Способ загрузки неорганических наночастиц или органических молекул в пористые частицы микронного или субмикронного размера

Изобретение относится к загрузке пористых частиц микронного или субмикронного размера неорганическими наночастицами или органическими молекулами. Описан способ загрузки неорганических наночастиц или органических молекул в пористые частицы микронного или субмикронного размера, включающий получение суспензии неорганических наночастиц или органических молекул и пористых частиц в водной среде или в среде органического растворителя; контролируемое замораживание суспензии со скоростью фронта кристаллизации меньшей критической скорости, при которой частицы захватываются фронтом, причем замораживание осуществляют при перемешивании со скоростью, при которой не происходит седиментация частиц; оттаивание суспензии; и выделение загруженных пористых частиц, а также способ получения полимерных капсул микронного или субмикронного размера, включающий получение загруженных пористых частиц микронного или субмикронного размера, формирование полимерной оболочки на поверхности указанных загруженных пористых частиц микронного или субмикронного размера, растворение пористых частиц микронного или субмикронного размера путем обработки реагентом, растворяющим пористые частицы, а также полимерная капсула, содержащая неорганические наночастицы и/или органические молекулы. Технический результат - повышение эффективности загрузки неорганических наночастиц или органических молекул в пористые частицы микронного или субмикронного размера или полимерные капсулы. 3 н. и 10 з.п. ф-лы, 3 пр., 1 табл., 6 ил.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к загрузке пористых частиц микронного или субмикронного размера неорганическими наночастицами или органическими молекулами. Способ также позволяет получать полимерные капсулы, загруженные неорганическими наночастицами или органическими молекулами.

Уровень техники

В настоящее время существует проблема изготовления новых инновационных продуктов для фармацевтической, авиакосмической промышленности, фотоники, экологии и пищевой промышленности. Прогресс в этом направлении сдерживается отсутствием способов получения мультифункциональных умных материалов. Мультифункциональность материалов и контролирование их свойств можно реализовать при использовании многокомпонентных композитных структур со строго определенными массовыми долями и распределением каждого компонента. Индуцированная кристаллизацией адсорбция (ИКА) представляет собой новый подход к контролируемой загрузке неорганических наночастиц и органических молекул, в частности, белков, в пористые частицы. Способ ИКА позволяет адсорбировать компоненты количественно, с высокой воспроизводимостью для каждого цикла.

Существует известный способ прессования материалов под воздействием направленного замораживания кристаллов льда, который используют для сжатия предшественников керамических материалов (Qian, L. & Zhang, H. Controlled freezing and freeze drying: a versatile route for porous and micro-/nano-structured materials. J. Chem. Technol. Biotechnol. 86, 172-184 (2011). Известна также инкапсуляция флуоресцентных красителей или флуоресцентно меченых полимеров и действующих лекарств в тераностические носители с многофункциональными свойствами. Навигацию таких носителей in vivo можно осуществлять с помощью градиентов магнитного поля (Voronin, D. V. et al. In Vitro and in Vivo Visualization and Trapping of Fluorescent Magnetic Microcapsules in a Bloodstream. ACS

Appl. Mater. Interfaces 9, 6885-6893 (2017) и Galanzha, E. I. et al. In vivo magnetic enrichment, photoacoustic diagnosis, and photothermal purging of infected blood using multifunctional gold and magnetic nanoparticles. PLoS One 7, e45557 (2012)), и они обеспечивают наиболее высокий фотоакустический сигнал в неразбавленной крови, а также демонстрируют лазерную активацию и высвобождение под действием ультразвука. Наиболее широко используемыми типами темплатов для таких носителей являются пористые ватеритные частицы микронных и субмикронных размеров. Указанные частицы обладают значительными преимуществами, такими как низкая стоимость, легко масштабируемое получение, биосовместимость, биоразлагаемость, растворимость в мягких условиях pH (6,5), высокая пористость и стабильность при высокой температуре и давлении.

Примеры инкапсулированных веществ включают в себя противоопухолевые препараты цисплатин и доксорубицин, гидрохлорид тетрациклина и фотодинамические красители. В большинстве опубликованных статей, касающихся ватеритных частиц, сообщалось об исследованиях эффективности интернализации, токсичности (жизнеспособности клеток) и кинетических профилях высвобождения лекарств in vitro. Значительное достижение в эффективности интернализации частиц клетками и доставки лекарств связано с переходом от микронного к субмикронному диапазону.

