Способ определения неоникотиноидов в подморе пчел с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии
Владельцы патента RU 2730399:
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности" (ФГБНУ "ФЦТРБ-ВНИВИ") (RU)
Изобретение относится к ветеринарной токсикологии и санитарии, а именно к совместному определению остаточных количеств неоникотиноидов в подморе пчел при отравлении с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии. Способ определения неоникотиноидных пестицидов в подморе пчел с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии включает отбор павших пчел, экстракцию дистиллированной водой и ацетонитрилом, измельчение, внесение сульфата магния и ацетата натрия при перемешивании, центрифугирование при 10000 об/мин, в течение 15 мин, отбор надосадочной жидкости с добавлением к ней сорбента (PSA или Amberlite ХАД-2), встряхивание, фильтрацию, упаривание растворителя в токе азота при температуре 40°С, растворение полученного осадка в смеси метанол-вода в соотношении 10:90, пропускание смеси через 0,2 мкм шприцевой насадочный фильтр в аналитический виал, введение растворенного осадка в хроматограф и обработку результатов анализа, предварительно перед внесением сульфата магния и ацетата натрия в смесь дополнительно добавляют гексан, а в качестве элюента используют смесь ацетонитрил-вода в соотношении 80:20 соответственно с 0,2% муравьиной кислоты. Техническим результатом является повышение чувствительности, избирательности и сокращение времени проведения анализа. 1 з.п. ф-лы, 1 табл., 2 ил.
Изобретение относится к ветеринарной токсикологии и санитарии, а именно к совместному определению остаточных количеств неоникотиноидов в подморе пчел при их отравлении с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
Среди многообразия пестицидов используемых в сельском хозяйстве особое место занимают неоникотиноиды. Вещества этой группы широко используются для борьбы с вредителями растений, паразитами животных, характеризуются относительной дешевизной, небольшими нормами расхода на единицу площади, простотой применения и высокой эффективностью.
По сравнению с другими пестицидами неоникотиноиды имеют очень продолжительный период действия и проявляют высокую острую токсичность по отношению к пчелам. В связи с этим необходимы исследования, дополняющие и расширяющие сведения о потенциальной опасности неоникотиноидов, что в конечном итоге будет способствовать безопасному их использованию в растениеводстве и ветеринарии.
Для аналитического контроля остаточных количеств неоникотиноидных инсектицидов в кормах, воде, объектах сельского хозяйства и окружающей среды используют высокоэффективную жидкостную хроматографию и газовую хроматографию с масс-спектрометрией.
Интенсивная разработка теоретических основ, организация промышленного выпуска необходимых сорбентов и аппаратуры в последние десятилетия способствовали бурному развитию жидкостной хроматографии, как высокоэффективного метода.
Известен способ определения имидаклоприда в воде, почве, огурцах, томатах, сахарной свекле, картофеле, перце и баклажанах, включающий экстракцию имидаклоприда гексаном, с последующей переэкстракцией в дихлорметан, фильтрацию, дегидратацию безводным натрия сульфатом, упаривание и хроматографирование на жидкостном хроматографе с ультрафиалетовым детектором (Определение остаточных количеств имидаклоприда в воде, почве, огурцах, томатах, сахарной свекле, картофеле, перце и баклажанах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания МУК 4.1.1390-03).
Существует способ определения имидаклоприда в картофеле, огурцах, томатах и томатном соке, которое заключается в отборе проб, экстракции, фильтрации, дегидратации безводным натрия сульфатом, упаривании, хроматографировании на жидкостном хроматографе с ультрафиалетовым детектором и обработки результатов (Методические указания по определению имидаклоприда в картофеле, огурцах, томатах и томатном соке хроматографическими методами. Сборник №30: Методические указания по определению микроколичеств пестицидов в пищевых продуктах, кормах и внешней среде. Киев, 2001. - С. 80-87).
Известен способ определения тиаклоприда в воде, включающий экстракцию тиаклоприда гексаном, с последующей переэкстракцией в дихлорметан, фильтрацию и дегидратацию безводным натрия сульфатом, упаривание и хроматографирование на жидкостном хроматографе с ультрафиолетовым детектором (Определение остаточных количеств тиаклоприда в воде, почве и яблоках методом высокоэффективной жидкостной хроматографировании. Методические указания МУК 4.1.1399-03).
Существует способ определения тиаметоксама в капусте, зеленой массе, семенах рапса, масле рапса и горчицы, смородине методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, включающий экстракцию, очистку экстрактов перераспределением инсектицида в системе несмешивающихся растворителей, а также на колонке с силикагелем (Определение остаточных количеств тиаметоксама в капусте, зеленой массе, семенах рапса, масле рапса и горчицы, смородине методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания МУК 4.1.1805-03).
