Новая дегидрогеназа 5'-инозиновой кислоты и способ получения 5'-инозиновой кислоты с ее использованием

Авторы патента:

ЧАН Джин Сук (KR)

C12N9/04 - действующие на CHOH-группы как доноры, например глюкозооксидаза, лактат дегидрогеназа (1.1)

C12N9/0006 - Ферменты, например лигазы (6.); проферменты; композиции их (препараты для чистки зубов, содержащие ферменты A61K 7/28; лекарственные препараты, содержащие ферменты или проферменты A61K 38/43; составы моющих средств, содержащих ферменты C11D); способы получения, активирования, ингибирования, разделения или очистки ферментов (приготовление солода C12C 1/00)

C12N1/21 - модифицированные введением чужеродного генетического материала

C12N1/20 - бактерии; питательные среды для них

Владельцы патента RU 2728334:

СИДЖЕЙ ЧЕИЛДЖЕДАНГ КОРПОРЕЙШН (KR)

Изобретение относится к биотехнологии. Предложены дегидрогеназа 5'-инозиновой кислоты, микроорганизм, ее включающий, и способ получения 5'-инозиновой кислоты с использованием этого микроорганизма. Изобретение позволяет получить фермент с сохранением его активности и 5'-инозиновую кислоту с высоким выходом. 4 н. и 2 з.п. ф-лы, 12 табл., 4 пр.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное описание относится к варианту дегидрогеназы 5'-инозиновой кислоты, микроорганизму, включающему его, и способу получения 5'-инозиновой кислоты с его использованием.

ОПИСАНИЕ ПРЕДШЕСТВУЮЩЕГО УРОВНЯ ТЕХНИКИ

5'-Инозиновая кислота (5'-инозинмонофосфат, обозначаемый далее в данном документе ИМФ), которая представляет собой соединение на основе нуклеотида, является промежуточным соединением метаболической системы биосинтеза нуклеиновых кислот и используется в различных областях, таких как медицинские изделия и медицинское применение. ИФМ представляет собой соединение, которое широко используют в качестве пищевой добавки-приправы или используют для пищи, наряду с 5'-гуаниловой кислотой (5'-гуанинмонофосфатом, обозначаемым далее в данном документе ГМФ). Известно, что ИМФ сам по себе имеет вкус говядины и усиливает вкус мононатриевой соли глутаминовой кислоты (обозначаемой далее в данном документе как МНГ), как ГМФ. Таким образом, ИМФ привлек внимание как вкусовая добавка на основе нуклеотида.

Способы получения ИМФ включают способ ферментативного расщепления рибонуклеиновых кислот, которые выделяют из клеток дрожжей, способ химического фосфорилирования инозина, полученного путем ферментации (Agri. Biol. Chem., 36, 1511(1972), и так далее), способ культивирования микроорганизма, способного непосредственно продуцировать ИМФ, и последующего выделения ИМФ из его культуры и так далее. Среди них наиболее широко распространен способ, в котором используют микроорганизм, способный непосредственно продуцировать ИМФ.

При этом ферменты в их естественном состоянии не всегда демонстрируют оптимальные характеристики в показателях активности, стабильности, субстратной специфичности в отношении оптических изомеров и так далее, которые требуются при промышленном использовании. Таким образом, предпринимали различные попытки для улучшения ферментов посредством мутаций их аминокислотных последовательностей и так далее, чтобы сделать их подходящими для их планируемого использования. Для улучшения функций ферментов применяли рациональный дизайн и сайт-направленный мутагенез ферментов. Однако, во многих случаях недостатком являлось то, что информация о структуре целевого фермента недостаточна или взаимосвязь структуры и функции неясна, и поэтому способы невозможно применять эффективно. В связи с этим предпринимались попытки улучшения фермента путем направленных изменений при помощи скрининга ферментов с желательным признаком из библиотеки мутантных ферментов, сконструированной посредством случайного мутагенеза гена фермента, приводящего к улучшению его активности.

Авторы данного изобретения провели многочисленные исследования для получения ИМФ с высоким выходом, используя способ непосредственного продуцирования ИМФ посредством ферментации с участием микроорганизмов, и обнаружили вариант белка, участвующего в продуцировании ИМФ, тем самым завершив данное изобретение.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Задачей данного изобретения является предложение варианта дегидрогеназы 5'-нозиновой кислоты.

Другой задачей данного изобретения является предложение полинуклеотида, кодирующего вариант дегидрогеназы 5'-инозиновой кислоты.

Еще одной задачей данного изобретения является предложение вектора, включающего указанный полинуклеотид.

Еще одной задачей данного изобретения является предложение микроорганизма, продуцирующего 5'-инозиновую кислоту, включающего вариант дегидрогеназы 5'- инозиновой кислоты и указанный вектор.

Еще одной задачей данного изобретения является предложение способа получения 5'-инозиновой кислоты, включающего стадии культивирования микроорганизма рода Corynebacterium в среде и выделение 5'-инозиновой кислоты из микроорганизма или среды.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВОПЛОЩЕНИЙ

Далее подробно описаны предпочтительные воплощения изобретения. При этом соответствующие описания и воплощения, раскрытые в данной заявке, также могут быть применены к другим описаниям и воплощениям. Таким образом, все комбинации различных элементов, раскрытых в данной заявке, входят в объем данного изобретения. Более того, объем данного изобретения не ограничен конкретным описанием, приведенным ниже.

Для решения всех вышеуказанных задач в одном аспекте данного изобретения предложен вариант дегидрогеназы 5'-инозиновой кислоты, имеющий полипептид, включающий замену одной или более чем одной аминокислоты в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2. В частности, в данном описании предложен вариант дегидрогеназы 5'-инозиновой кислоты, имеющий полипептид, включающий замену одной или более чем одной аминокислоты в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, где аминокислотная замена включает по меньшей мере любую замену, выбранную из группы, состоящей из замены аминокислоты в положении 377 на треонин и замену аминокислоты в положении 499 от N-конца на изолейцин. В другом аспекте данного изобретения предложен вариант дегидрогеназы 5'-инозиновой кислоты, обладающий активностью дегидрогеназы 5'-инозиновой кислоты, где указанный вариант имеет аминокислотную последовательность, включающую замену аминокислоты в положении 377 на треонин, замену аминокислоты в положении 499 на изолейцин в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 или их комбинацию. В частности, вариант дегидрогеназы 5'-инозиновой кислоты может включать замену одной или более чем одной аминокислоты в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, где аминокислотная замена может включать по меньшей мере любую замену, выбранную из группы, состоящей из замены аминокислоты в положении 377 на треонин и замену аминокислоты в положении 499 на изолейцин.

В данном описании термин «дегидрогеназа 5'-инозиновой кислоты» относится к белку, участвующему в продуцировании 5'-инозиновой кислоты (5'-инозинмонофосфата, ИМФ). Применительно к задачам данного изобретения термин может использоваться взаимозаменяемо с терминами инозин-5'-монофосфатдегидрогеназа, ИМФ-дегидрогеназа, дегидрогеназа инозиновой кислоты, ИМФДГ и так далее.

В данном описании SEQ ID NO: 2 относится к аминокислотной последовательности, обладающей активностью дегидрогеназы 5'-инозиновой кислоты. В частности, SEQ ID NO: 2 представляет собой последовательность белка, обладающего активностью дегидрогеназы 5'-инозиновой кислоты, кодируемой геном guaB. Аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 2 может быть получена в общедоступной базе данных NCBI GenBank. Например, аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 2 может иметь происхождение из Corynebacterium stationis, но не ограничивается таким происхождением, и может включать любую последовательность, обладающую такой же активностью, как указанная выше аминокислотная последовательность, без ограничения. Кроме того, аминокислотная последовательность может включать аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 или аминокислотную последовательность, на 80% или более гомологичную или идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, но не ограничивается ими. В частности, аминокислотная последовательность может включать аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% или более гомологичную или идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2. Гомологичная или идентичная аминокислотная последовательность может быть одной из указанных выше, за исключением последовательности, обладающей 100% идентичностью, или может быть последовательностью, обладающей идентичностью менее 100%. Кроме того, очевидно, что в объем данного изобретения входит белок, имеющий аминокислотную последовательность с делецией, модификацией, заменой или добавлением некоторых аминокислот, при условии, что он обладает гомологией или идентичностью и демонстрирует эффективность, соответствующую таковой указанного выше белка.

В данном описании термин «вариант дегидрогеназы 5'-инозиновой кислоты» может быть использован взаимозаменяемо с вариантом полипептида, обладающего способностью продуцировать ИМФ, вариантом ИМФ-продуцирующего полипептида, вариантом полипептида, обладающего способностью продуцировать 5'-инозиновую кислоту, вариантом полипептида, продуцирующего 5'-инозиновую кислоту, вариантом полипептида, обладающего активностью дегидрогеназы 5'-инозиновой кислоты, вариантом дегидрогеназы 5'-инозиновой кислоты и так далее. Кроме того, белок может иметь происхождение из рода Corynebacterium, в частности, Corynebacterium stationis , но не ограничивается таковым.