Ватеритные носители начали использовать in vivo более восьми лет назад (Genina, E. A. et al. In vivo optical monitoring of transcutaneous delivery of calcium carbonate microcontainers. Biomed. Opt. Express 7, 2082-2087 (2016)). В настоящее время их применяют в биомедицине в качестве темплатов и носителей для систем доставки лекарств. Их вводят различными путями, включая трансдермальное введение, ингаляцию, интертуморальное и пероральное введение. Частицы ватерита также используют при получении пищевых полимерных добавок и очистке воды. Однако их переход от научных исследований и разработок к промышленному применению осложнился из-за отсутствия эффективного подхода к загрузке. Традиционные способы позволяют вводить максимум лишь 4 мас.% магнетита за семь стадий, а воспроизводимость загрузки в течение одной стадии является низкой. Среди упомянутых способов следует отметить, такие как адсорбция из раствора (De Cock, L. J. et al. Polymeric multilayer capsules in drug delivery. Angew. Chemie Int. Ed. 49, 6954-6973 (2010)), инкапсуляция в ходе приготовления частиц (метод соосаждения) (Svenskaya, Y. I. et al. Photodynamic therapy platform based on localized delivery of photosensitizer by vaterite submicron particles. Colloids Surfaces B Biointerfaces 146, 171-179 (2016)), химическое осаждение паров (Christian, P., Ehmann, H. M. A., Coclite, A. M. & Werzer, O. Polymer Encapsulation of an Amorphous Pharmaceutical by initiated Chemical Vapor Deposition for Enhanced Stability. ACS Appl. Mater. Interfaces 8, 21177-21184 (2016)) и сверхкритическая флюидная технология (Liu, H., Finn, N. & Yates, M. Z. Encapsulation and sustained release of a model drug, indomethacin, using CO2-based microencapsulation. Langmuir 21, 379-385 (2005)).

Повышение эффективности загрузки функциональных наночастиц или молекулярных веществ в пористые частицы представляет собой актуальную задачу. Решение этой проблемы позволит улучшать носители биоактивных веществ, предназначенных для целевой доставки, и разрабатывать эффективные функциональные материалы на основе наночастиц, обладающие суперпарамагнитными или плазмонными свойствами.

Сущность изобретения

Подход замораживания/оттаивания широко использовался для многих целей, включая создание ламеллярных и пористых структур, микро- и нанопроволок, а также микро- и наночастиц. Указанный подход основан на контролируемом направленном замораживании, с тем, чтобы кристаллы льда росли в одном направлении. В направлении «a» гексагонального основания кристаллы растут в 100 раз быстрее, чем в перпендикулярном направлении «c». В результате кристаллы льда вырастают в виде ламеллярной микроструктуры, параллельно направлению «a» (Wegst, U. G. K., Schecter, M., Donius, A. E. & Hunger, P. M. Biomaterials by freeze casting. Philos. Trans. R. Soc. London A Math.Phys. Eng. Sci. 368, 2099-2121 (2010)).

До сих пор упомянутый подход не применялся для загрузки неорганических наночастиц или органических молекул в микронные и субмикронные пористые частицы. В настоящем изобретении авторы предлагают использовать для загрузки неорганических наночастиц или органических молекул в пористые матрицы кристаллизацию растворителя (ИКА).

Решение указанной проблемы достигается способом загрузки неорганических наночастиц или органических молекул в пористые частицы микронного или субмикронного размера, включающим получение суспензии неорганических наночастиц или органических молекул и пористых частиц в водной среде или в среде органического растворителя; контролируемое замораживание суспензии со скоростью фронта кристаллизации меньшей скорости, при которой частицы захватываются фронтом, причем замораживание осуществляют при перемешивании со скоростью, при которой не происходит седиментация частиц; оттаивание суспензии; и выделение загруженных пористых частиц. Предпочтительно, после оттаивания в суспензию вводят дополнительное количество неорганических наночастиц или органических молекул и проводят повторное замораживание и оттаивание.