Известен способ определения ацетамиприда в ботве и корнеплодах сахарной свеклы, включающий экстракцию ацетамиприда ацетоном, фильтрацию, дегидратацию натрия сульфатом безводным, упаривание, введение растворенного сухого остатка в хроматограф с ультрафиолетовым детектором (Определение остаточных количеств ацетомиприда в ботве и корнеплодах сахарной свеклы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания МУК 4.1.3188-14).
Существует способ определения тиаклоприда в зеленой массе, зерне и масле кукурузы, в ботве, корнеплодах сахарной свекле, зерне гороха, в плодах томатов и томатном соке. Метод состоит из отбора пробы, экстракции, центрифугировании, фильтрации, очистки и введении растворенного остатка в жидкостной хроматограф (Определение остаточных количеств тиаклоприда в зеленой массе, зерне и масле кукурузы, в ботве, корнеплодах сахарной свекле, зерне гороха, в плодах томатов и томатном соке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания МУК 4.1.3209-14).
Известные способы хорошо себя зарекомендовали и пригодны для определения инсектицидов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Однако ни один из перечисленных способов не подходит для исследования данного объекта и не позволяет одновременно и за короткий промежуток времени определить весь комплекс неоникотиноидных пестицидов в подморе пчел.
Наиболее близким по технической сущности к заявляемому способу является способ определения остаточных количеств неоникотиноидов в подморе пчел с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии, включающий отбор павших пчел, экстракцию дистиллированной водой и ацетонитрилом, измельчение, внесение сульфата магния и ацетата натрия при перемешивании, центрифугирование при 10000 об/мин в течение 15 мин, отбор надосадочной жидкости с добавлением к ней сорбента (PSA или Amberlite ХАД-2), встряхивание, фильтрацию, упаривание растворителя в токе азота при температуре 40°С, растворение полученного осадка в смеси метанол-вода в соотношении 10:90, пропускание смеси через 0,2 мкм шприцевой насадочный фильтр а аналитический виал, введение растворенного осадка в хроматограф и обработку результатов анализа (Методические рекомендации по диагностике, лечению и профилактике отравлений животных пестицидами из группы неоникотиноидов. М. 2018, с. 27-30).
Недостатками данного способа является наличие большого количества примесей в пробе, приводящие к снижению чувствительности, избирательности и увеличению длительности проведения анализа.
Технический результат на достижение которого направлено изобретение, состоит в повышении чувствительности и избирательности способа, а также в сокращении продолжительности проведения анализа.
Для достижения названного технического результата в предлагаемом способе, включающем отбор павших пчел, экстракцию дистиллированной водой и ацетонитрилом, измельчение, внесение сульфата магния и ацетата натрия при перемешивании, центрифугирование при 10000 об/мин в течение 15 мин, отбор надосадочной жидкости с добавлением к ней сорбента (PSA или Amberlite ХАД-2), встряхивание, фильтрацию, упаривание растворителя в токе азота при t 40°С, растворение полученного осадка в смеси метанол-вода в соотношением 10:90, пропускание смеси через 0,2 мкм шприцевой насадочный фильтр в аналитический виал, введение растворенного осадка в хроматограф и обработку результатов анализа, предварительно перед внесением сульфата магния и ацетата натрия в смесь дополнительно добавляют гексан, а в качестве элюента используют смесь ацетонитрил-вода в соотношении 80:20 соответственно с 0,2% муравьиной кислоты. А в качестве хроматографа используют жидкостной хроматограф «Agilent 1265 Infiniti» с хроматографической колонкой ZORBAX Eclipse XDB - С18 (50×4,6) мм с размером частиц сорбента 1,8 мкм.
Отличительными признаками предложенного способа являются дополнительная очистка гексаном для проб - подмора пчел от воска, жировых компонентов, использование в качестве элюента смеси ацетонитрил-вода в соотношении 80:20 с 0,2% муравьиной кислоты, это позволяет повысить чувствительность и избирательность способа, за счет избавления от хроматографических пиков фоновых веществ матрицы, и снизить продолжительность проведения анализа в 2 раза.
Способ определения неоникотиноидных пестицидов в подморе пчел методом высокоэффективной жидкостной хроматографии осуществляют следующим образом.
Предварительно пробы подмора пчел искусственно контаминировали смесью стандартных растворов неоникотиноидов в различных дозах от 1 до 5 мкг/кг. Экспозиция заражения составляла 24 часа.
