Способ анализа терминальных мутаций в генах brca1, brca2, atm и palb2 с использованием мультиплексной пцр и последующей гибридизацией с олигонуклеотидным биологическим микрочипом (биочипом)

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и представляет собой способ определения терминальных мутаций в генах BRCA1, BRCA2, ATM и PALB2, с помощью технологии мультиплексной ПЦР и последующей гибридизацией с олигонуклеотидным биологическим микрочипом (биочипом). Изобретение обеспечивает возможность определения 23 терминальных мутаций: в гене BRCA2 (NM_000059.3): c.752_753insAG (p.T251fs), с. 1010_1011insTG (p.Asn337fs), c.2808_2811delACAA (p.Ala938Profs), c.5286T>G (p.Tyr1762Ter), c.5586delG (p.Val1862fs), 5722_5723delCT (p.Leu1908Argfs), c.5946delT (p.Ser1982Argfs), C.6070C>T (p.Gln2024Ter), c.6298C>T (p.Gln2100Ter), c.7879A>T (p.Ile2627Phe), c.6997_6998insT (p.Pro2334Thrfs); в гене ATM(NM_000051.3): c.5932G>T (p.Glu1978Ter); в гене PALB2 (NM_024675.3): c.172_175delTTGT (p.Gln60Argfs), 509_510delGA (p.R170Ilefs); в гене BRCA1 (NM_007294.3): c.68_69delAG (p.Glu23Valfs), c.181T>G (p.Cys61Gly), c.5266dup (p.Gln1756Profs*74), c.3700_3704delGTAAA (p.Val1234Glnfs), c.3756_3759delGTCT (p.Ser1253Argfs), c.4035delA (p.Glu1346Lysfs), c.5161C>T (p.Gln1721Ter), c.5251C>T (p.Arg1751Ter), c.1961delA (p.Lys654Serfs). Диагностика мутаций позволяет установить с определенной долей вероятности эффективность и целесообразность лечения пациентов препаратами платины и PARB-ингибиторами. Изобретение позволяет провести анализ в короткий срок и с небольшими материальными затратами. 2 з.п. ф-лы, 2 ил., 2 пр.

 

Способ анализа терминальных мутаций в генах BRCA1, BRCA2, ATM и PALB2 с использованием мультиплексной ПЦР и последующей гибридизацией с олигонуклеотидным биологическим микрочипом (биочипом).

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области генетики, молекулярной биологии и медицины и обеспечивает способ идентификации с помощью мультиплексной ПЦР и последующей гибридизацией с олигонуклеотидным биологическим микрочипом (биочипом) терминальных мутаций в генах BRCA1, BRCA2, ATM и PALB2, влияющих на чувствительности рака поджелудочной железы к терапии препаратами платины и PARB-ингибиторам.

Уровень техники

Известно большое количество способов определения терминальных мутаций, в которых используются различные инструменты для анализа уникальной нуклеотидной последовательности ДНК человека. Условно среди них можно выделить шесть групп:

Ферментативные методы:

анализ полиморфизма длин амплифицированных фрагментов (AFLP);

анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (RFLP);

расщепление клевазой (CFLP);

расщепление резольвазой (EMD);

анализ, основанный на лигазной реакции (LDR, LCR);

ПЦР с прямой терминацией синтеза (DT-PCR);

аллель-специфическая ПЦР (AS-PCR, PCR-SSP);

ПЦР в реальном времени с использованием TaqMan проб;

секвенирование по Сенгеру;

высокопроизводительное секвенирование (NGS).

Химические методы:

химическое расщепление гетеродуплексов;

химическое лигирование.

Методы, основанные на различной электрофоретической подвижности полиморфных участков ДНК:

анализ конформации одноцепочечных фрагментов (SSCP);

гетеродуплексный анализ (НА);

конформационно-чувствительный гель-электрофорез (CSGE);

разделение продуктов амплификации посредством капиллярного электрофореза.

Детекция на твердой фазе:

гибридизация на олигонуклеотидных матрицах;

оптико-волоконный ДНК-гибридизационный анализ;

элонгация иммобилизованных праймеров (минисеквенирование);

пиросеквенирование.

Хроматографические методы:

высокоэффективная жидкостная хроматография (HPLC);

денатурирующая высокоэффективная жидкостная хроматография (DHPLC).

Физические методы:

масс-спектрометрия;

резонансное тушение флуоресценции (FRET)

люминесценция, зависящая от локального окружения;

анализ кривых плавления высокого разрешения (HRM).

Наиболее распространенными из представленных методов являются:

1. Секвенирование по Сенгеру

Hereditary pancreatic cancer: a retrospective single-center study of 5143 Italian families with history of BRCA-related malignancies / A. Toss, M. Venturelli, E. Molinaro [et al.] // Cancers (Basel). - 2019. - Vol. 11(2). - pii: E193. doi: 10.3390/cancers11020193.

Screening for common mutations in BRCA1 and BRCA2 genes: interest in genetic testing of Tunisian families with breast and/or ovarian cancer / A. Fourati, M.M. Louchez, J. Fournier, [et al.] // Bulletin du Cancer. - 2014. - Vol. 101(11). - E. 36-40. doi: 10.1684/bdc.2014.2049.

Identification of BRCA1/2 founder mutations in Southern Chinese breast cancer patients using gene sequencing and high resolution DNA melting analysis / A. Kwong, E.K. Ng, C.L. Wong [et al.] // PLoS One. - 2012. - Vol. 7(9). - e43994. doi: 10.1371/journal.pone.0043994.

Germline mutations in the PALB2 gene are population specific and occur with low frequencies in familial breast cancer / H. Hellebrand, C. Sutter, E. Honisch [et al.] // Human Mutation. - 2011. -Vol. 32(6). - E. 2176-88. doi: 10.1002/humu.21478.

PALB2 mutations in European familial pancreatic cancer families / E.P. Slater, P. Langer, E. Niemczyk [et al.] // Clinical Genetics. - 2010. - Vol. 78(5). - P. 490-494. doi: 10.1111/j.1399-0004.2010.01425.x.

Contribution of inherited mutations in the BRCA2-interacting protein PALB2 to familial breast cancer / S. Casadei, B.M. Norquist, T. Walsh [et al.] // Cancer Research. - 2011. - Vol. 71(6). - P. 2222-2229. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-10-3958.

A novel germline PALB2 deletion in Polish breast and ovarian cancer patients / A. Dansonka-Mieszkowska, A. Kluska, J. Moes [et al.] // BMC Medical Genetics. - 2010. - Vol. 11. - 20. doi: 10.1186/1471-2350-11-20.

2. Анализ конформации одноцепочечных фрагментов ДНК (SSCP)

A comparison of BRCA1 mutation analysis by direct sequencing, SSCP and DHPLC / E. Gross, N. Arnold, J. Goette, [et al] // Human Genetics. - 1999. - Vol. 105(1-2). - P. 72-78.