При необходимости, введение дополнительного количества неорганических наночастиц или органических молекул, повторное замораживание и оттаивание проводят несколько раз.

Предпочтительно, органические молекулы представляют собой белки, в частности бычий сывороточный альбумин, или красители, в частности индоцианин зеленый, цианиновые красители, фталоцианины.

Как правило, пористые частицы микронного или субмикронного размера содержат СаСО₃, в частности одну из его полиморфных модификаций - ватерит.

Предпочтительно, неорганические наночастицы содержат магнетит или золото.

Кроме того, применение способа ИКА позволяет получать полимерные капсулы микронного или субмикронного размера, путем получения загруженных пористых частиц микронного или субмикронного размера способом, раскрытым выше;

формирования полимерной оболочки на поверхности указанных загруженных пористых частиц микронного или субмикронного размера;

растворения пористых частиц микронного или субмикронного размера путем обработки реагентом, растворяющим пористые частицы.

Предпочтительно полимерная оболочка дополнительно содержит белок.

Как правило, полимерную многослойную оболочку формируют путем послойной адсорбции полимеров. Для этого получают суспензию загруженных пористых частиц микронного или субмикронного размера, полимера и, при необходимости белка, в воде; осуществляют контролируемое замораживание суспензии со скоростью фронта кристаллизации меньшей критической скорости, при которой частицы захватываются фронтом кристаллизации, причем замораживание осуществляют при перемешивании со скоростью, при которой не происходит седиментация частиц; проводят оттаивание суспензии и выделение частиц. Оболочка может быть сформирована различными парами полимеров, например: бычий сывороточный альбумин и дубильная кислота, поли-L-аргинин и декстрансульфат, полиаллиламина гидрохлорид и полистиролсульфонат натрия.

Изобретение также раскрывает пористые частицы микронного или субмикронного размера загруженные неорганическими наночастицами или органическими молекулами, полученные способом по изобретению и полимерную капсулу, полученную способом по изобретению.

Далее изобретение раскрыто с учетом следующих чертежей:

Фиг.1. (a) схема способа ИКА;

(b) (I), загрузка наночастиц магнетита (МНЧ) путем соосаждения;

(b) (II, III), 1-я и 7-я загрузка МНЧ посредством адсорбции;

(IV, V), 1-я и 7-я загрузка МНЧ способом ИКА;

(c), зависимость массовой доли МНЧ (определенной с помощью взвешивания твердого остатка после каждого цикла замораживания-оттаивания) от числа циклов замораживания-оттаивания.

Фиг.2. Оптическая микроскопия процесса ИКА;

(a) Суспензия микрочастиц;

(b) Движение фронта кристаллизации;

(c) Запрессовывание наночастиц в микрочастицы фронтом кристаллизации;

(d-f) Схема адсорбции МНЧ, вызванной продвижением фронта кристаллизации.

Фиг.3. Изображения микронных (a-f) и субмикронных (g-i) частиц ватерита, полученные методом СЭМ;

(a, d, g) до осуществления способа ИКА;

(b, e, h) после одного цикла ИКА;

(c, f, i) после максимального числа циклов ИКА. Вставки показывают изображения СЭМ при большем увеличении.

Фиг.4. (a) Полученное методом СЭМ изображение микрочастицы, загруженной наночастицами золота (НЧЗ) с использованием способа ИКА;

(b) Полученное методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (КЛСМ) изображение незагруженных контрольных микрочастиц;

(c) Полученное методом КЛСМ изображение микрочастицы, загруженной комплексом БСА-РИТЦ с использованием способа ИКА;

(d) Зависимость массовой доли комплекса БСА-РИТЦ от числа циклов замораживания/оттаивания или ступеней адсорбции. Стрелка указывает на массовую долю комплекса БСА-РИТЦ, достигнутую путем соосаждения; (e) фотография пробирок, содержащих микрочастицы CaCO₃/БСА-РИТЦ, полученные путем осуществления (I) адсорбции, (II) соосаждения и (III) способа ИКА.

Фиг.5. (a) Формирование полимерных капсул;

(b-d) полученные методом СЭМ изображения микрокапсул с различными количествами магнетита;

(e-g) полученные методом СЭМ изображения субмикронных капсул с различными количествами магнетита.

