Средство, вызывающее в экспериментах in vivo замещение опухолевой ткани соединительной и переводящее клетки опухоли из фазы g1 клеточного цикла в состояние покоя g0
Владельцы патента RU 2731105:
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского" Министерства здравоохранения Российской Федерации (RU)
Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к средству, вызывающему в экспериментах in vivo замещение опухолевой ткани соединительной и переводящему клетки опухоли из фазы G1 клеточного цикла в состояние покоя G0. Средство, вызывающее в экспериментах in vivo замещение опухолевой ткани соединительной и переводящее клетки опухоли из фазы G1 клеточного цикла в состояние покоя G0, представляющее собой сухой экстракт листьев аврана лекарственного, полученный путем измельчения их, экстракции спиртом 96% на водяной бане до кипения и кипячения в течение 14-15 минут, выпаривания при температуре 55-60°C, разведения выпаренного остатка сначала дистиллированной водой при температуре 40-50°C, затем добавления хлороформа в пропорции 4/5 части воды и 1/5 части хлороформа, охлаждения до комнатной температуры и центрифугирования со скоростью 1500 оборотов в минуту в течение 15 минут с последующим отделением водной фракции и высушиванием ее. Вышеописанное средство эффективно для замещения in vivo опухолевой ткани соединительной и для перевода клеток опухоли из фазы G1 клеточного цикла в состояние покоя G0. 8 ил., 3 табл., 2 пр.
Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной и клинической онкологии, а также к фармацевтической промышленности, а именно созданию лекарственных средств на основе новогаленового экстракта, содержащего биофлавоноиды, которое может быть использовано при лечении сарком, способствующее переходу клеток опухоли из фазы G1 клеточного цикла в состояние покоя G0 и при воздействии на симбиотические отношения между опухоль-ассоциированными фибробластами (ФАО) и опухолевыми клетками приводящее к замещению опухоли соединительной тканью в экспериментах in vivo.
Средство может быть использовано как самостоятельное - для лечения злокачественных новообразований, так и при создании комбинированных химиопрепаратов.
- злокачественная опухоль, возникшая на основе активно делящихся клеток т.н. «незрелой» соединительной ткани, в отличие от рака, происходящего из эпителиальных клеток. Саркоме присущи такие черты злокачественной опухоли, как: инфильтрирующий рост с разрушением соседних тканей, рецидивы после удаления, раннее образование метастазов. Саркома характеризуется прогрессивным и более быстрым, чем у рака ростом, особенно у детей, что объясняется более активным ростом соединительных и мышечных тканей в детском возрасте, а также частыми рецидивами. Занимают второе место после рака среди злокачественных заболеваний по числу летальных исходов (Петерсон Б.Е. Онкология (учебник для мед. ин-тов). - М.: Медицина, 1980. - 447 с).
Трудноразрешимой клинической задачей в терапии злокачественных новообразований в целом является развитие резистентности, препятствующей эффективному лечению.
В настоящее время ключевыми участниками прогрессии злокачественной опухоли при противоопухолевой терапии считают опухоль-ассоциированные фибробласты (ФАО), определяющие выживание злокачественных клеток и способствующие их уходу из-под контроля организма (Olumi A.F. et al. Carcinoma-associated fibroblasts direct tumor progression of initiated human prostatic epithelium. Cancer Res. 59, 5002-5011 (1999); Correia A.L. & Bissell M.J. The tumor microenvironment is a dominant force in multidrug resistance;
Drug Resist. Updat. 15, 39-49 (2012). Dittmer, J. & Leyh, B. The impact of tumor stroma on drug response in breast cancer. Semin. Cancer Biol. 31, 3-15 (2015)). Роль таких фибробластов в развитии опухоли обусловлена их участием в стромальном ответе организма на повреждение ткани. В большинстве карцином ФАО считаются главными регуляторами многих различных стромальных программ и сигнальных путей в опухолевых клетках, такую регуляцию относят к эпигенетической (Sappino А.P., Skalli О., Jackson В., Schurch W. & Gabbiani G. Smooth-muscle differentiation in stromal cells of malignant and non-malignant breast tissues. Int. J. Cancer 41, 707-712, 1988). Так, исследования опухолей молочной железы у человека показывают, что ФАО имеют уникальные эпигенетические изменения, не наблюдающиеся в фибробластах нормальной ткани молочной железы (Hu М. et al. Distinct epigenetic changes in the stromal cells of breast cancers. Nat. Genet. 37, 899-905 (2005). ФАО также являются важными медиаторами вторичного роста опухоли в процессе метастазирования.
