Не относящиеся к человеку животные, экспрессирующие гуманизированный комплекс cd3

Изобретение относится к области биохимии, в частности к генетически модифицированному грызуну, который экспрессирует на поверхности своих Т-клеток функциональный гуманизированный CD3 комплекс, содержащий химерные белки человека/грызуна CD3ε, CD3δ и CD3γ, к его клетке, а также к способу его создания. Также раскрыт способ отбора антигенсвязывающего белка, вызывающего активацию Т-клеток, предусматривающий введение интересующего антигена в вышеуказанного генетически модифицированного грызуна. Изобретение позволяет эффективно исследовать биспецифический антигенсвязывающий белок на основе CD3. 5 н. и 52 з.п. ф-лы, 11 ил., 4 табл., 3 пр.

 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА СМЕЖНЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка представляет собой обычную заявку по заявке №62/083,653, поданной 24 ноября 2014 г., и заявке №62/106,999, поданной 23 января 2015 г., каждая из которых полностью включена в настоящий документ путем ссылки.

ССЫЛКА НА ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Настоящая заявка включает последовательности в файле формата txt под названием 470382_SEQLST.txt, созданном 23 ноября 2015 г. и имеющем размер 23 965 байт, который включен в настоящий документ путем ссылки.

ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Предложено генетически модифицированное не относящееся к человеку животное (например, грызун, например, мышь или крыса), которое содержит в геноме нуклеотидную последовательность, кодирующую гуманизированный белок CD3, например гуманизированный CD3ε, гуманизированный CD3δ и/или гуманизированный CD3γ. Таким образом, предложены генетически модифицированные не относящиеся к человеку животные, которые экспрессируют гуманизированный комплекс CD3. Также в настоящем документе предложена модель доклинического исследования лекарственных средств на основе CD3, например антител на основе CD3, например биспецифических антител на основе CD3.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В дополнение к субъединицам Т-клеточного рецептора, например высоковариабельным TCRα и TCRβ, Т-клеточный рецепторный комплекс на поверхности Т-клетки содержит инвариантные цепи CD3ε, CD3δ и CD3γ, которые образуют гетеродимеры, состоящие из CD3εδ и CD3εγ. Также с комплексом TCR/CD3 связана ζ-цепь, которая присутствует в виде гетеродимера, связанного дисульфидными мостиками.

Цепи CD3 играют ключевую роль в сборке Т-клеточного рецептора, транспорте к клеточной поверхности, эндоцитозе поверхностных рецепторов, развитии Т-клетки и Т-клеточной сигнализации. Например, в исследованиях дефицита различных субъединиц CD3 продемонстрировано, что цепи CD3 имеют важное значение при превращении Т-клетки из двойной отрицательной (CD4-CD8- или DN) в двойную положительную (CD4+CD8+ или DP) и в одинарную положительную (CD4+ или CD8+ или SP). Кроме того, каждая из цепей CD3ε, CD3δ и CD3γ содержит один иммунорецепторный тирозиновый активирующий мотив (ITAM), а димер ζ-цепи содержит 6 полных ITAM. Эти мотивы выступают в качестве сигнальных модулей и фосфорилируются посредством связанных киназ при взаимодействии с TCR.

Показано, что антитела к CD3 приводят к образованию кластеров CD3 на Т-клетках, тем самым вызывая активацию Т-клеток таким же образом, как при взаимодействии TCR с молекулами МНС, нагруженными пептидами. Таким образом, антитела к CD3 были предложены в качестве потенциальных лекарственных средств, направленных на активацию Т-клеток. Кроме того, биспецифические антитела, способные связываться с CD3 и целевым антигеном, были предложены для терапевтического применения, включающего нацеливание Т-клеточных иммунных ответов на ткани и клетки, экспрессирующие целевой антиген.

Наиболее предпочтительной является стандартная животная модель для доклинического исследования моно- и биспецифических терапевтических антител на основе CD3.

ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем документе предложено генетически модифицированное не относящееся к человеку животное, содержащее генетически модифицированный эндогенный локус нечеловеческого CD3, кодирующий внеклеточный домен человеческого белка CD3, причем человеческий белок CD3 представляет собой CD3ε, CD3δ, CD3γ, CD3ζ или любую их комбинацию. В одном варианте осуществления эндогенный локус нечеловеческого CD3 генетически модифицирован таким образом, что кодирует внеклеточный домен человеческого CD3ε, внеклеточный домен человеческого CD3δ и внеклеточный домен человеческого CD3γ. В одном варианте осуществления эндогенный локус нечеловеческого CD3 генетически модифицирован таким образом, что не экспрессирует функциональный(-ые) внеклеточный(-ые) домен(-ы) соответствующего(-их) нечеловеческого(-их) белка(-ов). В одном варианте осуществления эндогенный локус нечеловеческого CD3 дополнительно кодирует трансмембранный и цитоплазматический домены соответствующего(-их) эндогенного(-ых) белка(-ов) CD3 не относящегося к человеку животного, причем животное экспрессирует химерный белок CD3 на поверхности своих Т-клеток, содержащий внеклеточный домен человеческого белка CD3 и трансмембранный и цитоплазматический домены эндогенного белка CD3 не относящегося к человеку животного. В одном варианте осуществления нуклеотидная(-ые) последовательность(-и), кодирующая(-ие) внеклеточный домен человеческого CD3 у не относящегося к человеку животного, функционально связана с нуклеотидной(-ыми) последовательностью(-ями), кодирующей(-ими) трансмембранный и цитоплазматический домены соответствующего(-их) эндогенного(-ых) белка(-ов) CD3 не относящегося к человеку животного. В конкретном варианте осуществления не относящееся к человеку животное содержит (а) в эндогенном локусе CD3ε нуклеотидную последовательность, кодирующую внеклеточный домен человеческого CD3ε, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей трансмембранный и цитоплазматический домены эндогенного CD3ε не относящегося к человеку животного, (b) в эндогенном локусе CD3δ нуклеотидную последовательность, кодирующую внеклеточный домен человеческого CD3δ, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей трансмембранный и цитоплазматический домены эндогенного CD3δ не относящегося к человеку животного, и (с) в эндогенном локусе CD3γ нуклеотидную последовательность, кодирующую внеклеточный домен человеческого CD3γ, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей трансмембранный и цитоплазматический домены эндогенного CD3γ не относящегося к человеку животного, причем не относящееся к человеку животное экспрессирует на поверхности своих Т-клеток химерные белки CD3ε, CD3δ и CD3γ. В некоторых вариантах осуществления внеклеточный домен человеческого белка CD3 у не относящегося к человеку животного содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 и SEQ ID NO: 35. В некоторых вариантах осуществления животное содержит внеклеточные домены человеческих белков CD3, которые содержат последовательности SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 и SEQ ID NO: 35.

В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированное не относящееся к человеку животное, описанное в настоящем документе, содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую внеклеточный домен человеческого белка CD3, функционально связанный с промотором CD3. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления не относящееся к человеку животное, описанное в настоящем документе, содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую внеклеточный домен человеческого CD3ε, функционально связанный с промотором CD3, внеклеточный домен человеческого CD3δ, функционально связанный с промотором CD3, и внеклеточный домен человеческого CD3γ, функционально связанный с промотором CD3. В одном варианте осуществления промотор CD3 представляет собой промотор CD3 не относящегося к человеку животного. В одном варианте осуществления промотор CD3 представляет собой промотор человеческого CD3. В одном варианте осуществления промотор CD3 представляет собой эндогенный нечеловеческий промотор CD3.

В конкретном варианте осуществления предложенное не относящееся к человеку животное представляет собой млекопитающее. В одном варианте осуществления не относящееся к человеку животное представляет собой грызуна. В одном варианте осуществления животное представляет собой крысу или мышь. В одном варианте осуществления животное представляет собой мышь. Таким образом, в одном варианте осуществления настоящего изобретения предложена генетически модифицированная мышь, которая содержит (а) в эндогенном локусе мышиного CD3ε нуклеотидную последовательность, кодирующую внеклеточный домен человеческого CD3ε, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей трансмембранный и цитоплазматический домены эндогенного мышиного CD3ε, (b) в эндогенном локусе мышиного CD3δ нуклеотидную последовательность, кодирующую внеклеточный домен человеческого CD3δ, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей трансмембранный и цитоплазматический домены эндогенного мышиного CD3δ, и (с) в эндогенном локусе мышиного CD3γ нуклеотидную последовательность, кодирующую внеклеточный домен человеческого CD3γ, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей трансмембранный и цитоплазматический домены эндогенного мышиного CD3γ, и при этом мышь экспрессирует на поверхности своих Т-клеток гуманизированные белки CD3ε, CD3δ и CD3γ. В одном варианте осуществления аминокислотная последовательность гуманизированного белка CD3ε у указанной мыши представлена в SEQ ID NO: 24, аминокислотная последовательность гуманизированного белка CD3δ представлена в SEQ ID NO: 25, а аминокислотная последовательность гуманизированного белка CD3γ представлена в SEQ ID NO: 26. В одном варианте осуществления генетически модифицированная мышь, предложенная в настоящем документе, содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую внеклеточный домен человеческого CD3, функционально связанный с промотором мышиного CD3. В одном варианте осуществления промотор представляет собой эндогенный промотор мышиного CD3. В другом варианте осуществления генетически модифицированная мышь, предложенная в настоящем документе, содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую внеклеточный домен человеческого CD3, функционально связанный с промотором человеческого CD3. В одном варианте осуществления мышь, описанная в настоящем документе, демонстрирует схожее соотношение клеток CD4+/CD8+ в тимусе по сравнению с мышью, не содержащей генетических модификаций, позволяющих экспрессировать гуманизированные белки CD3. В одном варианте осуществления соотношение клеток CD4+/CD8+ в тимусе у мыши находится в пределах 30%, в пределах 25%, в пределах 20%, в пределах 15%, в пределах 12%, в пределах 10%, в пределах 5% или в пределах 2% от соотношения клеток CD4+/CD8+ у мыши, не содержащей генетических модификаций, позволяющих экспрессировать гуманизированные белки CD3. В одном варианте осуществления мышь демонстрирует схожее процентное содержание Т- и В-клеток в селезенке, лимфатических узлах и периферической крови по сравнению с мышью, не содержащей генетических модификаций, позволяющих экспрессировать гуманизированные белки CD3. В одном варианте осуществления мышь демонстрирует схожие количества циркулирующих лейкоцитов, лимфоцитов, моноцитов, нейтрофилов, эозинофилов и базофилов по сравнению с мышью, не содержащей генетических модификаций, позволяющих экспрессировать гуманизированные белки CD3.

Таким образом, в одном аспекте настоящего изобретения предложена генетически модифицированная мышь, содержащая в эндогенном локусе мышиного CD3 нуклеотидную последовательность, кодирующую внеклеточный домен человеческого белка CD3, причем человеческий белок CD3 выбран из группы, состоящей из CD3ε, CD3δ, CD3γ, CD3ζ, и их комбинации. В одном варианте осуществления мышь содержит внеклеточные домены человеческого CD3ε, CD3δ и CD3γ. В одном варианте осуществления мыши внеклеточный домен человеческого CD3ε представлен в SEQ ID NO: 33, внеклеточный домен человеческого CD3δ представлен в SEQ ID NO: 34, а внеклеточный домен человеческого CD3γ представлен в SEQ ID NO: 35. В одном варианте осуществления мышь экспрессирует гуманизированный CD3ε, гуманизированный CD3δ и гуманизированный CD3γ. В одном варианте осуществления мыши гуманизированный CD3ε представлен в SEQ ID NO: 24, гуманизированный CD3δ представлен в SEQ ID NO: 25, а гуманизированный CD3γ представлен в SEQ ID NO: 26. В одном варианте осуществления мышь дополнительно содержит трансмембранный и цитоплазматический домены мышиного CD3ε, CD3δ и CD3γ. В одном варианте осуществления мышь дополнительно содержит эндогенные трансмембранный и цитоплазматический домены мышиного CD3ε, CD3δ и CD3γ.

В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ получения генетически модифицированного не относящегося к человеку животного, экспрессирующего гуманизированный белок CD3, включающий введение в геном клетки не относящегося к человеку животного нуклеотидной последовательности, кодирующей внеклеточный домен человеческого белка CD3, причем человеческий белок CD3 выбран из группы, состоящей из CD3ε, CD3δ, CD3γ, CD3ζ и их комбинации; и воспроизведение из клетки генетически модифицированного не относящегося к человеку животного. В одном варианте осуществления способа животное не содержит функциональный(-ые) внеклеточный(-ые) домен(-ы) соответствующего(-их) нечеловеческого(-их) белка(-ов). В одном варианте осуществления способа животное содержит в эндогенном локусе CD3 нуклеотидную последовательность, кодирующую внеклеточный домен человеческого CD3ε, внеклеточный домен человеческого CD3δ и внеклеточный домен человеческого CD3γ. В одном варианте осуществления способа внеклеточный домен человеческого CD3ε представлен в SEQ ID NO: 33, внеклеточный домен человеческого CD3δ представлен в SEQ ID NO: 34, а внеклеточный домен человеческого CD3γ представлен в SEQ ID NO: 35. В одном варианте осуществления способа животное не содержит функциональный(-ые) внеклеточный(-ые) домен(-ы) соответствующего(-их) нечеловеческого(-их) белка(-ов). В одном конкретном варианте осуществления способ включает замещение в эндогенном локусе CD3 внеклеточного домена нечеловеческого(-их) белка(-ов) CD3 соответствующим внеклеточным доменом человеческого(-их) белка(-ов) CD3. В одном варианте осуществления способа животное дополнительно содержит нуклеотидную(-ые) последовательность(-и), кодирующую(-ие) трансмембранный и цитоплазматический домены соответствующего(-их) эндогенного(-ых) белка(-ов) CD3 не относящегося к человеку животного. В одном варианте осуществления способа не относящееся к человеку животное представляет собой мышь, а замещение выполняется в эндогенном локусе мышиного CD3. В одном варианте осуществления способа, в котором животное представляет собой мышь, мышь экспрессирует гуманизированный белок CD3, выбранный из группы, состоящей из гуманизированного CD3ε, представленного в SEQ ID NO: 24, гуманизированного CD3δ, представленного в SEQ ID NO: 25, гуманизированного CD3γ, представленного в SEQ ID NO: 26, и их комбинации. В одном варианте осуществления способа замещение выполняют в одной ЭС-клетке и эту одну ЭС-клетку вводят в мышиный эмбрион для получения мыши.

В еще одном аспекте настоящего изобретения предложена модель на не относящемся к человеку животном, например мышиная модель, для исследования биспецифического антигенсвязывающего белка на основе CD3, который способен связываться как с CD3, так и с интересующим антигеном, причем мышиная модель включает мышь с генетическими модификациями, позволяющими кодировать внеклеточный домен человеческого белка CD3, при этом человеческий белок CD3 представляет собой CD3ε, CD3δ, CD3γ, CD3ζ, или любую их комбинацию (например, два или более белка CD3) и содержит клетку, экспрессирующую или содержащую немышиный интересующий антиген. Не относящееся к человеку животное в модели может представлять собой любое из не относящихся к человеку животных, описанных выше или где-либо в другом месте настоящего документа. В одном варианте осуществления мышиной модели нуклеотидная(-ые) последовательность(-и) гуманизированного(-ых) белка(-ов) CD3 расположена(-ы) в эндогенном локусе CD3. В одном варианте осуществления мышиной модели в указанную мышь был введен антигенсвязывающий белок. В одном варианте осуществления мышиной модели мышь экспрессирует внеклеточные домены человеческого CD3ε, CD3δ и CD3γ. В одном варианте осуществления мышиной модели мышь дополнительно экспрессирует трансмембранный и цитоплазматический домены мышиного CD3ε, CD3δ и CD3γ.

В одном варианте осуществления мышиной модели мышь содержит ксенотрансплантат опухоли, экспрессирующей интересующий антиген. В одном варианте осуществления мышиной модели клетка, экспрессирующая или содержащая интересующий антиген, представляет собой опухолевую клетку. В одном варианте осуществления мышиной модели выбранный биспецифический антигенсвязывающий белок связывается как с гуманизированным белком CD3, так и с интересующим антигеном. В одном варианте осуществления мышиной модели интересующий антиген представляет собой человеческий антиген. В одном варианте осуществления мышиной модели антигенсвязывающий белок способен связываться с обезьяньим белком CD3. В одном варианте осуществления мышиной модели интересующий антиген представляет собой связанный с опухолью антиген. В таком варианте осуществления связанный с опухолью антиген может быть выбран из группы, состоящей из ALK, белков BAGE, BIRC5 (сурвивина), BIRC7, СА9, CALR, CCR5, CD19, CD20 (MS4A1), CD22, CD27, CD30, CD33, CD38, CD40, CD44, CD52, CD56, CD79, CDK4, СЕАСАМ3, СЕАСАМ5, CLEC12A, EGFR, EGFR варианта III, ERBB2 (HER2), ERBB3, ERBB4, ЕРСАМ, ЕРНА2, ЕРНА3, FCRL5, FLT3, FOLR1, белков GAGE, GD2, GD3, GPNMB, GM3, GPR112, IL3RA, KIT, KRAS, LGR5, полученного из EBV LMP2, L1CAM, белков MAGE, MLANA, MSLN, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5, MUC16, MUM1, ANKRD30A, NY-ESO1 (CTAG1B), ОХ40, PAP, РАХ3, РАХ5, PLAC1, PRLR, PMEL, PRAME, PSMA (FOLH1), белков RAGE, RET, RGS5, ROR1, SART1, SART3, SLAMF7, SLC39A6 (LIV1), STEAP1, STEAP2, TERT, TMPRSS2, Tn-антигена, TNFRSF17, TYR, UPK3A, VTCN1, WT1.

В другом варианте осуществления интересующий антиген представляет собой антиген, связанный с инфекционным заболеванием. В таком варианте осуществления мышь может быть инфицирована возбудителем инфекции. В одном таком варианте осуществления антиген, связанный с инфекционным заболеванием, может представлять собой вирусный антиген, который выбирают из группы, состоящей из антигена ВИЧ, гепатита А, гепатита В, гепатита С, вируса герпеса (например, HSV-1, HSV-2, CMV, HAV-6, VZV, вируса Эпштейна - Барр), аденовируса, вируса гриппа, флавивируса, эховируса, риновируса, вируса Коксаки, коронавируса, респираторно-синцитиального вируса, вируса эпидемического паротита, ротавируса, вируса кори, вируса краснухи, парвовируса, вируса коровьей оспы, Т-лимфотропного вируса человека (HTLV), вируса денге, папилломавируса, вируса контагиозного моллюска, полиовируса, вируса бешенства, вируса Джона Каннингема, вируса Эбола и вируса арбовирусного энцефалита. В другом таком варианте осуществления антиген, связанный с инфекционным заболеванием, может представлять собой бактериальный антиген, который выбирают из группы, состоящей из бактериального антигена хламидии, риккетсии, микобактерии, стафилококка, стрептококка, пневмококка, менингококка, гонококка, клебсиеллы, протея, серрации, псевдомонады, легионеллы, возбудителя дифтерии, сальмонеллы, бациллы, возбудителя холеры, столбняка, ботулизма, сибирской язвы, чумы, лептоспироза и болезни Лайма.

В одном варианте осуществления предложенной мышиной модели антигенсвязывающий белок на основе CD3 представляет собой антитело. В одном варианте осуществления антигенсвязывающий белок на основе CD3 представляет собой человеческий или гуманизированный антигенсвязывающий белок. Такая мышиная модель позволяет выполнять исследования эффективности и/или токсичности антигенсвязывающего белка на мыши.

Также в настоящем изобретении предложен способ отбора потенциального лекарственного средства, которое оказывает целевое воздействие на интересующий антиген, включающий (а) введение интересующего антигена в генетически модифицированную мышь, содержащую эндогенный локус нечеловеческого CD3 с генетическими модификациями, позволяющими кодировать внеклеточный домен человеческого белка CD3, причем человеческий CD3 представляет собой CD3ε, CD3δ, CD3γ, CD3ζ, или любую их комбинацию, как определено выше или в любом другом месте настоящего документа, (b) контактирование мыши с интересующим потенциальным лекарственным средством, которое воздействует на человеческий CD3 и интересующий антиген, и (с) определение, является ли потенциальное лекарственное средство эффективным в предотвращении появления, уменьшении количества или уничтожении клеток, характеризующихся наличием или экспрессией интересующего антигена. В одном варианте осуществления способа генетически модифицированная мышь содержит в эндогенном локусе мышиного CD3 нуклеотидную последовательность, кодирующую внеклеточный домен человеческого CD3ε, внеклеточный домен человеческого CD3δ и внеклеточный домен человеческого CD3γ. В одном варианте осуществления способа мышь не содержит функциональный внеклеточный домен соответствующего(-их) мышиного(-ых) белка(-ов). В одном варианте осуществления способа мышь содержит нуклеотидную(-ые) последовательность(-и), кодирующую(-ие) трансмембранный и цитоплазматический домены соответствующего(-их) эндогенного(-ых) мышиного(-ых) белка(-ов) CD3. В одном варианте осуществления способа нуклеотидная(-ые) последовательность(-и), кодирующая(-ие) внеклеточный домен человеческого CD3, функционально связана с нуклеотидной(-ыми) последовательностью (-ями), кодирующей(-ими) трансмембранный и цитоплазматический домены соответствующего (-их) эндогенного(-ых) мышиного(-ых) белка(-ов) CD3. В одном варианте осуществления способа внеклеточный домен человеческого CD3ε представлен в SEQ ID NO: 33, внеклеточный домен человеческого CD3δ представлен в SEQ ID NO: 34, а внеклеточный домен человеческого CD3γ представлен в SEQ ID NO: 35. Таким образом, в одном конкретном варианте осуществления способа мышь экспрессирует гуманизированный белок CD3ε, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 24, гуманизированный белок CD3δ, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 25, и гуманизированный белок CD3γ, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 26.