Вариант дегидрогеназы 5'-инозиновой кислоты может включать вариацию в положении 377 и/или в положении 499 от N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2. Вариант дегидрогеназы 5'-инозиновой кислоты может представлять собой вариант, имеющий замену аминокислоты в положении 377 на другую аминокислоту, замену аминокислоты в положении 499 на другую аминокислоту или замену аминокислоты в положении 377 на другую аминокислоту и замену аминокислоты в положении 499 на другую аминокислоту и имеющий ослабленную активность по сравнению с вариантами, включающими аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, или с немодифицированной дегидрогеназой 5'-инозиновой кислоты, имеющей происхождение из микроорганизма дикого типа. Такой вариант дегидрогеназы 5'-инозиновой кислоты означает варианты с вариацией аминокислот(ы) в положении 377 и/или в положении 499 от N-конца в SEQ ID NO: 2 и/или в аминокислотной последовательности, по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% или более гомологичной или идентичной SEQ ID NO: 2, как описано выше.

В частности, вариант дегидрогеназы 5'-инозиновой кислоты может иметь замену аминокислоты в положении 377 на треонин, замену аминокислоты в положении 499 на изолейцин или замену аминокислоты в положении 377 на треонин и замену аминокислоты в положении 499 на изолейцин в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, и полипептид может обладать ослабленной активностью дегидрогеназы 5'-инозиновой кислоты по сравнению с полипептидом, включающим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, но не ограничивается ими.

Применительно к задачам данного изобретения микроорганизм, включающий вариант дегидрогеназы 5'-инозиновой кислоты, характеризуется тем, что количество продуцируемого ИМФ увеличено. То, что количество продуцируемого ИМФ может быть увеличено вариантом дегидрогеназы 5'-инозиновой кислоты по данному изобретению, имеет важное значение, тогда как штамм дикого типа, относящийся к роду Corynebacterium, не способен продуцировать ИМФ или, даже если он способен продуцировать ИМФ, он способен продуцировать его лишь в очень небольшом количестве.

В частности, вариант дегидрогеназы 5'-инозиновой кислоты, включающий аминокислотную последовательность, имеющую замену аминокислоты в положении 377 на другую аминокислоту, замену аминокислоты в положении 499 на другую аминокислоту или замену аминокислоты в положении 377 на другую аминокислоту и замену аминокислоты в положении 499 на другую аминокислоту в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, может включать по меньшей мере любую последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6, 7 и 8. Более конкретно, вариант дегидрогеназы 5'-инозиновой кислоты, имеющий замену аминокислоты в положении 377 на треонин, замену аминокислоты в положении 499 на изолейцин или замену аминокислоты в положении 377 на треонин и замену аминокислоты в положении 499 на изолейцин в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, может включать по меньшей мере любую последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6, 7 и 8. Вариант дегидрогеназы 5'-инозиновой кислоты может состоять по меньшей мере из любого варианта, выбранного из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6, 7 и 8. Кроме того, вариант дегидрогеназы 5'- инозиновой кислоты может включать аминокислотную последовательность, имеющую SEQ ID NO: 6, 7 или 8 или аминокислотную последовательность, обладающую с ней гомологией или идентичностью 80% или более, без ограничения. В частности, вариант дегидрогеназы 5'-инозиновой кислоты по данному изобретению может включать полипептид, имеющий SEQ ID NO: 6, 7 или 8, и полипептид, обладающий по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% или более гомологией или идентичностью с SEQ ID NO: 6, 7 или 8. Кроме того, очевидно, что белок, имеющий аминокислотную последовательность с делецией, модификацией, заменой или добавлением некоторых аминокислот, помимо аминокислоты в положении 377 или 499, также входит в объем данного изобретения, при условии, что он обладает гомологией или идентичностью и демонстрирует эффективность, соответствующую таковой указанного выше белка.

Иными словами, даже если в данном изобретении описан «белок или полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную конкретной SEQ ID NO», очевидно, что белок, имеющий аминокислотную последовательность с делецией, модификацией, заменой, консервативной заменой или добавлением некоторых аминокислот, также может быть использован в данном изобретении, при условии, что он обладает активностью, идентичной или соответствующей таковой полипептида, имеющего аминокислотную последовательность соответствующей SEQ ID NO. Например, при условии, что белок обладает активностью, идентичной или соответствующей таковой варианта дегидрогеназы 5'-инозиновой кислоты, в нем не исключено добавление последовательностей, которые не меняют функцию белка, в начале и в конце аминокислотной последовательности, мутации естественного происхождения, молчащей мутации или консервативной замены. Очевидно, что белок, имеющий такое добавление последовательности или мутацию, также входит в объем данного изобретения.

«Консервативная замена» означает замену аминокислоты другой аминокислотой, имеющей похожую структуру и/или химические свойства. Такая аминокислотная замена, как правило, может производиться на основании сходства полярности, заряда, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатических свойств. Например, положительно заряженные (основные) аминокислоты включают аргинин, лизин и гистидин; и отрицательно заряженные (кислые) аминокислоты включают глутаминовую кислоту и аспарагиновую кислоту; ароматические аминокислоты включают фенилаланин, триптофан и тирозин; и гидрофобные аминокислоты включают аланин, валин, изолейцин, лейцин, метионин, фенилаланин, тирозин и триптофан.

Таким образом, в данном изобретении «вариант» может дополнительно включать консервативную замену и/или модификацию одной или более чем одной аминокислоты в «белке или полипептиде, имеющем аминокислотную последовательность, представленную конкретной SEQ ID NO». Например, некоторые варианты могут включать варианты, в которых были удалены одна или более частей, такие как N-концевая лидерная последовательность или трансмембранный домен. Другие варианты могут включать варианты, в которых была удалена часть с N- и/или C-конца зрелого белка. Вариант может также включать другие модификации, включая делецию или добавление аминокислот, которые оказывают минимальное влияние на свойства и вторичную структуру полипептида. Например, полипептид может быть конъюгирован с сигнальной (или лидерной) последовательностью на N-конце белка, которая обеспечивает транспорт белка одновременно с трансляцией или после ее завершения. Полипептид может также быть конъюгирован с другой последовательностью или линкером для удобства идентификации, очистки или синтеза полипептида. Термин «вариант» может быть использован взаимозаменяемо с модификацией, модифицированным белком, модифицированным полипептидом, мутантом, мутеином, дивергентом и так далее, и может быть использован любой термин, без ограничения, при условии, что он использован в смысле «модифицированный». Гомология и идентичность означают степень сходства между двумя заданными аминокислотными последовательностями или нуклеотидными последовательностями, и могут быть выражены в процентах.

Термины «гомология и идентичность» часто могут быть использованы взаимозаменяемо друг с другом.

Гомология или идентичность последовательностей консервативного полинуклеотида или полипептида может быть установлена при помощи стандартного алгоритма выравнивания со значениями штрафов за открытие гэпа, установленными в используемой программе по умолчанию. По существу, гомологичные или идентичные последовательности могут гибридизоваться в условиях умеренной или высокой жесткости по всей длине их последовательности или по меньшей мере на протяжении приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 70%, приблизительно 80% или приблизительно 90% от всей длины. Применительно к гибридизуемым полинуклеотидам, также можно рассматривать полинуклеотиды, включающие вместо кодона вырожденный кодон.

Установить, обладают ли две любые полинуклеотидные или полипептидные последовательности гомологией, сходством или идентичностью, можно, например, при 443, как описано Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482. Вкратце помощи известного компьютерного алгоритма, такого как программа FASTA с использованием параметров по умолчанию, как описано Pearson et al. (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444, и, в альтернативном варианте, при помощи алгоритма Needleman-Wunsch (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), используемого в программе Needle пакета EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277) (версии 5.0.0 или более поздней) (включая пакет программ GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego, 1994, и [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073). Например, гомологию, сходство или идентичность можно определять при помощи BLAST или ClustalW Национального Центра Биотехнологической Информации (the National Center for Biotechnology Information).

Гомологию, сходство или идентичность полинуклеотидов или полипептидов можно определять путем сравнения последовательностей с применением компьютерной программы GAP, разработанной Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48: программа GAP определяет сходство как количество выровненных символов (то есть нуклеотидов или аминокислот), которые являются одинаковыми, поделенное на общее количество символов в более короткой из двух последовательностей. Параметры по умолчанию для программы GAP могут включать: (1) унарную матрицу сравнения (содержащую значения 1 для идентичных и 0 для неидентичных символов) и взвешенную матрицу сравнения (или подстановочную матрицу EDNAFULL (EMBOSS версия NCBI NUC4.4)), предложенные Gribskov et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745, согласно описанию Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979); (2) штраф 3,0 для каждого гэпа и дополнительный штраф 0,10 для каждого символа в каждом гэпе (или штраф за открытие гэпа 10, штраф за продолжение гэпа 0,5); и (3) отсутствие штрафа за концевые гэпы. Таким образом, термины «гомология» или «идентичность» в данном документе описывают соответствие между последовательностями.