В свете полученных в последнее время данных (Биологическая роль фибробластов в развитии опухолей // http://medach.pro/surgery/onkologiya-hirurgicheskie-distsiplinyi fibroblasts/; Raghu Kalluri The biology and function of fibroblasts in cancer // Nature Reviews. 2016. 16. 582-598) стало понятно, что потенциальной мишенью для противоопухолевой терапии могут быть как симбиотические отношения между ФАО и опухолевыми клетками, так и сами ФАО, наряду со злокачественными клетками. Особенно эффективна терапия против ФАО, направленная или на их полное уничтожение, или на их репрограммирование или ретрансформацию, обратно в сторону нормального, покоящегося фенотипа. Воздействие на ФАО может послужить мощным противоопухолевым терапевтическим средством. В настоящее время на молекулярном уровне активно ведется поиск маркеров, позволяющих достоверно различить ФАО и фибробласты, ассоциированные с фиброзом (ФАФ), с очевидно идентичными морфологическими чертами на клеточном уровне. Также проводятся исследования индукции протуморогенных или противоопухолевых эффектов ФАО при направленной химио-, и лучевой терапии против активно пролиферирующих злокачественных клеток.
Известно также (Нельсон и соавторы https://www.onkonature.ru/2014/04/28), что при стандартной химиотерапии в подавляющем большинстве случаев происходит повреждение ДНК фибробластов, которые в результате такого повреждения могут выпускать широкий круг соединений, стимулирующих рост опухолевых клеток. ДНК ФАО, поврежденные химиотерапией, начинали производить белок WNT16B, внедряя его в микроокружение опухоли и вызывая рост раковых клеток, вторгающихся в окружающие ткани и сопротивляющиеся химиотерапии.
Особое значение имеют препараты на основе биофлавоноидов с низким цито- и генотоксическим действием. Так, большинство растительных экстрактов, содержащих флавоноиды. не только не являются мутагенами, но и сами могут выступать в роли протекторов индуцированного мутагенеза (Бариляк И.Р. Антимутагенные и генопротекторные свойства препаратов растительного происхождения / И.Р. Бариляк// Цитология и генетика. 1994. №3. С. 3-17; Басова Е.В. Антимутагенные свойства экстрактов багульника болотного / Е.В. Басова [и др.] // Фармация. 2004. №4. С. 40-41; Агабейли Р.А. Антимутагенная активность масла плодов Fagus orientalis (Fagaceae) / Р.А. Агабейли//Растительные ресурсы. 2012. Вып. 2. С. 267-272).
Известно средство лечения саркомы (саркомы Капоши), представляющее собой комплекс соединений, блокирующих рецепторы морфина, и соединений группы энкефалина и эндорфина, облегчающие проникновение первой группы соединений в клетки человека (Патент Франции №92/15281, МПК А61К 9/08, опубл. 1992), которые одномоментно вводятся внутривенно.
Недостатком средства является то, что оно не обладает селективностью в отношении опухолевого процесса, в результате чего происходит блокировка рецепторов морфина всего организма, в том числе в коре головного мозга, желез внутренней секреции, гипоталамуса. Кроме того, под тригерным действием энкефалина и эндорфина и их влиянием на биохимический гомеостаз организма развиваются такие побочные эффекты, как общая слабость, неконтролируемые скачки артериального давления, нарушения со стороны центральной и периферической нервной систем, желудочно-кишечного тракта.
Известно также средство, которое можно применять при стандартной химиотерапии для вовлечения в терапию ФАО и злокачественных клеток (Takeda Y., Tsujino K., Kijima Т. & Kumanogoh A. Efficacy and safety of pirfenidone for idiopathic pulmonary fibrosis. Patient Prefer. Adherence 8, 361-370 (2014)). Средство представляет собой иммунодепрессивный препарат для лечения идиопатического фиброза легкого, направленный на активацию фибробластов, ассоциированных с фиброзом (ФАФ) и усиление их секреторных функций (https://www.roche.ru/home/prjess-zjentr/news/news-2014-10-21.html) - пирфенидон (эсбриет).