В конкретном варианте осуществления способа отбора потенциальных лекарственных средств, описанных в настоящем документе, этап введения интересующего антигена в мышь, описанную в настоящем документе, включает экспрессирование у мыши интересующего антигена. В одном варианте осуществления этап экспрессирования у мыши интересующего антигена включает генетическую модификацию мыши таким образом, чтобы она экспрессировала интересующий антиген. В одном варианте осуществления этап введения интересующего антигена включает инфицирование мыши интересующим антигеном. В одном варианте осуществления способа этап введения включает введение указанной мыши клетки, экспрессирующей интересующий антиген. В различных вариантах осуществления способа клетка может представлять собой опухолевую клетку, бактериальную клетку или клетку, инфицированную вирусом. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления способа мышь инфицирована вирусной или бактериальной инфекцией. Таким образом, интересующий антиген может представлять собой антиген, связанный с инфекционным заболеванием. В одном варианте осуществления интересующий антиген представляет собой вирусный антиген, который выбирают из группы, состоящей из антигена ВИЧ, гепатита А, гепатита В, гепатита С, вируса герпеса (например, HSV-1, HSV-2, CMV, HAV-6, VZV, вируса Эпштейна - Барр), аденовируса, вируса гриппа, флавивируса, эховируса, риновируса, вируса Коксаки, коронавируса, респираторно-синцитиального вируса, вируса эпидемического паротита, ротавируса, вируса кори, вируса краснухи, парвовируса, вируса коровьей оспы, HTLV, вируса денге, папилломавируса, вируса контагиозного моллюска, полиовируса, вируса бешенства, вируса Джона Каннингема, вируса Эбола и вируса арбовирусного энцефалита. В другом варианте осуществления интересующий антиген представляет собой антиген, связанный с инфекционным заболеванием, который представляет собой бактериальный антиген, выбранный из группы, состоящей из хламидии, риккетсии, микобактерии, стафилококка, стрептококка, пневмококка, менингококка, гонококка, клебсиеллы, протея, серрации, псевдомонады, легионеллы, возбудителя дифтерии, сальмонеллы, бациллы, возбудителя холеры, столбняка, ботулизма, сибирской язвы, чумы, лептоспироза и болезни Лайма.

В другом варианте осуществления способа отбора потенциальных лекарственных средств интересующий антиген представляет собой связанный с опухолью антиген. В одном варианте осуществления способа связанный с опухолью антиген выбран из группы, состоящей из ALK, белков BAGE, BIRC5 (сурвивина), BIRC7, СА9, CALR, CCR5, CD19, CD20 (MS4A1), CD22, CD27, CD30, CD33, CD38, CD40, CD44, CD52, CD56, CD79, CDK4, СЕАСАМ3, СЕАСАМ5, CLEC12A, EGFR, EGFR варианта III, ERBB2 (HER2), ERBB3, ERBB4, ЕРСАМ, EPHA2, ЕРНА3, FCRL5, FLT3, FOLR1, белков GAGE, GD2, GD3, GPNMB, GM3, GPR112, IL3RA, KIТ, KRAS, LGR5, полученного из EBV LMP2, L1CAM, белков MAGE, MLANA, MSLN, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5, MUC16, MUM1, ANKRD30A, NY-ESO1 (CTAG1B), ОХ40, PAP, РАХ3, РАХ5, PLAC1, PRLR, PMEL, PRAME, PSMA (FOLH1), белков RAGE, RET, RGS5, ROR1, SART1, SART3, SLAMF7, SLC39A6 (LIV1), STEAP1, STEAP2, TERT, TMPRSS2, Tn-антигена, TNFRSF17, TYR, UPK3A, VTCN1, WT1.

В некоторых вариантах осуществления способа отбора потенциальных лекарственных средств мышь представляет собой иммунокомпетентную мышь. В некоторых вариантах осуществления способа, описанного в настоящем документе, интересующий антиген представляет собой человеческий интересующий антиген.

В некоторых вариантах осуществления способа потенциальное лекарственное средство представляет собой антитело. В некоторых вариантах осуществления потенциальное лекарственное средство представляет собой антигенсвязывающий белок. В некоторых вариантах осуществления потенциальное лекарственное средство представляет собой биспецифическое антитело или биспецифический антигенсвязывающий белок. В некоторых вариантах осуществления биспецифический антигенсвязывающий белок способен связываться как с человеческим белком CD3, так и с интересующим антигеном. В одном варианте осуществления потенциальное лекарственное средство способно распознавать обезьяний белок CD3.

В некоторых вариантах осуществления способа отбора потенциальных лекарственных средств потенциальное лекарственное средство способно уменьшать, прекращать или предотвращать рост опухоли по сравнению с агентом, который не оказывает целевого воздействия на интересующий антиген. В некоторых вариантах осуществления такого способа этап определения эффективности потенциального лекарственного средства в предотвращении появления, уменьшении числа или уничтожении клеток, характеризующихся наличием или экспрессией интересующего антигена, включает анализ объема опухоли или анализ киллинга опухолевых клеток, опосредованного Т-клетками.

В других вариантах осуществления потенциальное лекарственное средство способно ослаблять, уничтожать или предотвращать бактериальную или вирусную инфекцию по сравнению с агентом, который не оказывает целевого воздействия на интересующий антиген. В некоторых таких вариантах осуществления этап определения эффективности потенциального лекарственного средства в предотвращении появления, уменьшении числа или уничтожении клеток, характеризующихся наличием или экспрессией интересующего антигена, включает измерение вирусных или бактериальных титров.

В дополнительных других вариантах осуществления настоящего изобретения предложена модель на не относящемся к человеку животном, например мышиная модель, для исследования безопасности, эффективности и фармакокинетики комбинации лекарственных терапевтических средств, включающей лекарственное средство, например антигенсвязывающий белок, который связывается с человеческой молекулой CD3. Такие комбинации терапевтических средств предназначены для целевого воздействия на специфические опухоли, инфекции или другие заболевания, описанные в настоящем документе, течение которых может быть улучшено в результате рекрутинга и/или активации Т-клеток.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ

На ФИГ. 1 изображена структура Т-клеточного рецепторного комплекса. Комплекс содержит две субъединицы CD3ε, одну субъединицу CD3δ, одну субъединицу CD3γ и две субъединицы CD3ζ, объединенные в комплекс с гетеродимером TCRαβ на поверхности Т-клетки. Звездочки указывают на положения мотивов ITAM.

На ФИГ. 2А и В представлено схематическое изображение (без соблюдения масштаба) гуманизированного большого нацеливающего вектора CD3γδε. На ФИГ. 2А изображен большой нацеливающий вектор до делеции кассеты селекции (Neo) с указанием положений нокина человеческих последовательностей CD3E, CD3D и CD3G. Буквы А, В, С, D, Е, F и G указывают на положение областей соединения нуклеотидных последовательностей, представленных в таблице 1. На ФИГ. 2В изображен большой нацеливающий вектор после делеции кассеты селекции (Neo); так же, как на ФИГ. 2А, указаны положения человеческих CD3E, CD3D и CD3G. Буквы А-В, С, D, Е, F и G представляют положения областей соединения нуклеотидных последовательностей, представленных в таблицах 1 и 3.

На ФИГ. 3 изображены аминокислотные последовательности гуманизированных белков CD3 у гуманизированных по CD3γδε мышей. Подчеркнуты последовательности белка CD3 человеческого происхождения.

На ФИГ. 4 изображены участки выравнивания мышиных и человеческих последовательностей CD3e, CD3d и CD3g. 5'- и 3'-концы человеческих последовательностей, которые были введены в мышиные локусы CD3, отмечены знаками * и ** соответственно.

На ФИГ. 5А в верхнем ряду представлен график цитометрического анализа посредством сортировки клеток с активацией флуоресценции (FACS), демонстрирующий нормальное распределение тимоцитов CD4+ и CD8+ у мышей дикого типа (WT), гетерозиготных гуманизированных по CD3γδε (НЕТ) или гомозиготных гуманизированных по CD3γδε(HO) мышей. На Фиг. 5В в верхнем ряду представлены данные, отражающие проценты, а также количества В- и Т-клеток в периферической крови указанных животных. На Фиг. 5В в нижнем ряду представлены данные, отражающие проценты Т- и В-клеток в селезенке указанных животных. На ФИГ. 5С представлена поликлональность репертуара Vβ в Т-клетках CD4+ и CD8+, полученных из селезенок гуманизированных по CD3γδε мышей.

На ФИГ. 6А-В представлены титры вируса лимфатического хориоменингита (LCMV) в селезенках либо контрольных животных дикого типа, либо гуманизированных по CD3γδε мышей у мышей, инфицированных клоном 13 LCMV (ФИГ. 6А) или клоном 13 LCMV после предварительного инфицирования клоном Армстронга LCMV (ФИГ. 6В).

На ФИГ. 7 представлены данные анализа FACS спленоцитов мышей дикого типа (WT), гетерозиготных гуманизированных по CD3γδε (hCD3γδε Het) или гомозиготных гуманизированных по CD3γδε (hCD3γδεHo) мышей, сортированные с использованием двух антител к CD3 человека, которые также перекрестно реагируют с обезьяньим CD3 (ah/mfCD3-2 и ah/mfCD3-1), двух антител к CD3 человека, которые представляют собой антитела, специфичные к человеческому CD3 (ahCD3-1 и ahCD3-2), контрольных антител к CD3 мыши (amCD3-2C11), несвязанных контрольных человеческих IgG (контрольные hIgG) и только вторичных контрольных антител (только 2). Значения средней интенсивности флуоресценции (СИФ) приведены в таблицах под каждым графиком.

На ФИГ. 8 показан ответ на антитела к CD3 у гуманизированных по CD3γδε мышей. На ФИГ. 8А показано временное снижение числа Т- и В-клеток в крови мышей, которым вводили антитела к CD3; снижение числа Т-клеток в 1-й день для каждого указанного антитела (левая фигура) или снижение числа Т- и В-клеток и восстановление в течение 14 дней для каждого исследованного антитела (средняя и правая фигуры). На ФИГ. 8В показано увеличение концентрации цитокинов (ИФН-γ, KС, ФНО-α, ИЛ-6 и ИЛ-10), высвобожденных через 2 часа после введения указанных антител.

На ФИГ. 9 показана пролиферация спленоцитов (измеренная в виде кратности активации только по отношению к клеткам) при введении увеличивающихся количеств указанных антител мышам дикого типа (WT) и гуманизированным по CD3γδε гомозиготным (hCD3γδε Но) мышам.

На ФИГ. 10 представлена таблица, обобщающая различные свойства модели на гуманизированной по CD3 мыши.

На ФИГ. 11А показано влияние антитела к CD3 (Ab-1; биспецифическое антитело, распознающее CD3 и CD20 и протестированное в двух различных концентрациях) на объем опухолей В16F10.9/CD20 в случае начала лечения одновременно с имплантацией опухоли (профилактическая модель). На ФИГ. 11В показано влияние антитела к CD3 (Ab-1; биспецифическое антитело, распознающее CD3 и CD20 и протестированное в двух различных концентрациях) на объем уже развившихся опухолей B16F10.9/CD20 (терапевтическая модель).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Определения

В настоящем изобретении предложены генетически модифицированные не относящиеся к человеку животные, например грызуны, например мыши или крысы, которые экспрессируют гуманизированные белки CD3, например гуманизированные белки CD3ε, CD3δ, CD3γ и/или CD3ζ. Настоящее изобретение также относится к генетически модифицированным не относящимся к человеку животным, которые содержат в своем геноме, например в зародышевой линии, генетически модифицированные локусы CD3, кодирующие гуманизированные белки CD3, например химерные человеческие/мышиные белки CD3. Также предложены эмбрионы, клетки и ткани, содержащие все вышеуказанное, способы получения всего вышеуказанного, а также способы применения всего вышеуказанного. При отсутствии иных указаний все термины и фразы, используемые в настоящем документе, включают значения, которые эти термины и фразы имеют в данной области, кроме случаев, когда иное значение четко указано или очевидно из контекста, в котором используется термин или фраза.

Термин «CD3» в контексте настоящего документа означает антиген, который экспрессирован на Т-клетках в виде части мультимолекулярного комплекса Т-клеточного рецептора (TCR); причем мультимолекулярный комплекс TCR, образованный из ассоциации гомодимеров и/или гетеродимеров, содержит одну или более из следующих цепей рецепторов: CD3-эпсилон (ε), СЭ3-дельта (δ), CD3-дзета (ζ) и CD3-гамма (γ) (см. ФИГ. 1). Последовательности и учетные номера в GenBank человеческих и мышиных CD3-дельта, CD3-дзета и СD3-гамма представлены в таблице 4 ниже. В настоящей заявке ε, или эпсилон, может также обозначаться буквой Е, δ, или дельта, может также обозначаться буквой D, ζ, или дзета, может также обозначаться буквой Z, а γ, или гамма, может также обозначаться буквой G.

В контексте настоящего документа термин «антитело, которое связывается с CD3», или «антитело к CD3», обозначает антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически распознают одну субъединицу CD3 (например, эпсилон, дельта, гамма или дзета), а также антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически распознают димерный комплекс двух субъединиц CD3 (например, димеры CD3 гамма/эпсилон, дельта/эпсилон и дзета/дзета). Антитела и антигенсвязывающие фрагменты настоящего изобретения могут связываться с растворимым CD3 и/или клеточной поверхностью, экспрессирующей CD3. Растворимый CD3 включает природные белки CD3, а также варианты рекомбинантного белка CD3, такие, например, как мономерные и димерные конструкции CD3, в которых отсутствует трансмембранный домен или которые другим способом отсоединены от клеточной мембраны.

Термин «консервативный», используемый для описания консервативной аминокислотной замены, включает замену аминокислотного остатка другим аминокислотным остатком, имеющим R-группу боковой цепи со схожими химическими свойствами (например, зарядом или гидрофобностью). Консервативные аминокислотные замены могут быть выполнены посредством модификации нуклеотидной последовательности, направленной на изменение нуклеотидов, которые будут кодировать консервативную замену. В большинстве случаев консервативная аминокислотная замена по существу не изменит функциональные свойства интересующего белка, например способность белков CD3 играть роль в сборке Т-клеточного рецептора и Т-клеточной сигнализации. Примеры групп аминокислот, имеющих боковые цепи с аналогичными химическими свойствами, включают алифатические боковые цепи, такие как глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин; алифатические гидроксильные боковые цепи, такие как серии и треонин; амидосодержащие боковые цепи, такие как аспарагин и глутамин; ароматические боковые цепи, такие как фенилаланин, тирозин и триптофан; основные боковые цепи, такие как лизин, аргинин и гистидин; кислые боковые цепи, такие как аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота; и серосодержащие боковые цепи, такие как цистеин и метионин. Группы консервативной аминокислотной замены включают, например, валин/лейцин/изолейцин, фенилаланин/тирозин, лизин/аргинин, аланин/валин, глутамат/аспартат и аспарагин/глутамин. В некоторых вариантах осуществления консервативная аминокислотная замена может быть заменой любого нативного остатка в белке аланином, как, например, при аланин-сканирующем мутагенезе. В некоторых вариантах осуществления выполняется консервативная замена, которая имеет положительную величину в логарифмической матрице правдоподобия РАМ250, описанной в публикации Gonnet et al. ((1992) Exhaustive Matching of the Entire Protein Sequence Database, Science 256:1443-45), включенной в настоящий документ путем ссылки. В некоторых вариантах осуществления замена является умеренно консервативной и имеет неотрицательную величину в логарифмической матрице правдоподобия РАМ250.

Таким образом, изобретение охватывает генетически модифицированное не относящееся к человеку животное, например грызуна, например мышь или крысу, экспрессирующее гуманизированный(-ые) белок(-и) CD3, содержащий(-ие) консервативные аминокислотные замены в аминокислотной последовательности, описанной в настоящем документе.

Специалисту в данной области будет понятно, что в связи с вырождением генетического кода в дополнение к описанным в настоящем документе нуклеотидным остаткам, кодирующим гуманизированные белки CD3, полипептиды настоящего изобретения могут кодировать другие нуклеиновые кислоты. Таким образом, в дополнение к генетически модифицированному не относящемуся к человеку животному, которое содержит в геноме описанные в настоящем документе нуклеотидные последовательности, кодирующие гуманизированные белки CD3, также предложено не относящееся к человеку животное, которое в связи с вырождением генетического кода содержит в геноме нуклеотидные последовательности, которые отличаются от последовательностей, описанных в настоящем документе.

Термин «идентичность», используемый в отношении последовательностей, включает идентичность, определенную по нескольким различным алгоритмам, известным в данной области, которые можно использовать для измерения идентичности нуклеотидной и/или аминокислотной последовательности. В некоторых вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, идентичности определяются с помощью программы выравнивания ClustalW v. 1.83 (медленное выравнивание) со штрафом за открытие гэпа 10,0 и штрафом за продолжение гэпа 0,1 и с помощью матрицы правдоподобности Гоннета (MacVector™ 10.0.2, MacVector Inc., 2008). Длина последовательностей, сравненная по отношению к идентичности последовательностей, будет зависеть от конкретных последовательностей. В различных вариантах осуществления идентичность определяется посредством сравнения последовательности зрелого белка от N-конца к С-концу. В различных вариантах осуществления при сравнении гуманизированной последовательности с человеческой последовательностью человеческий участок гуманизированной последовательности (но не нечеловеческий участок) применяется для проведения сравнения с целью определения степени идентичности между человеческой последовательностью и гуманизированной последовательностью.

Термин «функционально связанный» включает смежное положение, в котором описанные компоненты находятся во взаимосвязи, позволяющей им функционировать надлежащим образом. Так, нуклеотидная последовательность, кодирующая белок, может быть функционально связана с регуляторными последовательностями (например, последовательностью промотора, энхансера, сайленсера и т.п), чтобы сохранить соответствующее регулирование транскрипции. Кроме того, различные участки гуманизированного белка по изобретению могут быть функционально связаны между собой для сохранения приемлемых фолдинга, процессинга, нацеливания, экспрессии и других функциональных свойств белка в клетке. Если не указано иное, различные домены гуманизированного белка по изобретению функционально связаны друг с другом. Функциональная связь человеческого внеклеточного домена белка CD3 с нечеловеческими трансмембранным и цитоплазматическим доменами может быть создана посредством экспрессии этих компонентов в виде непрерывного слитного белка из нуклеотидной кодирующей последовательности.

Термин «замещение» в отношении замещения гена включает размещение экзогенного генетического материала в эндогенном генетическом локусе, что приводит к замене всего или части эндогенного гена ортологичной или гомологичной нуклеотидной последовательностью. В одном случае эндогенный нечеловеческий ген или его фрагмент заменяется соответствующим человеческим геном или его фрагментом. Например, ДНК, кодирующая внеклеточный домен мышиного или другого нечеловеческого белка CD3, может быть замещена ДНК, кодирующей внеклеточный домен соответствующего человеческого белка. Соответствующий человеческий ген или его фрагмент представляет собой человеческий ген или его фрагмент, который представляет собой ортолог, гомолог или является по существу идентичным или аналогичным по структуре и/или функции замещаемому эндогенному нечеловеческому гену или его фрагменту. Как показано в примере ниже, нуклеотидные последовательности, кодирующие эндогенные нечеловеческие внеклеточные домены CD3, были замещены нуклеотидными последовательностями, соответствующими человеческим внеклеточным доменам CD3.

Термин «функциональный» в контексте настоящего документа, например по отношению к функциональному белку, означает белок, который сохраняет по меньшей мере один вид биологического действия, в норме присутствующий у нативного белка. Например, в некоторых вариантах осуществления изобретения замещение в эндогенном локусе (например, замещение в эндогенных нечеловеческих локусах CD3) приводит к потере локусом способности экспрессировать функциональный эндогенный белок.

Термин «локус», как, например, в случае локуса CD3, означает геномную ДНК, содержащую область, кодирующую CD3. Различные гены CD3 (CD3ε, CD3δ, CD3γ) располагаются на генетической карте рядом друг с другом на одной и той же хромосоме. Таким образом, в зависимости от контекста, упоминание эндогенного локуса CD3 может означать локус, включающий некоторые или все эти кодирующие области или отдельную кодирующую область. Например, при введении не относящемуся к человеку животному только одного из человеческих CD3, такого как CD3ε, нуклеиновая кислота, кодирующая этот CD3, предпочтительно модифицирует локус соответствующего нечеловеческого CD3. При введении не относящемуся к человеку животному нескольких CD3, таких как CD3ε, CD3δ, CD3γ, модифицированный эндогенный локус включает кодирующие области каждого из CD3ε, CD3δ и CD3γ. Локус CD3 может также обозначать локус CD3ζ, который находится в другой хромосоме по сравнению с локусами CD3ε, CD3δ и CD3γ. При введении человеческого CD3ζ вместе с любым из человеческого CD3ε, CD3δ или CD3γ могут быть изменены два или более локуса CD3 на различных хромосомах. В локус CD3, который был введен с целью генетической манипуляции, могут быть включены другие последовательности, например кассеты селекции, сайты рестрикции и т.п.