Фиг.6. Временная зависимость экстинкции раствора микрокапсул во внешнем магнитном поле.

Осуществление изобретения

В общем случае способ ИКА включает в себя несколько последовательных стадий: добавление суспензий микро- и наночастиц в емкость, замораживание образцов при слабом перемешивании, оттаивание образцов и разделение суспензии. Данный процесс можно повторять несколько раз, что делает возможным достижение высокой эффективности загрузки наночастиц (фиг.1a). Количество циклов замораживания/оттаивания определяется необходимой загрузкой.

Непрерывной фазой суспензии служит вода или водные растворы, кроме того могут быть использованы органические растворители, такие диметилсульфоксид.

Для запрессовывания наночастиц в пористую матрицу микрочастиц оба типа частиц должны выталкиваться фронтом кристаллизации до тех пор, пока не кристаллизуется вся жидкая фаза растворителя, в которой были первоначально диспергированы частицы.

Частицы вытесняются фронтом кристаллизации, если текущая скорость фронта меньше критической скорости, при которой частицы захватываются в ходе кристаллизации.

Из работы (Wegst, U. G. К., Schecter, М., Donius, А. Е. & Hunger, P. М. Biomaterials by freeze casting. Philos. Trans. R. Soc. London A Math.Phys. Eng. Sci. 368, 2099-2121 (2010)) известно, что критическая скорость кристаллизации рассчитывается по формуле:

где - свободная энергия, - среднее расстояние между молекулами в жидкости, η - вязкость жидкости, r - радиус частицы, где и - теплопроводность частиц и жидкости соответственно.

Отношение текущей скорости фронта кристаллизации к его критической скорости зависит от химического состава кристаллизующейся жидкости и частиц, радиуса частиц и условий замораживания. Суспензии микрочастиц СаСО₃ и наночастиц магнетита (МНЧ) замораживали по отдельности для проверки соответствия вышеуказанным условиям для каждого типа частиц. Нано- и микрочастицы смещались от стенок пробирки фронтом кристаллизации к ее центру, в чем можно легко убедиться при визуальном наблюдении. Это означает, что текущая скорость фронта кристаллизации меньше критической скорости фронта кристаллизации.

Присутствие частиц вблизи фронта кристаллизации приводит к его искривлению. Граница раздела твердое тело-жидкость претерпевает выпуклый изгиб в направлении частицы, если теплопроводность данной частицы ниже теплопроводности жидкости. Если теплопроводность частицы выше теплопроводности жидкости, граница раздела твердое тело-жидкость претерпевает вогнутый изгиб в сторону, противоположную от частицы. В дополнение к этому, впереди фронта кристаллизации образуются области, которые характеризуются высокими концентрациями нано- и микрочастиц и пониженной температурой кристаллизации (концентрационное переохлаждение). Температура кристаллизации воды в порах меньше 100 нм ниже, чем в объемной воде, и понижается с уменьшением диаметра пор. Указанный эффект в результате может приводить к выталкиванию наночастиц в поры ватерита под действием фронта кристаллизации.

Изображения микрочастиц ватерита, полученные методом СЭМ, до осуществления способа ИКА в отношении МНЧ (фиг. 3a), а также после 1-го (фиг. 3b) и 7-го (фиг. 3c) циклов замораживания/оттаивания приведены на фиг. 3. МНЧ формировали оболочки на поверхности ватерита (фиг. 3b,c, пунктирные линии).

Как показано на фиг.3b,c,e,f,h,i, форма микронных и субмикронных частиц ватерита сохранялась после каждого цикла замораживания/оттаивания с наночастицами магнетита.