A novel germline PALB2 deletion in Polish breast and ovarian cancer patients / A. Dansonka-Mieszkowska, A. Kluska, J. Moes [et al.] // BMC Medical Genetics. - 2010. - Vol. 11. - 20. doi: 10.1186/1471-2350-11-20.

New mutations, polymorphisms, and rare variants in the ATM gene detected by a novel SSCP strategy / S. , S. Sheikhavandi, M. Telatar [et al.] / Human Mutation. - 1999. - Vol. 14(2). - P. 156-162.

3. Аллель-специфичная ПЦР (AS-PCR)

Identification of a recurrent BRCA1 mutation in two breast/ovarian cancer predisposition families with distinct phenotypes, by using allele-specific multiplex-PCR / L. Negura, E. Carasevici, A. Negura [et al.] // Revista Romana de Medicina de Laborator. - 2010. - Vol. 18. - P. 53-61.

Germ-line BRCA1 mutations in Jewish and non-Jewish women with early-onset breast cancer / M.G. FitzGerald, D.J. MacDonald, M. Kramer [et al.] // The New England Journal of Medicine. - 1996. - Vol. 334(3). - P. 143-149.

Simple and rapid detection of BRCA1 and BRCA2 mutations by multiplex mutagenically separated PCR / P.C. Chan, B.Y. Wong, H. Ozcelik, D.E. Cole // Clinical Chemistry. - 1999. - Vol. 45(8 Pt 1). - P. 1285-1287.

4. Сравнительная геномная гибридизация

Comparative genomic hybridization profiles in human BRCA1 and BRCA2 breast tumors highlight differential sets of genomic aberrations / E.H. van Beers, T. van Welsem, L.F. Wessels [et al.] // Cancer Research. - 2005. - Vol. 65(3). - P. 822-827.

5. Анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (RFLP)

BRCA1/2 mutation screening in high-risk breast/ovarian cancer families and sporadic cancer patient surveilling for hidden high-risk families / D. Berzina, M. Nakazawa-Miklasevica, J. Zestkova [et al.] // BMC Medical Genetics. - 2013. - Vol. 14. - 61. doi: 10.1186/1471-2350-14-61.

Allelic variants of breast cancer susceptibility genes PALB2 and RECQL in the Latvian population / P. Hilz, R. Heinrihsone, L.A. Patzold [et al.] // Hereditary Cancer in Clinical Practice.-2019. - Vol. 17. - 17. doi: 10.1186/s13053-019-0116-6.

6. Конформационно-чувствительный гель-электрофорез (CSGE)

Detection of BRCA1 and BRCA2 mutations in breast cancer families by a comprehensive two-stage screening procedure / E. Spitzer, M.R. Abbaszadegan, F. Schmidt [et al.] // International Journal of Cancer. - 2000. - Vol. 85(4). - P. 474-481.

7. Анализ кривых плавления высокого разрешения

Identification of BRCA1/2 founder mutations in Southern Chinese breast cancer patients using gene sequencing and high resolution DNA melting analysis / A. Kwong, E.K. Ng, C.L. Wong [et al.] // PLoS One. - 2012. - Vol. 7(9). - e43994. doi: 10.1371/journal.pone.0043994.

PALB2 mutations in German and Russian patients with bilateral breast cancer / N. Bogdanova, A.P. Sokolenko, A.G. Iyevleva [et al.] // Breast Cancer Research and Treatment. - 2011. - Vol. 126(2). - P. 545-550. doi: 10.1007/s10549-010-1290-4.

Germline mutations in the PALB2 gene are population specific and occur with low frequencies in familial breast cancer / H. Hellebrand, C. Sutter, E. Honisch [et al.] // Human Mutation. - 2011. - Vol. 32(6). - E2176-88. doi: 10.1002/humu.21478.

8. Гибридизация на олигонуклеотидных матрицах (биологических микрочипах).

Анализ точечных мутаций в гене BRCA1 методом гибридизации с гидрогелевыми микрочипами / О.Е. Федорова, О.Н. Синицка, Л.П. Тихомирова [и др.] // Молекулярная биология. - 2006. - Том 40. - №1. - С. 31-36.

9. ПЦР в реальном времени с использованием TaqMan проб

Detection of BRCA1 and BRCA2 mutations in breast cancer families by a comprehensive two-stage screening procedure / E. Spitzer, M.R. Abbaszadegan, F. Schmidt [et al.] // International Journal of Cancer. - 2000. - Vol. 85(4). - P. 474-481.

Contribution of inherited mutations in the BRCA2-interacting protein PALB2 to familial breast cancer / S. Casadei, B.M. Norquist, T. Walsh [et al.] // Cancer Research. - 2011. - Vol. 71(6). - P. 2222-2229. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-10-3958.

10. Денатурирующая высокоэффективная жидкостная хроматография (DHPLC).

A comparison of BRCA1 mutation analysis by direct sequencing, SSCP and DHPLC / E. Gross, N. Arnold, J. Goette [et al.] // Human Genetics. - 1999. - Vol. 105(1-2). - P. 72-78.

11. Высокопроизводительное секвенирование (next generation sequencing, NGS)

Hereditary pancreatic cancer: a retrospective single-center study of 5143 Italian families with history of BRCA-related malignancies / A. Toss, M. Venturelli, E. Molinaro [et al.] // Cancers (Basel). - 2019. - Vol. 11(2). - pii: E193. doi: 10.3390/cancers11020193.

Multiple rare variants in high-risk pancreatic cancer-related genes may increase risk for pancreatic cancer in a subset of patients with and without germline CDKN2A mutations / X.R. Yang, M. Rotunno, Y. Xiao [et al.] // Human Genetics. - 2016. - Vol. 135(11). - P. 1241-1249.

Breast cancer patients suggestive of Li-Fraumeni syndrome: mutational spectrum, candidate genes, and unexplained heredity / J. Penkert, G. Schmidt, W. Hofmann [et al.]. // Breast Cancer Research. -2018. - Vol. 20(1). - 87. doi: 10.1186/s13058-018-1011-1.

Mutation Analysis of BRCA1, BRCA2, PALB2 and BRD7 in a Hospital-Based Series of German Patients with Triple-Negative Breast Cancer / F. Pern, N. Bogdanova, P. Schurmann [et al.]//PLoS One. - 2012. - Vol. 7(10). - e47993. doi: 10.1371/journal.pone.0047993.

Deleterious germline mutations in patients with apparently sporadic pancreatic adenocarcinoma / K. Shindo, J. Yu, M. Suenaga [et al.] // Journal of Clinical Oncology. -2017. - Vol.35(30). - P. 3382-3390. doi: 10.1200/JCO.2017.72.3502.

Prevalence of germline mutations in cancer genes among pancreatic cancer patients with positive family history / K.G. Chaffee, A.L. Oberg, R.R. McWilliams [et al.] // Genetics in Medicine.-2018. - Vol. 20(1). - P. 119-127. doi:10.1038/gim.2017.85.