Термин «зародышевая линия» в отношении нуклеотидной последовательности иммуноглобулина включает нуклеотидную последовательность, которая может быть передана потомству.

Фраза «молекула иммуноглобулина» означает две тяжелые цепи иммуноглобулина и две легкие цепи иммуноглобулина. Тяжелые цепи могут быть идентичными или различными, и легкие цепи могут быть идентичными или различными.

Термин «антитело» в контексте настоящего документа означает молекулы иммуноглобулина, содержащие четыре полипептидные цепи (две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи), соединенные между собой дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь включает вариабельный домен тяжелой цепи и константную область тяжелой цепи (С_H). Константная область тяжелой цепи содержит три домена: С_H1, С_H2 и С_H3. Каждая легкая цепь включает вариабельный домен легкой цепи и константный участок легкой цепи (C_L). Вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи могут быть дополнительно подразделены на области гипервариабельности, которые называются «участками, определяющими комплементарность (CDR)» и чередуются с более стабильными участками, которые называются «каркасными участками (FR)». Каждый вариабельный домен тяжелой цепи и легкой цепи содержит три CDR и четыре FR, расположенные от аминоконца к карбоксиконцу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (участки CDR тяжелой цепи могут обозначаться как HCDR1, HCDR2 и HCDR3; участки CDR легкой цепи могут обозначаться как LCDR1, LCDR2 и LCDR3).

Термин «высокоаффинное» антитело обозначает антитело с K_D по отношению к целевому эпитопу около 10^-9 М или менее (например, около 1×10^-9 М, 1×10^-10 М, 1×10^-11 М или около 1×10^-12 М).

Фраза «биспецифическое антитело» означает антитело, способное селективно связываться с двумя эпитопами. Биспецифические антитела по существу содержат два плеча, каждое из которых связывается с различным эпитопом (например, две тяжелые цепи с различными специфичностями) - либо на двух различных молекулах (например, различные эпитопы на двух различных иммуногенах), либо на одной и той же молекуле (например, различные эпитопы на одном и том же иммуногене). Если биспецифическое антитело способно селективно связываться с двумя различными эпитопами (первым эпитопом и вторым эпитопом), аффинность первого плеча антитела к первому эпитопу будет по существу по меньшей мере на один-два, или три, или четыре, или более порядков величины меньше, чем аффинность первого плеча антитела ко второму эпитопу, и наоборот. Эпитопы, специфично связанные биспецифическим антителом, могут находиться на одной и той же или на различных мишенях (например, на одном и том же или на различных белках). Примеры биспецифических антител включают антитела, у которых первое плечо обладает специфичностью к опухолевому антигену, а второе плечо обладает специфичностью к цитотоксическому маркеру, например рецептору Fc (например, FcγRI, FcγRII, FcγRIII и т.п.) или Т-клеточному маркеру (например, CD3, CD28 и т.п.). В одном варианте осуществления настоящего изобретения одно плечо биспецифического антитела обладает специфичностью к CD3. Дополнительно биспецифическое антитело, первое плечо которого обладает специфичностью к опухолевому антигену, а второе плечо обладает специфичностью к токсину, может быть спаренным для того, чтобы доставлять токсин (например, сапорин, алкалоид барвинка и т.п.) к опухолевой клетке. Другие примеры биспецифических антител включают антитела, первое плечо которых обладает специфичностью к активирующему рецептору (например, В-клеточному рецептору, FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIIA, FcγRI, Т-клеточному рецептору и т.п.), а второе плечо обладает специфичностью к ингибирующему рецептору (например, FcγRIIB, CD5, CD22, CD72, CD300a и т.п.). Такие биспецифические антитела могут создаваться для лечения заболеваний, связанных с клеточной активацией (например, аллергии и бронхиальной астмы). Биспецифические антитела можно получать, например, посредством комбинирования тяжелых цепей, которые распознают различные эпитопы одного и того же иммуногена. Например, нуклеотидные последовательности, кодирующие вариабельные участки тяжелой цепи, которые распознают различные эпитопы одного и того же иммуногена, могут быть слиты с нуклеотидными последовательностями, кодирующими одни и те же или различные константные области тяжелой цепи, и такие последовательности могут быть экспрессированы в клетке, которая экспрессирует легкую цепь иммуноглобулина. Типичное биспецифическое антитело имеет две тяжелые цепи, каждая из которых имеет три CDR тяжелой цепи, за которыми (от N-конца к С-концу) расположены домен С_H1, домен С_H2 и домен С_H3, и легкую цепь иммуноглобулина, которая либо не обладает связывающей эпитоп специфичностью, но способна связываться с каждой тяжелой цепью, либо способна связываться с каждой тяжелой цепью и способна связываться одним или более из эпитопов, связанных связывающими эпитоп областями тяжелой цепи, либо способна связываться с каждой тяжелой цепью и позволяет связываться одной или более из тяжелых цепей с одним или более эпитопами. Аналогично, фраза «мультиспецифическое антитело» означает антитело, способное селективно связываться с множеством эпитопов (например, двумя, тремя, четырьмя эпитопами).

Фраза «участок, определяющий комплементарность» или термин «CDR» означает аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью генов иммуноглобулина организма, которая в норме (т.е. у животного дикого типа) находится между двумя каркасными участками в вариабельной области легкой или тяжелой цепи молекулы иммуноглобулина. CDR может кодироваться, например, последовательностью зародышевой линии или перестроенной или неперестроенной последовательностью и, например, интактной или зрелой В-клеткой. CDR может иметь соматическую мутацию (например, отличаться от последовательности, кодируемой в зародышевой линии животного), может быть гуманизированным и/или модифицированным аминокислотными заменами, добавлениями или делециями. В некоторых обстоятельствах (например, в случае CDR3) CDR могут кодироваться двумя или более последовательностями (например, последовательностями зародышевой линии), которые не являются смежными (например, в неперестроенной нуклеотидной последовательности), но являются смежными в В-клеточной нуклеотидной последовательности, например, в результате сплайсинга или соединения последовательностей (например, рекомбинация V-D-J с образованием CDR3 тяжелой цепи).

Фраза «функциональный фрагмент» включает фрагменты антигенсвязывающих белков, таких как антитела, которые могут экспрессироваться, секретироваться и специфично связываться с эпитопом с К_D в микромолярном, наномолярном или пикомолярном диапазоне. Специфичное распознавание означает, что константа K_D находится по меньшей мере в микромолярном диапазоне, наномолярном диапазоне или пикомолярном диапазоне.

Выражение «тяжелая цепь» или «тяжелая цепь иммуноглобулина» означает последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина, включая последовательность константной области тяжелой цепи иммуноглобулина, от любого организма. Вариабельные домены тяжелой цепи включают три CDR тяжелой цепи и четыре участка FR, если не указано иное. Фрагменты тяжелых цепей включают CDR, CDR и FR и их комбинации. Типичные тяжелые цепи после вариабельного домена содержат (от N-конца к С-концу) домен С_H1, петлю, домен С_H2 и домен С_H3. Функциональный фрагмент тяжелой цепи включает в себя фрагмент, который способен специфически распознавать эпитоп (например, распознавать эпитоп с K_D в микромолярном, наномолярном или пикомолярном диапазоне), который способен к экспрессии и секреции из клетки и который содержит по меньшей мере одну CDR. Вариабельный домен тяжелой цепи кодируется последовательностью вариабельного участка гена, который обычно содержит сегменты V_H, D_H и J_H, полученные из набора сегментов V_H, D_H и J_H, присутствующих в зародышевой линии. Информация о последовательностях, расположениях и системе обозначений сегментов V, D и J тяжелой цепи для различных организмов находится на веб-сайте Международной иммуногенетической информационной системы (база данных IMGT).

Выражение «легкая цепь» означает последовательность легкой цепи иммуноглобулина от любого организма и, если не указано иное, включает человеческие легкие цепи каппа и лямбда и VpreB, а также суррогатные легкие цепи. Вариабельные домены легкой цепи, как правило, включают три CDR легкой цепи и четыре каркасных участка (FR), если не указано иное. Как правило, полноразмерная легкая цепь включает в себя (от амино-конца до карбокси-конца) вариабельный домен, включающий FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, и константный участок легкой цепи. Вариабельный домен легкой цепи кодируется последовательностью вариабельного участка легкой цепи гена, которая обычно содержит сегменты V_L и J_L, полученные из набора сегментов V и J, присутствующих в зародышевой линии. Информация о последовательностях, расположениях и системе обозначений сегментов V и J легкой цепи для различных организмов находится на веб-сайте Международной иммуногенетической информационной системы (база данных IMGT). Легкие цепи, например, включают те, которые селективно не связываются с какими-либо эпитопами, распознанными антигенсвязывающим белком (например, антителом), в котором они находятся. Легкие цепи также включают те, которые связывают и распознают или помогают тяжелой цепи связывать и распознавать один или более эпитопов, селективно связанных антигенсвязывающим белком (например, антителом), в котором они находятся.

Термин «антигенсвязывающий белок» в контексте настоящего документа означает антитела и различные природные и сконструированные молекулы, которые способны связываться с интересующим антигеном. Такие белки включают, например, домен-специфические антитела, однодоменные антитела (например, полученные от верблюда и рыбы), антитела с удаленным доменом, химерные антитела, CDR-привитые антитела, диатела, триотела, тетратела, минитела, нанотела (например, одновалентные нанотела, двухвалентные нанотела и т.п.), иммунофармацевтические средства на основе модульного белка малого размера (SMIP), акульи вариабельные домены IgNAR и т.п. Антигенсвязывающий белок также может включать антигенсвязывающие фрагменты, такие как, например, (i) фрагменты Fab; (ii) фрагменты F(ab')₂; (iii) фрагменты Fd; (iv) фрагменты Fv; (v) одноцепочечные молекулы Fv (scFv); (vi) фрагменты dAb; и (vii) минимальные распознающие единицы, состоящие из аминокислотных остатков, которые имитируют гипервариабельную область антитела (например, выделенный участок, определяющий комплементарность (CDR), такой как пептид CDR3) и т.п.

Термин «клетка» означает любую клетку, которая пригодна для экспрессии рекомбинантной нуклеотидной последовательности. Клетки включают прокариоты и эукариоты (одноклеточные или многоклеточные), бактериальные клетки (например, штаммы Е. coli, Bacillus spp., Streptomyces spp.и т.д.), клетки микобактерий, клетки грибов, дрожжевые клетки (например, S. cerevisiae, S. pombe, P. pastoris, P. methanolica и т.д.), клетки растений, клетки насекомых (например, SF-9, SF-21, инфицированные бакуловирусом клетки насекомых, Trichoplusia ni и т.д.), клетки не относящихся к человеку животных, клетки человека или слияния клеток, такие как, например, гибридомы или квадромы. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой клетку человека, обезьяны, человекообразной обезьяны, хомяка, крысы или мыши. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой эукариотическую клетку, выбранную из следующих клеток: СНО (например, СНО K1, DXB-11 СНО, Veggie-CHO), COS (например, COS-7), клетка сетчатки, Vero, CV1, клетка почек (например, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, НВ 8065, HL-60, (например, BHK21), Jurkat, Daudi, А431 (эпидермальная), CV-1, U937, 3Т3, L-клетка, клетка С127, SP2/0, NS-0, ММТ 060562, клетка Сертоли, клетка BRL 3А, клетка НТ1080, миеломная клетка, опухолевая клетка и клеточная линия, полученная из вышеупомянутых клеток. В некоторых вариантах осуществления клетка содержит один или более вирусных генов, например, клетка сетчатки, которая экспрессирует вирусный ген (например, клетка PER.C6™). В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой ЭС-клетку.

Термин «гуманизированный белок CD3» означает белок CD3, внеклеточный домен которого в одном варианте осуществления представляет собой человеческую последовательность. Трансмембранный и цитоплазматический домены также могут быть человеческими, но предпочтительно представляют собой нечеловеческие эндогенные последовательности. Белок CD3, включающий последовательности от различных видов, в особенности человеческий внеклеточный домен и нечеловеческие трансмембранный и цитоплазматический домены, может также называться химерным белком CD3.

Генетически модифицированные гуманизированные по CD3 животные

В различных вариантах осуществления настоящего изобретения предложены генетически модифицированные не относящиеся к человеку животные (например, грызуны, например, мыши или крысы), которые содержат в своем геноме (например, в геноме зародышевой линии) нуклеотидную последовательность, кодирующую гуманизированный белок CD3 (например, гуманизированный CD3ε, CD3γ, CD3δ или их комбинацию). В одном варианте осуществления настоящего изобретения предложены генетически модифицированные не относящиеся к человеку животные (например, грызуны, например, мыши или крысы), которые содержат в своем геноме нуклеотидные последовательности, кодирующие следующие белки: гуманизированный CD3δ, гуманизированный CD3γ и гуманизированный CD3ε. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения мышь экспрессирует на поверхности своих Т-клеток комплекс гуманизированного CD3γδε так, что гуманизированный CD3γδε образует комплекс с Т-клеточным рецептором, экспрессированным на той же Т-клетке.

Молекула CD3, как правило, представляет собой мишень для агентов, которые предназначены для модуляции Т-клеточного иммунитета, и с этой целью было разработано несколько антител к CD3 (например, муромонаб-CD3 или ОКТ3). Антитела к CD3, такие как ОКТ3, применяются в качестве иммуносупрессорных агентов (например, при отторжении трансплантата), но также исследуется их терапевтический потенциал при аутоиммунных заболеваниях (например, болезни Крона, сахарном диабете I типа, язвенном колите и т.п.).

Кроме того, также проводятся исследования молекул CD3 в качестве мишеней для биспецифических агентов, например биспецифических антител, поскольку биспецифические антитела к CD3 обладают способностью к рекрутингу Т-клеток у клетки-мишени, например клетки, экспрессирующей конкретный интересующий антиген. Примеры биспецифических антител к CD3 описаны в публикации заявки на патент США №2014/0088295 и в публикации заявки на патент США №2015/0266966, которые включены в настоящий документ путем ссылки.

На этапе доклинической разработки лекарственного средства потенциальные агенты обычно исследуют на основании их эффективности, токсичности и других фармакокинетических и фармакодинамических свойств. Потенциальные агенты, такие как антитела, обычно воздействуют на человеческий антиген, так как конечной целью исследования является разработка терапевтического средства для человека. Проведено множество доклинических исследований на крупных животных, таких как приматы, поскольку их физиология и метаболизм лекарственных средств имеют наибольшую схожесть с человеческими. Известно, что некоторые разработанные антитела к CD3 (например, ОКТ3) перекрестно не реагируют с нечеловеческим CD3, в частности с CD3 примата. Для проведения эффективных доклинических исследований, касающихся эффективности, токсичности и других параметров потенциального лекарственного средства, в первую очередь потенциальное лекарственное средство должно быть способно распознавать молекулу CD3 примата.

Однако отдельным фактором, усложняющим разработку терапии антителами к CD3, является то, что крупные приматы, такие как шимпанзе, находятся под угрозой исчезновения и во многих странах исследования на шимпанзе запрещены; в то время как исследования на других приматах, например яванских макаках (Масаса fascicularis), могут быть связаны с проблемами в области этики. Например, по всем вышеуказанным причинам до настоящего времени отсутствует эффективная модель человеческих опухолей на приматах. Таким образом, предварительные данные о конкретном потенциальном терапевтическом средстве, которые могут быть получены в модели на животном меньшего размера, таком как грызун, например мышь, могут быть полезными для определения дальнейшего направления доклинических исследований на крупных приматах.

Доклинические исследования в моделях на мелких животных, таких как мыши, традиционно выполняются с использованием заменителей лекарственного средства. Например, при разработке потенциального лекарственного средства для клинического применения, нацеленного на специфический человеческий антиген, проводят некоторые доклинические исследования на мыши с использованием молекулы, например антигенсвязывающего белка или антитела, которая оказывает специфическое целевое воздействие на мышиный гомолог интересующего антигена. В ходе таких исследований с применением заменителя лекарственного средства собирают информацию об эффективности, различных схемах введения, токсичности и побочных эффектах, а также других аспектах введения лекарственного средства. Однако такие данные имеют ограниченное применение, поскольку используют не фактически разрабатываемое лекарственное средство или его исследуемую мишень у человека.

Таким образом, наиболее приемлемой моделью на мелком животном для проведения предварительных доклинических исследований является не относящееся к человеку животное, например грызун, которое экспрессирует человеческий или гуманизированный белок CD3 и позволяет изучать потенциальные лекарственные средства-антитела к CD3, которые также перекрестно реагируют с CD3 яванского макака, что позволяет в дальнейшем проводить доклинические исследования на приматах. В настоящем изобретении предложена такая сложная животная модель.

Таким образом, в настоящем документе предложено генетически модифицированное не относящееся к человеку животное, содержащее в геноме нуклеотидную(-ые) последовательность(-и), кодирующую(-ие) внеклеточный домен человеческого белка CD3. В некоторых вариантах осуществления изобретения белок CD3 выбран из группы, состоящей из белков CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ и их комбинации. В некоторых вариантах осуществления белок CD3 выбран из группы, состоящей из белков CD3γ, CD3δ, CD3ε и их комбинации. В некоторых вариантах осуществления белок CD3 содержит полипептидные цепи CD3γ, CD3δ и CD3ε. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления генетически модифицированное не относящееся к человеку животное содержит в геноме нуклеотидную(-ые) последовательность(-и), кодирующую(-ие) внеклеточный домен человеческого CD3γ, внеклеточный домен человеческого CD3δ и внеклеточный домен человеческого CD3ε. В некоторых вариантах осуществления внеклеточные домены человеческого CD3γ, CD3δ и CD3ε могут кодироваться одной нуклеиновой кислотой. В некоторых вариантах осуществления внеклеточные домены человеческого CD3γ, CD3δ и CD3ε кодируются отдельными нуклеиновыми кислотами.

В некоторых вариантах осуществления не относящееся к человеку животное, описанное в настоящем документе, включает эндогенный(-ые) нечеловеческий(-ие) промотор(-ы) и/или регуляторные элементы CD3 (например, эндогенные нечеловеческие промоторы и/или регуляторные элементы CD3γ, CD3δ и/или CD3ε). В других вариантах осуществления не относящееся к человеку животное содержит человеческий(-ие) промотор(-ы) и регуляторные элементы CD3.

Хотя утверждается, что большинство антител, разработанных против CD3, распознают эпитопы CD3ε (см. Tunnacliffe et al. (1989) International Immunology, 1(5):546-50), имеется ряд агентов, которые могут распознавать другие субъединицы CD3 (например, CD3γ или CD3δ) или которым для связывания требуется сборка комплекса CD3. Таким образом, генетически модифицированное не относящееся к человеку животное, которое содержит в геноме нуклеотидную(-ые) последовательность(-и), кодирующую(-ие) внеклеточный домен человеческого CD3γ, внеклеточный домен человеческого CD3δ и внеклеточный домен человеческого CD3ε, обеспечивает преимущество, поскольку может принимать агент, который будет связываться с любой из субъединиц CD3 или комплексом CD3.

Примеры белков CD3 представлены в выравнивании на ФИГ. 4. Последовательность мышиного белка CD3ε представлена в GenBank под учетным номером NP 031674 и в SEQ ID NO: 27, а последовательность человеческого белка CD3ε представлена в GenBank под учетным номером NP 000724 и в SEQ ID NO: 28. Последовательность мышиного белка CD3δ представлена в GenBank под учетным номером NP_038515 и в SEQ ID NO: 29, а последовательность человеческого белка CD8 представлена в GenBank под учетным номером NP_000723 и в SEQ ID NO: 30. Последовательность мышиного белка CD3γ представлена в GenBank под учетным номером NP_033980 и в SEQ ID NO: 31, а последовательность человеческого белка CD3γ представлена в GenBank под учетным номером NP_000064 и в SEQ ID NO: 32.

В некоторых вариантах осуществления изобретения нуклеотидная(-ые) последовательность(-и), кодирующая(-ие) внеклеточный домен человеческого CD3, например внеклеточный домен человеческого CD3γ, человеческого CD3δ и человеческого CD3ε, расположена (-ы) в эндогенном локусе нечеловеческого CD3. Другими словами, такая нуклеиновая кислота изменяет эндогенный локус CD3 таким образом, что он кодирует человеческий полипептид CD3. В некоторых вариантах осуществления изобретения не относящееся к человеку животное не содержит функциональный внеклеточный домен соответствующего нечеловеческого белка CD3 из-за генетической модификации эндогенного локуса, в результате которой функциональный внеклеточный домен не экспрессируется. В некоторых вариантах осуществления изобретения нуклеотидная(-ые) последовательность(-и), кодирующая(-ие) внеклеточный домен человеческого CD3, замещает (-ют) соответствующую(-ие) нуклеотидную(-ые) последовательность(-и), кодирующую(-ие) эндогенный нечеловеческий CD3. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая внеклеточный домен человеческого CD3γ, замещает нуклеотидную последовательность, кодирующую внеклеточный домен эндогенного нечеловеческого CD3γ, нуклеотидная последовательность, кодирующая внеклеточный домен человеческого CD3δ, замещает нуклеотидную последовательность, кодирующую внеклеточный домен эндогенного нечеловеческого CD3δ, а нуклеотидная последовательность, кодирующая внеклеточный домен человеческого CD3ε, замещает нуклеотидную последовательность, кодирующую внеклеточный домен эндогенного нечеловеческого CD3ε. В некоторых вариантах осуществления замещение не содержит замещения нуклеотидной последовательности, кодирующей эндогенную сигнальную последовательность. В другом варианте осуществления замещение содержит замещение нуклеотидной последовательности, кодирующей эндогенную сигнальную последовательность, нуклеотидной последовательностью, кодирующей человеческую сигнальную последовательность.

