Способ моделирования сочетанного медикаментозного поражения сердца и почек у крыс

Изобретение относится к экспериментальной медицине, патофизиологии и фармакологии и может быть использовано для изучения механизмов формирования, прогрессирования и терапии сочетанного поражения сердца и почек в доклинических исследованиях. Заявлен способ создания экспериментальной модели токсической полиорганной патологии в виде сочетанного поражения сердца и почек у экспериментальных животных. Кардиотоксичность проявлялась развитием синдрома удлиненного интервала QT без морфологических признаков изменения тканей сердца. Поражение почек характеризовалось функциональными (снижение клиренса креатинина, гиперурикемия) и грубыми морфологическими изменениями эпителия канальцев. В основе моделирования токсической сочетанной патологии сердца и почек лежит комплексное воздействие ряда противотуберкулезных препаратов с кардиотоксическим потенциалом различного механизма действия и сочетании с препаратом прямого нефротоксического действия, и факторов (пол, возраст животных), инициирующих каскад функциональных нарушений, приводящих к развитию синдрома удлиненного интервала QT на фоне органического поражения почек. Способ обеспечивает отсутствие летального исхода экспериментальных животных и короткий период развития патологического состояния. 4 з.п. ф-лы, 2 ил., 6 табл., 1 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к экспериментальной медицине, патофизиологии и фармакологии и может быть использовано для изучения механизмов формирования, прогрессирования и терапии сочетанного поражения сердца и почек в доклинических исследованиях.

Уровень техники

Экспериментальные модели токсического полиорганного поражения внутренних органов, в частности, почек и сердца, используются для изучения механизмов формирования патологических процессов, выяснении роли органов и систем, и особенно их взаимоотношений при влиянии различных факторов на организм, выявления ведущей роли электролитной нефропатии, приводящей к сочетанным нарушениям в тканях почек и в проводящей системе сердца, и дают возможность изыскать средства для рационального терапевтического вмешательства и профилактики.

Риск медикаментозных поражений внутренних органов существенно повышается при наличии ряда факторов: необходимость использования многокомпонентных схем лечения при ряде заболеваний; сходного профиля безопасности компонентов схемы, наличие сопутствующей патологии, возраст пациентов. В условиях полипрагмазии повышается риск сочетанных нежелательных побочных явлений, в том числе со стороны сердечно-сосудистой системы и почек.

В течение длительного времени считалось, что токсическое действие на проводящую систему сердца оказывают исключительно антиаритмические препараты IA и III классов (например, хинидин, соталол, амиодарон), однако за последние 20 лет появилось множество свидетельств приобретенного изменения длительности интервала QT на электрокардиограмме (ЭКГ) на фоне применения различных препаратов других фармакологических групп: фторхинолонов, макролидов, противогрибковых и противотуберкулезных препаратов. Кардиотоксическое действие препаратов, в частности фторхинолонов, чаще наблюдается у лиц пожилого возраста с наличием почечной недостаточности, диареи или интенсивной мочегонной терапии с утратой электролитов [Stahlmann R., Lode Н. Fluoroquinolones in the elderly: safety considerations // Drugs. Aging. - 2003. - Vol. 20, No 4 - P. 289-302]. Пожилые пациенты более уязвимы для лекарственно-индуцированной острой почечной патологии (Chen D, Luo С, Tang Z, Zhou Y, Chen H, Zeng C, Liu Z: Delayed renal function recovery from drug-induced acute interstitial nephritis. Am J Med Sci 2012, 343(1):36-39).