Prospective Evaluation of Germline Alterations in Patients With Exocrine Pancreatic Neoplasms / M.A. Lowery, W. Wong, E.J. Jordan [et al.] // Journal of the National Cancer Institute.-2018. - Vol. 110(10). - P. 1067-1074. doi: 10.1093/jnci/djy024.

Метод 1 широко распространен и является достаточно информативным. Он предоставляет полную информацию о последовательности ДНК в исследуемом локусе и позволяет определять мутации de novo. Однако он отличается низкой производительностью. При анализе большого количества локусов он требует постановки отдельной реакции амплификации/очистки/секвенирования для каждого локуса индивидуально, что сказывается на его трудоемкости и стоимости анализа.

Метод 2 сложен в исполнении и трактовке результатов, дает лишь косвенную информацию о нуклеотидной последовательности и не подлежит автоматизации.

Метод 3 распространен достаточно широко, однако требует постановки независимых параллельных ПЦР-реакций, соответствующих количеству анализируемых однонуклеотидных замен, что снижает его ценность для широкомасштабного генотипирования.

Метод 4 может быть использован в научных целях, но требует высокой квалификации персонала и дорогостоящего оборудования, что препятствует его внедрению в рутинную лабораторную диагностику.

Методы 5-6 в классическом виде также требуют постановки нескольких независимых реакций по числу анализируемых локусов. Для метода 5 после проведения реакции амплификации требуется постановка рестрикции, а затем проводится электрофоретическое разделение продуктов рестрикции. Если для каждого пациента необходимо исследование нескольких локусов, то метод становится трудоемким, а использование различных рестриктаз негативно сказывается на его стоимости. Он был одним из основных методов выявления терминальных мутаций и полиморфизмов в начале 2000-х, однако в настоящее время уступает по распространенности более удобным методам анализа. Метод 6 также требует постановки параллельных реакций при анализе нескольких локусов у пациента и дает лишь косвенное представление о нуклеотидной последовательности анализируемых локусов. Он позволяет выявить только факт наличия/отсутствия мутации в образце, но не дает информации о ее нуклеотидной последовательности. Методы 5 и 6 имеют небольшой потенциал для мультиплексирования, однако он ограничивается 2-4 локусами.

Метод 7 широко используется для анализа терминальных мутаций, в том числе однонуклеотидных замен, однако он имеет ряд существенных ограничений. Данный метод требует постановки параллельных реакций по числу анализируемых локусов, каждый амплифицируемый локус должен быть довольно коротким, чтоб изменение одного нуклеотида в последовательности вносило существенный вклад в изменение кривой плавления высокого разрешения. Данный метод дает косвенное представление о нуклеотидной последовательности, и для ее установления необходимо проведение дополнительного анализа, например, секвенирования по Сенгеру. При анализе конкретных мутаций на картину кривой плавления влияют полиморфизмы и другие мутации, локализованные в анализируемом локусе, что может приводить к затруднениям в интерпретации результатов анализа.

Основанный на гибридизации метод 8 используется в высокопроизводительных платформах на основе биологических микрочипов. В технологии биологических микрочипов GeneChip (Affymetrix, США), используются аллель-специфичные зонды длиной 25 нуклеотидов, которые синтезируются непосредственно на подложке методом фотолитографии. Целевые локусы генов, несущие однонуклеотидные замены (полиморфизмы и мутации), амплифицируются посредством ПЦР, расщепляются на более короткие фрагменты, метятся биотиновыми метками и гибридизуются на микрочипе. Визуализация результатов гибридизации осуществляется посредством флуоресцентного маркирования красителем со стрептавидином. На каждом микрочипе может быть расположено несколько миллионов различных олигонуклеотидных зондов, что позволяет определять 10⁴-10⁵ однонуклеотидных замен в рамках одного анализа [Genotyping over 100,000 SNPs on a pair of oligonucleotide arrays / H. Matsuzaki, S. Dong, H. Loi, [et al] // Nat Methods. - 2004. - Vol. 1 (2). - P. 109-111]. Недостатком данного метода является сложность интерпретации полученных флуоресцентных изображений и высокая стоимость расходных материалов, что ограничивает применение данного метода в клинической практике.

Альтернативный подход с использованием олигонуклеотидных микрочипов представлен применением микрочипов низкой плотности, которые могут отличаться способом нанесения олигонуклеотидов на подложку, типом подложки и процедурой детекции результатов гибридизации. Одним из вариантов методов, относящихся к этой группе, является двухстадийная мультиплексная ПЦР с последующей гибридизацией продуктов ПЦР на гидрогелевых микрочипах низкой плотности. На первой стадии проводится ПЦР с равными концентрациями прямого и обратного праймеров для наработки фрагментов генов, несущих анализируемые мутации. На второй стадии в качестве матрицы для ПЦР используется продукт первого этапа. Для наработки одноцепочечных фрагментов ДНК, необходимых для гибридизации, в реакции используется асимметричная ПЦР, выполняемая за счет неравных концентраций прямого и обратного праймеров, причем обратный праймер, который добавляется в избытке мечен флуоресцентным красителем. Гибридизацию одноцепочечного фрагмента ДНК проводят на гидрогелевых микрочипах. Гидрогелевые микрочипы представляют собой пластиковые подложки с иммобилизованными ячейками гидрогеля. В каждой ячейке ковалентно закреплены специфические олигонуклеотидные зонды, с которыми и гибридизуются продукты второй стадии ПЦР. [Анализ точечных мутаций в гене BRCA1 методом гибридизации с гидрогелевыми микрочипами / О.Е. Федорова, О.Н. Синицка, Л.П. Тихомирова [и др.] // Молекулярная биология. - 2006. - Том 40. - №1. - С. 31-36]. Представленный метод является ближайшим аналогом, уступающим по диагностическим характеристикам, и прототипом предлагаемого в данном изобретении способа. К преимуществам вышеописанного метода относятся: невысокая цена расходных материалов, относительная простота проведения анализа и интерпретации результатов. Основным недостатком - малое (по сравнению с предлагаемым способом) количество одновременно идентифицируемых мутаций в меньшем количестве генов и более трудоемкий процесс амплификации, состоящий из двух последовательных реакций амплификации. Предлагаемый в настоящем изобретении способ обеспечивает мультиплексный анализ 23 терминальных мутаций в генах BRCA1, BRCA2, ATM и PALB2 в один этап амплификации, что делает его более удобным и перспективным для использования в клинико-лабораторной диагностике.

Метод 9 может быть использован для анализа терминальных мутаций, однако он имеет ограничения по мультиплексности анализа: в одной реакции возможна идентификация нескольких локусов, однако их количество весьма ограничено, прежде всего числом каналов детекции в используемом приборе для ПЦР в реальном времени.

Метод 10 может быть использован для анализа терминальных мутаций, однако он требует дорогостоящего оборудования и высокой квалификации персонала.