Очевидно, что вследствие вырожденности кодонов изобретение также может охватывать полинуклеотид, который будет транслироваться в полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6, 7 и 8, или полипептид, гомологичный или идентичный ему. Например, полинуклеотид может иметь нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, 4 и 5. Кроме того, изобретение может включать последовательность, гибридизующуюся в жестких условиях с зондом, полученным из известной последовательности гена, например, последовательность, комплементарную всей или части нуклеотидной последовательности, полинуклеотидную последовательность, кодирующую вариант дегидрогеназы 5'-инозиновой кислоты, включающий аминокислотную последовательность с заменой аминокислоты в положении 377 на треонин или с заменой аминокислоты в положении 499 на изолейцин в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, без ограничения.

Еще в одном аспекте данного изобретения предложен полинуклеотид, кодирующий вариант дегидрогеназы 5'-инозиновой кислоты, или вектор, включающий указанный полинуклеотид.

В данном описании термин «полинуклеотид» относится к цепи ДНК или РНК, длина которой как нуклеотидного полимера превышает некоторое значение, представляющей собой длинную цепь нуклеотидных мономеров, соединенных ковалентными связями и, в частности, к полинуклеотидному фрагменту, кодирующему полипептид.

Полинуклеотид, кодирующий вариант дегидрогеназы 5'-инозиновой кислоты по данному изобретению, может включать любую полинуклеотидную последовательность, без ограничения, при условии, что она кодирует вариант полипептида, обладающий активностью дегидрогеназы 5'-инозиновой кислоты по данному изобретению. В данном изобретении ген, кодирующий аминокислотную последовательность дегидрогеназы 5'-инозиновой кислоты, представляет собой ген guaB и, в частности, ген может иметь происхождение из Corynebacterium stationis , не ограничиваясь таковым.

В частности, вследствие выраженности кодонов или с учетом предпочтения кодонов у микроорганизма, в котором может экспрессироваться полипептид, могут быть осуществлены различные модификации в кодирующей области полинуклеотида по данному изобретению, в том объеме, который не меняет аминокислотную последовательность полипептида. Изобретение может включать любую полинуклеотидную последовательность, без ограничения, при условии, что она кодирует вариант дегидрогеназы 5'-инозиновой кислоты, имеющий замену аминокислоты в положении 377 на другую аминокислоту, замену аминокислоты в положении 499 на другую аминокислоту или замену аминокислоты в положении 377 на другую аминокислоту и замену аминокислоты в положении 499 на другую аминокислоту в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2. Например, полинуклеотид, кодирующий вариант дегидрогеназы 5'-инозиновой кислоты по данному изобретению, может иметь полинуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6, 7 и 8, но не ограничивается ими. Более конкретно, полинуклеотид может иметь полинуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, 4 и 5, но не ограничивается ими.

Кроме того, изобретение может включать последовательность, гибридизующуюся в жестких условиях с зондом, полученным из известной последовательности гена, например, последовательность, комплементарную всей или части нуклеотидной последовательности, последовательность, кодирующую белок, обладающий активностью варианта дегидрогеназы 5'-инозиновой кислоты, имеющий замену аминокислоты в положении 377 на другую аминокислоту, замену аминокислоты в положении 499 на другую аминокислоту или замену аминокислоты в положении 377 на другую аминокислоту и замену аминокислоты в положении 499 на другую аминокислоту в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, без ограничения.

«Жесткие условия» означают условия, при которых возможна гибридизация между полинуклеотидами. Такие условия подробно описаны в литературе (например, J. Sambrook et al., см. выше). Жесткие условия могут включать условия, при которых гены, обладающие значительной гомологией или идентичностью, например, гены, обладающие гомологией или идентичностью 40% или более, в частности, 90% или более, более конкретно, 95% или более, еще более конкретно, 97% или более, особенно 99% или более, способны гибридизоваться друг с другом, условия, при которых гены, обладающие низкой гомологией или идентичностью, не способны гибридизоваться друг с другом, или условия, которые представляют собой стандартные условия отмывки при гибридизации по Саузерну, например, концентрация соли и температура, соответствующие 60°C, 1X цитрат и хлорид натрия (SSC), 0,1% додецилсульфат натрия (SDS), в частности, 60°C, 0,1X SSC, 0,1% SDS, более конкретно, 68°C, 0,1X SSC, 0,1% SDS, однократно, в частности, двукратно или трехкратно.

Для гибридизации необходимо, чтобы две нуклеиновые кислоты имели комплементарные последовательности, хотя возможны ошибочные спаривания оснований в зависимости от строгости гибридизации. Термин «комплементарность» используется для описания взаимоотношения между основаниями нуклеотидов, которые способны гибридизоваться друг с другом. Например, в случае ДНК аденозин комплементарен тимину, и цитозин комплементарен гуанину. Соответственно, данное изобретение также может включать выделенные фрагменты нуклеиновых кислот, комплементарные полным последовательностям, а также по существу сходные последовательности нуклеиновых кислот.

В частности, полинуклеотид, обладающий гомологией или идентичностью, можно обнаружить при условиях гибридизации, включающих стадию гибридизации при T_m 55°C, и использовании вышеописанных условий. Кроме того, значение T_m может быть 60°C, 63°C или 65°C, без ограничения, и специалист в данной области техники может надлежащим образом его контролировать в соответствии с задачами.

Надлежащая строгость для гибридизации полинуклеотидов зависит от длины полинуклеотидов и степени комплементарности, и возможные значения хорошо известны в уровне техники (см. Sambrook et al., выше, 9.50-9.51, 11.7-11.8). В данном изобретении ген, кодирующий аминокислотную последовательность варианта дегидрогеназы 5'-инозиновой кислоты, представляет собой ген guaB, и полинуклеотид, кодирующий его, является таким же, как описано выше.

В данном изобретении полинуклеотид, кодирующий вариант дегидрогеназы 5'-инозиновой кислоты, также является таким же, как описано выше.

В данном описании термин «вектор» означает ДНК-конструкцию, содержащую нуклеотидную последовательность полинуклеотида, кодирующего требуемый полипептид, которая функционально связана с подходящей регуляторной последовательностью так, что требуемый полипептид экспрессируется в подходящем хозяине. Регуляторные последовательности могут включать промотор для направления транскрипции, определенную последовательность оператора для регуляции такой транскрипции, последовательность, кодирующую подходящий сайт связывания рибосом на мРНК, и последовательность для регуляции терминации транскрипции и трансляции. При трансформации подходящего хозяина вектор может реплицироваться или функционировать независимо от генома хозяина либо может интегрироваться в геном хозяина.

Вектор, используемый в данном изобретении, может не ограничиваться конкретными векторами, при условии, что вектор способен реплицироваться в клетке- хозяине, и можно использовать любой вектор, известный в уровне техники. Примеры обычно используемых векторов могут включать плазмиды, космиды, вирусы и бактериофаги естественного происхождения или рекомбинантные. Например, можно использовать фаговый вектор или космидный вектор, pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, Charon21A и так далее, и в качестве плазмидного вектора можно использовать вектор на основе pBR, pUC, pBluescriptII, pGEM, pTZ, pCL, pET и так далее. В частности, можно использовать векторы pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC.

Например, полинуклеотид, кодирующий требуемый полипептид, может быть встроен в хромосому. Встраивание полинуклеотида в хромосому можно осуществлять любым известным в уровне техники способом, например, посредством гомологичной рекомбинации, но не ограничиваться ей. Дополнительно может быть включен селективный маркер для подтверждения встраивания вектора в хромосому. Селективный маркер используют для отбора клеток, трансформированных вектором, то есть для подтверждения, встроилась ли требуемая молекула нуклеиновой кислоты, и могут быть использованы маркеры, способные придать селектируемый фенотип, такой как устойчивость к лекарственным средствам, ауксотрофия, устойчивость к цитотоксическим агентам и экспрессия поверхностных полипептидов. Только клетки, способные экспрессировать селективные маркеры, могут выжить или экспрессировать другие фенотипические признаки при воздействии селективных агентов, и поэтому трансформированные клетки могут быть легко отобраны. Еще в одном аспекте данного изобретения предложен микроорганизм, продуцирующий 5'-инозиновую кислоту за счет того, что в него включен вариант дегидрогеназы 5'-инозиновой кислоты или кодирующий ее полинуклеотид. В частности, микроорганизм, включающий вариант дегидрогеназы 5'-инозиновой кислоты и/или полинуклеотид, кодирующий ее, может представлять собой микроорганизм, полученный путем трансформации вектором, включающим указанный полинуклеотид, без ограничения.