В некоторых аспектах изобретения внеклеточный домен содержит область белка(-ов), которая не является трансмембранным или цитоплазматическим доменом, например область белка, которая находится на поверхности клетки и частично после сборки в комплекс взаимодействует с внеклеточными доменами других компонентов сигнального комплекса TCR, например внеклеточными доменами TCR альфа и бета. В различных вариантах осуществления, описанных в настоящем документе, внеклеточный домен представляет собой домен белка, экспрессированного на клеточной поверхности и, если не указано иное, не включает в себя сигнальную последовательность, которая, как правило, протеолитически расщепляется перед экспрессией на клеточной поверхности. В некоторых вариантах осуществления изобретения внеклеточный домен CD3ε содержит аминокислоты 17-130 аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 24 (представлена отдельно в виде SEQ ID NO: 33). В некоторых таких вариантах осуществления животное содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую эндогенную сигнальную последовательность CD3ε, например сигнальную последовательность из аминокислот 1-16 SEQ ID NO: 24. В других вариантах осуществления изобретения животное содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую сигнальную последовательность человеческого CD3ε. В некоторых вариантах осуществления изобретения внеклеточный домен CD3δ содержит аминокислоты 19-105 аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 25 (представлена отдельно в виде SEQ ID NO: 34). В некоторых таких вариантах осуществления животное содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую эндогенную сигнальную последовательность CD3δ, например сигнальную последовательность из аминокислот 1-18 SEQ ID NO: 25. В других вариантах осуществления изобретения животное содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую сигнальную последовательность человеческого CD3δ. В некоторых вариантах осуществления внеклеточный домен CD3γ содержит аминокислоты 20-116 аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 26 (представлена отдельно в виде SEQ ID NO: 35). В некоторых таких вариантах осуществления животное содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую эндогенную сигнальную последовательность CD3γ, например сигнальную последовательность из аминокислот 1-19 SEQ ID NO: 26. В других вариантах осуществления изобретения животное содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую сигнальную последовательность человеческого CD3γ.

В некоторых аспектах изобретения не относящееся к человеку животное содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую трансмембранный и цитоплазматический домены эндогенного белка CD3, например соответствующего эндогенного белка CD3. Таким образом, в одном варианте осуществления не относящееся к человеку животное содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую внеклеточный домен человеческого белка CD3, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей трансмембранный и цитоплазматический домены соответствующего эндогенного нечеловеческого белка CD3, так, что экспрессируется химерный белок, содержащий внеклеточный домен человеческого белка CD3 и трансмембранный и цитоплазматический домены соответствующего эндогенного нечеловеческого белка CD3. Таким образом, в одном аспекте животное содержит в эндогенном локусе CD3 нуклеотидную(-ые) последовательность(-и), кодирующую(-ие) внеклеточный домен человеческого белка CD3, функционально связанную(-ые) с нуклеотидной(-ыми) последовательностью(-ями), кодирующей(-ими) трансмембранный и цитоплазматический домены эндогенного нечеловеческого CD3. В одном варианте осуществления животное содержит в эндогенном локусе CD3ε нуклеотидную последовательность, кодирующую внеклеточный домен человеческого CD3ε, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей трансмембранный и цитоплазматический домены эндогенного CD3ε не относящегося к человеку животного, в эндогенном локусе CD3δ нуклеотидную последовательность, кодирующую внеклеточный домен человеческого CD3δ, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей трансмембранный и цитоплазматический домены эндогенного CD3δ не относящегося к человеку животного, и в эндогенном локусе CD3γ нуклеотидную последовательность, кодирующую внеклеточный домен человеческого CD3γ, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей трансмембранный и цитоплазматический домены эндогенного CD3γ не относящегося к человеку животного. Применение химерных белков CD3 с человеческим внеклеточным доменом и эндогенными трансмембранным и цитоплазматическим доменами позволяет осуществлять взаимодействие с лекарственными средствами, обладающими специфичностью к человеческому CD3, но также может позволить воспроизвести взаимодействие с эндогенным Т-клеточным рецептором и его передающими сигнал компонентами, характерное для полностью человеческого белка CD3.

В некоторых аспектах изобретения не относящееся к человеку животное экспрессирует внеклеточные домены человеческого белка CD3. В некоторых аспектах не относящееся к человеку животное экспрессирует внеклеточный домен человеческого CD3ε, представленный в SEQ ID NO: 33. В некоторых аспектах не относящееся к человеку животное экспрессирует внеклеточный домен человеческого CD3δ, представленный в SEQ ID NO: 34. В некоторых аспектах не относящееся к человеку животное экспрессирует внеклеточный домен человеческого CD3γ, представленный в SEQ ID NO: 35.

В некоторых вариантах осуществления изобретения не относящееся к человеку животное представляет собой млекопитающее. В одном аспекте не относящееся к человеку животное представляет собой мелкое млекопитающее, например, из надсемейства Dipodoidea или Muroidea. В одном варианте осуществления генетически модифицированное животное представляет собой грызуна. В одном варианте осуществления грызуна выбирают из мыши, крысы и хомяка. В одном варианте осуществления грызун выбран из надсемейства Muroidea. В одном варианте осуществления генетически модифицированное животное выбрано из семейства Calomyscidae (например, мышевидные хомячки), Cricetidae (например, хомяк, мыши и крысы Нового света, полевка), Muridae (например, мыши и крысы, песчанки, иглистые мыши, косматые хомяки), Nesomyidae (например, рипидомисы, скальные крысы, белохвостые крысы, мадагаскарские крысы и мыши), Platacanthomyidae (например, колючие соневидные хомяки) и Spalacidae (например, слепыши, бамбуковые крысы и цокоры). В конкретном варианте осуществления генетически модифицированный грызун выбран из мыши или крысы (семейство Muridae), песчанки, иглистой мыши и косматого хомяка. В одном варианте осуществления генетически модифицированная мышь является представителем семейства Muridae. В одном варианте осуществления не относящееся к человеку животное представляет собой грызуна. В конкретном варианте осуществления грызуна выбирают из мыши и крысы. В одном варианте осуществления не относящееся к человеку животное представляет собой мышь.

В одном варианте осуществления не относящееся к человеку животное представляет собой грызуна, который является мышью линии C57BL, выбранной из C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr и C57BL/0la. В другом варианте осуществления мышь представляет собой мышь линии 129, которую выбирают из группы, состоящей из линий 129Р1, 129Р2, 129Р3, 129X1, 129S1 (например, 129S1/SV, 129S1/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7,129S8, 129Т1, 129Т2 (см., например, Festing et al. (1999) Revised nomenclature for strain 129 mice, Mammalian Genome 10:836, см. также Auerbach et al (2000) Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv- and C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Lines). В конкретном варианте осуществления генетически модифицированная мышь представляет собой смесь вышеупомянутой линии 129 и вышеупомянутой линии C57BL/6. В другом конкретном варианте осуществления мышь представляет собой смесь вышеупомянутых линий 129 или смесь вышеупомянутых линий BL/6. В конкретном варианте осуществления линия 129 смеси представляет собой линию 129S6 (129/SvEvTac). В другом варианте осуществления мышь представляет собой мышь линии BALB, например линии BALB/c. В другом варианте осуществления мышь представляет собой смесь линии BALB с другой вышеупомянутой линией.

В одном варианте осуществления не относящееся к человеку животное представляет собой крысу. В конкретном варианте осуществления крыса выбрана из крысы линии Вистар, линии LEA, линии Спрег-Доули, линии Фишер, F344, F6 и темной агути. В одном варианте осуществления линия крыс представляет собой смесь двух или более линий, выбранных из группы, состоящей из линий Вистар, LEA, Спрег-Доули, Фишер, F344, F6 и темной агути.

Таким образом, в одном варианте осуществления генетически модифицированное не относящееся к человеку животное представляет собой грызуна. В одном варианте осуществления генетически модифицированное не относящееся к человеку животное представляет собой крысу или мышь. В одном варианте осуществления животное представляет собой мышь. Таким образом, в одном варианте осуществления генетически модифицированное животное представляет собой мышь, содержащую в эндогенном локусе мышиного CD3 нуклеотидную последовательность, кодирующую внеклеточный домен человеческого белка CD3. В одном варианте осуществления мышь содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую внеклеточный домен человеческого CD3ε, нуклеотидную последовательность, кодирующую внеклеточный домен человеческого CD3δ, и нуклеотидную последовательность, кодирующую внеклеточный домен человеческого CD3γ. В некоторых вариантах осуществления изобретения внеклеточный домен человеческого CD3ε содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO:33, внеклеточный домен человеческого CD3δ содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 34, а внеклеточный домен человеческого CD3γ содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 35. В некоторых вариантах осуществления мышь содержит последовательность(-и), кодирующую(-ие) сигнальную(-ые) последовательность(-и) эндогенного мышиного CD3. В других вариантах осуществления мышь содержит последовательность(-и), кодирующую(-ие) сигнальную(-ые) последовательность(-и) человеческого CD3.

В некоторых вариантах осуществления изобретения мышь, предложенная в изобретении, экспрессирует гуманизированный(-ые) белок(-и) CD3. В одном варианте осуществления мышь экспрессирует гуманизированный белок CD3ε, гуманизированный белок CD3δ и гуманизированный белок CD3γ. В некоторых вариантах осуществления изобретения мышь экспрессирует внеклеточный домен человеческого CD3ε и эндогенный трансмембранный и цитоплазматический домены мышиного CD3ε, внеклеточный домен человеческого CD3δ и эндогенный трансмембранный и цитоплазматический домены мышиного CD3δ и внеклеточный домен человеческого CD3γ и эндогенный трансмембранный и цитоплазматический домены мышиного CD3γ. В некоторых таких вариантах осуществления мышь экспрессирует гуманизированные белки CD3, которые представляют собой гуманизированный CD3ε, представленный в SEQ ID NO: 24, гуманизированный CD3δ, представленный в SEQ ID NO: 25, и гуманизированный CD3γ, представленный в SEQ ID NO: 26.

В некоторых аспектах изобретения модифицированная методами генной инженерии мышь представляет собой иммунокомпетентную мышь. В некоторых вариантах осуществления изобретения введение гуманизированного(-ых) белка(-ов) CD3 не влияет на функцию иммунной системы мыши. В некоторых вариантах осуществления изобретения мышь содержит нормальное соотношение Т- и В-клеток. В некоторых вариантах осуществления изобретения мышь способна обеспечивать нормальный ответ на мышиную инфекцию. В некоторых аспектах мышь демонстрирует схожее соотношение клеток CD4+ и CD8+ в тимусе по сравнению с мышью дикого типа, например мышью, не содержащей генетических модификаций, позволяющих экспрессировать гуманизированный(-ые) белок(-и) CD3. В некоторых вариантах осуществления изобретения соотношение клеток CD4+ и CD8+ в тимусе мыши находится в пределах 30%, например в пределах 20%, например в пределах 15%, например в пределах 12%, например в пределах 10%, например в пределах 5%, например в пределах 2% от соотношения клеток CD4+ и CD8+ мыши, не содержащей генетических модификаций, позволяющих экспрессировать гуманизированный(-ые) белок(-и) CD3. В некоторых аспектах мышь демонстрирует схожие процентные содержания Т- и В-клеток в селезенке, лимфатических узлах и периферической крови по сравнению с мышью дикого типа, например мышью, не содержащей генетических модификаций, позволяющих экспрессировать гуманизированный(-ые) белок(-и) CD3. В некоторых аспектах мышь демонстрирует схожие количества циркулирующих лейкоцитов, лимфоцитов, моноцитов, нейтрофилов, эозинофилов и базофилов по сравнению с мышью дикого типа, например мышью, не содержащей генетических модификаций, позволяющих экспрессировать гуманизированный(-ые) белок(-и) CD3.

Также в настоящем изобретении предложены способы получения генетически модифицированного не относящегося к человеку животного, описанного в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления способ получения генетически модифицированного не относящегося к человеку животного, экспрессирующего гуманизированный белок CD3, включает введение в эндогенный локус CD3 не относящегося к человеку животного нуклеотидной последовательности, кодирующей внеклеточный домен человеческого белка CD3, причем человеческий белок CD3 выбран из группы, состоящей из CD3ε, CD3δ, CD3γ, CD3ζ и их комбинации. При введении множества человеческих белков CD3 их можно вводить вместе в одну нуклеиновую кислоту (как показано в примерах) или отдельно. В последнем случае одну клеточную линию (например, линию ЭС-клеток) подвергают последовательным модификациям до тех пор, пока не будут включены нуклеиновые кислоты, кодирующие каждый из заданных человеческих CD3. В одном варианте осуществления животное не содержит функциональный внеклеточный домен соответствующего(-их) нечеловеческого(-их) белка(-ов) CD3. В одном аспекте животное содержит в эндогенном локусе нечеловеческого CD3 нуклеотидную последовательность, кодирующую внеклеточный домен человеческого CD3ε, внеклеточный домен человеческого CD3δ и внеклеточный домен человеческого CD3γ. В некоторых вариантах осуществления внеклеточный домен человеческого CD3ε представлен в SEQ ID NO: 33, внеклеточный домен человеческого CD3δ представлен в SEQ ID NO: 34, а внеклеточный домен человеческого CD3γ представлен в SEQ ID NO: 35. В одном варианте осуществления животное не содержит функциональный внеклеточный домен соответствующего(-их) нечеловеческого(-их) белка(-ов) CD3.

В некоторых вариантах осуществления способ получения генетически модифицированного не относящегося к человеку животного по изобретению включает замещение в эндогенном локусе CD3 нуклеотидной последовательности, кодирующей внеклеточный домен нечеловеческого(-их) белка(-ов) CD3, нуклеотидной последовательностью, кодирующей внеклеточный домен соответствующего(-их) человеческого(-их) белка(-ов) CD3. В одном варианте осуществления животное сохраняет трансмембранный и цитоплазматический домены нечеловеческого(-их) белка(-ов) CD3. В некоторых вариантах осуществления замещение приводит к получению химерного(-ых) белка(-ов), содержащего(-их) внеклеточный домен человеческого(-их) белка(-ов) CD3 и трансмембранный и цитоплазматический домены соответствующего(-их) нечеловеческого(-их) белка(-ов) CD3.

Нуклеиновую(-ые) кислоту(-ы), кодирующую(-ие) человеческий(-ие) белок(-и) CD3, как правило, вводят в клетку и воспроизводят из этой клетки не относящееся к человеку животное. В некоторых вариантах осуществления в способе замещения применяется нацеливающая конструкция, полученная с использованием технологии VELOCIGENE®, причем конструкцию вводят в ЭС-клетки, а целевые ЭС-клеточные клоны вводят в мышиный эмбрион с использованием технологии VELOCIMOUSE®, как описано в примерах.

В одном варианте осуществления, в котором способ включает замещение нуклеотидной последовательности, кодирующей внеклеточный домен эндогенного нечеловеческого CD3ε, нуклеотидной последовательностью, кодирующей внеклеточный домен человеческого белка CD3ε, способ включает замещение частичной последовательности эндогенной мыши, кодирующей экзоны 2-4 мышиного гена CD3ε, частичной последовательностью человека, кодирующей экзоны 2-5 человеческого гена CD3ε. В одном варианте осуществления, в котором способ включает замещение нуклеотидной последовательности, кодирующей внеклеточный домен эндогенного нечеловеческого CD3δ, нуклеотидной последовательностью, кодирующей внеклеточный домен человеческого CD3δ, способ включает замещение частичной последовательности эндогенной мыши, кодирующей экзоны 2-3 мышиного CD3δ, частичной последовательностью человека, кодирующей экзоны 2-3 человеческого гена CD3δ. В одном варианте осуществления, в котором способ включает замещение нуклеотидной последовательности, кодирующей внеклеточный домен эндогенного нечеловеческого CD3γ, нуклеотидной последовательностью, кодирующей внеклеточный домен человеческого CD3γ, способ включает замещение частичной последовательности мыши, кодирующей экзоны 2-4 мышиного CD3γ, частичной последовательностью человека, кодирующей экзоны 2-4 человеческого гена CD3γ. В одном варианте осуществления изобретения замещение содержит замещение последовательности CD3ε, CD3δ и CD3γ. В таком варианте осуществления замещение может быть выполнено посредством создания большого нацеливающего вектора, который внедряет последовательную генетическую модификацию во все три локуса, а затем введения большого нацеливающего вектора в мышиные ЭС-клетки для получения мыши, например, как описано в примере 1.

Таким образом, в одном варианте осуществления изобретения предложен большой нацеливающий вектор для получения генетически модифицированного животного по изобретению. В одном варианте осуществления большой нацеливающий вектор содержит 5' и 3' мышиные гомологичные плечи; фрагмент ДНК, содержащий ген CD3ε, который содержит замещение частичной последовательности мышиного CD3ε, кодирующей экзоны 2-4, частичной последовательностью человеческого CD3ε, кодирующей экзоны 2-5; фрагмент ДНК, содержащий ген CD3δ, который содержит замещение частичной последовательности мышиного CD3δ, кодирующей экзоны 2-3, частичной последовательностью человеческого CD3δ, кодирующей экзоны 2-3; фрагмент ДНК, содержащий ген CD3γ, который содержит замещение частичной последовательности мышиного CD3γ, кодирующей экзоны 2-4, частичной последовательностью человеческого CD3γ, кодирующей экзоны 2-4; и кассету селекции.

Кассета селекции представляет собой нуклеотидную последовательность, вставленную в нацеливающую конструкцию для упрощения отбора клеток (например, бактериальных клеток, ЭС-клеток), в которые была интегрирована интересующая конструкция. В данной области известно множество приемлемых кассет селекции (Neo, Hyg, Pur, CM, SPEC и т.п.). Кроме того, кассета селекции может быть фланкирована сайтами рекомбинации, которые позволяют осуществлять делецию кассеты селекции путем обработки рекомбиназными ферментами. Наиболее распространенными сайтами рекомбинации являются lохР и Frt, распознаваемые ферментами Cre и Flp соответственно, но в данной области также известны другие сайты рекомбинации. Кассета селекции может быть расположена в любом месте конструкции за пределами кодирующей области. В одном варианте осуществления кассета селекции вставлена ближе к 5' концу от вставленной последовательности человеческого CD3ε.

После завершения нацеленного воздействия на ген ЭС-клетки или генетически модифицированных не относящихся к человеку животных подвергают скринингу для подтверждения успешного внедрения интересующей экзогенной нуклеотидной последовательности или экспрессии экзогенного полипептида. Специалистам в данной области известно множество способов, включая (без ограничений) саузерн-блоттинг, ПЦР длинных фрагментов, количественную ПНР (например, ПЦР в реальном времени с использованием TAQMAN®), флуоресцентную гибридизацию in situ, нозерн-блоттинг, проточную цитометрию, вестерн-блоттинг, иммуноцитохимические способы, иммуногистохимические способы и т.д. В одном примере не относящихся к человеку животных (например, мышей), несущих интересующую генетическую модификацию, идентифицируют путем скрининга на потерю мышиного аллеля и/или приобретение человеческого аллеля с помощью модифицированного анализа аллелей, описанного в публикации Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21(6):652-659. Специалистам в данной области известны другие анализы, выявляющие специфическую нуклеотидную или аминокислотную последовательность у генетически модифицированных животных.

Гетерозиготы, полученные вышеупомянутыми способами, могут быть спарены для выведения гомозигот.

В одном аспекте предложен способ получения химерной человеческой/нечеловеческой молекулы CD3, включающий экспрессию в одной клетке химерного белка CD3 из нуклеотидной конструкции, как описано в настоящем документе. В одном варианте осуществления нуклеотидная конструкция представляет собой вирусный вектор; в определенном варианте осуществления вирусный вектор представляет собой лентивирусный вектор. В одном варианте осуществления клетку выбирают из СНО, COS, 293, HeLa и клетки сетчатки, экспрессирующей вирусную нуклеотидную последовательность (например, клетка PERC.6™).

В одном аспекте предложена клетка, которая экспрессирует химерный человеческий/нечеловеческий белок CD3. В одном варианте осуществления клетка содержит экспрессионный вектор, содержащий химерную последовательность CD3, как описано в настоящем документе. В одном варианте осуществления клетку выбирают из СНО, COS, 293, HeLa и клетки сетчатки, экспрессирующей вирусную нуклеотидную последовательность (например, клетка PERC.6™).

Также предложена химерная молекула CD3, произведенная не относящимся к человеку животным, как описано в настоящем документе, причем в одном варианте осуществления химерная молекула CD3 содержит аминокислотную последовательность всего или по существу всего внеклеточного домена человеческого белка CD3 и по меньшей мере трансмембранный и цитоплазматический домены нечеловеческого белка CD3, например мышиного белка CD3.