Метод 11 является наиболее перспективным для проведения одновременного генотипирования большого количество генетических локусов с высокой аналитической чувствительностью. Однако из-за высокой стоимости оборудования, расходных материалов и необходимости высокой квалификации персонала его применение в рутинной лабораторной диагностике ограничено.

Кроме указанной выше литературы в настоящее время имеется ряд патентов и заявок на патенты, описывающих различные способы обнаружения терминальных мутаций в одном или нескольких генах из списка (предполагаемых к анализу предлагаемым способом): в гене BRCA2 (NM_000059.3): c.752_753insAG (p.T251fs), с.1010_1011insTG (p.Asn337fs), c.2808_2811delACAA (p.Ala938Profs), c.5286T>G (p.Tyr1762Ter), c.5586delG (p.Val1862fs), 5722_5723delCT (p.Leu1908Argfs), c.5946delT (p.Ser1982Argfs), C.6070C>T (p.Gln2024Ter), c.6298C>T (p.Gln2100Ter), c.7879A>T (p.Ile2627Phe), c.6997_6998insT (p.Pro2334Thrfs); в гене ATM (NM_000051.3): c.5932G>T (p.Glu1978Ter); в гене PALB2 (NM_024675.3): c.172_175delTTGT (p.Gln60Argfs), 509_510delGA (p.R170Ilefs); в гене BRCA1 (NM_007294.3): c.68_69delAG (p.Glu23Valfs), c.181T>G (p.Cys61Gly), c.5266dup (p.Gln1756Profs*74), c.3700_3704delGTAAA (p.Val1234Glnfs), c.3756_3759delGTCT (p.Ser1253Argfs), c.4035delA (p.Glu1346Lysfs), C.5161C>T (p.Gln1721Ter), c.5251C>T (p.Arg1751Ter), c.1961delA (p.Lys654Serfs).

Существующие в настоящее время патенты, как правило описывают методы анализа мутаций в одном из генов BRCA1, BRCA2, ATM или PALB2, а не охватывают их все.

В российском патенте RU 2473700 С2 описан способ выявления мутации 5382insC в гене BRCA1, также известной как c.5266dup (исторически сложилось так, что одна и та же мутация может иметь несколько альтернативных названий, особенно это характерно для генов BRCA1/2, они указаны далее в табл. 1) в геномной ДНК с помощью аллель-специфической полимеразной цепной реакции в режиме реального времени на пулированной ДНК, отличающийся тем, что пулы ДНК формируют из индивидуальных образцов ДНК различной концентрации.

В российском патенте RU 2445368 С2 описан способ выявления только одной мутации 5382insC в гене BRCA1 снованный на использовании аллель-специфичных праймеров с регистрацией результатов ПЦР в реальном времени, характеризующийся тем, что используются праймеры, отличающиеся для каждого аллеля, общий для двух аллелей праймер и общий флуоресцентный зонд.

В российском патенте RU 2445369 С2 описан способ определения генотипа человека по мутации 185delAG (также известна как c.68_69delAG) гена BRCA1, основанный на использовании аллель-специфичных праймеров с регистрацией результатов ПЦР в реальном времени, характеризующийся тем, что используются праймеры, отличающиеся для каждого аллеля, общий для двух аллелей праймер и общий флуоресцентный зонд.

Изобретение, описанное в патенте RU 2445372 С1, может быть использовано для определения генотипа человека по мутации 6174delT (также известна как c.5946delT) гена BRCA2. Способ, как и два вышеописанных патента RU 2445368 С2 и RU 2445369 С2, заключается в использовании аллель-специфичных праймеров с регистрацией результатов ПЦР в режиме реального времени с использованием флуоресцентно-меченых проб. Реакционная смесь включает праймеры, отличающиеся для каждого аллеля, и общие для двух аллелей праймер и пробу, а также общий флуоресцентный зонд.

Очевидным существенным недостатком вышеперечисленных способов является возможность обнаружения только одной мутации.

Изобретение, описанное в российском патенте RU 2440415 С1 описывает набор синтетических олигонуклеотидов для осуществления генетического скрининга мутаций гена BRCA1. Выявляют мутации путем определения полной нуклеотидной последовательности кодирующей части гена BRCA1. Осуществляют амплификацию кодирующей части гена BRCA1 с помощью 28 пар синтетических олигонуклеотидов с последующим секвенированием полученных продуктов амплификации.

В патенте US 20030235819 A1 описываются способы идентификации мутаций в гене BRCA1, приводящих к образованию стоп-кодонов. Методы анализа в том числе включают олигонуклеотиды, которые специфически гибридизуются с кодонами в анализируемой последовательности, которые приводят к терминации синтеза белка.

К недостаткам вышеперечисленных патентов относится возможность обнаружения мутаций только в одном гене.

Существует несколько патентов и заявок на патенты, описывающих методы одновременного обнаружения нескольких мутаций в разных генах:

В российском патенте RU 2612894 С1 описан способ определения последовательностей экзонов генов BRCA1 и BRCA2 с помощью высокопроизводительного секвенирования. Способ включает в себя два раунда амплификации экзонов с сайтами сплайсинга генов BRCA1 и BRCA2, секвенирование пулированГной ДНК после амплификации с помощью MiSeq Illumina и анализ данных. Патент содержит набор праймеров для 86 моноплексных реакций амплификаций целевых фрагментов данных генов, которые могут быть использованы в пробоподготовке для NGS. Данные наборы праймеров полностью охватывают кодирующие последовательности генов BRCA1 и BRCA2. однако процесс трудоемок и требует высокой квалификации персонала.

Изобретение CN 105779636 А описывает набор праймеров, предназначенных для амплификации кодирующих участков генов BRCA1 и BRCA2 для последующего анализа полученных фрагментов с помощью высокопроизводительного секвенирования.

Изобретение CN 104694663 А описывает набор праймеров, предназначенных для амплификации экзонных и некоторых интронных областей генов BRCA1 и BRCA2 для последующего анализа полученных фрагментов с помощью высокопроизводительного секвенирования.

К недостаткам патентов RU 2612894 C1, CN 104694663 A, CN 105779636 А, можно отнести необходимость использования дорогостоящего оборудования и высокой квалификации персонала.

Патент US 9725759 В2 описывает среди прочих метод анализа мутаций в генах BRCA1 (185delAG, 5382insC) и BRCA2 (6174delT). Метод основан на проведении мультиплексной амплификации целевых участков генов, затем осуществляется лигазная реакция с аллель-специфичными праймерами, которые несут флуоресцентные метки (один тип метки для праймеров, соответствующих последовательности дикого типа, другой - для праймеров, соответствующих мутации). Наличие мутации оценивают с помощью гибридизации с олигонуклеотидами, иммобилизованными на подложке или посредством капилярного электрофореза.

Патент WO 2015089333 А1 описывает способ анализа мутаций в том числе в генах BRCA1 (185delAG, 5382insC) и BRCA2 (6174delT). Метод основан на получении циклических полинуклеотидов, включающих последовательность целевых участков, их последующего анализа, например, секвенированием и интерпретации результатов посредством сравнения с референсной последовательностью.