В исследованиях коллектива авторов (A. Ore, Е. Т. Olayinka. Influence of Moxifloxacin on Hepatic Redox Status and Plasma Biomarkers of Hepatotoxicity and Nephrotoxicity in Rat//Biochemistry Research International-Volume 2015, Article ID 192724, 8 ps) и E. T. Olayinka, A. Ore, and O. S. Ola, "Influence of different doses of levofloxacin on antioxidant defense systems and markers of renal and hepatic dysfunctions in rats," Advances in Toxicology, vol. 2015, Article ID 385023, 7 pages, 2015) показано сочетанное медикаментозное поражение почек и печени под воздействием фторхинолонов в эксперименте. Крысам вистар в течение 7 дней вводили моксифлоксацин в дозах 4, 8, 16 мг/кг или левофлоксацин в дозах от 5 до 20 мг/кг и наблюдали дозозависимое повышение уровня мочевины в плазме крови и ферментов АЛТ, ACT, ЩФ по сравнению с интактными крысами. При этом были повышены уровни показателей липидного профиля (молонового диальдегида) в крови и значительно снижены уровни содержания ферментных антиоксидантов (СОД, глутатион-S-трансфераза) и неферментных антиоксидантов (аскорбиновой кислоты, восстановленного глутатиона) в клетках печени. В данной модели в течение короткого времени применения только одного препарата из группы фторхинолонов было получено сочетанное нарушение функционального состояния почек и печени, но не исследовалось функциональное состояние сердечно-сосудистой системы. Описан способ моделирования кардиотоксичности в эксперименте на крысах с использованием комбинаций противотуберкулезных препаратов (ПТП) (Мордык А.В. Патогенез и обоснование способов коррекции кардиотоксического действия противотуберкулезных препаратов (клинико-экспериментальное исследование). - Автореф. дисс…д.м.н… - 2008). Суть метода заключается в введении крысам -самцам линии Вистар массой 180-250 г 3 комбинаций из ПТП в терапевтических дозах в течение 2 месяцев с оценкой биоэлектрической активности сердца, вариабельности сердечного ритма и центральной гемодинамики. В результате исследования установлено, что наиболее выраженные проявления кардиотоксичности в виде появления единичных экстрасистол наблюдали при использовании комбинации из основных ПТП (изониазид + рифампицин + пиразинамид + этамбутол). Однако у данного способа моделирования кардиотоксичности имеются недостатки: длительный период моделирования (2 месяца). Также в данном исследовании не изучали нефротоксичности данной схемы.

Известен "Способ моделирования инфарктоидной кардиовазопатии у крыс" (RU 21092048, МПК 7 G09B 23/28) Т.П. Новгородцевой (2000 г.). В основе моделирования инфарктоподобного состояния у крыс положен электролитный и стероидный дисбаланс, сопровождающийся некрозами сердца. Моделирование кардивазопатии включало несколько патогенных факторов, запускающих нарушения разного генеза. Пусковым механизмом развития данного патологического состояния сердечно-сосудистой системы являлась односторонняя нефрэктомия, приводящая к грубому нарушению электролитного обмена, функции почек и усугубляемая используемым дисбалансом электролитов с пищей за счет избытка солей натрия и кальция на фоне дефицита калия и магния и разрешающим агентом было воздействие холодового стресса. Недостатком моделирования кардивазопатии является смертность животных в послеоперационном периоде в 2% случаев, обусловленная почечной недостаточностью, значительным электролитным дисбалансом, миокардиодистрофией и некрозом сердечной мышцы.

Наиболее близким к заявляемому является способ моделирования кардиовазоренальной гипертензии у крыс, основанный на введении в течение 2 недель экспериментальным животным кардиовазо-нефропатогенной полусинтетической диеты, обогащенной холестерином, солями двузамещенного фосфорнокислого водного натрия и заменой питьевой воды на 1% раствор хлорида натрия, и при дефиците калия и магния [RU 2327228, 20.06.2008]. Также ежедневно внутримышечно вводят суспензию гидрокортизона ацетата из расчета 1,5 мг на 100 г массы животного. В последствии крысы были подвергнуты холодовому воздействию в течение 4 ч при 4°С. В результате развивается органическое поражение сердечной ткани и эпителия почек.

В данной модели получено сочетанное поражение сердечно-сосудистой системы и почек при использовании специальной полусинтетической диеты, приведшей к нарушению электролитного баланса, и последующим воздействием физического фактора, который стал пусковым стрессорным агентом. Этот способ моделирования по основному патогенетическому механизму - нарушение электролитного баланса - наиболее близок к заявляемому способу моделирования. Однако при этом способе моделирования развивалось органическое поражение тканей почек и сердца, вызванное мультифакторным воздействием. Кроме того, эту модель нельзя отнести к категории токсического сочетанного поражения почек и сердца лекарственной этиологии.

Технической проблемой, на решение которой направлено заявляемое изобретение является разработка способа моделирования токсического поражения почек и сердца с преимущественно функциональными нарушениями проводящей системы, токсическую этиологию и патогенез развития приобретенного синдрома удлиненного интервала QT, в короткие сроки (2 недели) и без летальности животных.