Данным способом могут быть загружены неорганические наночастицы диаметром от 5 до 40 нм, например, золота или оксида железа (магнетит), а также диоксида титана, и органические молекулы с высокой (белки, например бычий сывороточный альбумин) и низкой молекулярной массой (органические красители - индоцианин зеленый, цианиновые красители, фталоцианины). Выбор загружаемого вещества (сорбат): неорганические частицы и/или органические молекулы, зависит от конкретных задач, для выполнения которых создаются носители. Кроме этого, главным критерием является выталкивание загружаемых частиц фронтом кристаллизации дисперсионной среды. В качестве пористых частиц (сорбент) для экспериментов был использован СаСО₃, в частности, ватерит размером 400-700 нм (субмикронные частицы) и 3-5 мкм (микронные частицы), так как частицы ватерита обладают рядом преимуществ: высокая пористость, биосовместимость, технологическая простота их растворения после формирования полимерной оболочки (если требуется), низкая стоимость реагентов для их получения. Однако выбор сорбента не ограничен только ватеритом. Главным и для сорбента, и для сорбата должна быть способность выталкивания частиц фронтом кристаллизации дисперсионной среды.

Изобретение может быть проиллюстрировано следующими примерами.

Пример 1

В качестве примера осуществления способа был проведен эксперимент по загрузке частиц ватерита частицами магнетита, осуществляемый различными способами.

Микрочастицы CaCO₃ загружали путем соосаждения следующим образом:

0,615 мл 1 M раствора CaCl₂ и 0,615 мл 1 M раствора Na₂CO₃ впрыскивали в 2,5 мл суспензии МНЧ в воде при интенсивном перемешивании. Через одну минуту перемешивание останавливали, а образовавшуюся дисперсию частиц разделяли центрифугированием и промывали два раза деионизованной водой.

Микрочастицы CaCO₃ загружали посредством адсорбции следующим образом:

к 40 мг частиц CaCO₃ добавляли 2 мл суспензии МНЧ и встряхивали смесь в течение 15 мин. После этого частицы отделяли центрифугированием и промывали два раза деионизованной водой. Для различных образцов указанную процедуру повторяли до семи раз.

Микрочастицы CaCO₃ загружали способом ИКА следующим образом:

к 40 мг частиц CaCO₃ добавляли 2 мл суспензии МНЧ в воде. Пробирку для микроцентрифуги с реакционной смесью выдерживали в морозильной камере при -20°C в течение 2 ч при медленном и постоянном перемешивании со скоростью 4 об/мин в ротационном перемешивателе.

После этого образцы оттаивали при комнатной температуре и промывали. Условия оттаивания не существенны. Его проводят при температуре не более 35°С, чтобы уменьшить вероятность перекристаллизации карбоната кальция из полиморфной модификации ватерит в более термодинамически устойчивую - кальцит.

Некоторые образцы высушивали в сушильном шкафу, тогда как другие подвергали повторному замораживанию/оттаиванию. Для различных образцов замораживание/оттаивание повторяли до семи раз.

Количество МНЧ, загруженных способом ИКА, измеряли как разность между массой частиц до и после загрузки. При соосаждении количество МНЧ определяли методом колориметрического титрования, поскольку в указанном случае МНЧ загружали в ходе получения микрочастиц ватерита.

Результаты экспериментов проиллюстрированы на фиг. 1b и 1с.

Сравнительное изображение суспензии ватерита с МНЧ, загруженными различными способами, показано на фиг.1b. Изображение демонстрирует способ ИКА (фиг.1b (IV,V)) в сравнении с другими использованными способами (фиг.1b (I-III)). Способ ИКА позволяет адсорбироваться более значительным количествам магнетита (13%) в микрочастицы ватерита по сравнению с адсорбцией (4%) и соосаждением (3%). Можно добавлять дополнительное количество наночастиц того же или другого типа способом соосаждения до осуществления способа ИКА или можно адсорбировать дополнительное количество наночастиц того же или другого типа на полиэлектролитную оболочку после осуществления способа ИКА. Это позволяет достигать еще более высокой загрузки или создавать многофункциональные носители. Образцы частиц ватерита промывали, сушили и взвешивали после каждой загрузки для оценки массовой доли адсорбированных МНЧ. Зависимость массы адсорбированных МНЧ от числа циклов замораживания представлена на фиг.1c. На фиг. показано, что, при использовании одинакового массового соотношения между МНЧ и частицами ватерита для субмикронных и микронных частиц ватерита, количество адсорбированных МНЧ было больше на частицах субмикронных размеров (массовая доля 31%), чем на частицах микронных размеров (массовая доля 13%). Предположительно, это обусловлено тем, что субмикронные частицы имеют более развитую пористую поверхность. При этом при одинаковой массе частиц ватерита, общая площадь поверхности частиц микронных размеров была в восемь раз меньше площади частиц субмикронных размеров.