К недостаткам патентов US 9725759 В2 и WO 2015089333 А1 можно отнести то, что они описываю анализ только трех мутаций из перечня мутаций, который предлагает анализировать настоящее изобретение.

Патент ЕР 3447154 А1 описывает изобретение, в котором описывается метод обнаружения мутаций в трех генах, в том числе в BRCA1 и BRCA2 с помощью матрицы с технологией DNA IMAGING.

В патенте WO 2016154584 А1 описан алгоритм анализа данных, полученных с помощью высокопроизводительного секвенирования с целью поиска мутаций.

Как видно выше, в настоящее время существуют патенты и научные статьи, описывающих возможность анализа мутаций в каком-либо из генов BRCA1, BRCA2, ATM или PALB2, однако нет источников, описывающих простой и надежный способ одновременного анализа всех 23 представленных в настоящем изобретении клинически-значимых мутаций в этих генах. Поскольку все имеющиеся в настоящее время методы определения терминальных мутаций в генах BRCA1, BRCA2, ATM пли PALB2 обладают теми или иными недостатками, существует реальная потребность в создании выгодно отличающегося от известных решений простотой проведения анализа и низкой стоимостью метода для выявления терминальных мутаций, ассоциированных с чувствительностью рака поджелудочной железы к препаратам платины или PARB-ингибиторам, с целью дальнейшего внедрения в любую стандартную клиническую лабораторию.

Такой способ обеспечивается настоящим изобретением.

Раскрытие изобретения

Сущность изобретения заключается в обеспечении способа определения терминальных мутаций в генах BRCA1, BRCA2, ATM и PALB2, влияющих на чувствительность рака поджелудочной железы к терапии препаратами платины и PARB-ингибиторами. Данный способ позволяет проводить детекцию терминальных мутаций, перечень которых представлен в таблице 1.

Рак поджелудочной железы занимает 12 место по частоте встречаемости среди всех онкологических заболеваний, ежегодно регистрируется более 400000 новых случаев [Global, regional, and national cancer incidence, mortality, years of life lost, years lived with disability, and disability-adjusted life-years for 32 cancer groups, 1990 to 2015: A Systematic Analysis for the Global Burden of Disease Study Global Burden / C. Fitzmaurice, C. Allen, R.M. Barber [et al] //JAMA Oncology. - 2017. - Vol. 3. - №4. - P. 524-548]. Ежегодно количество новых случаев и смертей от рака поджелудочной железы неуклонно растет [Cancer Facts & Figures 2013. Atlanta: American Cancer Society // American Cancer Society. - 2013]. До 95% новообразований поджелудочной железы относятся к протоковым аденокарциномам, которые обладают низкой чувствительностью к консервативным методам лечения. Медиана продолжительности жизни пациентов с метастатическим паком поджелудочной железы составляет всего 6-11 месяцев.

Согласно данным научных исследований, опухоли с дефицитом гомологичной рекомбинации обладают повышенной чувствительностью к производным платины или PARP-ингибиторам [Overall survival and clinical characteristics of pancreatic cancer in BRCA mutation carriers / T. Golan, Z.S. Kanji, R. Epelbaum [et al] // British Journal of Cancer. - 2014. - Vol. 111. - №6. - P. 1132-1138], [Randomized, double-blind phase II trial with prospective classification by ATM protein level to evaluate the efficacy and tolerability of olaparib plus paclitaxel in patients with recurrent or metastatic gastric cancer / Y.J. Bang, S.A. Im, K.W. Lee [et al] //Journal of Clinical Oncology. - 2015. - Vol 33. - №33. - P. 3858-3865], [FDA Approves Olaparib for Germline BRCA-mutated Metastatic: website. - URL: https://www.esmo.org/Oncology-News (Accessed: 21.01.2020). - [Electronic resource]], [Furuse, J. A PARP inhibitor in pancreatic cancer: Enhancement anti-tumour activity of chemoradiation therapy against pancreatic cancer? / J. Furuse // EBioMedicine. - 2019. - Vol. 40. - P. 9-10], [ATM dysfunction in pancreatic adenocarcinoma and associated therapeutic implications // S.A. Armstrong, C.W. Schultz, A. Azimi-Sadjadi [et al] // Molecular Cancer Therapeutics. - 2019. - Vol. 18. - №11. - P. 1899-1908], [Abstract CT234: A Phase II, single arm study of maintenance rucaparib in patients with platinum-sensitive advanced pancreatic cancer and a pathogenic germline or somatic mutation in BRCA1, BRCA2 or PALB2 / K.A.R. Binder, R. Mick, M. O'Hara [et al] // Clinical Trials. American Association for Cancer Research - 2019. - P. CT234-CT234], [Maintenance olaparib for germline BRCA-mutated metastatic pancreatic cancer / T. Golan, P. Hammel, M. Reni [et al] // The New England Journal of Medicine. - 2019. - Vol. 381/ - №4. - P. 317-327].

Одной из основных причин возникновения дефицита гомологичной рекомбинации являются патогенные мутации в генах BRCA1, BRCA2, ATM и PALB2. В неотобранной когорте больных раком поджелудочной железы доля пациентов с терминальными мутациями в генах BRCA1/2 составляет 2,4% - 4,6%, в гене ATM и PALB2 - 1,4% и 0,7%, соответственно [Germline BRCA mutations in a large clinic-based cohort of patients with pancreatic adenocarcinoma / S. Hotter, A. Borgida, A. Dodd [et al] // Journal of Clinical Oncology. - 2015. - Vol. 33. - №28. - P. 3124-3129], [Germline cancer susceptibility gene variants, somatic second hits, and survival outcomes in patients with resected pancreatic cancer / M.B. Yurgelun, A.B. Chittenden, V. Morales-Oyarvide [et al] // Genetics in Medicine. - 2019. - Vol. 21. - №1. - P. 213-223].

Интеграция в клиническую практику анализа на наличие дефицита гомологичной рекомбинации у больных раком поджелудочной железы открывает перспективы индивидуализации противоопухолевой терапии, повышения эффективности лечения и снижения показателей смертности от данного заболевания.

Основными признаками данного изобретения являются мультиплексная ПЦР и биологический микрочип, содержащий набор иммобилизованных дифференцирующих олигонуклеотидов.

Первым важным признаком изобретения являются праймеры для амплификации целевых локусов генов BRCA1, BRCA2, ATM и PALB2, набор которых используется для получения изучаемых флуоресцентно меченых фрагментов ДНК в требуемом количестве. Последовательности праймеров приведены в Перечне последовательностей 1 (SEQ ID NO: 1-44).