Кроме модифицированного методами генной инженерии не относящегося к человеку животного также предложен нечеловеческий эмбрион (например, эмбрион грызуна, например, мышиный или крысиный эмбрион), содержащий донорскую ЭС-клетку, которая получена от не относящегося к человеку животного (например, грызуна, например, мыши или крысы), как описано в настоящем документе. В одном аспекте эмбрион содержит донорскую ЭС-клетку, которая содержит химерный ген CD3, и клетки эмбриона-хозяина.

Также предложена ткань, полученная от не относящегося к человеку животного (например, грызуна, например, мыши или крысы), как описано в настоящем документе, и экспрессирующая химерный белок CD3.

Кроме того, предложена нечеловеческая клетка, изолированная из не относящегося к человеку животного, как описано в настоящем документе. В одном варианте осуществления клетка представляет собой ЭС-клетку. В одном варианте осуществления клетка представляет собой Т-клетку. В одном варианте осуществления клетка представляет собой Т-клетку CD8+. В другом варианте осуществления клетка представляет собой Т-клетку CD4+.

В некоторых вариантах осуществления изобретения также предложены генетические локусы, содержащие нуклеотидные последовательности, которые кодируют гуманизированный (-ые) белок (-и) CD3, описанный (-ые) в настоящем документе.

Мышиная модель для исследования видов терапии у человека

В некоторых аспектах настоящего изобретения предложена мышиная модель для исследования терапевтических агентов, нацеленных на CD3 («против CD3»). В некоторых аспектах настоящего изобретения предложена мышиная модель для исследования антигенсвязывающих белков против CD3. В некоторых аспектах настоящего изобретения предложена мышиная модель для исследования антител к CD3. В некоторых таких вариантах осуществления предложена мышиная модель для исследования мультиспецифических, например биспецифических, антигенсвязывающих белков против CD3 или биспецифических антител к CD3. Соответственно, мультиспецифический антигенсвязывающий белок против CD3, например биспецифический антигенсвязывающий белок против CD3, оказывает целевое воздействие или специфически связывается с указанным гуманизированным белком CD3 и по меньшей мере одним другим интересующим антигеном. В различных аспектах мышиная модель для исследования биспецифических антигенсвязывающих белков против CD3, в которой антигенсвязывающий белок способен связываться как с CD3, так и с интересующим антигеном, включает нуклеотидную последовательность, кодирующую гуманизированный белок CD3, который выбирают из группы, состоящей из CD3ε, CD3δ, CD3γ, CD3ζ и их комбинации, и клетку, экспрессирующую или содержащую интересующий антиген. В одном варианте осуществления мышь содержит Т-клетку, экспрессирующую указанный(-ые) гуманизированный(-ые) белок(-и) CD3.

В варианте осуществления тестирование моноспецифического и биспецифического антигенсвязывающего белка включает выполнение анализа или исследования, позволяющего определить влияние антигенсвязывающего белка на Т-клетку, экспрессирующую указанный гуманизированный белок CD3. В другом варианте осуществления тестирование биспецифического антигенсвязывающего белка включает выполнение анализа или исследования, позволяющего определить влияние антигенсвязывающего белка на Т-клетку, экспрессирующую указанный гуманизированный белок CD3, и на клетку, экспрессирующую или содержащую интересующий антиген, или на взаимодействие между указанной CD3-экспрессирующей Т-клеткой и клеткой, экспрессирующей или содержащей интересующий антиген. В одном варианте осуществления тестирование моноспецифического и биспецифического антигенсвязывающего белка включает выполнение анализа или исследования, позволяющего определить влияние Т-клетки, экспрессирующей указанный гуманизированный белок CD3, на клетку, экспрессирующую или содержащую указанный интересующий антиген. В одном варианте осуществления в таком анализе измеряют, например, число клеток, экспрессирующих интересующий антиген, иммунный ответ, клеточные взаимодействия, клеточноопосредованную цитотоксичность, высвобождение цитокинов, клеточную активацию, клеточную пролиферацию, рост или регрессию опухоли, изменения гистологических данных и т.п. Различные анализы включают, без ограничений, измерение комплементнаправленной цитотоксичности (CDC), антителозависимой цитотоксичности (ADCC), антителозависимого клеточного фагоцитоза (ADCP), пролиферации РВМС (мононуклеарных клеток периферической крови), активации CD69, гистологический анализ ткани, анализ ткани и клеточных биомаркеров (например, клетки или ткани могут быть извлечены из мыши с целью выполнения анализов или могут быть исследованы с использованием радиографического анализа, МРТ, ПЭТ, ОФЭКТ, BLI (биолюминисцентной визуализации) и других методов флюоресцентной визуализации).

В некоторых вариантах осуществления изобретения в такой мышиной модели в указанную мышь был введен интересующий антиген. Интересующий антиген может быть введен несколькими способами, известными специалистам в данной области. Некоторые не имеющие ограничительного характера способы включают трансгенез, инъекцию, инфицирование, трансплантацию ткани или клетки. Интересующий антиген или его фрагмент (например, фрагмент, который распознается исследуемым антигенсвязывающим белком) может быть нацелен на конкретные типы клеток или может быть экспрессирован этими клетками. В некоторых вариантах осуществления интересующий антиген представляет собой гуманизированный интересующий антиген, кодируемый мышиным геномом.

Интересующий антиген может представлять собой связанный с мембраной белок так, что он экспрессируется только на клеточной поверхности. В альтернативном варианте осуществления интересующий антиген или его фрагмент (например, фрагмент, который распознается исследуемым антигенсвязывающим белком) может быть представлен на клеточной поверхности в комплексе с другим белком или функциональной группой. Некоторые антигены клеточной поверхности могут быть связаны с другими белками в виде корецепторных комплексов, могут быть связаны с внеклеточными молекулами или иметь аффинность к ним. Таким образом, мышиную модель можно применять для исследования биспецифических антигенсвязывающих молекул, которые взаимодействуют с Т-клетками в различных клеточных системах.

В одном варианте осуществления мышиная модель экспрессирует внеклеточные домены человеческого CD3ε, CD3δ, CD3γ. В одном варианте осуществления мышь экспрессирует трансмембранный и цитоплазматический домен мышиного CD3ε, CD3δ и CD3γ; в одном варианте осуществления трансмембранный и цитоплазматический домены представляют собой эндогенные мышиные домены. В одном варианте осуществления мышиная модель экспрессирует CD3ε, CD3δ и CD3γ, каждый из которых содержит человеческий внеклеточный домен и мышиные, например эндогенные мышиные, трансмембранный и цитоплазматический домены.

В различных вариантах осуществления изобретения антигенсвязывающий белок в мышиной модели связывается как с CD3, так и с интересующим антигеном. В одном варианте осуществления интересующий антиген представляет собой человеческий антиген. В одном варианте осуществления интересующий антиген представляет собой антиген примата, например антиген яванского макака. В одном варианте осуществления антигенсвязывающий белок способен связываться с одним и тем же интересующим антигеном как человеческого, так и обезьяньего происхождения. В одном варианте осуществления антигенсвязывающий белок способен связываться как с человеческим, так и с обезьяньим CD3.

В одном варианте осуществления мышиная модель содержит ксенотрансплантат опухоли, экспрессирующей интересующий антиген. В одном варианте осуществления клетка, экспрессирующая или содержащая интересующий антиген в указанной мыши, представляет собой иммортализованную клетку, такую как опухолевая клетка. Таким образом, мышиная модель применяется для исследования активности биспецифических антигенсвязывающих белков против CD3 в отношении блокирования опухолевой клетки, экспрессирующей интересующий антиген, или воздействия на нее.

Таким образом, в варианте осуществления изобретения, в котором клетка, экспрессирующая или содержащая интересующий антиген, представляет собой опухолевую клетку, интересующий антиген может представлять собой связанный с опухолью антиген (ТАА). Различные опухолевые антигены перечислены в базе данных опухолевых антигенов, определяемых Т-клетками (van der Bruggen Р, Stroobant V, Vigneron N, Van den Eynde B. Peptide database: T cell-defined tumor antigens. Cancer Immun 2013). Примеры связанных с опухолью антигенов включают, без ограничений, ALK, белки BAGE, BIRC5 (сурвивин), BIRC7, СА9, CALR, CCR5, CD19, CD20 (MS4A1), CD22, CD27, CD30, CD33, CD38, CD40, CD44, CD52, CD56, CD79, CDK4, СЕАСАМ3, СЕАСАМ5, CLEC12A, EGFR, EGFR типа III, ERBB2 (HER2), ERBB3, ERBB4, ЕРСАМ, ЕРНА2, ЕРНА3, FCRL5, FLT3, FOLR1, белки GAGE, GD2, GD3, GPNMB, GM3, GPR112, IL3RA, KIT, KRAS, LGR5, полученный из EBV LMP2, L1CAM, белки MAGE, MLANA, MSLN, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5, MUC16, MUM1, ANKRD30A, NY-ESO1 (CTAG1B), OX40, PAP, РАХ3, PAX5, PLAC1, PRLR, PMEL, PRAME, PSMA (FOLH1), белки RAGE, RET, RGS5, ROR1, SART1, SART3, SLAMF7, SLC39A6 (LIV1), STEAP1, STEAP2, TERT, TMPRSS2, Tn-антиген, TNFRSF17, TYR, UPK3A, VTCN1, WT1. В одном примере (пример 3, описанный в настоящем документе) интересующий антиген может представлять собой CD20, например человеческий или гуманизированный CD20.

В другом варианте осуществления изобретения мышиная модель используется для определения способности потенциального биспецифического антигенсвязывающего белка блокировать интересующий антиген, который представляет собой антиген, связанный с инфекционным заболеванием, или воздействовать на него. В одном варианте осуществления изобретения мышь инфицирована возбудителем инфекции. В одном варианте осуществления изобретения антиген, связанный с инфекционным заболеванием, представляет собой вирусный антиген. В одном аспекте вирусный антиген выбирают из группы, состоящей из антигена ВИЧ, гепатита А, гепатита В, гепатита С, вируса герпеса (например, HSV-1, HSV-2, CMV, HAV-6, VZV, вируса Эпштейна - Барр), аденовируса, вируса гриппа, флавивируса, эховируса, риновируса, вируса Коксаки, коронавируса, респираторно-синцитиального вируса, вируса эпидемического паротита, ротавируса, вируса кори, вируса краснухи, парвовируса, вируса коровьей оспы, HTLV, вируса денге, папилломавируса, вируса контагиозного моллюска, полиовируса, вируса бешенства, вируса Джона Каннингема, вируса Эбола и вируса арбовирусного энцефалита.

В другом варианте осуществления изобретения, в котором интересующий антиген представляет собой антиген, связанный с инфекционным заболеванием, интересующий антиген представляет собой бактериальный антиген. В некоторых аспектах изобретения бактериальный антиген выбирают из группы, состоящей из бактериального антигена хламидии, риккетсии, микобактерии, стафилококка, стрептококка, пневмококка, менингококка, гонококка, клебсиеллы, протея, серрации, псевдомонады, легионеллы, возбудителя дифтерии, сальмонеллы, бациллы, возбудителя холеры, столбняка, ботулизма, сибирской язвы, чумы, лептоспироза и болезни Лайма.

В некоторых аспектах изобретения биспецифический антигенсвязывающий белок на основе CD3 представляет собой антигенсвязывающий белок на основе человеческого CD3. В одном варианте осуществления антигенсвязывающий белок представляет собой антитело, например человеческое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

В некоторых вариантах осуществления изобретения мышиная модель представляет собой модель иммунокомпетентной мыши. В некоторых вариантах осуществления изобретения мышиная модель позволяет проводить исследование эффективности и/или токсичности интересующего антигенсвязывающего белка. Критерии эффективности будут зависеть от интересующего антигена, на который нацелен биспецифический агент. В некоторых вариантах осуществления критерием эффективности является киллинг Т-клеткой клетки, экспрессирующей антиген. В других вариантах осуществления критерием эффективности является нейтрализация вируса. В другом варианте осуществления критерием эффективности может быть жизнеспособность животного. В еще одном варианте осуществления критерием эффективности может быть уничтожение клеток, экспрессирующих интересующий антиген, пролиферация Т-клеток, продуцирование цитокинов (например, ИФН-g, ФНО-α, ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-10, ИЛ-4, ИЛ-6, гранзима, перфорина и т.п.).

В некоторых вариантах осуществления изобретения токсичность для животного может быть измерена в виде нежелательного явления у животного, например изменения массы тела, аппетита, изменений в пищеварении, изменений числа кровяных клеток, спленомегалии, гистологических изменений органов, изменений активности печеночных ферментов, изменений в анализе мочи, органной токсичности, кровотечений, дегидратации, выпадения шерсти и неряшливости или других признаков болезни. Одним показателем может быть определение перекрестной реактивности антигенсвязывающего белка с посторонними антигенами, что, в одном варианте осуществления, может быть обнаружено посредством гистологического исследования органов, а именно посредством обнаружения антигенсвязывающего белка в тканях или типах клеток, которые не экспрессируют интересующий антиген.

Использование генетически модифицированных не относящихся к человеку животных

Также в изобретении предложены способы применения генетически модифицированных не относящихся к человеку животных, описанных в настоящем документе.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения предложен способ отбора потенциальных лекарственных средств для терапии, которые оказывают целевое воздействие на интересующий антиген, включающий (а) обеспечение или получение генетически модифицированной мыши, содержащей в эндогенном локусе мышиного CD3 нуклеотидную последовательность, кодирующую внеклеточный домен человеческого белка CD3, выбранного из группы, состоящей из CD3ε, CD3δ, CD3γ, CD3ζ и их комбинации, (b) введение в указанную генетически модифицированную мышь интересующего антигена, (с) контактирование указанной мыши с интересующим потенциальным лекарственным средством, которое направлено против человеческого CD3 и интересующего антигена, и (d) определение, является ли потенциально лекарственное средство эффективным в предотвращении появления, уменьшении количества или уничтожении клеток, характеризующихся наличием или экспрессией интересующего антигена. В различных вариантах осуществления мышь экспрессирует на поверхности своих Т-клеток функциональный гуманизированный белок CD3. В одном варианте осуществления способа генетически модифицированная мышь содержит в эндогенном локусе мышиного CD3 нуклеотидную последовательность, кодирующую внеклеточный домен человеческого CD3ε, внеклеточный домен человеческого CD3δ и внеклеточный домен человеческого CD3γ. В одном варианте осуществления способа, описанного в настоящем документе, мышь не содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую функциональный внеклеточный домен соответствующего мышиного белка. В некоторых вариантах осуществления способа внеклеточный(-ые) домен(-ы) человеческого(-их) белка(-ов) CD3 функционально связан(-ы) с трансмембранным и цитоплазматическим доменами соответствующего(-их) эндогенного(-ых) мышиного(-ых) белка(-ов) CD3. В различных вариантах осуществления способов внеклеточный домен человеческого CD3ε представлен в SEQ ID NO: 33, внеклеточный домен человеческого CD3δ представлен в SEQ ID NO: 34, а внеклеточный домен человеческого CD3γ представлен в SEQ ID NO: 35. В различных вариантах осуществления способов, описанных в настоящем документе, мышь может экспрессировать гуманизированный белок CD3ε, представленный в SEQ ID NO: 24, гуманизированный белок CD38, представленный в SEQ ID NO: 25, и гуманизированный CD3γ, представленный в SEQ ID NO: 26.

В различных вариантах осуществления способа, описанного в настоящем документе, введение интересующего антигена в генетически модифицированную мышь, описанную в настоящем документе, может быть выполнено с помощью любых способов, известных специалистам в данной области, которые могут включать, без ограничений, трансгенез, инъекцию, инфицирование, трансплантацию ткани или клетки. Соответственно, введение может быть выполнено посредством экспрессирования мышью интересующего антигена, которое включает генетическую модификацию мыши таким образом, чтобы она экспрессировала интересующий антиген. В альтернативном варианте осуществления введение может включать введение в указанную мышь клетки, экспрессирующей интересующий антиген, как, например, в случае трансплантации клетки или ткани. Введение может также включать инфицирование указанной мыши интересующим антигеном, как, например, в случае бактериальной или вирусной инфекции. В одном варианте осуществления интересующий антиген может представлять собой человеческий интересующий антиген. В другом варианте осуществления он может представлять собой бактериальный или вирусный интересующий антиген.

Интересующий антиген может представлять собой связанный с опухолью антиген, как подробно описано выше. Антиген может также представлять собой антиген, связанный с инфекционным заболеванием, например бактериальный или вирусный антиген, как подробно описано выше.

В различных вариантах осуществления способов отбора потенциального терапевтического лекарственного средства потенциальное лекарственное средство может представлять собой антигенсвязывающий белок, например антитело, например биспецифическое антитело. В различных аспектах такое потенциальное лекарственное средство способно связываться как с человеческим CD3, так и с интересующим антигеном. Интересующий антиген может представлять собой человеческий антиген. Интересующий антиген также может представлять собой антиген примата, например обезьяний антиген. Таким образом, потенциальное лекарственное средство, используемое для отбора, кроме связывания с человеческим CD3 может быть способно связываться как с человеческим антигеном, так и с соответствующим антигеном примата. Потенциальное лекарственное средство также может быть способно связываться с CD3 примата, например обезьяны. Таким образом, потенциальное лекарственное средство может быть способно связываться с CD3 как человека, так и примата, например обезьяны; а также, в одном варианте осуществления, способно связываться с человеческим интересующим антигеном. В другом варианте осуществления интересующий антиген может представлять собой бактериальный или вирусный антиген, а потенциальное лекарственное средство может быть способно связываться с CD3 как человека, так и примата, например обезьяны, и с бактериальным или вирусным интересующим антигеном.

В некоторых аспектах потенциальное терапевтическое средство представляет собой антитело, которое является человеческим антителом. В других аспектах оно может представлять собой гуманизированное антитело. Например, потенциальное терапевтическое средство может представлять собой антитело, продуцируемое мышами VELOCIMMUNE® (см. патент США №8,502,018, включенный в настоящий документ путем ссылки); таким образом, начальное потенциальное антитело может содержать человеческий вариабельный участок и мышиный константный участок. Мышиный константный участок потенциального антитела может быть повторно сконструирован в человеческий посредством экспрессии человеческого вариабельного участка, полученного путем селекции в мышах VELOCIMMUNE®, в функциональной связи с человеческим константным участком.

В различных вариантах осуществления способов, описанных в настоящем документе, потенциальное терапевтическое средство способно ослаблять, устранять или предотвращать заболевание. В одном варианте осуществления заболевание представляет собой опухоль, а потенциальное терапевтическое средство способно уменьшать, прекращать или предотвращать рост опухоли по сравнению с агентом, который не воздействует на интересующий антиген. В таком варианте осуществления способа определение того, является ли потенциальное лекарственное средство эффективным в предотвращении появления, уменьшении количества или уничтожении клеток, характеризующихся наличием или экспрессией интересующего антигена, может быть выполнено с использованием анализа объема опухоли, анализа киллинга опухолевых клеток, индукции маркеров апоптоза в опухолях, замедления роста кровеносных сосудов в опухолях, инфильтрации иммунных клеток в опухолях и т.п. В другом варианте осуществления заболевание представляет собой инфекционное заболевание, а потенциальное терапевтическое средство способно ослаблять, устранять или предотвращать бактериальную или вирусную инфекцию по сравнению с агентом, который не воздействует на интересующий антиген. В таком варианте осуществления способа определение того, является ли потенциальное лекарственное средство эффективным в предотвращении появления, уменьшении количества или уничтожении клеток, характеризующихся наличием или экспрессией интересующего антигена, может быть выполнено с использованием измерения бактериальных или вирусных титров, индукции маркеров апоптоза в инфицированных клетках и т.п.

Также предложены другие способы использования гуманизированных по CD3 мышей настоящего изобретения. Например, не относящееся к человеку животное, например гуманизированная по CD3 мышь, описанная в настоящем документе, может использоваться для исследования механизма действия лекарственного средства. До разработки настоящего животного было сложно исследовать механизм действия лекарственного средства, поскольку такие исследования, как правило, не проводятся с участием людей и приматов и для них часто требуется модель на иммунокомпетентном животном. Понимание механизма действия лекарственного средства может приводить к разработке более эффективных антител. В различных вариантах осуществления изобретения гуманизированная по CD3 мышь представляет собой иммунокомпетентную мышь. Например, гуманизированная по CD3 мышь по изобретению, которая имеет здоровую нормальную иммунную систему с интактным развитием и полным набором иммунных клеток всех типов и интактными иммунными сигнальными путями, может использоваться для исследования влияния различных потенциальных терапевтических средств на конкретные типы клеток, цитокины, хемокины и т.п. Впоследствии эту мышь можно использовать для получения ответов на механистические вопросы, касающиеся функции потенциального лекарственного средства.

Кроме того, гуманизированные по CD3 мыши могут использоваться в способах, которые включают исследование влияния потенциальных лекарственных средств в виде биспецифических антител к CD3 на опухолевые трансплантаты. Ранее разработанные мышиные модели представляли собой модели на мышах с ослабленным иммунитетом для того, чтобы должным образом мог прижиться трансплантат человеческой опухоли. Гуманизированная по CD3 мышь является полностью иммунокомпетентной и позволяет вводить и выращивать опухолевые клетки, экспрессирующие интересующий антиген, в результате чего может быть исследовано полное влияние на иммунный ответ, включая, без ограничений, ответы на механистические вопросы, вопросы, связанные с ранней токсичностью и ранней эффективностью, и т.п.