В данном описании термин «трансформация» относится к процессу встраивания вектора, который включает полинуклеотид, кодирующий целевой белок, в клетку- хозяина, так что белок, кодируемый полинуклеотидом, способен экспрессироваться в клетке-хозяине. Для трансформированного полинуклеотида не имеет значения, встроен ли он в хромосому клетки-хозяина и находится в ней или находится за пределами хромосомы, при условии, что трансформированный полинуклеотид может экспрессироваться в клетке-хозяине. Кроме того, полинуклеотид может включать ДНК и РНК, которые кодируют целевой белок. Полинуклеотид может быть введен в любой форме, при условии, что он может быть введен в клетку-хозяина и экспрессироваться в ней. Например, полинуклеотид может быть введен в клетку-хозяина в форме экспрессионной кассеты, которая представляет собой генную конструкцию, включающую все элементы, необходимые для ее автономной экспрессии. Экспрессионная кассета может включать промотор, сигнал терминации транскрипции, сайт связывания рибосом и сигнал терминации трансляции, которые могут быть функционально связаны с полинуклеотидом. Экспрессионная кассета может быть в форме экспрессирующего вектора, способного к саморепликации. Кроме того, полинуклеотид может быть введен в клетку-хозяина как таковой и функционально связан с последовательностью, требуемой для его экспрессии в клетке-хозяине, без конкретного ограничения.

Кроме того, в данном описании термин «функционально связан» относится к функциональной связи между последовательностью гена и последовательностью промотора, который инициирует и опосредует транскрипцию полинуклеотида, кодирующего целевой полипептид по данному изобретению.

Термин «микроорганизм, включающий вариант полипептида» или «микроорганизм, включающий вариант дегидрогеназы 5'-инозиновой кислоты» в данном описании означает микроорганизм, полученный путем придания способности продуцировать ИМФ микроорганизму, имеющему от природы слабые способности продуцировать ИМФ, или родительскому штамму, не обладающему способностью продуцировать ИМФ. В частности, микроорганизм может представлять собой микроорганизм, экспрессирующий вариант дегидрогеназы 5'-инозиновой кислоты, имеющий полипептид, включающий замену одной или более чем одной аминокислоты в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, где аминокислотная замена может включать по меньшей мере любую замену, выбранную из группы, состоящей из замены аминокислоты в положении 377 на треонин и замену аминокислоты в положении 499 от N-конца на изолейцин. Кроме того, микроорганизм может представлять собой микроорганизм, экспрессирующий вариант полипептида, где микроорганизм обладает активностью дегидрогеназы 5'-инозиновой кислоты в результате замены аминокислоты в положении 377 на другую аминокислоту, замены аминокислоты в положении 499 на другую аминокислоту или замены аминокислоты в положении 377 на другую аминокислоту и замены аминокислоты в положении 499 на другую аминокислоту в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, но не ограничивается ими.

Микроорганизм может представлять собой клетку или микроорганизм, который может включать полинуклеотид, кодирующий вариант дегидрогеназы 5'-инозиновой кислоты, или может быть трансформирован вектором, включающим полинуклеотид, кодирующий вариант дегидрогеназы 5'-инозиновой кислоты, для экспрессии варианта дегидрогеназы 5'-инозиновой кислоты, и применительно к задачам данного изобретения клетка-хозяин или микроорганизм могут представлять собой любой микроорганизм, при условии, что он включает вариант дегидрогеназы 5'-инозиновой кислоты для продуцирования 5'-инозиновой кислоты.

В данном изобретении микроорганизм, продуцирующий 5'-инозиновую кислоту, может быть использован взаимозаменяемо с микроорганизмом, продуцирующим 5'- инозиновую кислоту, или микроорганизмом, обладающим способностью продуцировать 5'-инозиновую кислоту.

В данном описании термин «микроорганизм, продуцирующий 5'-инозиновую кислоту» может обозначать микроорганизм, в котором происходит генетическая модификация или усиливается активность для продуцирования требуемой 5'- инозиновой кислоты, включая все микроорганизмы дикого типа или микроорганизм, в котором генетическая модификация возникает естественным или искусственным образом, и микроорганизм может представлять собой микроорганизм, в котором конкретный механизм ослаблен или усилен путем встраивания экзогенного гена или усиления или инактивации активности эндогенного гена. Применительно к задачам данного изобретения микроорганизм, продуцирующий 5'-инозиновую кислоту, может характеризоваться тем, что он включает вариант дегидрогеназы 5'-инозиновой кислоты, чтобы обладать повышенной способностью продуцировать требуемую 5'-инозиновую кислоту и, в частности, микроорганизм может представлять собой микроорганизм рода Corynebacterium. В частности, в данном изобретении микроорганизм, продуцирующий 5'-инозиновую кислоту, или микроорганизм, обладающий способностью продуцировать 5'-инозиновую кислоту, может представлять собой микроорганизм, в котором часть генов, участвующих в пути биосинтеза 5'-инозиновой кислоты, усилена или ослаблена, или часть генов, участвующих в пути деградации 5'-инозиновой кислоты, усилена или ослаблена. Например, микроорганизм может представлять собой микроорганизм, в котором усилена экспрессия purF, кодирующего фосфорибозилпирофосфатамидотрансферазу, или ослаблена экспрессия purA, кодирующего аденилосукцинатсинтетазу, без ограничения.

В данном описании термин «микроорганизм рода Corynebacterium, продуцирующий 5'-инозиновую кислоту» относится к микроорганизму рода Corynebacterium, который обладает способностью продуцировать 5'-инозиновую кислоту от природы или в результате мутации. В частности, в данном описании микроорганизм рода Corynebacterium, обладающий способностью продуцировать 5'-инозиновую кислоту, может представлять собой микроорганизм рода Corynebacterium, обладающий улучшенной способностью продуцировать 5'-инозиновую кислоту в результате усиления или ослабления активности гена guaB, кодирующего дегидрогеназу 5'-инозиновой кислоты. Более конкретно, в данном описании микроорганизм рода Corynebacterium, обладающий способностью продуцировать 5'- инозиновую кислоту, может представлять собой микроорганизм рода Corynebacterium, обладающий улучшенной способностью продуцировать 5'-инозиновую кислоту в результате того, что он включает вариант дегидрогеназы 5'-инозиновой кислоты или кодирующий ее полинуклеотид, или в результате того, что он трансформирован вектором, включающим полинуклеотид, кодирующий вариант дегидрогеназы 5'- инозиновой кислоты. «Микроорганизм рода Corynebacterium, обладающий улучшенной способностью продуцировать 5'-инозиновую кислоту» означает микроорганизм, обладающий улучшенной способностью продуцировать 5'-инозиновую кислоту по сравнению с родительским штаммом до трансформации или немодифицированным микроорганизмом. «Немодифицированный микроорганизм» означает сам штамм дикого типа или микроорганизм, который не включает вариант белка, продуцирующего 5'-инозиновую кислоту, или микроорганизм, который не трансформирован вектором, включающим полинуклеотид, кодирующий вариант дегидрогеназы 5'-инозиновой кислоты.

В данном описании «микроорганизм рода Corynebacterium» может, в частности, представлять собой Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium ammoniagenes, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium flavum, Corynebacterium thermoaminogenes, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium stationis и так далее, но не ограничивается ими.

Еще в одном аспекте данного изобретения предложен способ получения 5'-инозиновой кислоты, включающий культивирование в среде микроорганизма рода Corynebacterium, продуцирующего 5'-инозиновую кислоту, и выделение 5'-инозиновой кислоты из микроорганизма или из среды.

В способе стадия культивирования микроорганизма может быть осуществлена известным периодическим культивированием, непрерывным культивированием, культивированием с подпиткой и так далее, но не ограничивается ими. В этой связи условия культивирования не ограничены какими-либо конкретными, однако можно доводить значения pH до оптимальных (например, от pH 5 до pH 9, в частности, от pH 6 до pH 8, и более конкретно, pH 6,8) с помощью основного соединения (например, гидроксида натрия, гидроксида калия или аммиака) или кислотного соединения (например, фосфорной кислоты или серной кислоты). Аэробные условия можно поддерживать путем добавления к культуре кислорода или кислород-содержащей газовой смеси. Температуру культивирования можно поддерживать от 20°C до 45°C, и в частности, от 25°C до 40°C, и осуществлять культивирование в течение от приблизительно 10 часов до приблизительно 160 часов, без конкретного ограничения. Продуцируемая в ходе культивирования 5'-инозиновая кислота может секретироваться в среду или оставаться внутри клеток.