Вторым важным признаком изобретения является биологический микрочип, содержащий набор иммобилизованных дифференцирующих олигонуклеотидов, последовательности которых приведены в Перечне последовательностей 2 (SEQ ID NO: 45-90). Дифференцирующие олигонуклеотиды иммобилизуются в ячейках гидогелевого микрочипа, как описано в патенте [А.Д. Мирзабеков, А.Ю. Рубина, С.В. Паньков, А.Н. Перов, В.В. Чупеева. Композиция для иммобилизации биологических макромолекул в гидрогелях, способ приготовления композиции, биочип, способ проведения ПЦР на биочипе // Патент RU 2206575 С2, 2003] в концентрации 200-400 мкМ. Схема расположения ячеек биологического микрочипа для анализа мутаций в генах BRCA1, BRCA2, ATM и PALB2 приведена на Фиг. 1.

Набор праймеров используется на стадии амплификации ДНК-локусов посредством проведения мультиплексной ПЦР для подготовки ДНК-мишени к гибридизации на биочипе. Все обратные праймеры имеют адаптер, служащий местом посадки для короткого универсального праймера (SEQ ID NO: 44), несущего флуоресцентную метку (Су-5) на 5'-конце. Условия полимеразной цепной реакции спроектированы таким образом, чтобы на первом этапе амплификации происходила симметричная амплификация целевых генетических локусов, а на втором этапе с короткого универсального праймера получали одноцепочечный флуоресцентно меченный ПЦР-продукт. Далее проводится гибридизация полученных флуоресцентно меченых одноцепочечных фрагментов ДНК с иммобилизованными в ячейках геля олигонуклеотидами, расположенными на пластиковой подложке. После проведения гибридизации и отмывки биологического микрочипа проводится анализ полученной флуоресцентной картины, на основании которого делается вывод о генотипе исследуемого образца. Пример гибридизационной картины приведен на Фиг. 2.

Перечни последовательностей

Перечень последовательностей 1. Последовательности праймеров для проведения мультиплексной ПЦР с последующим анализом методом гибридизации на биочипе для анализа терминальных мутаций в генах BRCAJ, BRCA2, ATM и PALB2.

Перечень последовательностей 2. Последовательности олигонуклеотидных зондов, используемых для иммобилизации в ячейках биологического микрочипа.

Копия перечня последовательностей, представленная на машиночитаемом носителе, идентична перечню последовательностей в печатной форме.

Перечень фигур

Фигура 1. Схема биологического микрочипа для анализа терминальных мутаций в генах BRCA1, BRCA2, ATM и PALB2. В угловых позициях нанесены ячейки (М), содержащие флуоресцентный краситель Су 5, светящийся перманентно, для ориентировки и контроля интенсивности свечения.

Фигура 2. Гибридизационная картина, полученная с помощью биологического микрочипа для анализа терминальных мутаций в генах BRCA1, BRCA2, ATM и PALB2 у испытуемого №ХХХ. Образец содержит мутацию 509_510delGA в гене PALB2.

Осуществление изобретения

Задача настоящего изобретения состоит в создании способа экспресс-анализа, позволяющего выявлять терминальные мутации в генах BRCA1, BRCA2, ATM и PALB2.

Для обеспечения оптимального состава и структуры праймеров, используемых в протоколе мультиплексной ПЦР, необходимы такие праймеры, которые не образуют между собой высокоэнергетических структур (шпильки и дуплексы), обеспечивают специфичную амплификацию и при этом подобраны таким образом, чтобы их отжиг на мишени происходил при одинаковой температуре (Перечень последовательностей 1 (SEQ ID NO: 1-43)). Все обратные праймеры имеют адаптер, служащий местом посадки для короткого универсального праймера (Перечень последовательностей 1 (SEQ ID NO: 44)), несущего флуоресцентную метку (Су-5) на 5'-конце. Для обеспечения сбалансированной эффективной амплификации исследуемых образцов также должны быть оптимизированы такие параметры как концентрация MgCl₂ и праймеров в ПЦР-смеси, соотношение прямых и обратных праймеров, количество циклов амплификации на обоих этапах, время элонгации, денатурации и отжига праймеров на каждом этапе. В результате проведенной работы подобраны праймеры, которые позволяют осуществлять эффективную наработку выбранных фрагментов генов BRCA1, BRCA2, ATM и PALB2.

Олигонуклеотиды для иммобилизации на биологическом микрочипе подбираются таким образом, чтобы идентифицировать все выбранные для анализа терминальные мутации в генах BRCA1, BRCA2, ATM и PALB2.

Олигонуклеотиды должны соответствовать следующим критериям:

1) Дискриминирующий зонд должен обладать высокой специфичностью к выбранному для анализа мутантному локусу, который представляет собой участок гена, амплифицированный с помощью ПЦР, с включенной флуоресцентной меткой.

2) Вариабельный нуклеотид должен находиться в серединной области зонда, поскольку такое положение позволяет добиться большей дискриминации между совершенными и несовершенными дуплексами.

3) Выбранные олигонуклеотиды не должны содержать высокостабильных вторичных структур, наличие которых может приводить к снижению эффективности гибридизации.

На биочипе для определения терминальных мутаций в генах BRCA1, BRCA2, АТМ и PALB2 иммобилизовано 46 высокоспецифичных дифференцирующих олигонуклеотидных зондов (Перечень последовательностей 2 (SEQ ID NO: 45-90)), структура которых обеспечивает связывание только с полностью комплементарными ДНК-мишенями, что обуславливает яркий флуоресцентный сигнал в соответствующих им ячейках биологического микрочипа и дает наиболее четкие картины распределения гибридизационных сигналов. Неспецифическое связывание сведено к минимуму, что практически исключает ложноположительное «срабатывание» ячеек.

Приведем последовательность анализа с использованием данного метода. Наработка ПЦР-продуктов проводится в одной реакции амплификации в одной пробирке. В качестве матрицы используют геномную ДНК.

ПЦР может быть проведена с использованием любого вида термостабильной полимеразы (например, Hot Start Taq ДНК полимераза (ООО "СибЭнзим-М", Россия)). Для построения новой цепи в буфер добавляется смесь дНТФ (дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ) в принятых концентрациях, при этом вместо дТТФ может быть использован дУТФ. Для проведения ПЦР могут быть использованы готовые коммерчески доступные наборы, содержащие все необходимые компоненты за исключением праймеров.

Для проведения мультиплексной ПЦР используют праймеры SEQ ID NO: 1-44, приведенные в Перечне последовательностей 1.

В программе амплификации (температурно-временной режим) условно выделяют два этапа: в первой половине программы ПЦР проходит симметричная амплификация локусов генов BRCA1, BRCA2, ATM и PALB2 с использованием специфичных праймеров (SEQ ID NO: 1-43). Во второй части программы амплификации происходит получение флуоресцентно-меченного одноцепочечного ПЦР-продукта: за счет понижения температуры отжига праймеров становится возможным отжиг и элонгация добавленного в избытке короткого универсального флуоресцентно меченного праймера (SEQ ID NO: 44), который отжигается на адаптерной части обратных специфичных праймеров. Это позволяет получать одноцепочечный флуоресцентно-меченный ампликон, способный к гибридизации специфичными ДНК-зондами на биологическом микрочипе. В качестве флуоресцентной метки используется Су5: короткий универсальный праймер несет флуоресцентную метку (Су-5) на 5'-конце. В качестве флуоресцентной метки также может быть использован любой флуорохром без ограничения (например, FITC, Texas red, Су-3 и т.д.), а также биотин.