Техническая проблема решается заявляемым способом путем введения экспериментальным животным комплекса противотуберкулезных препаратов моксифлоксацина, бедаквилина, линезолида, протионамида и капреомицина, при этом для моделирования в качестве экспериментальных животных использовали самки крыс в возрасте 10-12 мес. и массой 330-350 г.

Раскрытие изобретения

Техническим результатом заявляемого изобретения является создание модели, позволяющей получить у крыс нарушение функционального состояния сердца в виде синдрома удлиненного интервала QT, в сочетании с морфологическими и функциональными изменениями почек, вызванные медикаментозной полипрагмазией, приближенную к клиническому течению данных нарушений у больных, получающих комплексную терапию, за короткий срок - 2 недели.

Технический результат достигается способом моделирования токсического поражения почек и сердца, заключающийся в том, что токсическое поражение почек и сердца у животных вызывают путем ежедневного по меньшей мере в течение 2 недель введения лабораторным животным комплекса противотуберкулезных препаратов моксифлоксацина, бедаквилина, линезолида, протионамида и капреомицина, при этом для моделирования использовали самки крыс в возрасте 10-12 мес.и массой 330-350 г, препараты моксифлоксацин, бедаквилин, линезолид, протионамид вводят внутрижелудочно в 0,1% крахмальном геле, а капреомицин вводят внутримышечно. Препараты вводят в следующих дозах моксифлоксацин - 36 мг/кг, бедаквилин - 36 мг/кг, линезолид - 54 мг/кг, протионамид - 90 мг/кг, капреомицин - 90 мг/кг и практически одновременно.

Противотуберкулезные препараты, которые использовались для создания модели обладают выраженным потенциалом кардиотоксичности с различным механизмом токсического действия, в сочетании с внутримышечным введением противотуберкулезного препарата, вызывающего прямое нефротоксическое действие и нарушение электролитного баланса. Использование половозрелых крыс самок в возрасте 10-12 мес.и массой 330-350 г повышает развитие кардиотоксичности и нефротоксичности. Для экспериментов отбирались здоровые крысы, прошедшие период карантинного наблюдения в течение 2 недель, с небольшим, до 20 грамм, разбросом по массе тела. Перед введением комплекса препаратов крысам проводили функциональные исследования.

Патологические изменения проявлялись уменьшением частоты сердечных сокращений с 354,7±8,4 до 320,6±15,3, появлением единичных экстрасистол, нарушением сердечного ритма, связанного с электрической проводимостью - увеличение интервалов QT от 0,043±0,002 мсек до 0,056±0,002 (Р=0,03) и QRS от 0,022±0,001 до 0,028±0,003 мсек на фоне снижения содержания электролитов - калия до 2,83+0,11 при норме 4,37+0,26 и кальция до 1,19+0,01 при норме 1,27+0,02 ммоль/л и изменений анализов мочи и крови почечного профиля. В сыворотке крови наблюдали повышение уровня мочевой кислоты (9,78±1,28 против 6,8±0,41 в контроле), в 1,5 раза повышение креатинина. Клиренс креатинина снизился до 0,62+0,07 против 0,77+0,02. У всех крыс в почках были изменения разной степени выраженности. В корковом веществе почек отмечено сильное расширение просвета канальцев, дезаггрегация и десквамация, гибель и атрофия эпителия канальцев. В отдельных участках сохранного эпителия извитых канальцев - признаки зернистой дистрофии. В просвете некоторых канальцев - скопления погибшего эпителия (зернистые цилиндры) или скопления гомогенной эозинофильной жидкости (первичная моча). Обнаруживались отдельные поврежденные сосудистые клубочки, имеющие вид бесструктурных и плотных комочков. В мозговом веществе обнаруживались зернистые цилиндры и скопления гомогенной эозинофильной жидкости (моча).

Способ позволяет получить новую экспериментальную модель сочетанного токсического поражения почек и сердца лекарственного генеза с преимущественными нарушениями проводящей системы сердца, наиболее точно отражающую механизмы развития приобретенного синдрома удлиненного интервала QT, желудочковых аритмий и электролитного дисбаланса. Предложенная модель проста в исполнении, отличается хорошей воспроизводимостью, отсутствием летального исхода у экспериментальных животных и комплексностью воздействия на организм животного.