Замораживание суспензии, содержащей микрочастицы CaCO₃ и МНЧ, показано на фиг.2. В ходе кристаллизации МНЧ и микрочастицы CaCO₃ продвигались под действием фронта кристаллизации (фиг.2b, e;), и МНЧ концентрировались вокруг поверхности частиц ватерита. На конечной стадии процесса (фиг.2c, f) МНЧ запрессовывались под действием растущего давления образующегося льда на поверхность частиц CaCO₃.

Пример 2

Способ ИКА испытали на наночастицах золота (НЧЗ) для оценки эффективности адсорбции частиц размером 10, 20 и 40 нм. Процесс загрузки ватерита путем замораживания/оттаивания повторяли три раза. Было обнаружено, что эффективность адсорбции повышалась с увеличением размера наночастиц. НЧЗ агрегировали в процессе загрузки, и агрегаты размещались на поверхности микрочастиц (фиг.4a). Эффективность загрузки НЧЗ определяли методом оптической спектроскопии (Synergy H1Multi-Mode Reader, фирма BioTek Instruments, США) путем измерения поглощения света в диапазоне 300-900 нм. После каждого цикла замораживания/оттаивания измеряли количество незагруженных НЧЗ в надосадочной жидкости. Количество загруженных НЧЗ (Δm) определяли как разность между исходным и незагруженным количеством частиц. В результате эксперимента оказалось, что количество НЧЗ, загруженных способом ИКА, было в три раза больше количества, достигнутого при адсорбции. Результаты представлены в табл.1

Таблица 1.

Эффективность адсорбции наночастиц золота размером 10, 20 и 40 нм.

Количество загрузок	ИКА	Адсорбция из раствора
	10 нм	20 нм	40 нм	10 нм	20 нм	40 нм
Δm, мкг	Δm, мкг	Δm, мкг	Δm, мкг	Δm, мкг	Δm, мкг
1	390	660	700	130	580	210
2	285	650	620	100	220	250
3	300	600	700	80	20	270
Общее кол-во	980	1920	2010	310	820	730

Способ ИКА можно использовать для адсорбции полимеров на поверхности ватерита. Это позволяет получать структуры с большим количеством комплекса бычий сывороточный альбумин - родамин-B-изотиоцианат (БСА-РИТЦ; фиг.4e). Комплекс БСА-РИТЦ адсорбировался на микрочастицах из забуференного фосфатами физиологического раствора (ЗФР). Образование оболочек БСА-РИТЦ на поверхности ватерита подтверждали методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (КЛСМ; фиг.4b,c), а количество адсорбированного комплекса БСА-РИТЦ определяли методом спектрофотометрии (Зависимость массовой доли комплекса БСА-РИТЦ, определенной методом оптической спектроскопии, от числа циклов загрузки ИКА/адсорбции приведена на фиг.4d). Способ ИКА позволяет адсорбировать в четыре раза большее количество комплекса БСА-РИТЦ (13,5%), чем способы адсорбции (3,7%) и соосаждения (3,6%). Процесс замораживания-оттаивания может оказывать влияние на третичную или четвертичную структуру альбумина. Его можно контролировать при помощи таких факторов, как скорость замораживания и концентрация белков. Повышение скорости замораживания приводит к сокращению периода времени сильного воздействия охладителя на молекулы (Yu, Z., Garcia, A. S., Johnston, K. P. & Williams, R. O. III Spray freezing into liquid nitrogen for highly stable protein nanostructured microparticles. Eur. J. Pharm. Biopharm. 58, 529-537 (2004)). В дополнение к этому, возрастание концентрации белка повышает его стабильность. Это можно объяснить уменьшением относительного количества молекул белка на границе раздела лед/концентрированный раствор. Таким образом, существует много возможностей для исключения негативного воздействия замораживания на третичную или четвертичную структуру альбумина.