Праймеры и олигонуклеотидные зонды синтезируют с использованием различных химических подходов, таких как фосфодиэфирный метод, гидрофосфорильный метод и т.д., при этом наиболее распространенным в настоящее время является фосфоамидитный метод синтеза. Синтез праймеров осуществляют, используя автоматические ДНК/РНК синтезаторы, например производства фирмы «Applied Biosystems» (США).

При изготовлении биочипа могут быть использованы олигонуклеотиды, несущие по 5'- или 3'-концу активную группу, обеспечивающую иммобилизацию. Модификация олигонуклеотида для введения активной группы может быть осуществлена как в автоматическом режиме при синтезе с использованием широкого спектра коммерчески доступных модификаторов, так и постсинтетически в ручном режиме. Например, при синтезе олигонуклеотидных зондов с помощью 3'-Amino-Modifier С7 CPG 500 («Glen Research)), США) на 3'-конец олигонуклеотидов вводится спейсер со свободной аминогруппой, используемый для последующей иммобилизации олигонуклеотида на биочипе.

Далее проводится гибридизация флуоресцентно меченых фрагментов ДНК, полученных после проведения ПЦР, с иммобилизованными в ячейках геля олигонуклеотидами, которые представляют собой участки генов BRCA1, BRCA2, ATM и PALB2 и являются комплементарными последовательности «дикого типа» или последовательности, содержащей мутацию.

Гибридизация может быть проведена в любом известном специалисту в данной области гибридизационном буфере, например в гуанидиновом или SSPE-буфере. Типичное время гибридизации составляет 18-24 ч. при 37°С. Анализ генотипа исследуемого образца проводится с учетом расположения олигонуклеотидных зондов на биологическом микрочипе, схема которого позволяет определить, какие терминальные мутации присутствуют в том или ином образце.

Анализируемые фрагменты ДНК образует совершенные гибридизационные дуплексы только с полностью комплементарными им олигонуклеотидами. Если последовательность анализируемой ДНК полностью комплементарна последовательности зонда, то образуется стабильный совершенный дуплекс (детектируется сигнал флуоресценции). В случае если искомого фрагмента нет или в нем находится некомплементарное основание, то стабильного дуплекса не образуется (сигнал флуоресценции отсутствует). Дискриминацию совершенных и несовершенных дуплексов проводят после отмывки биологического микрочипа, сравнивая интенсивности сигналов флуоресценции соответствующих ячеек биологического микрочипа. Отмывка может быть проведена в любом известном в данной области техники буфере с добавлением соли (SSC, SSPE и т.п.) или в деионизованной воде, но за более короткое время [Sambrook, J.F. Molecular cloning: a laboratory manual / J.F. Sambrook, D. W. Russell - Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001].

Регистрация гибридизационной картины может быть произведена с помощью любой детектирующей системы, распознающей флуоресцентный сигнал (флуоресцентный микроскоп с ПЗС-камерой, лазерный сканер, портативный анализатор биочипов и т.п. коммерчески доступные флуоресцентные анализаторы, например, портативный анализатор биочипов, снабженный ПЗС-камерой и специальным программным обеспечением, производства ООО «БИОЧИП-ИМБ» (Россия)).

Биологические микрочипы могут быть изготовлены посредством последовательного нанесения на поверхность стеклянной подложки матрицы из ячеек акриламидного геля, активации ячеек и ковалентной иммобилизации в ячейках модифицированных олигонуклеотидов, несущих активные группы [Kolchinsky, А. Analysis of SNPs and other genomic variations using gel-based chips / A. Kolchinsky, A. Mirzabekov // Human Mutation. - 2002. Vol. 19(4). - P. 343-360]. В качестве подложки помимо стекла может быть использован другой материал, в том числе металл, гибкие мембраны и пластик [С.В. Паньков, Э.Я. Крейндлин, О.Г. Сомова, О.В. Моисеева, В.Е. Барский, А.С. Заседателев. Применение немодифицированных полимерных материалов для изготовления подложки биочипов, биочип на их основе и способ его изготовления, способ иммобилизации гидрогелей на немодифицированных полимерных материалах // Патент RU 2309959, 2007]. Биочипы также могут быть изготовлены любыми другими известными специалисту в данной области способами [Seliger, Н. Arrays of immobilized oligonucleotides-contributions to nucleic acids technology / H. Seliger, M. Hinz, E. Happ // CurrPharm Biotechnol. - 2003. - Vol. 4(6). - P. 379-395].

Для изготовления биологического микрочипа в настоящем изобретении используется набор олигонуклеотидов (SEQ ID NO: 45-90), приведенных в Перечне последовательностей 2. В качестве контроля прохождения гибридизации в настоящем изобретении используют образец контрольной ДНК. Расположение конкретных олигонуклеотидных зондов на биологическом микрочипе может варьироваться и определяется только удобством интерпретации результатов гибридизации.

Далее приводятся примеры, которые показывают применение способа анализа терминальных мутаций в генах BRCA1, BRCA2, ATM и PALB2. Следует понимать, что приводимые примеры служат исключительно для иллюстрации и не предназначены для ограничения объема притязаний, выраженных в формуле изобретения. На основании настоящего описания специалист в данной области сможет легко предложить свои варианты и модификации осуществления изобретения, не отходя от общей концепции настоящего изобретения и без привлечения собственной изобретательской деятельности, так что должно быть понятно, что такие варианты и модификации также будут входить в объем притязаний настоящего изобретения.

Пример 1. Амплификация фрагментов генов BRCA1, BRCA2, ATM и PALB2 методом мультиплексной ПЦР с целью получения флуоресцентно меченого ПЦР-продукта в необходимом количестве.

Геномную ДНК выделяли с помощью набора DNeasy Blood & Tissue Kits (QIAGEN, Германия) из образцов периферической крови.

Амплификацию локусов генов BRCA1, BRCA2, ATM и PALB2 проводили в одной мультиплексной реакции, содержащей праймеры SEQ ID NO: 1-44. ПЦР проводили на приборе Т100 («Bio-Rad», США). ПЦР-смесь первого этапа общим объемом 25 мкл включала в себя: 1× ПЦР-буфер (67 мМ Трис-HCl, рН 8.6, 166 мМ (NH₄)₂SO₄, 0,01% Тритон Х-100), 4.4 мМ MgCl₂, 0.2 мМ каждого из дНТФ («Силекс», Россия), 1.25 U Hot Start Taq ДНК полимеразы (ООО "СибЭнзим-М", Россия), по 0.04 мкМ специфичных праймеров (SEQ ID NO: 1-43), 0.4 мкМ универсального флуоресцентно-меченного праймера (SEQ ID NO: 44) и 25 нг ДНК. Амплификацию проводили по схеме, указанной в таблице 2.