В дополнительных других вариантах осуществления гуманизированная по CD3 мышь может использоваться для исследования влияния комбинации лекарственных терапевтических средств в животных моделях, а именно такой комбинации лекарственных терапевтических средств, в которой, например, одно лекарственное средство представляет собой антигенсвязывающий белок, который связывается с CD3, а другое лекарственное средство представляет собой агент, который был ранее одобрен для применения по конкретному показанию. Ответы на специфические вопросы, относящиеся к дозированию лекарственных средств и их влиянию, могут быть получены в животной модели до проведения каких-либо испытаний с участием людей.

ПРИМЕРЫ

Следующие примеры приведены для того, чтобы описать обычным специалистам в данной области, как создать и использовать способы и композиции изобретения. Эти примеры не предназначены для ограничения объема того, что авторы рассматривают в качестве их изобретения. Были приложены усилия для обеспечения точности использованных чисел (например, количеств, температуры и т.п.), но следует учитывать некоторые погрешности и отклонения в экспериментах. Примеры не включают подробные описания стандартных способов, которые хорошо известны средним специалистам в данной области (технологии молекулярного клонирования и т.п.). При отсутствии особых указаний части представляют собой массовые части, молекулярная масса представляет собой средневесовую молекулярную массу, температура указана в градусах по шкале Цельсия, а давление является атмосферным или близким к атмосферному.

Пример 1. Конструирование гуманизированного локуса CD3

Пример 1.1. Конструирование гуманизированного CD3γδε

Мышиный локус CD3 был гуманизирован посредством конструирования уникальных нацеливающих векторов из ДНК человеческой и мышиной бактериальных искусственных хромосом (ВАС) с использованием технологии VELOCIGENE® (см., например, патент США №6,586,251 и публикацию Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nat. Biotech. Nat. Biotech. 21(6): 652-659, оба документа включены в настоящий документ путем ссылки. ДНК из мышиной ВАС bMQ-425K11 модифицировали посредством гомологичной рекомбинации для замещения геномной ДНК, кодирующей участки мышиных генов CD3ε, CD3δ и CD3γ (мышиные гены CD3, расположенные в непосредственной близости друг от друга на хромосоме 9), соответствующими участками генов CD3ε, CD3δ и CD3γ, полученными из человеческой ВАС RP11-414G21 (человеческие гены CD3, расположенные в непосредственной близости друг от друга на хромосоме 11), соответственно.

А именно, для получения гуманизированных по CD3γδε мышей мышиную ВАС сначала модифицировали посредством замещения 714 п.н. мышиной последовательности Cd3d (соответствующей частичной последовательности мыши, кодирующей экзоны 2-3 гена Cd3d) 939 п.н. человеческой последовательности CD3D (соответствующей частичной последовательности человека, кодирующей экзоны 2-3 гена CD3D) за один этап нацеливания с использованием нацеливающего вектора, содержащего кассету Spec, и мышиных гомологичных плеч.

Мышиная ВАС, содержащая замещение частичной последовательности мыши, кодирующей экзоны 2-3 гена CD3d, соответствующей человеческой последовательностью, была впоследствии модифицирована посредством замещения 1738 п.н. мышиной последовательности Cd3g (соответствующей частичной последовательности мыши, кодирующей экзоны 2-4 гена Cd3g) 1639 п.н. человеческой последовательности CD3G (соответствующей частичной последовательности человека, кодирующей экзоны 2-4 гена CD3G) также за один этап нацеливания с использованием другого вектора, содержащего кассету Spec, и других гомологичных плеч.

В заключение ВАС, содержащую замещение мышиных генов CD3d и CD3g соответствующими человеческими генами, дополнительно модифицировали посредством замещения 6213 п.н. мышиной последовательности CD3е 6817 п.н. человеческой последовательности (соответствующего замещению частичной последовательности мыши, кодирующей экзоны 2-4 мышиного гена CD3е, частичной последовательностью человека, кодирующей экзоны 2-5 человеческого гена CD3E). Неомициновую кассету размером 4996 п.н., фланкированную сайтами lохР, вставляли ближе к 5' концу от нокина человеческой последовательности CD3E.

Полученный гуманизированный большой нацеливающий вектор, предназначенный для вставки в ЭС-клетки, представлен на ФИГ. 2А, где буквами А, В, С, D, Е, F и G обозначены различные участки соединения мышиной и человеческой последовательностей, мышиной последовательности с кассетой NEO или человеческой последовательности с кассетой NEO. Последовательности в участках соединения представлены в таблице 1 ниже.

ДНК с нацеленной ВАС использовали для электропорации мышиных ЭС-клеток, содержащих делецию в локусе мышиного CD3, с целью создания модифицированных ЭС-клеток для получения мышей, которые экспрессируют на поверхности Т-клеток гуманизированный CD3ε, CD3δ и CD3γ. ЭС-клетки, содержащие вставки человеческих последовательностей CD3ε, CD3δ и CD3γ, выявляли посредством количественного анализа TAQMAN™ (см., например, публикацию Lie and Petropoulos, 1998. Curr. Opin. Biotechnology 9:43-48, включенную в настоящий документ путем ссылки). Разработали специальные наборы праймеров и зондов для обнаружения вставки человеческих последовательностей (приобретение аллеля, GOА) и делеции мышиных последовательностей (потеря аллеля, LOA). В таблице 2 указаны названия и расположения каждого из наборов праймеров/зондов, используемых в количественной ПЦР.

Целевые ЭС-клетки, описанные выше, были использованы в качестве донорских ЭС-клеток и введены в мышиный эмбрион на стадии 8 клеток с использованием способа VELOCIMOUSE® (см., например, патент США №7,294,754 и публикацию Poueymirou et al. (2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses Nature Biotech. 25(1):91-99). Мышей VELOCIMICE® (мыши поколения F0, полностью происходящие из донорской ЭС-клетки), независимо несущих гуманизированные гены CD3, выявляли посредством генотипирования с помощью модификации анализа аллелей (см. выше), в котором обнаруживают присутствие уникальных последовательностей человеческого гена CD3.

Кассету селекции можно удалить с помощью способов, известных специалистам в данной области. Например, для удаления кассеты, фланкированной сайтами lохР, ЭС-клетки, несущие гуманизированный локус CD3, могут быть трансфицированы конструктом, который экспрессирует Cre. Кассета селекции может быть необязательно удалена посредством выведения мышей, которые экспрессируют рекомбиназу Cre. Необязательно кассета селекции у мышей может быть сохранена. Участок соединения мышиной/человеческой последовательностей гуманизированного аллеля CD3ε после удаления кассеты селекции (обозначен на ФПГ. 2В буквами А-В) представлен в таблице 3 ниже. Оставшиеся соединительные последовательности являются такими же, как в нацеливающем векторе, и представлены в таблице 1.

Последовательность полученных гуманизированных белков CD3ε, CD3δ и CD3γ показана на ФИГ. 3 и включена в перечень последовательностей. Кроме того, выравнивание мышиной и человеческой последовательностей и участки соединения со стороны 5'- и 3'-концов от вставленной человеческой последовательности показаны на ФИГ. 4 в виде отмеченных знаками * и ** соответственно. Учетные номера белка в GenBank для белков CD3ε, CD3δ и CD3γ приведены в таблице 4 ниже.

Пример 2. Определение характеристик гуманизированных по CD3 мышей

Пример 2.1. Развитие иммунной клетки у гуманизированных по CD3 мышей

Развитие иммунной клетки в тимусе и периферической крови мышей с человеческим CD3εδγ оценивали с помощью анализа цитометрии посредством сортировки клеток с активацией флуоресценции (FACS) и определения лейкоцитарной формулы. Тимус, селезенку и лимфатические узлы брали от групп мышей дикого типа (WT, не содержат человеческий CD3γδε), гетерозиготных мышей (Het, один аллель hCD3γδε) и гомозиготных мышей (Но, два аллеля hCD3γδε). Периферическую кровь брали посредством пункции сердца или из ретроорбитального синуса в пробирки Microtainer (BD), покрытые ЭДТА. Из селезенки, лимфатических узлов и тимуса готовили суспензии одиночных клеток посредством механического разрушения, и из селезенки, тимуса и цельной крови удаляли эритроциты путем лизиса с помощью буферного раствора AKC Lysis. Клетки инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре с очищенными антителами к CD16/CD32 (FcBlock) для блокирования неспецифического связывания посредством Fc-рецепторов, а затем инкубировали в течение 30 минут при 4°С со смесью прямо конъюгированных антител к Т- и В-клеточным маркерам. Клетки дважды промывали холодным фосфатно-солевым буфером (PBS), содержащим БСА 1%, повторно суспендировали в буферном растворе и анализировали посредством проточной цитометрии на проточном цитометре FACSCanto II™ (BD Biosciences). Тимоциты идентифицировали сначала посредством гейтирования по переднему и боковому светорассеянию, а затем посредством гейтирования по популяции В220-. В периферической крови Т-клетки идентифицировали по CD45+/TCRb+/B220-, а В-клетки идентифицировали по CD45+/TCRb-/B220+. Абсолютные количества подсчитывали на гематологическом анализаторе Hemavet 950FS.

Как показано на ФИГ. 5А и 5В, у гуманизированных по CD3γδε мышей наблюдалось нормальное развитие тимоцитов и нормальные соотношения Т-клеток и В-клеток в тимусе, периферической крови и селезенке. Кроме того, в лимфатических узлах наблюдались нормальные процентные содержания Т- и В-клеток, а абсолютные количества клеток в селезенке и лимфатических узлах (данные не показаны) находились в пределах нормального диапазона. Количества клеток CD4 и CD8 в крови было схожим у мышей WT, Het и Но. Количества циркулирующих лейкоцитов, лимфоцитов, моноцитов, нейтрофилов, эозинофилов и базофилов находились в пределах нормального диапазона (данные не показаны). Таким образом, у гуманизированных по CD3εδγ мышей наблюдается нормальное развитие иммунных клеток.

Для того чтобы определить, проявляют ли гуманизированные по CD3εδγ мыши поликлональность в отношении набора Vβ в CD4+ и CD8+ Т-клетках, спленоциты выделяли от четырех гуманизированных и пяти контрольных мышей соответствующей линии и исследовали на частоту применения TCR Vβ. Брали селезенки и получали спленоциты в виде единичных клеток, как описано выше. Клетки инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре с очищенными антителами к CD16/CD32 (FcBlock; Biolegend) для блокирования неспецифического связывания посредством Fc-рецепторов, а затем повторно суспендировали в смеси прямо конъюгированных антител к мышиному CD4 (Biolegend) и мышиному CD8 (Biolegend). Затем прямо конъюгированные антитела к TCR Vβ добавляли в отдельные лунки и инкубировали в течение 30 минут при 4°С. Клетки промывали холодным фосфатно-солевым буфером и инкубировали с красителем, предназначенным для определения жизнеспособности (клеточная линия LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead, Life Technologies), в течение 15 минут при комнатной температуре. Клетки промывали холодным PBS, содержащим 2%-ную фетальную бычью сыворотку (FBS), повторно суспендировали в буферном растворе, фиксировали стабилизационным буферным раствором компании BD, а затем анализировали посредством проточной цитометрии на проточном цитометре LSR Fortessa™ (BD Biosciences). Т-клетки CD4 и CD8 идентифицировали сначала посредством гейтирования по переднему и боковому светорассеянию, а затем посредством гейтирования по живой популяции. Т-клетки CD4 (CD4+CD8-) и Т-клетки CD8 (CD4-CD8+) затем исследовали на частоту применения TCR Vβ.

Как видно на ФИГ. 5С, набор Vβ, используемый Т-клетками CD4 и CD8 гуманизированных по CD3εδγ мышей, демонстрирует поликлональность, причем отсутствуют значимые отличия в частоте применения от контрольных мышей соответствующей линии.

Пример 2.2. Т-клеточный ответ на инфекцию у гуманизированных по CD3 мышей

Для того чтобы определить, могут ли гуманизированные по CD3 мыши (гуманизированные по CD3γδε мыши) нормально отвечать на инфекцию, исследовали способность гуманизированных мышей уничтожать вирус лимфоцитарного хориоменингита (LCMV). LCMV представляет собой вирус, воздействующий на мышей, причем развитие инфекции зависит от вирусного штамма. Инфицирование штаммом Армстронга приводит к острой инфекции, при которой мыши быстро формируют Т-клеточный ответ на вирус и уничтожают инфекцию приблизительно в течение недели. С другой стороны, клон 13 вируса не может быть уничтожен, Т-клетки становятся «истощенными» и развивается хроническая инфекция. Поскольку и хроническая, и острая инфекция зависят от активности Т-клеток, LCMV представляет собой идеальную модель для исследования Т-клеточной функции.

Гуманизированных по CD3 или контрольных мышей соответствующей линии в возрасте 6-8 недель инфицировали интраперитонеально штаммом Армстронга (2×10⁵ БОЕ) и/или внутривенно клоном 13 вируса (2×10⁶ БОЕ) и через две недели после инфицирования собирали селезенки и измеряли титры вируса с помощью анализа бляшкообразования. Вирусные титры были схожими как у контрольных мышей, так и у мышей huCD3 (ФИГ. 6А), и это указывает, что гуманизация CD3 не вызывала истощения Т-клеток, так как Т-клетки способны сдерживать вирус в аналогичной степени у мышей обеих линий. В отношении инфекции, вызванной штаммом Армстронга, через две недели после первичного инфицирования штаммом Армстронга мышей заражали клоном 13 и через две недели в селезенках измеряли индуцированные клоном 13 вирусные титры. Ни у контрольных, ни у гуманизированных по CD3 мышей не обнаружили вирус (ФИГ. 6В). Полученные данные показывают, что острая инфекция Армстронга была уничтожена. Кроме того, это демонстрирует, что Т-клеточная память, которая сформировалась при инфекции Армстронга, является достаточной для защиты мышей обеих линий от последующей инфекции клоном 13.

Пример 3. Гуманизированные по CD3 мыши в качестве модели для исследования потенциальных терапевтических средств против CD3

Пример 3.1. Гуманизированная по CD3 мышь для исследования антител к CD3 человека, перекрестно-реагирующих с антигеном яванского макака

Способность различных антител против CD3, воздействующих только на человека или перекрестно-реагирующих с антигеном яванского макака, связываться со спленоцитами мышей дикого типа (WT) или гуманизированных по CD3γδε (Но = гомозиготных, Het = гетерозиготных) мышей исследовали с помощью цитометрии посредством сортировки клеток с активацией флуоресценции (FACS).

Свежевыделенные спленоциты (2×10⁵ на лунку) инкубировали с антителами к CD3 (15 мкг/мл) в течение 30 минут при 4°С. После инкубации клетки дважды промывали, добавляли подходящие вторичные антитела (например, флуоресцентно-меченные антитела к человеческому IgG, конъюгированные с фикоэритрином (РЕ), и прямо конъюгированные антитела к Т-клеточным маркерам) и инкубировали в течение еще 30 минут при 4°С, после чего дважды промывали. Использовали следующие антитела: ah/mfCD3-2 и ah/mfCD3-1 представляют собой два антитела, которые распознают как человеческие, так и обезьяньи CD3; ahCD3-2 и ahCD3-1 представляют собой два антитела, которые распознают только человеческий CD3, amCD3-2C11 представляет собой антитело, которое распознает только мышиный CD3, контрольный человеческий IgG представляет собой постороннее контрольное антитело, а только 2 представляет собой контроль в виде только вторичного антитела. Клетки дважды промывали холодным фосфатно-солевым буфером (PBS), содержащим БСА 1%, повторно суспендировали в буферном растворе и анализировали посредством проточной цитометрии на проточном цитометре FACSCanto II™ (BD Biosciences). Т-клетки идентифицировали по CD45+/TCRb+/B220-. Антитела против mCD3-2C11, содержащие hIgG1, использовали для идентификации Т-клеток среди спленоцитов мыши дикого типа.

Как показано на ФИГ. 7, антитела к CD3, которые распознавали только человеческий CD3, были способны связываться с CD3 на поверхности спленоцитов от гуманизированных по CD3γδε мышей; аналогично, антитела к CD3, которые распознавали человеческий и обезьяний CD3, были способны связываться с CD3 на поверхности спленоцитов от гуманизированных по CD3γδε мышей. Таким образом, мыши, гуманизированные по всем трем из CD3ε, CD3δ и CD3γ, являются пригодными для начальных доклинических исследований потенциальных лекарственных средств на основе CD3, после которых могут быть проведены исследования эффективности и токсичности на яванских макаках.

Пример 3.2. Т-клеточная активация у гуманизированных по CD3 мышей

Исследовали способность антител к CD3 человека вызывать иммунный ответ у гуманизированных по CD3 мышей. Мышам, гуманизированным по CD3γδε (n равно 2/группа), интраперитонеально вводили 10 мкг различных антител к CD3, воздействующих только на человека или перекрестно-реагирующих с антигеном яванского макака (все hIgG1). Для получения клеточной композиции и оценки концентраций цитокина в плазме кровь собирали в пробирки Microtainer (BD), покрытые ЭДТА, из ретроорбитального синуса через 2 часа после инъекции. Количество периферических Т- и В-клеток оценивали с помощью FACS. Кратко, 50 мкл цельной крови инкубировали в течение 30 минут при 4°С со смесью прямо конъюгированных антител против Т- и В-клеточных маркеров. Эритроциты удаляли посредством лизиса с буферным раствором АКС Lysis и меченые клетки промывали один раз холодным PBS, содержащим 1% БСА. После промывки клетки повторно суспендировали в холодном буферном растворе и анализировали посредством проточной цитометрии на проточном цитометре FACSCANTO II™ (BD Biosciences). Т-клетки идентифицировали по живым клеткам CD45+/TCRb+/B220- а В-клетки идентифицировали по живым клеткам CD45+/TCRb-/B220+. Абсолютные количества клеток определяли путем добавления известного количества гранул для подсчета абсолютного количества клеток CountBright ТМ. Концентрации цитокинов в плазме из крови, взятой через 2 часа после инъекции, оценивали с использованием набора Mouse Proinflammatory 7-Р1ех Ultra-Sensitive Kit (Meso-Scale Discovery).

Как показано на ФИГ. 8А, инъекция 10 мкг антител к CD3 вызывала временное снижение количеств Т- и В-клеток, которые практически полностью восстанавливались к 4-му дню после начального введения антитела. Дополнительно, инъекция антител к CD3 (как антител к CD3, распознающих только человеческий CD3 (ahCD3-1 и ahCD3-3), так и антител к CD3, распознающих как человеческий, так и обезьяний CD3 (ah/mfCD3-1 и ah/mfCD3-2)) индуцировала продукцию цитокинов у гуманизированных по CD3γδε мышей (Фиг. 8В).

Кроме того, способность антител к человеческому CD3, к человеческому/обезьяньему CD3 или к мышиному антигену индуцировать пролиферацию спленоцитов, полученных от мышей дикого типа или гуманизированных по CD3γδε мышей, оценивали посредством количественного анализа, катализируемого АТФ (CellTiter Glo®). Активация мышиных спленоцитов приводила к высвобождению цитокинов, которые стимулируют клеточную пролиферацию. Данные о пролиферации получали в соответствии со следующим протоколом: спленоциты (5×10⁵/лунка), полученные от мышей дикого типа (WT) или гуманизированных гомозиготных по CD3γδε (hCD3γδεHo) мышей, добавляли в 96-луночные планшеты, которые накануне вечером при 4°С были покрыты уменьшающимися количествами воздействующих только на человека, перекрестно-реагирующих с антигеном яванского макака или специфических мышиных антител к CD3. В культуры добавляли 500 нг/мл антител против мышиного CD28 и планшеты инкубировали в течение 72 ч при 37°С. После инкубации добавляли CellTiter Glo® и измеряли люминесценцию с помощью многоканального планшетного спектрофотометра VICTOR Х5 (PerkinElmer). ЕС50 жизнеспособности клеток (количественный анализ, катализируемый АТФ) определяли с использованием программы Prism (GraphPad Software, г. Сан-Диего, штат Калифорния, США). Значения рассчитывали с помощью 4-параметрового нелинейного регрессионного анализа.

Как показано на ФИГ. 9, антитела против CD3, перекрестно-реагирующие с антигеном яванского макака, вызывали пролиферацию спленоцитов, полученных от гуманизированных по CD3γδε мышей.

Краткое описание различных свойств мышей дикого типа и гуманизированных по CD3γδε представлено на ФИГ. 10. Как показано, лимфоциты мышей с CD3γδε способны связываться с антителами против CD3 человека и реагировать на связь с ними, в особенности это касается антител к CD3 человека, перекрестно-реагирующих с обезьяньим CD3, что является важным аспектом для терапевтических агентов, поскольку доклинические исследования на потенциальных лекарственных средствах часто выполняют на крупных животных, таких как яванские макаки.