Кроме того, в используемой культуральной среде в качестве источника углерода можно использовать сахара и углеводы (например, глюкозу, сахарозу, лактозу, фруктозу, мальтозу, мелассу, крахмал и целлюлозу), масла и жиры (например, соевое масло, подсолнечное масло, арахисовое масло и кокосовое масло), жирные кислоты (например, пальмитиновую кислоту, стеариновую кислоту и линолевую кислоту), спирты (например, глицерин и этанол), органические кислоты (например, уксусную кислоту) и так далее, как в отдельности, так и в смеси, однако источник углерода не ограничивается перечисленными типами. В качестве источника азота можно использовать азотсодержащее органическое соединение (например, пептон, дрожжевой экстракт, мясной экстракт, экстракт солода, кукурузный экстракт, соевую муку и мочевину) или неорганическое соединение (например, сульфат аммония, хлорид аммония, фосфат аммония, карбонат аммония и нитрат аммония) и так далее, как в отдельности, так и в смеси, однако источник азота не ограничивается перечисленными типами. В качестве источника фосфора можно использовать дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, соответствующую им натрий-содержащую соль и так далее, как в отдельности, так и в смеси, однако источник фосфора не ограничивается перечисленными типами. Среда также может содержать незаменимые способствующие росту вещества, такие как соли других металлов (например, сульфат магния или сульфат железа), аминокислоты и витамины.

Способ выделения 5'-инозиновой кислоты, продуцированной на стадии культивирования по данному изобретению, представляет собой сбор 5'-инозиновой кислоты из культуральной жидкости подходящим способом, известным в области техники, соответствующим способу культивирования. Например, можно использовать центрифугирование, фильтрацию, анионообменную хроматографию, кристаллизацию, высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) и так далее, и можно выделять требуемую 5'-инозиновую кислоту из среды или микроорганизма с помощью соответствующего способа, известного в данной области техники.

Кроме того, стадия выделения может включать процесс очистки. Процесс очистки можно осуществлять соответствующим способом, известным в данной области техники. Таким образом, выделенная 5'-инозиновая кислота может представлять собой очищенную форму или ферментированную микроорганизмом среду, включающую 5'-инозиновую кислоту (Introduction to Biotechnology and Genetic Engineering, A. J. Nair., 2008).

Далее данное изобретение будет описано более подробно в примерах. Однако, специалистам в области техники, к которой относится данное изобретение, будет очевидно, что данные Примеры приведены исключительно в иллюстративных целях и не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Получение штамма, продуцирующего ИМФ, на основе штамма дикого типа

Штамм дикого типа рода Corynebacterium не может продуцировать ИМФ или может продуцировать ИМФ в очень малом количестве. Таким образом, получали ИМФ-продуцирующий штамм на основе Corynebacterium stationis ATCC6872. Более конкретно, ИМФ-продуцирующий штамм получали путем усиления активности PurF, кодирующего фосфорибозилпирофосфатамидотрансферазу, которая является первым ферментом биосинтеза пуринов, и ослабления активности PurA, кодирующего аденилосукцинатсинтетазу в пути деградации 5'-инозиновой кислоты.

Пример 1-1. Получение штамма с усиленным purF

Для получения штамма, в котором был изменен стартовый кодон purF, сначала получали инсерционный вектор, содержащий purF. Для клонирования гена purF в инсерционный вектор, в частности, выполняли ПЦР с использованием в качестве матрицы геномной ДНК Corynebacterium stationis ATCC6872 и праймеров с последовательностями SEQ ID NO: 9 и 10 и SEQ ID NO: 11 и 12 для 30 циклов денатурации при 94°C в течение 30 сек, отжига при 55°C в течение 30 сек и удлинения при 72°C в течение 2 мин. Выполняли ПЦР с использованием в качестве матрицы двух фрагментов ДНК, полученных в ПЦР, описанной выше, и праймеров с последовательностями SEQ ID NO: 9 и 12 для 30 циклов денатурации при 94°C в течение 30 сек, отжига при 55°C в течение 30 сек и удлинения при 72°C в течение 2 мин с получением фрагмента ДНК. Полученный фрагмент ДНК расщепляли при помощи рестрикционного фермента XbaI и клонировали в вектор (pDZ (патент Кореи № 10-0924065 и международная патентная публикация № 2008-033001)), который был расщеплен тем же самым ферментом. Вектор, полученный описанным выше способом, обозначали pDZ-purF-g1a.

Рекомбинантным вектором pDZ-purF-g1a трансформировали Corynebacterium stationis ATCC6872 при помощи электропорации и затем отбирали штаммы, в которых вектор был встроен в геномную ДНК в результате гомологичной рекомбинации, на среде, содержащей 25 мг/л канамицина. Проводили повторное скрещивание отобранных таким образом первичных штаммов и затем отобранные штаммы секвенировали, тем самым отбирая необходимый штамм, в который была введена мутация, и указанный штамм обозначали ATCC6872::purF(g1a).

Пример 1-2. Получение штамма с ослабленным purA

Для получения штамма, в котором был изменен стартовый кодон purA, сначала получали инсерционный вектор, содержащий purA. Для клонирования гена purA в инсерционный вектор, в частности, выполняли ПЦР с использованием в качестве матрицы геномной ДНК Corynebacterium stationis ATCC6872 и праймеров с последовательностями SEQ ID NO: 13 и 14 и SEQ ID NO: 15 и 16. ПЦР-продукты клонировали, как описано в Примере 1-1, и полученный таким образом вектор обозначали pDZ-purA-a1t.

Рекомбинантным вектором pDZ-purA-a1t трансформировали штамм ATCC6872::purF(g1a), полученный в Примере 1-1, при помощи электропорации и затем отбирали штаммы, в которых вектор был встроен в геномную ДНК в результате гомологичной рекомбинации, на среде, содержащей 25 мг/л канамицина. Проводили повторное скрещивание отобранных таким образом первичных штаммов и затем отобранные штаммы секвенировали, тем самым отбирая необходимый штамм, в который была введена мутация.

Отобранный в результате продуцирующий ИМФ штамм на основе Corynebacterium stationis ATCC6872 дикого типа обозначали CJI2331.

Пример 1-3. Определение титра после ферментации с использованием CJI2331

2 Мл среды для посевной культуры помещали в пробирки диаметром 18 мм и автоклавировали под давлением. Инокулировали каждый из ATCC6872 и CJI2331 и инкубировали при 30°C в течение 24 ч при встряхивании для использования в качестве посевных культур. В 250 мл встряхиваемые колбы Эрленмейера наливали 29 мл среды для ферментации, автоклавировали под давлением при 121°C в течение 15 мин, инокулировали 2 мл посевной культуры и инкубировали в течение 3 суток. Устанавливали условия культивирования при скорости перемешивания 170 об/мин, температуре 30°C и pH 7,5.

После завершения культивирования определяли количество продуцированного ИМФ при помощи ВЭЖХ (SHIMAZDU LC20A), и результаты культивирования приведены в Таблице 3 ниже. Приведенные результаты свидетельствуют о том, что штамм с усиленным purF и ослабленным purA обладает способностью продуцировать

ИМФ.

Среда для посевной культуры: 1% глюкоза, 1% пептон, 1% мясной экстракт, 1% дрожжевой экстракт, 0,25% хлорид натрия, 100 мг/л аденин, 100 мг/л гуанин, pH 7,5.

Среда для ферментации: 0,1% глутамат натрия, 1% хлорид аммония, 1,2% сульфат магния, 0,01% хлорид кальция, 20 мг/л сульфат железа, 20 мг/л сульфат марганца, 20 мг/л сульфат цинка, 5 мг/л сульфат меди, 23 мг/л L-цистеин, 24 мг/л аланин, 8 мг/л никотиновая кислота, 45 мкг/л биотин, 5 мг/л гидрохлорид тиамина, 30 мг/л аденин, 1,9% фосфорная кислота (85%), 2,55% глюкоза, 1,45% фруктоза

Пример 2. Получение варианта с ослабленной дегидрогеназой 5'-инозиновой кислоты

Для выявления мутации дегидрогеназы 5'-инозиновой кислоты, которая улучшает продуцирование ИМФ, создали библиотеку мутаций guaB, который представляет собой ген, кодирующий дегидрогеназу 5'-инозиновой кислоты.

Пример 2-1. Получение вектора, содержащего guaB

Для создания библиотеки мутаций guaB сначала получали рекомбинантный вектор, содержащий guaB. Выполняли ПЦР с использованием в качестве матрицы геномной ДНК Corynebacterium stationis ATCC6872 и праймеров с последовательностями SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 18, и клонировали ПЦР-продукт в вектор pCR2.1 для E. coli с помощью набора для клонирования TOPO Cloning Kit (Invitrogen) для получения pCR-guaB.