Полученные композитные частицы микронного и субмикронного размера использовали в качестве темплата для полимерных магнитных капсул (фиг. 5a). Формирование полимерных капсул состояло из четырех стадий. Первая стадия представляла собой синтез микронных или субмикронных частиц ватерита. Вторая стадия представляла собой загрузку различных концентраций МНЧ на поверхность частиц ватерита способом ИКА. На третьей стадии формировали многослойные оболочки, состоящие из БСА и таниновой кислоты, на поверхности композитных частиц. Указанные оболочки формировали комплексом полифенолов и белков, взаимодействующих в основном за счет водородных связей. Они могут обладать достаточной прочностью, чтобы быть стабильными, хотя электростатические силы, активирующие межслоевые взаимодействия, не вовлечены в формирование упомянутых микросфер. На четвертой стадии ватеритные ядра медленно растворяли при добавлении 0,2 M раствора ЭДТА, затем следовала стадия промывания. Указанная процедура в результате приводила к получению полимерных капсул микронного и субмикронного размера с различным количеством магнетита (фиг. 5b-g). Концентрацию комплекса БСА-РИТЦ определяли путем измерения интенсивности флуоресценции (A_ex=560 нм, A_em=590 нм) надосадочной жидкости после каждой ступени замораживания/оттаивания. Все измерения выполняли при 24°C в одноразовых 96-луночных планшетах.

На фиг. 5d, g показано, что капсулы, сформировавшиеся на основе микрочастиц ватерита, загруженные большим количеством магнетита, не сжимались после высушивания. Это непосредственно указывает на то, что основная масса частиц магнетита распределялась по поверхности частиц ватерита и образовывала магнетитные оболочки/корки, которые сохраняли свою форму после растворения ядра. В отличие от капсул микронных размеров, субмикронные капсулы не сохраняли свою форму при высушивании.

Скорость перемещения полученных капсул во внешнем магнитном поле определяли по форме временной зависимости экстинкции суспензии образца на 660 нм при приложении постоянного магнита к одной из стенок кюветы. Указанные зависимости приведены в виде графиков на фиг. 6. Как показано на фиг. 6, способ ИКА позволяет получать полимерные нанокомпозитные капсулы с большими количествами магнетита и, как результат, с большим магнитным моментом для лучшей магнитной навигации в вариантах применения доставки лекарств.

Высвобождение комплекса БСА-РИТЦ из полученных микрокапсул измеряли в течение 9 дней. Высвобождение комплекса БСА-РИТЦ являлось медленным и устойчивым. Загруженный материал также может контролируемо высвобождаться в результате ферментативной деградации оболочки, под действием лазерного излучения или ультразвуковой обработки.

Получение полимерных капсул иллюстрируется следующим примером.

Пример 3

Темплатом для полимерных капсул являлись частицы ватерита, загруженные МНЧ согласно примеру 1. Для изготовления микронных и субмикронных капсул использовали послойную сборку. Способ получения микрокапсул с помощью послойной сборки путем последовательной адсорбции полиэлектролитов раскрыт в работах (G.B. Sukhorukov, E. Donath, S. Davis, H. Lichtenfeld, F. Caruso, V.I. Popov, H. Möhwald, Polym. Adv. Technol. 1998, 9, 759-767, E. Donath, G.B. Sukhorukov, F. Caruso, S.A. Davis, H. Möhwald, Angew. Chem. Int. Ed. 1998, 37, 2201-2205) и в патенте EP1064087A2.

Микрокапсулы приготовляли путем последовательной адсорбции из 1 мл суспензии БСА (концентрация в воде 2 мг/мл) и таниновой кислоты (концентрация в воде 2 мг/мл) на сферические поверхности ядер CaCO₃. Каждый цикл адсорбции полимера проводили в течение 15 мин. Затем ядра медленно растворяли путем обработки реагентом ЭДТА (концентрация в воде 0,2 M, уровень pH 7,3), а продукты реакции удаляли путем двукратного промывания в деионизованной воде. Для медленного растворения ядер реагент ЭДТА медленно добавляли к суспензии частиц при встряхивании до полного растворения ядер. После каждого цикла адсорбции, а также после растворения ядер CaCO₃, суспензию микрочастиц центрифугировали (при 240 g в случае микронных капсул и при 1300 g в случае субмикронных капсул) и дважды промывали деионизованной водой. В результате, капсулы представляли собой оболочки с тремя двойными слоями БСА-таниновая кислота. В отличие от частиц ватерита, полимерные композитные капсулы являются очень стабильными. Все образцы композитных капсул хранили в холодильной камере при 4°C. После 15 месяцев хранения капсулы сохраняли свою форму и дзета-потенциал (-45±5 мВ) и не агрегировали.