Пример 3.3. Исследования по уменьшению опухоли у гуманизированной по CD3 мыши

Мыши, дважды гуманизированные как по CD3 (гуманизированные по CD3γδε мыши, описанные выше), так и по CD20, были получены посредством скрещивания мышей, гуманизированных в локусе CD3, с мышами, гуманизированными в локусе CD20. Полученные животные экспрессировали оба гуманизированных белка. А именно, для получения гуманизированных по CD20 мышей всю мышиную кодирующую область Ms4a1 (Cd20) от 2-й аминокислоты (первая представляет собой метионин и является общей) до 167-й п.н. ближе к 3'-концу от нетранслируемой области со стороны 3'-конца, охватывающей 9312 п.н. (мышиная хромосома 19), замещали соответствующей человеческой кодирующей областью CD20 от 2-й аминокислоты до 107-й п.н. ближе к 3' концу от нетранслируемой области со стороны 3'-конца, охватывающей 8482 п.н. (человеческая хромосома 11). Как мышиный, так и человеческий CD20 имеют шесть экзонов. Животные, использованные в описанном ниже эксперименте, были гомозиготными по замещениям в обоих локусах CD3 и CD20 и были получены путем скрещивания мышей, модифицированных в отдельных локусах.

Гуманизированным по CD3/CD20 мышам подкожно имплантировали 2×10⁵ опухолевых клеток меланомы B16F10.9, трансдуцированных человеческим CD20. Начиная с 0 дня (день трансплантации опухоли), мышам интраперитонеально 2 раза в неделю вводили несущую среду (PBS; n=5), контрольное Ab 2 в дозе 0,4 мг/кг (контрольное антитело, которое не обладает перекрестной реактивностью к антигену CD20; n=5), Ab 1 в дозе 0,4 мг/кг (биспецифическое антитело к CD3/CD20, см. документ WO 2014121087 A1, опубликованный 7 августа 2014 г., N=5) или Ab 1 в дозе 0,004 мг/кг (n=5). Объемы опухоли измеряли так, как показано на Фиг. 11А. Мышей умерщвляли при достижении опухолями объема более 1500 мм³. Как показано на Фиг. 11А, лечение Ab 1 замедляло рост опухоли, если лечение начинали одновременно с трансплантацией опухоли.

Также в отдельном эксперименте исследовали способность Ab 1 подавлять рост уже развившейся опухли (Фиг. 11В). Гуманизированным по CD3/CD20 мышам подкожно имплантировали 2×10⁵ опухолевых клеток меланомы B16F10.9, экспрессирующих человеческий CD20. На 10-й день после имплантации опухоли мышей рандомизировали на основании размера опухоли и распределяли в группы лечения по 5 мышей в каждой группе, в которых мышам вводили один из следующих препаратов: несущая среда (PBS), контрольное антитело Ab 2 в дозе 4 мг/кг (контрольное антитело, которое не обладает перекрестной реактивностью к антигену CD20), антитело Ab 1 в дозе 4 мг/кг или антитело Ab 1 в дозе 0,4 мг/кг. Всем мышам препарат вводили интраперитонеально 2 раза в неделю. Мышей умерщвляли при достижении опухолями объема более 1500 мм³. Как показано на Фиг. 11В, лечение с применением Ab 1 замедляло рост уже развившихся опухолей, и это показывает, что гуманизированные по CD3 мыши являются предпочтительными для начальных исследований потенциального лекарственного средства.

Эквиваленты

Специалисты в данной области смогут определить или с помощью лишь стандартных экспериментов смогут установить множество эквивалентов конкретных вариантов осуществления изобретения, описанных в настоящем документе. Подразумевается, что такие эквиваленты охвачены следующей формулой изобретения.

Полное содержание всех непатентных документов, учетных номеров, вебсайтов и т.п., заявок на патент и патентов, ссылки на которые присутствуют в настоящей заявке, полностью включено в настоящий документ путем ссылки для всех целей в том же объеме, как если бы они были индивидуально обозначены. Если учетный номер или другая ссылка связана с различным содержанием в разное время, то подразумевается содержание, имеющее силу на действительную дату подачи заявки, причем действительная дата подачи представляет собой дату подачи наиболее ранней приоритетной заявки, относящейся к ссылке, или, в случае отсутствия таковой, фактическую дату подачи.

Если из контекста не следует иное, любой вариант осуществления, аспект, элемент, признак, этап или т.п. может быть использован в сочетании с любым другим.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc.

<120> Не относящиеся к человеку животные, экспрессирующие гуманизированный комплекс CD3

<130> 7310P1

<150> 62/083,653

<151> 2014-11-24

<150> 62/106,999

<151> 2015-01-23

<160> 35

<170> PatentIn, версия 3.5

<210> 1

<211> 223

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> синтетическая

<400> 1

cgactttctt gacttctatt tgttaaacac tgtgcattca catcgaatgc tagaagtttc 60

ctcgtcccgc ttcctcctga attgcctggg atcctctgct tgatgccctg taggaaacgt 120

cctttcctgt ggtatagaaa tgactgctcg agataacttc gtataatgta tgctatacga 180

agttatatgc atggcctccg cgccgggttt tggcgcctcc cgc 223

<210> 2

<211> 224

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> синтетическая

<400> 2

tgtatcttat catgtctgga ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttatgctagt 60

aactataacg gtcctaaggt agcgagctag ccttccacag acaccaatgt tcaaaatgga 120

ggcttggggg caaaattctt ttgctatgtc tctagtcgtc caaaaaatgg tcctaacttt 180

ttctgactcc tgcttgtcaa aaattgtggg ctcatagtta atgc 224

<210> 3

<211> 227

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> синтетическая

<400> 3

aggggagaat ggccttcatg cactccctcc tcacctccag cgccttgtgt tttccttgct 60

tagtgatttc ccctctcccc accccacccc ccacagtgtg tgagaactgc atggagatgg 120

atgtgatgtc ggtggccata atcatcattg ttgacatctg tatcactctg ggcttgctga 180

tggtcattta ttactggagc aagaatagga aggccaaggc caagcct 227

<210> 4

<211> 220

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> синтетическая

<400> 4

gaaagagaga gtctttctgc taactaaccc ccagaaggcc ttccggtctc atgtcctgca 60

aagcagtaga cgcccaaagc caggagcaga gttgcgatga ggtcaatgaa gatgacacca 120

gccacggtgg ctggatccag ctccacacag ctctggcaca ctgtggggga agggaggaga 180

gaggagaggt tgagagcctt taagatcagg gaaccatcct 220

<210> 5

<211> 226

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> синтетическая

<400> 5

caagagagac agaagtcaca agaaaaagcc ttcagaaagt tccccaccaa ctgcaggggt 60

caagggggac atgaggatgc cattcaagcg tcgacgagcg taggcagctt attgctctgc 120

atacttacag accatttgtg tagtaaggga catgatgccg agtgaaaggg gcaggagcaa 180

ccagagggag atttcaggaa gttctccagg gactcgaggt tcgtga 226

<210> 6

<211> 224

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> синтетическая

<400> 6

gaagccccac ccagaaaggt aggacaaaga tcatagtcat atttacttca tccaggagag 60

aaacacagac acagccattg ccttggccat catctctctc catcttgacc tcacgtgatc 120

atggcgatcg cgagtgattt agtctacaat ccggaaaact aagtatagat actaccattt 180

tcatggattt ggatctttct tcatcttggc ctcaaataac catg 224

<210> 7

<211> 216

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> синтетическая

<400> 7

gcattattgc agacaggcag gagaaaacga accaggaaaa acaactttcg caacctgaag 60

gtttgtctct ccttttccct acagtgtgtc agaactgcat tgaactaaat gcagccacca 120

tatctggctt tatcttcgct gaggtcatca gcatcttctt ccttgctctt ggtgtatatc 180

tcattgcggg acaggatgga caataccctg tcttaa 216

<210> 8

<211> 356

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> синтетическая

<400> 8

cgactttctt gacttctatt tgttaaacac tgtgcattca catcgaatgc tagaagtttc 60

ctcgtcccgc ttcctcctga attgcctggg atcctctgct tgatgccctg taggaaacgt 120

cctttcctgt ggtatagaaa tgactgctcg agataacttc gtataatgta tgctatacga 180

agttatgcta gtaactataa cggtcctaag gtagcgagct agccttccac agacaccaat 240

gttcaaaatg gaggcttggg ggcaaaattc ttttgctatg tctctagtcg tccaaaaaat 300

ggtcctaact ttttctgact cctgcttgtc aaaaattgtg ggctcatagt taatgc 356

<210> 9

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> синтетическая

<400> 9

cctctgccat gtaggtttgt gtac 24

<210> 10

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> синтетическая

<400> 10

tgccgtgatg tttgttcaat gaccaaa 27

<210> 11

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> синтетическая

<400> 11

gttctgagaa aggcgttctt aagtg 25

<210> 12

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> синтетическая

<400> 12

ccaggcgtac ttgctgttct g 21

<210> 13

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> синтетическая

<400> 13

tgggcttacc atccaggacg a 21

<210> 14

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> синтетическая

<400> 14

gctactcttc ccacaaactg cttag 25

<210> 15

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> синтетическая

<400> 15

ccagcagtaa gttccactgt tctag 25

<210> 16

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> синтетическая

<400> 16

tgtagaaatg gctgtgaccc agca 24

<210> 17

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> синтетическая

<400> 17

gggctgtgtt gcagtatgac 20

<210> 18

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> синтетическая

<400> 18

accgtgcaag ttcattatcg aag 23

<210> 19

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> синтетическая

<400> 19

acgtgcttcc tgaacccttt gggt 24

<210> 20

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> синтетическая

<400> 20

tctcacatcc agaagcccta tc 22

<210> 21

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> синтетическая

<400> 21

cgagggatgt atcagtgtaa agga 24

<210> 22

<211> 29

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> синтетическая

<400> 22

cacagaacaa gtcaaaacca ctccaagtg 29

<210> 23

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> синтетическая

<400> 23

gctcaccaga acagcaaata ctg 23

<210> 24

<211> 207

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> химерный белок

<400> 24

Met Arg Trp Asn Thr Phe Trp Gly Ile Leu Cys Leu Ser Leu Leu Ala

1 5 10 15

Val Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr

20 25 30

Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr

35 40 45

Cys Pro Gln Tyr Pro Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys

50 55 60

Asn Ile Gly Gly Asp Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp

65 70 75 80

His Leu Ser Leu Lys Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr

85 90 95

Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu

100 105 110

Tyr Leu Arg Ala Arg Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp Val Met

115 120 125

Ser Val Ala Ile Ile Ile Ile Val Asp Ile Cys Ile Thr Leu Gly Leu

130 135 140

Leu Met Val Ile Tyr Tyr Trp Ser Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys

145 150 155 160

Pro Val Thr Arg Gly Thr Gly Ala Gly Ser Arg Pro Arg Gly Gln Asn

165 170 175

Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg

180 185 190

Lys Gly Gln Arg Asp Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gln Arg Ala Val

195 200 205

<210> 25

<211> 173

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> химерный белок

<400> 25

Met Glu His Ser Gly Ile Leu Ala Ser Leu Ile Leu Ile Ala Val Leu

1 5 10 15

Pro Gln Val Ser Pro Phe Lys Ile Pro Ile Glu Glu Leu Glu Asp Arg

20 25 30

Val Phe Val Asn Cys Asn Thr Ser Ile Thr Trp Val Glu Gly Thr Val

35 40 45

Gly Thr Leu Leu Ser Asp Ile Thr Arg Leu Asp Leu Gly Lys Arg Ile

50 55 60

Leu Asp Pro Arg Gly Ile Tyr Arg Cys Asn Gly Thr Asp Ile Tyr Lys

65 70 75 80

Asp Lys Glu Ser Thr Val Gln Val His Tyr Arg Met Cys Gln Ser Cys

85 90 95

Val Glu Leu Asp Pro Ala Thr Val Ala Gly Val Ile Phe Ile Asp Leu

100 105 110

Ile Ala Thr Leu Leu Leu Ala Leu Gly Val Tyr Cys Phe Ala Gly His

115 120 125

Glu Thr Gly Arg Pro Ser Gly Ala Ala Glu Val Gln Ala Leu Leu Lys

130 135 140

Asn Glu Gln Leu Tyr Gln Pro Leu Arg Asp Arg Glu Asp Thr Gln Tyr

145 150 155 160

Ser Arg Leu Gly Gly Asn Trp Pro Arg Asn Lys Lys Ser

165 170

<210> 26

<211> 182

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> химерный белок

<400> 26

Met Glu Gln Arg Lys Gly Leu Ala Gly Leu Phe Leu Val Ile Ser Leu

1 5 10 15

Leu Gln Gly Thr Leu Ala Gln Ser Ile Lys Gly Asn His Leu Val Lys

20 25 30

Val Tyr Asp Tyr Gln Glu Asp Gly Ser Val Leu Leu Thr Cys Asp Ala

35 40 45

Glu Ala Lys Asn Ile Thr Trp Phe Lys Asp Gly Lys Met Ile Gly Phe

50 55 60

Leu Thr Glu Asp Lys Lys Lys Trp Asn Leu Gly Ser Asn Ala Lys Asp

65 70 75 80

Pro Arg Gly Met Tyr Gln Cys Lys Gly Ser Gln Asn Lys Ser Lys Pro

85 90 95

Leu Gln Val Tyr Tyr Arg Met Cys Gln Asn Cys Ile Glu Leu Asn Ala

100 105 110

Ala Thr Ile Ser Gly Phe Ile Phe Ala Glu Val Ile Ser Ile Phe Phe

115 120 125

Leu Ala Leu Gly Val Tyr Leu Ile Ala Gly Gln Asp Gly Val Arg Gln

130 135 140

Ser Arg Ala Ser Asp Lys Gln Thr Leu Leu Gln Asn Glu Gln Leu Tyr

145 150 155 160

Gln Pro Leu Lys Asp Arg Glu Tyr Asp Gln Tyr Ser His Leu Gln Gly

165 170 175

Asn Gln Leu Arg Lys Lys

180

<210> 27

<211> 189

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 27

Met Arg Trp Asn Thr Phe Trp Gly Ile Leu Cys Leu Ser Leu Leu Ala

1 5 10 15

Val Gly Thr Cys Gln Asp Asp Ala Glu Asn Ile Glu Tyr Lys Val Ser

20 25 30

Ile Ser Gly Thr Ser Val Glu Leu Thr Cys Pro Leu Asp Ser Asp Glu

35 40 45

Asn Leu Lys Trp Glu Lys Asn Gly Gln Glu Leu Pro Gln Lys His Asp

50 55 60

Lys His Leu Val Leu Gln Asp Phe Ser Glu Val Glu Asp Ser Gly Tyr

65 70 75 80

Tyr Val Cys Tyr Thr Pro Ala Ser Asn Lys Asn Thr Tyr Leu Tyr Leu

85 90 95

Lys Ala Arg Val Cys Glu Tyr Cys Val Glu Val Asp Leu Thr Ala Val

100 105 110

Ala Ile Ile Ile Ile Val Asp Ile Cys Ile Thr Leu Gly Leu Leu Met

115 120 125

Val Ile Tyr Tyr Trp Ser Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys Pro Val

130 135 140

Thr Arg Gly Thr Gly Ala Gly Ser Arg Pro Arg Gly Gln Asn Lys Glu

145 150 155 160

Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg Lys Gly

165 170 175

Gln Arg Asp Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gln Arg Ala Val

180 185

<210> 28

<211> 207

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 28

Met Gln Ser Gly Thr His Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser

1 5 10 15

Val Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr

20 25 30

Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr

35 40 45

Cys Pro Gln Tyr Pro Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys

50 55 60

Asn Ile Gly Gly Asp Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp

65 70 75 80

His Leu Ser Leu Lys Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr

85 90 95

Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu

100 105 110

Tyr Leu Arg Ala Arg Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp Val Met

115 120 125

Ser Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp Ile Cys Ile Thr Gly Gly Leu

130 135 140

Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys

145 150 155 160

Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn

165 170 175

Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg

180 185 190

Lys Gly Gln Arg Asp Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gln Arg Arg Ile

195 200 205

<210> 29

<211> 173

<212> PRT

<213> mus musculus

<400> 29

Met Glu His Ser Gly Ile Leu Ala Ser Leu Ile Leu Ile Ala Val Leu

1 5 10 15

Pro Gln Gly Ser Pro Phe Lys Ile Gln Val Thr Glu Tyr Glu Asp Lys

20 25 30

Val Phe Val Thr Cys Asn Thr Ser Val Met His Leu Asp Gly Thr Val

35 40 45

Glu Gly Trp Phe Ala Lys Asn Lys Thr Leu Asn Leu Gly Lys Gly Val

50 55 60

Leu Asp Pro Arg Gly Ile Tyr Leu Cys Asn Gly Thr Glu Gln Leu Ala

65 70 75 80

Lys Val Val Ser Ser Val Gln Val His Tyr Arg Met Cys Gln Asn Cys

85 90 95

Val Glu Leu Asp Ser Gly Thr Met Ala Gly Val Ile Phe Ile Asp Leu

100 105 110

Ile Ala Thr Leu Leu Leu Ala Leu Gly Val Tyr Cys Phe Ala Gly His

115 120 125

Glu Thr Gly Arg Pro Ser Gly Ala Ala Glu Val Gln Ala Leu Leu Lys

130 135 140

Asn Glu Gln Leu Tyr Gln Pro Leu Arg Asp Arg Glu Asp Thr Gln Tyr

145 150 155 160

Ser Arg Leu Gly Gly Asn Trp Pro Arg Asn Lys Lys Ser

165 170

<210> 30

<211> 171

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 30

Met Glu His Ser Thr Phe Leu Ser Gly Leu Val Leu Ala Thr Leu Leu

1 5 10 15

Ser Gln Val Ser Pro Phe Lys Ile Pro Ile Glu Glu Leu Glu Asp Arg

20 25 30

Val Phe Val Asn Cys Asn Thr Ser Ile Thr Trp Val Glu Gly Thr Val

35 40 45

Gly Thr Leu Leu Ser Asp Ile Thr Arg Leu Asp Leu Gly Lys Arg Ile

50 55 60

Leu Asp Pro Arg Gly Ile Tyr Arg Cys Asn Gly Thr Asp Ile Tyr Lys

65 70 75 80

Asp Lys Glu Ser Thr Val Gln Val His Tyr Arg Met Cys Gln Ser Cys

85 90 95

Val Glu Leu Asp Pro Ala Thr Val Ala Gly Ile Ile Val Thr Asp Val

100 105 110

Ile Ala Thr Leu Leu Leu Ala Leu Gly Val Phe Cys Phe Ala Gly His

115 120 125

Glu Thr Gly Arg Leu Ser Gly Ala Ala Asp Thr Gln Ala Leu Leu Arg

130 135 140

Asn Asp Gln Val Tyr Gln Pro Leu Arg Asp Arg Asp Asp Ala Gln Tyr

145 150 155 160

Ser His Leu Gly Gly Asn Trp Ala Arg Asn Lys

165 170

<210> 31

<211> 182

<212> PRT

<213> mus musculus

<400> 31

Met Glu Gln Arg Lys Gly Leu Ala Gly Leu Phe Leu Val Ile Ser Leu

1 5 10 15

Leu Gln Gly Thr Val Ala Gln Thr Asn Lys Ala Lys Asn Leu Val Gln

20 25 30

Val Asp Gly Ser Arg Gly Asp Gly Ser Val Leu Leu Thr Cys Gly Leu

35 40 45

Thr Asp Lys Thr Ile Lys Trp Leu Lys Asp Gly Ser Ile Ile Ser Pro

50 55 60

Leu Asn Ala Thr Lys Asn Thr Trp Asn Leu Gly Asn Asn Ala Lys Asp

65 70 75 80

Pro Arg Gly Thr Tyr Gln Cys Gln Gly Ala Lys Glu Thr Ser Asn Pro

85 90 95

Leu Gln Val Tyr Tyr Arg Met Cys Glu Asn Cys Ile Glu Leu Asn Ile

100 105 110

Gly Thr Ile Ser Gly Phe Ile Phe Ala Glu Val Ile Ser Ile Phe Phe

115 120 125

Leu Ala Leu Gly Val Tyr Leu Ile Ala Gly Gln Asp Gly Val Arg Gln

130 135 140

Ser Arg Ala Ser Asp Lys Gln Thr Leu Leu Gln Asn Glu Gln Leu Tyr

145 150 155 160

Gln Pro Leu Lys Asp Arg Glu Tyr Asp Gln Tyr Ser His Leu Gln Gly

165 170 175

Asn Gln Leu Arg Lys Lys

180

<210> 32

<211> 182

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 32

Met Glu Gln Gly Lys Gly Leu Ala Val Leu Ile Leu Ala Ile Ile Leu

1 5 10 15

Leu Gln Gly Thr Leu Ala Gln Ser Ile Lys Gly Asn His Leu Val Lys

20 25 30

Val Tyr Asp Tyr Gln Glu Asp Gly Ser Val Leu Leu Thr Cys Asp Ala

35 40 45

Glu Ala Lys Asn Ile Thr Trp Phe Lys Asp Gly Lys Met Ile Gly Phe

50 55 60

Leu Thr Glu Asp Lys Lys Lys Trp Asn Leu Gly Ser Asn Ala Lys Asp

65 70 75 80

Pro Arg Gly Met Tyr Gln Cys Lys Gly Ser Gln Asn Lys Ser Lys Pro

85 90 95

Leu Gln Val Tyr Tyr Arg Met Cys Gln Asn Cys Ile Glu Leu Asn Ala

100 105 110

Ala Thr Ile Ser Gly Phe Leu Phe Ala Glu Ile Val Ser Ile Phe Val

115 120 125

Leu Ala Val Gly Val Tyr Phe Ile Ala Gly Gln Asp Gly Val Arg Gln

130 135 140

Ser Arg Ala Ser Asp Lys Gln Thr Leu Leu Pro Asn Asp Gln Leu Tyr

145 150 155 160

Gln Pro Leu Lys Asp Arg Glu Asp Asp Gln Tyr Ser His Leu Gln Gly

165 170 175

Asn Gln Leu Arg Arg Asn

180

<210> 33

<211> 113

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 33

Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln

1 5 10 15

Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Cys

20 25 30

Pro Gln Tyr Pro Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys Asn

35 40 45

Ile Gly Gly Asp Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp His

50 55 60

Leu Ser Leu Lys Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val

65 70 75 80

Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu Tyr

85 90 95

Leu Arg Ala Arg Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp Val Met Ser