Пример 2-2. Получение библиотек и мутаций guaB

Библиотеку мутаций guaB получали на основе вектора, полученного в Примере 2-1. Библиотеку получали с использованием набора для ПЦР пониженной точности (clontech Diversify® PCR Random Mutagenesis Kit). Проводили ПЦР в условиях, при которых могут возникать мутации, с использованием праймеров с последовательностями SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 20. В частности, в условиях, при которых на 1000 пар нуклеотидов (пн) может возникать от 0 до 3 мутаций проводили предварительный нагрев при 94°C в течение 30 сек, после чего следовали 25 циклов при 94°C в течение 30 сек и при 68°C в течение 1 мин 30 сек. Полученный таким образом ПЦР-продукт подвергали ПЦР с использованием мегапраймера (от 500 нг до 125 нг) в ходе 25 циклов при 95°C в течение 50 сек, 60°C в течение 50 сек и 68°C в течение 12 мин, и затем воздействовали DpnI и трансформировали E. coli DH5α и распределяли по поверхности твердой среды Луриа-Бертани (LB), содержащей канамицин (25 мг/л). Отбирали 20 трансформированных колоний и затем получали плазмиды, после чего анализировали их при помощи секвенирования. В результате подтвердили, что мутации введены в различные сайты с частотой 2 мутации/тысяча пар нуклеотидов (тпн). Брали приблизительно 20 000 трансформированных колоний E. coli, выделяли плазмиды и обозначали библиотеку как pTOPO-guaB-library.

Пример 2-3. Оценка полученной библиотеки и отбор штамма

Библиотекой pTOPO-guaB-library, полученной в Примере 2-2, трансформировали штамм CJI2331, полученный в Примере 1-1, при помощи электропорации и затем распределяли по поверхности питательной среды, содержащей 25 мг/л канамицина, с получением 10 000 колоний, в которые был введен мутантный ген. Каждая колония получала обозначение от CJI2331_pTOPO_guaB(mt)1 до CJI2331_pTOPO_guaB(mt)10000.

Питательная среда: 1% пептон, 1% мясной экстракт, 0,25% хлорид натрия, 1% дрожжевой экстракт, 2% агар, pH 7,2.

Каждую из полученных 10 000 колоний инокулировали в 200 мкл среды для посевной культуры, проавтоклавированной под давлением, и культивировали в 96- луночных планшетах с глубокими лунками при встряхивании со скоростью 1200 об/мин при 30°C в течение 24 ч, используя шейкер для микропланшетов (TAITEC), а затем использовали в качестве посевной культуры. В 96-луночный планшет с глубокими лунками разливали по 290 мкл среды для ферментации, проавтоклавированной под давлением, и инокулировали в нее 20 мкл каждой из посевных культур, после чего культивировали с перемешиванием при таких же условиях, как описаны выше, в течение 72 ч.

Для анализа продукции 5'-инозиновой кислоты в культуральной среде после завершения культивирования 3 мкл культуральной надосадочной жидкости переносили в 96-луночный планшет с прозрачным для УФ лучей дном (UV-plate), где в каждой лунке содержалось 197 мкл дистиллированной воды. Затем при помощи считывающего устройства для микропланшетов производили перемешивание в течение 30 сек и при помощи спектрофотометра измеряли оптическую плотность при 270 нм при температуре 25°C и сравнивали с оптической плотностью штамма CJI2331, чтобы отобрать 50 колоний мутантных штаммов, демонстрирующих увеличение оптической плотности на 10% или более. Другие колонии демонстрировали сопоставимую или пониженную оптическую плотность по сравнению с родительским штаммом.

Для повторного определения продуцируемого количества 5'-инозиновой кислоты измеряли оптическую плотность у 50 отобранных штаммов таким же образом, как описано выше. Отбирали три штамма CJI2331_pTOPO_guaB(mt)133, CJI2331_pTOPO_guaB(mt)1209 и CJI2331_pTOPO_guaB(mt)8927, демонстрировавшие выраженное улучшение продуцирования 5'-инозиновой кислоты по сравнению со штаммом CJI2331.

Пример 2-4. Обнаружение мутаций при помощи секвенирования

Для обнаружения генных мутаций в мутантных штаммах проводили ПЦР с каждым из штаммов CJI2331_pTOPO_guaB(mt)133, CJI2331_pTOPO_guaB(mt)1209 и CJI2331_pTOPO_guaB(mt)8927 с использованием праймеров SEQ ID NO: 21 и 22 с последующим секвенированием. Сравнивали их гены guaB с таковыми штамма дикого типа ATCC6872 и штамма CJI2331.

В результате обнаружили, что у всех трех штаммов ген guaB имел мутацию в различных сайтах.

В частности, подтвердили, что штамм CJI2331_pTOPO_guaB(mt)133 имеет мутацию с заменой треонина в положении 499 на изолейцин, штамм CJI2331_pTOPO_guaB(mt)1209 имеет мутацию с заменой аланина в положении 377 на треонин, и штамм CJI2331_pTOPO_guaB(mt)8927 имеет мутацию с заменой аланина в положении 377 на треонин и мутацию с заменой треонина в положении 499 на изолейцин в аминокислотной последовательности гена GuaB, представленной в SEQ ID NO: 2. Таким образом, в приведенных ниже Примерах 3 и 4 изучали, влияет ли каждая из указанных мутаций на количество ИМФ, продуцируемого микроорганизмом рода Corynebacterium.

Пример 3. Изучение продуцирования ИМФ у CJI2331

Мутации, обнаруженные в Примере 2, вводили в CJI2331, представляющий собой штамм, имеющий происхождение из ATCC6872, продуцирующий ИМФ, и изучали продуцирование ИМФ.

Пример 3-1. Получение штамма с введенной мутацией

Для введения мутаций, обнаруженных в Примере 2, создавали обратные олигонуклеотиды длиной 75 пн, содержащие соответствующие целевые мутации.

В частности, 30 мкг олигонуклеотида SEQ ID NO: 23 или 24 трансформировали штамм CJI2331 при помощи электрического импульса (Appl. Microbiol. Biothcenol., 1999,52:541-545) и добавляли 1 мл комплексной жидкой среды, с последующим культивированием при 30°C при перемешивании со скоростью 160 об/мин в течение 30 мин. Затем культуру инкубировали на льду в течение 10 мин и центрифугировали при 4°C при 4000 об/мин в течение 10 мин и удаляли надосадочную жидкость для получения клеточного осадка. Затем к нему добавляли 1 мл 10% раствора глицерина при 4°C с последующим перемешиванием. Смесь центрифугировали при 4°C и 4000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость удаляли и промывали клеточный осадок. Клеточный осадок промывали еще раз и к нему добавляли 0,1 мл 10% раствора глицерина при 4°C для подготовки клеток к последующей трансформации. Затем клетки трансформировали олигонуклеотидом с последовательностью SEQ ID NO: 23 или 24 при помощи электрического импульса и повторяли данную процедуру десять раз. Клетки распределяли по поверхности чашки со сложной агаровой средой для получения колоний (Nat. Protoc., 2014 Oct; 9(10):2301-16).

Проводили анализ полученных колоний при помощи секвенирования. В результате обнаружили, что целевые мутации были введены в штаммы. Штамм, в котором в белок, кодируемый геном guaB, была введена мутация A377T, обозначали CJI2331_guaB_m1, и штамм, в котором в тот же белок была введена мутация T499I, обозначали CJI2331_guaB_m2.

Далее, для получения мутантного штамма, включающего обе мутации A377T и T499I, 30 мкг олигонуклеотида SEQ ID NO: 24 трансформировали штамм CJI2331_guaB_m1 и получали колонии таким же способом, как описано выше (Nat. Protoc., 2014 Oct;9(10):2301-16). Анализировали полученные колонии при помощи секвенирования и отбирали штамм, в котором в белок, кодируемый геном guaB, были введены обе мутации A337T и T499I, и обозначали CJI2331_guaB_m1m2.

Пример 3-2. Изучение продуцирования ИМФ у штаммов с введенными мутациями

2 Мл среды для посевной культуры разливали по пробиркам диаметром 18 мм и автоклавировали под давлением. Инокулировали каждый из ATCC6872 и CJI2331 и инкубировали при 30°C в течение 24 ч при встряхивании для использования в качестве посевных культур. В 250 мл встряхиваемые колбы Эрленмейера наливали 29 мл среды для ферментации, автоклавировали под давлением при 121°C в течение 15 мин, инокулировали 2 мл посевной культуры и инкубировали в течение 3 суток. Устанавливали условия культивирования при перемешивании со скоростью 170 об/мин, температуре 30°C и pH 7,5.