Краткое описание чертежей

Изобретение поясняется следующими чертежами.

На фиг. 1 представлено фото фрагмента брюшной полости крысы, демонстрирующее изменение цвета (белесый) и увеличение размеров почек.

На фиг. 2 представлена ЭКГ крысы, на которой видны изменения, а именно уменьшение частоты сердечных сокращений, увеличение интервалов QT и QRS по сравнению с контролем, экстрасистолы.

Осуществление изобретения

Все используемые реагенты являются коммерчески доступными, все процедуры, если не оговорено особо, осуществляли при комнатной температуре или температуре окружающей среды, то есть в диапазоне от 18 до 25°С.

Возможность реализации заявляемого изобретения показана, но не ограничена, в примерах конкретного выполнения.

Перед введением комплекса препаратов крысам проводили функциональные исследования и биохимические исследования. На ЭКГ оценивали частоту сердечных сокращений (ЧСС), показатели временных интервалов сердечных сокращений (RR, PQ, QRS, QT). В анализах крови и мочи определяли содержание электролитов, креатинина и клиренс креатинина.

Использовали нелинейных самок крыс в возрасте 11 месяцев массой 330-350 г, которым ежедневно в течение 2 недель вводили внутрижелудочно в 0,1% крахмальном геле комплекс ПТП в следующих дозах: моксифлоксацин (36 мг/кг) + бедаквилин (36 мг/кг) + линезолид (54 мг/кг) + протионамид (90 мг/кг). Препарат капреомицин в дозе 90 мг/кг вводили внутримышечно. Дозы препаратов соответствовали максимальным терапевтическим дозам для человека.

Комплекс препаратов готовили ex tempore следующим образом: таблетку каждого препарата тщательно растирали в фарфоровых ступках и добавляли необходимый объем 0,1% крахмального геля с тем, чтобы нужное количество препарата содержалось в 0,5 мл крахмальной взвеси. Непосредственно перед введением все препараты набирали в один шприц и одномоментно в общем объеме 2 мл вводили в желудок крысе. Инъекцию капреомицина в объеме 0,5 мл в мышцу делали практически одновременно с внутрижелудочным введением таблетированных форм ПТП.

Для создания модели животные были распределены на 3 группы случайным образом. Первой группе животных (8 особей) комплекс ПТП вводили в течение 14 дней, второй группе животных (8 особей) комплекс ПТП вводили в течение 28 дней, затем выводили из эксперимента, предварительно проведя все необходимые тесты. Контрольной группе (10 особей) в течение 4 недель вводили ежедневно перорально 0,1% раствор крахмального клейстера в объеме 2,0 мл (соответствующем объему вводимого комплекса ПТП) и внутримышечно 0,9% раствор натрия хлорида в объеме 0,5 мл (соответствующем объему введения капреомицина), затем выводили из эксперимента, предварительно проведя все необходимые тесты.

Введение препаратов в течение более длительного срока (28 дней) нецелесообразно, т.к. появляется гибель животных.

Критериями оценки токсичности являлись: число павших животных и сроки их гибели, динамика массы тела, клиническая картина интоксикации, данные ЭКГ, показатели суточного диуреза, исследования электролитов крови и патологические изменения в тканях и внутренних органах, выявляемые при аутопсии павших и выживших животных, выведенных из эксперимента в конце опыта.

Результаты исследования.

В результате проведенных исследований установлено, что животные в течение первых 14 дней введения удовлетворительно переносили введение комплекса препаратов. Гибели животных в этот период отмечено не было. У крыс отмечали снижение аппетита, изменение цвета и консистенции фекалий, пилоэрекцию. При дальнейшем продолжении введений состояние животных ухудшалось. Отмечена гибель 1 крысы на 20 сутки введения комплекса препаратов.

Для определения динамики массы тела животных взвешивали дважды - в начале опыта и перед выведением из эксперимента. Измерение массы тела крыс проводили с помощью весов лабораторных AND EK-600i (наибольший предел взвешивания 600 г, дискретность отсчета 0,1 г), производитель "AND Company Limited", Япония. Установлено что примененный комплекс ПТП вызвал прогрессивное снижение массы тела животных в отличие от крыс контрольной группы, в которой наблюдался физиологический прирост массы тела (таблица 1).