Во всех случаях загрузка в % - это отношение массы загруженного вещества к общей массе полученного носителя вместе с загруженным веществом.

Как продемонстрировано в настоящем документе при помощи НЧЗ, МНЧ и комплекса БСА-РИТЦ в случае частиц ватерита микронного размера способ ИКА обеспечивал достижение, по меньшей мере, в три раза большей загрузки наночастиц магнетита и в четыре раза большей загрузки белка, по сравнению с традиционными способами, такими как адсорбция и соосаждение. Для субмикронных частиц способ ИКА позволяет осуществлять превышающую в пять раз загрузку наночастиц магнетита, по сравнению с традиционными способами.

Указанный дешевый и легкий для последующего масштабирования способ можно применять с целью изготовления наполнителей композитов для новых сплавов, многофункциональных контрастных веществ, датчиков и носителей для доставки биоактивных веществ с регулируемой чувствительностью к внешним стимуляторам (градиент магнитного поля, лазерное излучение или ультразвук).

1. Способ загрузки неорганических наночастиц или органических молекул в пористые частицы микронного или субмикронного размера, включающий

получение суспензии неорганических наночастиц или органических молекул и пористых частиц в водной среде или в среде органического растворителя;

контролируемое замораживание суспензии со скоростью фронта кристаллизации меньшей критической скорости, при которой частицы захватываются фронтом, причем замораживание осуществляют при перемешивании со скоростью, при которой не происходит седиментация частиц;

оттаивание суспензии; и

выделение загруженных пористых частиц.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что после оттаивания в суспензию вводят дополнительное количество неорганических наночастиц или органических молекул и проводят повторное замораживание и оттаивание.

3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что введение дополнительного количества неорганических наночастиц или органических молекул, повторное замораживание и оттаивание проводят несколько раз.

4. Способ по любому из пп. 1-3, в котором органические молекулы представляют собой белки, в частности бычий сывороточный альбумин.

5. Способ по любому из пп. 1-3, в котором органические молекулы представляют собой красители, в частности индоцианин зеленый, цианиновые красители, фталоцианины.

6. Способ по любому из пп. 1-5, в котором пористые частицы микронного или субмикронного размера содержат СаСОз в частности ватерит.

7. Способ по любому из пп. 1-6, в котором неорганические наночастицы состоят из магнетита или золота.

8. Пористые частицы микронного или субмикронного размера загруженные неорганическими наночастицами или органическими молекулами, полученные способом по любому из пп. 1-7.

9. Способ получения полимерных капсул микронного или субмикронного размера, включающий

получение загруженных пористых частиц микронного или субмикронного размера способом по любому из пп. 1-7;

формирование полимерной оболочки на поверхности указанных загруженных пористых частиц микронного или субмикронного размера; и

растворение пористых частиц микронного или субмикронного размера путем обработки реагентом, растворяющим пористые частицы.

10. Способ по п. 9, отличающийся тем, что полимерная оболочка дополнительно содержит белок.

11. Способ по п. 9 или 10, отличающийся тем, что полимерную оболочку формируют путем получения суспензии загруженных пористых частиц микронного или субмикронного размера, полимера и, при необходимости белка, в воде; контролируемое замораживание суспензии со скоростью фронта кристаллизации меньшей критической скорости, при которой частицы захватываются фронтом кристаллизации, причем замораживание осуществляют при перемешивании со скоростью, при которой не происходит седиментация частиц; оттаивание суспензии и выделение частиц.

12. Способ по п. 10 или 11, отличающийся тем, что полимерная оболочка содержит пару полимеров, выбранных из ряда: бычий сывороточный альбумин и дубильная кислота, поли-L-аргинин и декстрансульфат, полиаллиламина гидрохлорид и полистиролсульфонат натрия.

13. Полимерная капсула, содержащая неорганические наночастицы и/или органические молекулы, полученная способом по любому из пп. 9-12.