После завершения культивирования определяли количество продуцированного ИМФ при помощи ВЭЖХ (SHIMAZDU LC20A), и результаты представлены в Таблице 7 ниже. Как показывают приведенные результаты, штамм CJI2331_guaB_m1 или CJI2331_guaB_m2, имеющий мутацию A377T или мутацию T499I в белке, кодируемом геном guaB, демонстрировали увеличение концентрации ИМФ на 0,42 г/л (на 40%) или на 0,21 г/л (на 20%), соответственно, по сравнению с родительским штаммом CJI2331. Кроме того, штамм CJI2331_guaB_m1m2, имеющий обе мутации A377T и T499I, демонстрировал наибольшее увеличение концентрации ИМФ на 0,58 г/л (на 50%), что позволяло предположить, что наиболее выраженное увеличение концентрации ИМФ может достигаться при включении обеих мутаций.

Пример 4. Изучение продуцирования ИМФ у ИМФ-продуцирующего штамма, имеющего происхождение из ATCC6872

Пример 4-1. Отбор ИМФ-продуцирующего штамма, имеющего происхождение из ATCC6872

Для получения ИМФ-продуцирующего штамма, имеющего происхождение из ATCC6872, суспендировали ATCC6872 в фосфатном буфере (pH 7,0) или цитратном буфере (pH 5,5) в концентрации от 107 клеток/мл до 108 клеток/мл и затем воздействовали ультрафиолетом (УФ) при комнатной температуре или при 32°C в течение 20-40 мин для индукции мутаций. Штамм дважды промывали 0,85% солевым раствором и распределяли по поверхности минимальной среды, содержащей 1,7% агар, в которую было добавлено вещество для придания устойчивости, в необходимой концентрации, и таким образом получали колонии. Каждую колонию культивировали в питательной среде и культивировали в среде для посевной культуры в течение 24 ч, и затем культивировали в среде для ферментации в течение 3-4 суток. В результате отбирали колонию, которая демонстрировала наилучшее продуцирование ИМФ, который накапливался в культуральной среде. Для получения штамма, продуцирующего ИМФ в высокой концентрации, при помощи вышеописанной процедуры последовательно придавали ауксотрофию по аденину, неполную ауксотрофию по гуанину, чувствительность к лизоциму, устойчивость к 3,4- дегидропролину, устойчивость к стрептомицину, устойчивость к азетидин-карбоновой кислоте, устойчивость к тиапролину, устойчивость к азасерину, устойчивость к сульфагуанидину, устойчивость к норвалину и устойчивость к триметоприму. В итоге выбрали CJI2335 с указанными видами устойчивости и превосходным продуцированием ИМФ. Сравнивали устойчивость CJI2335 относительно ATCC6872, и результаты показаны в Таблице 8 ниже.

Минимальная среда: 2% глюкоза, 0,3% сульфат натрия, 0,1% дигидрофосфат калия, 0,3% гидрофосфат калия, 0,3% сульфат магния, 10 мг/л хлорид кальция, 10 мг/л сульфат железа, 1 мг/л сульфат цинка, 3,6 мг/л хлорид марганца, 20 мг/л L-цистеин, 10 мг/л пантотенат кальция, 5 мг/л гидрохлорид тиамина, 30 мкг/л биотин, 20 мг/л аденин, 20 мг/л гуанин, pH доводили до 7,3.

Пример 4-2. Определение титра после ферментации с использованием CJI2335

2 Мл среды для посевной культуры разливали по пробиркам диаметром 18 мм и автоклавировали под давлением. Инокулировали каждый из ATCC6872 и CJI2335 и инкубировали при 30°C в течение 24 ч при встряхивании для использования в качестве посевных культур. В 250 мл встряхиваемые колбы Эрленмейера наливали 29 мл среды для ферментации, автоклавировали под давлением при 121°C в течение 15 мин, инокулировали 2 мл посевной культуры и инкубировали в течение 3 суток. Устанавливали условия культивирования при перемешивании со скоростью 170 об/мин, температуре 30°C и pH 7,5.

После завершения культивирования определяли количество продуцированного ИМФ при помощи ВЭЖХ (SHIMAZDU LC20A), и результаты представлены в Таблице 9 ниже.

Пример 4-3. Получение инсерционного вектора, содержащего мутацию guaB

Для введения в штаммы мутации, отобранной в Примере 3, получали инсерционный вектор. Вектор для введения мутации guaB получали следующим образом. Выполняли ПЦР с использованием в качестве матрицы гена guaB(A377T) штамма CJI2331_pTOPO_guaB(mt)1209 и гена guaB(T499I) штамма CJI2331_pTOPO_guaB(mt)133, отобранных в Примере 2, и праймеров с последовательностями SEQ ID NO: 25 и SEQ ID NO: 26. Проводили ПЦР посредством денатурации при 94°C в течение 5 мин, и затем 20 циклов при 94°C в течение 30 сек, при 55°C в течение 30 сек, при 72°C в течение 1 мин с последующей полимеризацией при 72°C в течение 5 мин. Каждый из полученных фрагментов гена расщепляли при помощи XbaI. Каждый из фрагментов гена, расщепленный рестрикционным ферментом XbaI, клонировали в линейый вектор pDZ с помощью лигазы T4 и таким образом получали pDZ-guaB(A377T) и pDZ-guaB(T499I).

Пример 4-4. Введение мутаций в штамм CJI2335 и оценка

Для проверки нуклеотидной последовательности гена guaB штамма CJI2335, отобранного в Примере 4-1, геномную ДНК CJI2335 амплифицировали при помощи ПЦР. В частности, сначала выполняли ПЦР с использованием в качестве матрицы хромосомной ДНК CJI2335 и праймеров с последовательностями SEQ ID NO: 21 и 22 в ходе 28 циклов полимеризации при 94°C в течение 1 мин, при 58°C в течение 30 сек и при 72°C в течение 2 мин с использованием Taq ДНК-полимеразы для амплификации guaB размером приблизительно 2,1 тпн. Проводили его секвенирование с использованием тех же праймеров, и в результате его последовательность оказалась такой же, как у гена guaB ATCC6872 дикого типа, что свидетельствовало об отсутствии мутаций в гене guaB.

CJI2335 трансформировали каждым из векторов pDZ-guaB(A377T) и pDZ-guaB(T499I), полученных в Примере 4-3, и затем отбирали штаммы, в которых вектор был встроен в геномную ДНК в результате гомологичной рекомбинации, на среде, содержащей 25 мг/л канамицина. Проводили повторное скрещивание отобранных таким образом первичных штаммов для отбора штаммов, в которых в целевой ген была введена мутация. Введение генной мутации в необходимые трансформированные штаммы исследовали при помощи ПЦР с использованием праймеров с последовательностями SEQ ID NO: 21 и SEQ ID NO: 22, и затем проводили секвенирование для подтверждения введения мутации в штаммы. В частности, штамм, в котором в белок, кодируемый геном guaB, была введена мутация A377T, обозначали CJI2335_guaB_m1, и штамм, в котором в белок, кодируемый геном guaB, была введена мутация T499I, обозначали CJI2335_guaB_m2. Далее, для получения мутантного штамма, имеющего обе мутации A377T и T499I, штамм CJI2335_guaB_m1 трансформировали вектором pDZ-guaB(T499I) и получали колонии таким же образом, как описано выше. Для анализа полученных колоний при помощи секвенирования отбирали штамм, в котором в белок, кодируемый геном guaB, были введены обе мутации A337T и T499I, и обозначали как CJI2335_guaB_m1m2.

Как показано в Таблице 12, штамм CJI2335_guaB_m1 или CJI2335_guaB_m2, имеющие мутацию A377T или мутацию T499I в белке, кодируемом геном guaB, демонстрировали увеличение концентрации ИМФ на 2,2 г/л (на 40%) или на 1,0 г/л (на 18,5%), соответственно, по сравнению с родительским штаммом CJI2335. Кроме того, штамм CJI2331_guaB_m1m2, имеющий обе мутации A377T и T499I, демонстрировал увеличение концентрации ИМФ на 2,7 г/л (на 50%), указывающее, что наиболее выраженное увеличение концентрации ИМФ может достигаться при включении обеих мутаций.

Данные результаты подтверждают, что при введении варианта дегидрогеназы 5'- инозиновой кислоты по данному изобретению в различные виды микроорганизмов рода Corynebacterium, обладающих способностью продуцировать ИМФ, можно существенно улучшить продуцирование 5'-инозиновой кислоты.

CJI2335 был депонирован в Корейском центре культур микроорганизмов 22 июня 2018, в соответствии с Будапештским договором, с присвоением ему регистрационного номера KCCM12278P. Кроме того, полученный штамм CJI2335_guaB_m1m2, также обозначенный CJI2347, был депонирован в Корейском центре культур микроорганизмов 22 июня 2018, в соответствии с Будапештским договором, с присвоением ему регистрационного номера KCCM12279P.

