве основных компонентов. Осуществляют контактирование раствора источника с аффинным хроматографическим гелем, где гепарин или гепаран связаны с веществом матрицы. Обеспечивают адсорбцию FXI и FXIa. Выделяют обедненную по FXI и FXIa жидкость из адсорбирующей среды. Дополнительно элюируют FXI и FXIa из адсорбирующей среды буфером, содержащим 0,2 - 1,4 М NaCl, или буферами эквивалентной ионной силы с обеспечением элюата FXI и FXIa. В другом варианте способа дополнительно также проводят по меньшей мере один этап инактивации вирусов с применением три-N-бутилфосфата и детергента и этап концентрирования с получением содержащего иммуноглобулин-γ концентрата. Все стадии указанных способов проводят в отсутствие Polybrene® и бензамидина. Изобретения позволяют единым способом получать раствор иммуноглобулина, обедненный по FXI и FXIa, и избирательно элюировать FXI и FXIa из насыщенного антитромбином аффинного геля. При этом оба продукта не содержат Polybrene® и бензамидин, нежелательные для терапевтических препаратов. 2 н. и 11 з.п. ф-лы, 3 табл., 2 пр.

Наверх