Для определения показателей электрической активности сердца у крыс регистрировали показатели ЭКГ на электрокардиографе SHILLER АТ-1 (Швейцария) при скорости протяжки ленты 50 мм/сек в I, II и III стандартных отведениях и в усиленных однополюсных отведениях от конечностей в aVL aVR и aVF.

Оценивали частоту сердечных сокращений (ЧСС), показатели временных интервалов сердечных сокращений (RR, PQ, QRS, QT).

Выявлены изменения показателей временных интервалов сердечных сокращений у крыс опытных групп по сравнению с контрольной группой животных. Частота сердечных сокращений уменьшалось у крыс опытных групп после 14 и 28 введений комбинации препаратов по сравнению с контрольной группой животных (таблица 2).

Интервал PQ не изменялся у крыс опытных групп на всем протяжении опыта по сравнению с контрольной группой животных (таблица 3).

Интервал QT увеличился до 0,056±0,002 и до 0,067±0,003 сек у опытной группы крыс на 14 и 28 дни опыта (соответственно) по сравнению с контрольной группой животных (0,043±0,002 сек).

Интервал QRS увеличился после 14 введения до 0,028±0,003 сек по сравнению с контрольной группой животных (0,022±0,001 сек).

Выявлены качественные изменения: после 14 введения комплекса противотуберкулезных препаратов у одной из восьми крыс отмечено нарушение сердечного ритма, связанного с электрической проводимостью: выпадение третьего или пятого зубца R, при наличии зубца P.

После 28 введения комплекса противотуберкулезных препаратов у одной из семи крыс выявлен высокий куполообразный зубец Т во II, III и aVF отведениях.

Изученная комбинация препаратов вызывает уменьшение частоты сердечных сокращений, появление высокого куполообразного зубца Т, нарушение сердечного ритма, связанного с электрической проводимостью, увеличение интервалов QT и QRS.

Для оценки функционального состояния почек в условиях спонтанного диуреза крыс помещали в специальные обменные клетки, где в течение суток у них собиралась моча. Оценивали суточный водный баланс (соотношение между количеством введенной в организм жидкости и количеством выделенной жидкости из организма в течение суток), для чего в обменную клетку помещалась емкость с фиксированным количеством жидкости, остаток которой по окончанию опыта можно замерить.

В результате проведенного исследования установлено влияние комплекса ПТП на функциональное состояние почек. В опытной группе животных отмечена прогрессирующая полиурия, как на 14, так и на 28 сутки наблюдения, которая свидетельствует о патологии почек (таблица 3).

Биохимические исследования крови и мочи выявили гиперурикемию через 14 и, особенно, через 28 дней введения ПТП и значительное снижение клиренса креатинина по сравнению с интактными крысами (таблица 4).

При макроскопическом исследовании выведенных из эксперимента животных через 14 и 28 суток отмечено изменение размеров и цвета почек (фиг. 1). Измерение массы отдельных органов на вскрытии с целью проведения морфометрии и определения их массовых коэффициентов проводили с помощью электронных лабораторных весов Е 2000D (наибольший предел взвешивания 2000 г, дискретность отсчета 0,001 г), производитель: Фирма "Sartorius" AG, Германия. Установлено прогрессирующее увеличение массы почек и печени животных относительно данных контрольной группы. Результаты морфометрического анализа относительной массы внутренних органов крыс представлены в таблице 4.

Определение электролитов сыворотки крови крыс проводили на приборе GemPremier 3500 (USA). Результаты исследований выявили существенное снижение содержания калия и кальция в сыворотке крови опытных крыс через 14 дней введения ПТП по сравнению с контрольными животными (таблица 6). Различия в содержании калия через 28дней с контролем были недостоверными.

При исследовании гистологических препаратов тканей сердца крыс, получавших комплекс ПТП 14 дней, не выявили существенных изменений по сравнению с контролем. В корковом веществе почек этих крыс отмечено достаточно выраженное расширение просвета извитых и прямых канальцев, очаговую дезагрегацию, десквамацию и гибель эпителия канальцев, скопления гомогенной эозинофильной жидкости (первичная моча), наличие зернистых цилиндров в небольшом количестве и признаки зернистой дистрофии в эпителии отдельных канальцев, уплотнение и сморщивание некоторых клубочков. В мозговом веществе отдельных крыс в прямых канальцах скопления гомогенной эозинофильной жидкости (моча).