Брали навеску павших пчел массой 1 г, искусственно зараженную смесью стандартных растворов неоникотиноидов, помещали в коническую колбу емкостью 100 см3, заливали 100 мкл дистиллированной воды и 500 мкл ацетонитрила, тщательно измельчали и добавляли 500 мкл гексана. В полученную массу при перемешивании добавляли 30 мг сульфата магния и 5 мг ацетата натрия, перемешивали в течение 5 мин, затем центрифугировали при 10000 об/мин в течение 15 мин. Надосадочную жидкость отбирали в отдельную пробирку и добавляли 20 мг сорбента (PSA или Amberlite XAD-2). Пробирку встряхивали 10 мин, фильтровали от сорбента, а растворитель упаривали в токе азота при температуре 40°С.Остаток растворяли в 300 мкл смеси метанол-вода (10:90) и пропускали через 0,2 мкм шприцевой насадочный фильтр в аналитический виал. Конечный объем вносили в жидкостный хроматограф «Agilent 1265 Infiniti», оснащенный термостатом колонок, кватернарным насосом и диодно-матричным детектором (ДМД). Рабочая длина волны 266 нм. Колонка ZORBAX Eclipse XDB - С18 (50×4,6) мм, с размером частиц сорбента 1,8 мкм. Скорость потока мобильной фазы 0,7 мл/мин. Температура колонки - 30°С. В качестве элюента использовали подвижную фазу ацетонитрил-вода в соотношении 80:20 с 0,2% муравьиной кислоты. Длина волны - 266 нм.
Время удерживания неоникотиноидов представлены в таблице.
Обработку результатов анализа проводили методом абсолютной градуировки, содержание неоникотиноидов в анализируемой пробе (X, мг/кг) вычисляли по формуле: 
X - содержание неоникотиноида в пробе, мг/кг;
К - концентрация стандартного раствора неоникотиноида, введенного в хроматограф, мкг/см3;
S1 - площадь хроматографического пика стандарта неоникотиноида, мм2;
S2 - площадь хроматографического пика стандарта неоникотиноида в пробе, мм2;
V - общий объем конечного раствора пробы, мл;
m - масса пробы, г;
М - среднее значение определения, найденное предварительно, %.
При анализе неоникотиноидных пестицидов, установили, что лучшие результаты при совместном определении остаточных количеств неоникотиноидов в подморе пчел дает предлагаемый нами способ. В хроматограмме мы получили острые, симметричные пики неоникотиноидов при дозе 1 мкг/кг, по сравнению с прототипом (фиг. 1, фиг. 2), а также сократили время их удерживания в колонке в 2 раза, что повышает чувствительность и избирательность способа. Данный способ позволяет получить наиболее высокую степень извлекаемости неоникотиноидов, что составило 80,5%. Усовершенствованный нами способ определения неоникотиноидов в подморе пчел методом ВЭЖХ прост и экономичен в осуществлении, может быть применен в лабораториях для осуществления диагностики отравлений пчел.
Предлагаемый способ определения неоникотиноидных пестицидов в подморе пчел с использованием ВЭЖХ был апробирован в лаборатории химического анализа ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности».
Источники информации
1. Методические указания по определению имидаклоприда в картофеле, огурцах, томатах и томатном соке хроматографическими методами. Сборник №30: Методические указания по определению микроколичеств пестицидов в пищевых продуктах, кормах и внешней среде. - Киев, 2001, с. 80-87.
2. Определение остаточных количеств пестицидов в пищевых продуктах, сельскохозяйственном сырье и объектах окружающей среды: Сборник методических указаний. Выпуск 3, М, 2009, с. 127-133.
3. Определение остаточных количеств имидаклоприда в воде, почве, огурцах, томатах, сахарной свекле, картофеле, перце и баклажанах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания МУК 4.1.1390-03. Выпуск 3, М., 2006. - 11 с.
4. Методические рекомендации по диагностике, лечению и профилактике животных пестицидами из группы неоникотиноидов / В.И. Егоров (и др.). - М, 2018. - 33 с.
1. Способ определения неоникотиноидных пестицидов в подморе пчел с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии, включающий отбор павших пчел, экстракцию дистиллированной водой и ацетонитрилом, измельчение, внесение сульфата магния и ацетата натрия при перемешивании, центрифугирование при 10000 об/мин, в течение 15 мин, отбор надосадочной жидкости с добавлением к ней сорбента (PSA или Amberlite ХАД-2), встряхивание, фильтрацию, упаривание растворителя в токе азота при температуре 40°С, растворение полученного осадка в смеси метанол-вода в соотношении 10:90, пропускание смеси через 0,2 мкм шприцевой насадочный фильтр в аналитический виал, введение растворенного осадка в хроматограф и обработку результатов анализа, отличающийся тем, что предварительно перед внесением сульфата магния и ацетата натрия в смесь дополнительно добавляют гексан, а в качестве элюента используют смесь ацетонитрил-вода в соотношении 80:20 соответственно с 0,2% муравьиной кислоты.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве хроматографа используют жидкостный хроматограф «Agilent 1265 Infiniti» с хроматографической колонкой ZORBAX Eclipse XDB - С18 (50×4,6) мм с размером частиц сорбента 1,8 мкм.