Пример 2. Олигонуклеотидный биологический микрочип для определения терминальных мутаций в генах BRCA1, BRCA2, ATM и PALB2.

Олигонуклеотиды для иммобилизации на микрочипе синтезируют на автоматическом синтезаторе 394 DNA/RNA Synthesizer («Applied Biosystems», США) с использованием стандартной фосфоамидитной процедуры. 3'-конец олигонуклеотидов содержит спейсер со свободной аминогруппой, который вводят в состав олигонуклеотида при синтезе путем использования 3'-Amino-Modifier С7 CPG 500 («Glen Research)), США). Присоединение флуоресцентной метки к олигонуклеотидам по свободной аминогруппе осуществляют в соответствии с рекомендациями производителя.

Биологические микрочипы изготавливают методом сополимеризации олигонуклеотида в акриламидном геле, как описано ранее [С.В. Паньков, Э.Я. Крейндлин, О.Г. Сомова, и др. Применение немодифицированных полимерных материалов для изготовления подложки биочипов, биочип на их основе и способ его изготовления, способ иммобилизации гидрогелей на немодифицированных полимерных материалах // Патент RU 2309959, 2007], [А.Д. Мирзабеков, А.Ю. Рубина, С.В. Паньков, и др. Способ иммобилизации олигонуклеотидов, содержащих непредельные группы, в полимерных гидрогелях при формировании микрочипа // Патент RU 2175972, 2001]. После изготовления биологические микрочипы проходят контроль качества нанесения, который включает в себя визуальный контроль физических размеров гелевых ячеек при помощи светового микроскопа в отраженном свете и контроль концентрации иммобилизованных олигонуклеотидов с помощью красителя Су-3 (ООО «БИОЧИП-ИМБ», Москва, Россия). Биологический микрочип содержит 46 иммобилизованных олигонуклеотидных зондов (SEQ ID NO: 45-90), список которых представлен Перечне последовательностей 2. Ячейки наносят согласно схеме на Фиг. 1. Пример 3. Гибридизация меченого продукта на биочипе

Реакционную смесь, полученную после проведения мультиплексной ПЦР, описанной в Примере 1, используют для гибридизации на биочипе. Гибридизационная смесь общим объемом 40 мкл содержала 10 мкл формамида ("Serva", США), 10 мкл 20×SSPE ("Promega", США) и 20 мкл ПЦР-продукта. Готовую гибридизационную смесь тщательно перемешивают и наносят на биологический микрочип в гибридизационную камеру объемом 40 мкл (ООО «БИОЧИП-ИМБ», Москва, Россия). Гибридизацию проводят в течение 18-24 ч при температуре 37°С. После завершения инкубации гибридизационную камеру удаляют вместе с непрореагировавшей гибридизационной смесью и проводят отмывку в 1x SSPE буфере («Promega», США) при комнатной температуре в течение 15 мин.

Пример 4. Регистрация и интерпретация результатов гибридизации

Регистрацию гибридизационной картины производят с помощью портативного анализатора биочипов, снабженного ПЗС-камерой, производимого ООО «БИОЧИП-ИМБ». Описание алгоритма автоматического анализа изображения с помощью программы Image Ware™ выходит за рамки настоящего изобретения.

Определим генотип по гибридизационной картине, представленной на Фиг. 2.

В ячейках биологического микрочипа, соответствующих локусу c.509_510delGA (p.R170Ilefs) гена PALB2, положительный сигнал наблюдается в двух верхних (соответствуют последовательности дикого типа) и двух нижних ячейках (соответствуют мутантной последовательности), соответственно, образец является гетерозиготой по мутации c.509_510delGA (p.R170Ilefs) в гене PALB2.

Определим генотип по остальным локусам гена BRCA2 (NM_000059.3): c.752_753insAG (p.T251fs), с. 1010_1011insTG (p.Asn337fs), c.2808_2811delACAA (p.Ala938Profs), c.5286T>G (p.Tyr1762Ter), c.5586delG (p.Val1862fs), 5722_5723delCT (p.Leu1908Argfs), c.5946delT (p.Ser1982Argfs), C.6070C>T (p.Gln2024Ter), c.6298C>T (p.Gln2100Ter), c.7879A>T (p.Ile2627Phe), c.6997_6998insT (p.Pro2334Thrfs); гена ATM (NM_000051.3): c.5932G>T (p.Glu1978Ter); гена PALB2 (NM_024675.3): c.172_175delTTGT (p.Gln60Argfs); гена BRCA1 (NM_007294.3): c.68_69delAG (p.Glu23Valfs), c.181T>G (p.Cys61Gly), c.5266dup (p.Gln1756Profs*74), c.3700_3704delGTAAA (p.Val1234Glnfs), c.3756_3759delGTCT (p.Ser1253Argfs), c.4035delA (p.Glu1346Lysfs), c.5161C>T (p.Gln1721Ter), c.5251C>T (p.Arg1751Ter), c.1961delA (p.Lys654Serfs). Для каждого из локусов интенсивный флуоресцентный сигнал наблюдается только в паре ячеек, соответствующих последовательностям «дикого типа».

Следовательно, генотип анализируемого образца: гетерозигота по мутации c.509_510delGA (p.R170Ilefs) в гене PALB2

1. Способ выявления терминальных мутаций в генах BRCA1, BRCA2, ATM и PALB2, предусматривающий следующие стадии:

(а) - амплификация фрагментов генов BRCA1, BRCA2, ATM и PALB2 посредством мультиплексной ПЦР, в которой в качестве матрицы для амплификации используется образец геномной ДНК:

в ПЦР используются праймеры SEQ ID NO: 1-44;

в результате образуется флуоресцентно меченый ПЦР-продукт;

(б) - обеспечение биологического микрочипа для идентификации терминальных мутаций в генах BRCA1, BRCA2, ATM и PALB2, содержащего набор иммобилизованных олигонуклеотидов с последовательностями, представленными в SEQ ID NO: 45-90;

(в) - гибридизация меченого ПЦР-продукта на биологическом микрочипе;

(г) - регистрация и интерпретация результатов гибридизации;

2. Способ по п. 1, в котором регистрацию результатов гибридизации проводят с помощью устройства, способного регистрировать и записывать сигналы флуоресценции, оснащенного программным обеспечением, позволяющим проводить автоматическую обработку интенсивности сигналов с последующей интерпретацией результатов;

3. Способ по п. 1, в котором для идентификации мутаций в генах BRCA1, BRCA2, ATM и PALB2, амплифицированных с помощью набора праймеров, охарактеризованных в п. 1, используется биологический микрочип, представляющий собой подложку с набором иммобилизованных на ней олигонуклеотидов с последовательностями, представленными в SEQ ID NO: 45-90.