При исследовании гистологических препаратов тканей сердца крыс, получавших комплекс ПТП 28 дней, не выявили существенных изменений по сравнению с контролем у 7 из 8 крыс. У 1 крысы стенка сердца истончена, растянута, в миокарде левого желудочка обнаруживаются кардиомиоциты с признаками зернистой дистрофии. В гистологических препаратах почек у большинства этих крыс выражена дезаггрегация и десквамация и атрофия эпителия канальцев. Встречаются группы клеток стенки эпителия канальцев с признаками вакуольной и зернистой дистрофии. В просвете части канальцев-зернистые цилиндры или скопление гомогенной эозинофильной жидкости. Обнаруживаются отдельные поврежденные сморщенные и уплотненные клубочки. У всех крыс участки рыхлого строения с расширенными канальцами чередуются с участками плотного расположения канальцев. В мозговом веществе обнаруживаются зернистые и гомогенные цилиндры.

Выводы: Использованный комплекс ПТП (моксифлоксацин (36 мг/кг) + бедаквилин (36 мг/кг) + линезолид (54 мг/кг) + протионамид (90 мг/кг) внутрижелудочно и капреомицин (90 мг/кг) внутримышечно) у крыс, старых самок, за 14 дней вызвал поражение почек и кардиотоксическое действие, которое проявлялось уменьшением частоты сердечных сокращений, появлением единичных экстрасистол и нарушением сердечного ритма, связанного с электрической проводимостью,- увеличение интервалов QT и QRS на фоне снижения содержания электролитов - калия и кальция по сравнению с контролем и выраженного поражения почек.

Пример 1. Крыса №3, 14 дней введения комплекса ПТП.

На ЭКГ: увеличение интервалов PQ (0,08 сек) и QT (0,06 сек).

В анализах: снижение содержания калия в крови до 2,7 мкг/мл; снижение клиренса креатинина до 0,4.

При вскрытии брюшной полости: изменение цвета (белесые), размеров и массы почек. При гистологическом исследовании - признаки тубулоинтерстициального нефрита. При морфологическом исследовании сердца- соответствие норме.

Таким образом, проведенные исследования позволили получить новую экспериментальную модель токсической полиорганной патологии в виде сочетанного поражения сердца и почек у экспериментальных животных. Кардиотоксичность проявлялась развитием синдрома удлиненного интервала QT без морфологических признаков изменения тканей сердца. Поражение почек характеризовалось функциональными (снижение клиренса креатинина, гиперурикемия) и грубыми морфологическими изменениями эпителия канальцев. В основе моделирования токсической сочетанной патологии сердца и почек лежит комплексное воздействие ряда противотуберкулезных препаратов с кардиотоксическим потенциалом различного механизма действия и сочетании с препаратом прямого нефротоксического действия, и факторов (пол, возраст животных), инициирующих каскад функциональных нарушений, приводящих к развитию синдрома удлиненного интервала QT на фоне органического поражения почек. Предложенная модель проста в исполнении, отличается хорошей воспроизводимостью, отсутствием летального исхода экспериментальных животных и коротким периодом развития патологического состояния.

1. Способ моделирования токсического поражения почек и сердца, заключающийся в том, что токсическое поражение почек и сердца у животных вызывают путем ежедневного по меньшей мере в течение 2 недель введения комплекса противотуберкулезных препаратов моксифлоксацина, бедаквилина, линезолида, протионамида и капреомицина, при этом для моделирования использовали самки крыс в возрасте 10-12 мес. и массой 330-350 г.

2. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что моксифлоксацин, бедаквилин, линезолид, протионамид вводят внутрижелудочно в 0,1% крахмальном геле.

3. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что капреомицин вводят внутримышечно.

4. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что препараты вводят в следующих дозах моксифлоксацин - 36 мг/кг, бедаквилин - 36 мг/кг, линезолид - 54 мг/кг, протионамид - 90 мг/кг, капреомицин - 90 мг/кг.

5. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что препараты вводят практически одновременно.