100 105 110

Val

<210> 34

<211> 87

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 34

Val Ser Pro Phe Lys Ile Pro Ile Glu Glu Leu Glu Asp Arg Val Phe

1 5 10 15

Val Asn Cys Asn Thr Ser Ile Thr Trp Val Glu Gly Thr Val Gly Thr

20 25 30

Leu Leu Ser Asp Ile Thr Arg Leu Asp Leu Gly Lys Arg Ile Leu Asp

35 40 45

Pro Arg Gly Ile Tyr Arg Cys Asn Gly Thr Asp Ile Tyr Lys Asp Lys

50 55 60

Glu Ser Thr Val Gln Val His Tyr Arg Met Cys Gln Ser Cys Val Glu

65 70 75 80

Leu Asp Pro Ala Thr Val Ala

85

<210> 35

<211> 97

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 35

Thr Leu Ala Gln Ser Ile Lys Gly Asn His Leu Val Lys Val Tyr Asp

1 5 10 15

Tyr Gln Glu Asp Gly Ser Val Leu Leu Thr Cys Asp Ala Glu Ala Lys

20 25 30

Asn Ile Thr Trp Phe Lys Asp Gly Lys Met Ile Gly Phe Leu Thr Glu

35 40 45

Asp Lys Lys Lys Trp Asn Leu Gly Ser Asn Ala Lys Asp Pro Arg Gly

50 55 60

Met Tyr Gln Cys Lys Gly Ser Gln Asn Lys Ser Lys Pro Leu Gln Val

65 70 75 80

Tyr Tyr Arg Met Cys Gln Asn Cys Ile Glu Leu Asn Ala Ala Thr Ile

85 90 95

Ser

<---

1. Генетически модифицированный грызун, который представляет собой крысу или мышь, содержащий

в эндогенном локусе CD3ε грызуна и функционально связанную с эндогенными регуляторными последовательностями CD3ε нуклеотидную последовательность, кодирующую функциональный химерный белок CD3ε человека/грызуна, который содержит внеклеточный домен человеческого белка CD3ε,

в эндогенном локусе CD3δ грызуна и функционально связанную с эндогенными регуляторными последовательностями CD3δ нуклеотидную последовательность, кодирующую функциональный химерный белок CD3δ человека/грызуна, который содержит внеклеточный домен человеческого белка CD3δ, и

в эндогенном локусе CD3γ грызуна и функционально связанную с эндогенными регуляторными последовательностями CD3γ нуклеотидную последовательность, кодирующую функциональный химерный белок CD3γ человека/грызуна, который содержит внеклеточный домен человеческого белка CD3γ,

причем грызун экспрессирует на поверхности своих Т-клеток функциональный гуманизированный CD3 комплекс, содержащий химерные белки человека/грызуна CD3ε, CD3δ и CD3γ.

2. Грызун по п. 1, у которого эндогенные локусы CD3ε, CD3δ и CD3γ грызуна генетически модифицированы, чтобы функциональные внеклеточные домены эндогенных CD3ε, CD3δ и CD3γ грызуна не экспрессировались.

3. Грызун по п. 1, у которого

нуклеотидная последовательность, кодирующая функциональный химерный белок CD3ε человека/грызуна, замещает нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующий эндогенный белок CD3ε грызуна,

нуклеотидная последовательность, кодирующая функциональный химерный белок CD3δ человека/грызуна, замещает нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующий эндогенный белок CD3δ грызуна, и

нуклеотидная последовательность, кодирующая функциональный химерный белок CD3γ человека/грызуна, замещает нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующий эндогенный белок CD3γ грызуна.

4. Грызун по п. 1, у которого функциональный химерный белок CD3ε человека/грызуна содержит последовательность SEQ ID NO: 33, функциональный химерный белок CD3δ человека/грызуна содержит последовательность SEQ ID NO: 34 и функциональный химерный белок CD3γ человека/грызуна содержит последовательность SEQ ID NO: 35.

5. Грызун по п. 1, у которого функциональный белок CD3ε человека/грызуна или его часть кодируется геномной нуклеотидной последовательностью,

у которого функциональный белок CD3δ человека/грызуна или его часть кодируется геномной нуклеотидной последовательностью и

у которого функциональный белок CD3γ человека/грызуна или его часть кодируется геномной нуклеотидной последовательностью.

6. Грызун по п. 1, который является гетерозиготным по модифицированным эндогенным локусам CD3 грызуна.

7. Грызун по п. 1, который является гомозиготным по модифицированным эндогенным локусам CD3 грызуна.

8. Грызун по любому из пп. 1-7, где грызун представляет собой мышь и где локус CD3ε генетически модифицирован для кодирования полипептида с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 24, локус CD3δ генетически модифицирован для кодирования полипептида с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 25, и локус CD3γ генетически модифицирован для кодирования полипептида с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 26.

9. Грызун по п. 8, у которого функциональный гуманизированный CD3 комплекс образует комплекс с эндогенным рецептором Т-клетки грызуна, экспрессируемым на той же клетке.

10. Способ создания генетически модифицированного грызуна по любому из пп. 1-7, включающий:

(а) введение в геном клетки грызуна

в эндогенный локус CD3ε грызуна и функционально связанной с эндогенными регуляторными последовательностями CD3ε нуклеотидной последовательности, кодирующей функциональный химерный белок CD3ε человека/грызуна, который содержит внеклеточный домен человеческого белка CD3ε,

в эндогенный локус CD3δ грызуна и функционально связанной с эндогенными регуляторными последовательностями CD3δ нуклеотидной последовательности, кодирующей функциональный химерный белок CD3δ человека/грызуна, который содержит внеклеточный домен человеческого белка CD3δ, и

в эндогенный локус CD3γ и функционально связанной с эндогенными регуляторными последовательностями CD3γ нуклеотидной последовательности, кодирующуей функциональный химерный белок CD3γ человека/грызуна, который содержит внеклеточный домен человеческого белка CD3γ, и

(b) создание генетически модифицированного грызуна из указанной клетки,

где грызун представляет собой крысу или мышь.

11. Способ по п. 10, в котором клетка представляет собой одиночную ЭС-клетку мыши, и причем одиночную ЭС-клетку мыши вводят в мышиный эмбрион для создания мыши.

12. Способ по п. 11, где локус CD3ε генетически модифицирован для кодирования полипептида с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 24, локус CD3δ генетически модифицирован для кодирования полипептида с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 25, и локус CD3γ генетически модифицирован для кодирования полипептида с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 26.

13. Мышь, которая применяется в качестве модели для исследования биспецифического антигенсвязывающего белка на основе CD3,

где мышь содержит:

(i) в своем геноме

в эндогенном локусе CD3ε мыши и функционально связанную с эндогенными регуляторными последовательностями CD3ε нуклеотидную последовательность, кодирующую функциональный химерный белок CD3ε человека/мыши, который содержит внеклеточный домен человеческого белка CD3ε,

в эндогенном локусе CD3δ мыши и функционально связанную с эндогенными регуляторными последовательностями CD3δ нуклеотидную последовательность, кодирующую функциональный химерный белок CD3δ человека/мыши, который содержит внеклеточный домен человеческого белка CD3δ, и

в эндогенном локусе CD3γ мыши и функционально связанную с эндогенными регуляторными последовательностями CD3γ нуклеотидную последовательность, кодирующую функциональный химерный белок CD3γ человека/мыши, который содержит внеклеточный домен человеческого белка CD3γ;

(ii) на поверхности своих Т-клеток функциональный гуманизированный CD3 комплекс, содержащий функциональный химерный белок человека/мыши CD3ε, функциональный химерный белок CD3δ человека/мыши и функциональный химерный белок CD3γ человека/мыши, содержащий внеклеточный домен человеческого белка CD3γ, и

(iii) клетку, экспрессирующую или содержащую немышиный представляющий интерес антиген, и причем биспецифический антигенсвязывающий белок на основе CD3 способен связываться как с человеческим CD3, так и с немышиным представляющим интерес антигеном.

14. Мышь, которая применяется в качестве модели, по п. 13, в которой мышь представляет собой мышь по любому из пп. 1-7.

15. Мышь, которая применяется в качестве модели, по п. 14, где

химерный белок человека/грызуна CD3ε содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 24, химерный белок человека/грызуна CD3δ содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 25, и химерный белок человека/грызуна CD3γ содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 26.

16. Способ отбора антигенсвязывающего белка, вызывающего активацию Т-клеток, где антигенсвязывающий белок связывается с CD3 человека и интересующим антигеном, способ включает:

a) введение интересующего антигена в генетически модифицированного грызуна по п. 8, в котором грызун представляет собой мышь,

b) введение антигенсвязывающего белка мыши и

c) определение того, эффективен ли антигенсвязывающий белок в активации мышиных Т-клеток, которые экспрессируют функциональный гуманизированный комплекс CD3.

17. Способ по п. 16, в котором этап введения включает генетическую модификацию мыши для экспрессирования интересующего антигена.

18. Способ по п. 16, в котором этап введения включает введение указанной мыши клетки, экспрессирующей интересующий антиген.

19. Способ по п. 18, где клетка представляет собой опухолевую клетку.

20. Способ по п. 18, где клетка представляет собой бактериальную клетку.

21. Способ по п. 16, в котором этап введения включает инфицирование мыши вирусом или бактерией.

22. Способ по п. 16, где мышь представляет собой иммунокомпетентную мышь.

23. Способ по п. 19, где интересующий антиген представляет собой связанный с опухолью антиген.

24. Способ по п. 23, где связанный с опухолью антиген выбирают из группы, состоящей из ALK, белков BAGE, BIRC5 (сурвивина), BIRC7, СА9, CALR, CCR5, CD 19, CD20 (MS4A1), CD22, CD27, CD30, CD33, CD38, CD40, CD44, CD52, CD56, CD79, CDK4, СЕАСАМ3, СЕАСАМ5, CLEC12A, EGFR, EGFR варианта III, ERBB2 (HER2), ERBB3, ERBB4, ЕРСАМ, ЕРНА2, ЕРНА3, FCRL5, FLT3, FOLR1, белков GAGE, GD2, G3, GPNMB, GM3, GPR112, IL3RA, KIT, KRAS, LGR5, полученного из EBV LMP2, L1CAM, белков MAGE, MLANA, MSLN, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5, MUC16, MUM1, ANKRD30A, NY-ES01 (CTAG1B), 0X40, PAP, РАХЗ, РАХ5, PLAC1, PRLR, PMEL, PRAME, PSMA (FOLH1), белков RAGE, RET, RGS5, ROR1, SART1, SART3, SLAMF7, SLC39A6 (LIV1), STEAP1, STEAP2, TERT, TMPRSS2, Tn-антигена, TNFRSF17, TYR, UPK3A, VTCN1 и WT1.

25. Способ по п. 16, где интересующий антиген представляет собой антиген инфекционного заболевания.

26. Способ по п. 25, где антиген инфекционного заболевания представляет собой вирусный антиген.

27. Способ по п. 26, где вирусный антиген выбирают из группы, состоящей из антигена ВИЧ; гепатита А; гепатита В; гепатита С; вируса герпеса, такого как HSV-1, HSV-2, CMV, HAV-6, VZV и вирус Эпштейна - Барр; аденовируса; вируса гриппа; флавивируса; эховируса; риновируса; вируса Коксаки; коронавируса; респираторно-синцитиального вируса; вируса эпидемического паротита; ротавируса; вируса кори; вируса краснухи; парвовируса; вируса осповакцины; HTLV (Т-лимфотропного вируса человека); вируса денге; папилломавируса; вируса контагиозного моллюска; полиовируса; вируса бешенства; вируса Джона Каннингема; вируса Эбола и вируса арбовирусного энцефалита.

28. Способ по п. 25, где антиген инфекционного заболевания представляет собой бактериальный антиген.

29. Способ по п. 28, где бактериальный антиген выбирают из группы, состоящей из бактериального антигена хламидии, риккетсии, микобактерии, стафилококка, стрептококка, пневмококка, менингококка, гонококка, клебсиеллы, протея, серрации, псевдомонады, легионеллы, возбудителя дифтерии, сальмонеллы, бациллы, возбудителя холеры, столбняка, ботулизма, сибирской язвы, чумы, лептоспироза и болезни Лайма.

30. Способ по любому из пп. 16-29, в котором антигенсвязывающий белок представляет собой антитело.

31. Способ по любому из пп. 16-30, в котором антигенсвязывающий белок представляет собой биспецифическое антитело или биспецифический антигенсвязывающий белок.

32. Способ по п. 31, в котором антигенсвязывающий белок способен распознавать обезьяний белок CD3.

33. Способ по п. 19, в котором антигенсвязывающий белок способен уменьшать, устранять или предотвращать рост опухоли по сравнению с агентом, который не оказывает целевого воздействия на интересующий антиген.

34. Способ по п. 19, в котором этап определения того, эффективен ли антигенсвязывающий белок в активации мышиных Т-клеток, которые экспрессируют функциональный гуманизированный комплекс CD3, включает анализ объема опухоли.

35. Способ по п. 19, в котором этап определения того, эффективен ли антигенсвязывающий белок в активации мышиных Т-клеток, которые экспрессируют функциональный гуманизированный комплекс CD3, включает анализ киллинга опухолевых клеток, опосредованного Т-клетками.

36. Способ по п. 21, в котором антигенсвязывающий белок способен ослаблять, устранять или предотвращать бактериальную или вирусную инфекцию по сравнению с антигенсвязывающим белком, который не оказывает целевого воздействия на интересующий антиген.

37. Способ по п. 21, в котором этап определения того, эффективен ли антигенсвязывающий белок в активации мышиных Т-клеток, которые экспрессируют функциональный гуманизированный комплекс CD3, включает измерение вирусных или бактериальных титров.

38. Способ по п. 16, где интересующий антиген представляет собой человеческий интересующий антиген.

39. Мышь, которая применяется в качестве модели, по п. 14, где клетка представляет собой опухолевую клетку.

40. Мышь, которая применяется в качестве модели, по п. 14, где клетка представляет собой бактериальную клетку.

41. Мышь, которая применяется в качестве модели, по п. 14, где мышь представляет собой иммунокомпетентную мышь.

42. Мышь, которая применяется в качестве модели, по п. 14, где интересующий антиген представляет собой связанный с опухолью антиген.

43. Мышь, которая применяется в качестве модели, по п. 42, где связанный с опухолью антиген выбирают из группы, состоящей из ALK, белков BAGE, BIRC5 (сурвивина), BIRC7, СА9, CALR, CCR5, CD19, CD20 (MS4A1), CD22, CD27, CD30, CD33, CD38, CD40, CD44, CD52, CD56, CD79, CDK4, СЕАСАМ3, СЕАСАМ5, CLEC12A, EGFR, EGFR варианта III, ERBB2 (HER2), ERBB3, ERBB4, ЕРСАМ, ЕРНА2, ЕРНА3, FCRL5, FLT3, FOLR1, белков GAGE, GD2, GD3, GPNMB, GM3, GPR112, IL3RA, KIT, KRAS, LGR5, полученного из EBV LMP2, L1CAM, белков MAGE, MLANA, MSLN, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5, MUC16, MUM1, ANKRD30A, NY-ES01 (CTAG1B), 0X40, PAP, РАХ3, РАХ5, PLAC1, PRLR, PMEL, PRAME, PSMA (FOLH1), белков RAGE, RET, RGS5, ROR1, SART1, SART3, SLAMF7, SLC39A6 (LIV1), STEAP1, STEAP2, TERT, TMPRSS2, Tn-антигена, TNFRSF17, TYR, UPK3A, VTCN1 и WT1.

44. Мышь, которая применяется в качестве модели, по п. 14, где интересующий антиген представляет собой антиген инфекционного заболевания.

45. Мышь, которая применяется в качестве модели, по п. 44, где антиген инфекционного заболевания представляет собой вирусный антиген.

46. Мышь, которая применяется в качестве модели, по п. 45, где вирусный антиген выбирают из группы, состоящей из антигена ВИЧ; гепатита А; гепатита В; гепатита С; вируса герпеса, такого как HSV-1, HSV-2, CMV, HAV-6, VZV и вирус Эпштейна - Барр; аденовируса; вируса гриппа; флавивируса; эховируса; риновируса; вируса Коксаки; коронавируса; респираторно-синцитиального вируса; вируса эпидемического паротита; ротавируса; вируса кори; вируса краснухи; парвовируса; вируса осповакцины; HTLV (Т-лимфотропного вируса человека); вируса денге; папилломавируса; вируса контагиозного моллюска; полиовируса; вируса бешенства; вируса Джона Каннингема; вируса Эбола и вируса арбовирусного энцефалита.

47. Мышь, которая применяется в качестве модели, по п. 44, где антиген инфекционного заболевания представляет собой бактериальный антиген.

48. Мышь, которая применяется в качестве модели, по п. 47, где бактериальный антиген выбирают из группы, состоящей из бактериального антигена хламидии, риккетсии, микобактерии, стафилококка, стрептококка, пневмококка, менингококка, гонококка, клебсиеллы, протея, серрации, псевдомонады, легионеллы, возбудителя дифтерии, сальмонеллы, бациллы, возбудителя холеры, столбняка, ботулизма, сибирской язвы, чумы, лептоспироза и болезни Лайма.

49. Мышь, которая применяется в качестве модели, по п. 14, где интересующий антиген представляет собой человеческий интересующий антиген.

50. Эмбриональная стволовая (ЭС) клетка генетически модифицированного грызуна для создания генетически модифицированного грызуна по любому из пп. 1-7, которая представляет собой ЭС клетку крысы или ЭС клетку мыши, содержащая

в эндогенном локусе CD3ε грызуна и функционально связанную с эндогенными регуляторными последовательностями CD3ε нуклеотидную последовательность, кодирующую функциональный химерный белок CD3ε человека/грызуна, который содержит внеклеточный домен человеческого белка CD3ε,

в эндогенном локусе CD3δ грызуна и функционально связанную с эндогенными регуляторными последовательностями CD3δ нуклеотидную последовательность, кодирующую функциональный химерный белок CD3δ человека/грызуна, который содержит внеклеточный домен человеческого белка CD3δ, и

в эндогенном локусе CD3γ грызуна и функционально связанную с эндогенными регуляторными последовательностями CD3γ нуклеотидную последовательность, кодирующую функциональный химерный белок CD3γ человека/грызуна, который содержит внеклеточный домен человеческого белка CD3γ.

51. ЭС клетка грызуна по п. 50, где эндогенные локусы CD3ε, CD3δ и CD3γ грызуна генетически модифицированы, чтобы функциональные внеклеточные домены эндогенных CD3ε, CD3δ и CD3γ грызуна не экспрессировались.

52. ЭС клетка грызуна по п. 50, где

нуклеотидная последовательность, кодирующая функциональный химерный белок CD3ε человека/грызуна, замещает нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующий эндогенный белок CD3ε грызуна,

нуклеотидная последовательность, кодирующая функциональный химерный белок CD3δ человека/грызуна, замещает нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующий эндогенный белок CD3δ грызуна, и

нуклеотидная последовательность, кодирующая функциональный химерный белок CD3γ человека/грызуна, замещает нуклеотидную последовательность, кодирующую соответствующий эндогенный белок CD3γ грызуна.

53. ЭС клетка грызуна по п. 50, где функциональный химерный белок CD3ε человека/грызуна содержит последовательность SEQ ID NO: 33, функциональный химерный белок CD3δ человека/грызуна содержит последовательность SEQ ID NO: 34 и функциональный химерный белок CD3γ человека/грызуна содержит последовательность SEQ ID NO: 35.

54. ЭС клетка грызуна по п. 50, где функциональный белок CD3ε человека/грызуна или его часть кодируется геномной нуклеотидной последовательностью,

где функциональный белок CD3δ человека/грызуна или его часть кодируется геномной нуклеотидной последовательностью и

где функциональный белок CD3γ человека/грызуна или его часть кодируется геномной нуклеотидной последовательностью.

55. ЭС клетка грызуна по п. 50, которая является гетерозиготной по модифицированным эндогенным локусам CD3 грызуна.

56. ЭС клетка грызуна по п. 50, которая является гомозиготной по модифицированным эндогенным локусам CD3 грызуна.

57. ЭС клетка грызуна по любому из пп. 50-56, где ЭС клетка грызуна представляет собой ЭС клетку мыши и где локус CD3ε генетически модифицирован для кодирования полипептида с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 24, локус CD3δ генетически модифицирован для кодирования полипептида с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 25, и локус CD3γ генетически модифицирован для кодирования полипептида с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 26.