На основании приведенного описания специалист в данной области техники поймет, что возможны и другие частные воплощения изобретения, без изменения сущности изобретения или его существенных признаков. Таким образом, следует понимать, что приведенное выше воплощение не ограничивает объем изобретения, а является иллюстративным во всех аспектах. Объем данного изобретения определяется прилагаемой формулой изобретения, а не предшествующим описанием, и таким образом, все изменения и модификации, подпадающие под объем формулы изобретения, или их эквиваленты, считаются входящими в объем формулы изобретения.

Название международного органа по депонированию: Корейская коллекция типовых культур

Регистрационный номер: KCCM12278P Дата депонирования: 20180622

Название международного органа по депонированию: Корейская коллекция типовых культур

Регистрационный номер: KCCM12279P Дата депонирования: 20180622

ТЕХНИЧЕСКИЙ ЭФФЕКТ ИЗОБРЕТЕНИЯ

При культивировании микроорганизма рода Corynebacterium, продуцирующего 5'-инозиновую кислоту с использованием варианта дегидрогеназы 5'-инозиновой кислоты по данному изобретению, возможно получение 5'-инозиновой кислоты с высоким выходом.

--->

<110> CJ CheilJedang Corporation

<120> Novel inosine-5'-monophosphate dehydrogenase and method for producing 5'-inosine monophosphate using the same

<130> OPA18245

<150> 10-2018-0087597

<151> 2018-07-27

<160> 26

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 1521

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> нуклеотидная последовательность guaB

<400> 1

atgaccgaaa atcgtgtttc taccggtgga gatgacccaa ataaggttgc attgcatggc 60

ttgacgtttg atgacgtgct gctgctacct gccgaatcca atgttgttcc gtcggaagta 120

gacacttcgg cgcagttcac ccgcaatact cgtttaggta ttcctttggc atcggctgcg 180

atggacacgg ttactgaggc gcgcatggct attgccatgg cacgccaggg tggcattggt 240

gtcttgcacc gcaacttgtc ctcgcaagag caggcggagc aggtcgaaat cgtcaagcgc 300

tctgagtccg gcatggtcac cgaccctgtg accgcgaatc cagacatgac tatccaggaa 360

gttgatgacc tgtgtgcacg cttccgcatc tctggtcttc ctgtggtcaa cgaagacggc 420

accttgttgg gcatttgcac caaccgcgat atgcgctttg agcgcgacta ttcccgcaag 480

gtttctgaca tcatgaccgc tatgccgctg gttgtggcaa aagaaggcgt cagcaaggaa 540

gaagccctgg atctgctgtc gacgaacaag gtagaaaagc tacctatcgt tgataaaaac 600

aacaagctgg tcggtctgat taccgttaaa gactttgtta agaccgaaca gttcccgaat 660

tcctccaagg atgcttcggg ccgcttgcta gtagcagcag gtattggtac cggcgaggag 720

tcttatgagc gtgcaggctt gcttgtcgat gccggcgtgg acgttctcat tgtcgactcc 780

gcacacgcgc acaataaccg cgtgctggaa atggtctcgc gcgtcaagaa tgacttcggc 840

tccaagattg atgttgtcgg cggcaacctg gcaacacgct cggcagcaaa ggcgatgatt 900

gaggctggcg cagacgccat caaggtgggt attggtcctg gttctatctg caccacccgt 960

gtggttgctg gtgttggtgc accacagatt accgcgatca tggaagcagc taccgtggct 1020

tctgctgcgg gcgtgccttt gattgcagac ggcggcatgc agtactccgg tgacgttgct 1080

aaggctttgg ctgctggcgc ggactcggtc atgctgggct cgatgttcgc aggcaccctg 1140

gaggctcctg gtgacatcgt gattgtcggc ggcaagcagt acaagcgcta ccgcggcatg 1200

ggttcgatgg gcgctatgca aggccgtggc ctctccggcg agaagcgttc ttactccaag 1260

gaccgctact tccaggcaga tgtgcgcagc gaagataagc tggttccaga aggcgtggaa 1320

ggcaaggttc cttaccgcgg cgaaattggt cagattaccc accagattgt gggcggtttg 1380

cgcgcggcaa tgggctacac tggctccgct actattgaag agctgaagac caagcagttc 1440

gtgcgtatta ccactgctgg cttggctgag tcgcacccgc accacctgca gcaaactgta 1500

gaagctccga actaccgtta a 1521

<210> 2

<211> 506

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<223> аминокислотная последовательность guaB

<400> 2

Met Thr Glu Asn Arg Val Ser Thr Gly Gly Asp Asp Pro Asn Lys Val

1 5 10 15

Ala Leu His Gly Leu Thr Phe Asp Asp Val Leu Leu Leu Pro Ala Glu

20 25 30

Ser Asn Val Val Pro Ser Glu Val Asp Thr Ser Ala Gln Phe Thr Arg

35 40 45

Asn Thr Arg Leu Gly Ile Pro Leu Ala Ser Ala Ala Met Asp Thr Val

50 55 60

Thr Glu Ala Arg Met Ala Ile Ala Met Ala Arg Gln Gly Gly Ile Gly

65 70 75 80

Val Leu His Arg Asn Leu Ser Ser Gln Glu Gln Ala Glu Gln Val Glu

85 90 95

Ile Val Lys Arg Ser Glu Ser Gly Met Val Thr Asp Pro Val Thr Ala

100 105 110

Asn Pro Asp Met Thr Ile Gln Glu Val Asp Asp Leu Cys Ala Arg Phe

115 120 125

Arg Ile Ser Gly Leu Pro Val Val Asn Glu Asp Gly Thr Leu Leu Gly

130 135 140

Ile Cys Thr Asn Arg Asp Met Arg Phe Glu Arg Asp Tyr Ser Arg Lys

145 150 155 160

Val Ser Asp Ile Met Thr Ala Met Pro Leu Val Val Ala Lys Glu Gly

165 170 175

Val Ser Lys Glu Glu Ala Leu Asp Leu Leu Ser Thr Asn Lys Val Glu

180 185 190

Lys Leu Pro Ile Val Asp Lys Asn Asn Lys Leu Val Gly Leu Ile Thr

195 200 205

Val Lys Asp Phe Val Lys Thr Glu Gln Phe Pro Asn Ser Ser Lys Asp

210 215 220

Ala Ser Gly Arg Leu Leu Val Ala Ala Gly Ile Gly Thr Gly Glu Glu

225 230 235 240

Ser Tyr Glu Arg Ala Gly Leu Leu Val Asp Ala Gly Val Asp Val Leu

245 250 255

Ile Val Asp Ser Ala His Ala His Asn Asn Arg Val Leu Glu Met Val

260 265 270

Ser Arg Val Lys Asn Asp Phe Gly Ser Lys Ile Asp Val Val Gly Gly

275 280 285

Asn Leu Ala Thr Arg Ser Ala Ala Lys Ala Met Ile Glu Ala Gly Ala

290 295 300

Asp Ala Ile Lys Val Gly Ile Gly Pro Gly Ser Ile Cys Thr Thr Arg

305 310 315 320

Val Val Ala Gly Val Gly Ala Pro Gln Ile Thr Ala Ile Met Glu Ala

325 330 335

Ala Thr Val Ala Ser Ala Ala Gly Val Pro Leu Ile Ala Asp Gly Gly

340 345 350

Met Gln Tyr Ser Gly Asp Val Ala Lys Ala Leu Ala Ala Gly Ala Asp

355 360 365

Ser Val Met Leu Gly Ser Met Phe Ala Gly Thr Leu Glu Ala Pro Gly

370 375 380

Asp Ile Val Ile Val Gly Gly Lys Gln Tyr Lys Arg Tyr Arg Gly Met

385 390 395 400

Gly Ser Met Gly Ala Met Gln Gly Arg Gly Leu Ser Gly Glu Lys Arg

405 410 415

Ser Tyr Ser Lys Asp Arg Tyr Phe Gln Ala Asp Val Arg Ser Glu Asp

420 425 430

Lys Leu Val Pro Glu Gly Val Glu Gly Lys Val Pro Tyr Arg Gly Glu

435 440 445

Ile Gly Gln Ile Thr His Gln Ile Val Gly Gly Leu Arg Ala Ala Met

450 455 460

Gly Tyr Thr Gly Ser Ala Thr Ile Glu Glu Leu Lys Thr Lys Gln Phe

465 470 475 480

Val Arg Ile Thr Thr Ala Gly Leu Ala Glu Ser His Pro His His Leu

485 490 495

Gln Gln Thr Val Glu Ala Pro Asn Tyr Arg

500 505

<210> 3

<211> 1521

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> нуклеотидная последовательность guaB (A377T)

<400> 3