Недостатком средства является то, что оно не может выступать как самостоятельное противоопухолевое средство, а только в совокупности со стандартной химиотерапией, которая, как известно, наряду с высокой токсичностью, не обладает избирательным действием в отношении опухолевых клеток. К тому же пирфенидон не вызывает дистрофических изменений опухолевой ткани. Кроме того, у пациентов,
получавших Эсбриет, были выявлены следующие побочные эффекты: повышение уровня печеночных ферментов в крови (признак поражения печени, в 3,7%), фотосенсибилизация или сыпь (у 9,0%), а также побочные эффекты со стороны желудочно-кишечного тракта, в связи с которыми 2,2% пациентов пришлось прекратить лечение.
Известно средство - кальцитриол (активная форма витамина D животных стероидной природы), способное репрограммировать звездчатые клетки поджелудочной железы, дающие начало ФАО при аденоме предстательной железы, возвращая их к нормальному фенотипу (Sherman М.Н. et al. Vitamin D receptor-mediated stromal reprogramming suppresses pancreatitis and enhances pancreatic cancer therapy. Cell 159, 80-93 (2014).
Недостатком данного средства является воздействие только на клетки, дающие начало ФАО, а не самим ФАО и не на опухолевые клетки, в результате чего не происходит атрофических изменений опухолевой ткани саркомы и ее замещения соединительной тканью.
Известно средство для лечения рака - сибротузумаб, представляющее собой гуманизированное моноклональное антитело, которое связывается с белком-активатором фибробластов, в результате чего происходит таргетированное воздействие на ФАО [Scott AM; Wiseman G; Welt S; Adjei A; Lee Ft; Hopkins W; Divgi CR; Hanson LH; et al. (2003). "A Phase I dose-escalation study of sibrotuzumab in patients with advanced or metastatic fibroblast activation protein-positive cancer". Clinical Cancer Research. 9 (5): 1639-47; Kloft C; Graefe EU; Tanswell P; Scott AM; Hofheinz R; Amelsberg A; Karlsson MO (2004). "Population pharmacokinetics of sibrotuzumab, a novel therapeutic monoclonal antibody, in cancer patients". Investigational new drugs.22 (1): 39-52; Wang X.M., Yu D.M., Mc Caughan G.W. & Gorrell M.D. Fibroblast activation protein increases apoptosis, cell adhesion, and migration by the LX-2 human stellate cell line. Hepatology 42, 935-945 (2005)].
Недостатком такого средства является то, что он не влияет на сами опухолевые клетки и, в частности, не вызывает атрофию опухолевой ткани и не способствует переходу клеток опухоли из фазы G1 клеточного цикла в состояние покоя G0 и активации в них апоптоза.
Наиболее близким к заявленному средству относится средство на основе винбластина - винбластин сульфат (Е. Klein, R.A. Schwartz, Y. Laor, Н. Mz/cdilgrom, G. Н Burgess, О.A. Holtermann. Treatment of kaposi's sarcoma with vinblastine // Cancer, 1980, vol. 45. P. 427-431), который систематически внутривенно вводится пациентам с саркомой Капоши в режиме низких доз.
Недостатком средства является высокая цитостатическая активность в сочетании с иммуносупрессивным действием и наличие выраженных побочных реакций за счет неизбирательного цитостатического эффекта; винбластина угнетает пролиферирующую лимфоидную ткань, лимфа-, эритро- и тромбоцитопоэз. Кроме того, под действием этого средства не происходит атрофических и дистрофических изменений опухолевой ткани, не происходит перехода клеток опухоли из фазы G1 клеточного цикла в состояние покоя G0 и активации апоптоза, не происходит воздействия на симбиотические отношения между опухоль-ассоциированными фибробластами (ФАО) и опухолевыми клетками, в результате чего средство не приводит к замещению опухоли соединительной тканью
На данный момент не известно противоопухолевого средства, вызывающее переход клеток опухоли из фазы G1 клеточного цикла в состояние покоя G0, препятствующее взаимодействию ФАО и опухолевых клеток, и способствующее переходу опухоль-ассоциированных фибробластов (ФАО) в фибробласты соединительной ткани, что в итоге приводило бы к прекращению дальнейшей опухолевой прогрессии.
Нами впервые получено средство, приводящее к замещению саркомы в экспериментах in vivo соединительной тканью за счет воздействия на симбиотические отношения между опухоль-ассоциированными фибробластами (ФАО), а также приводящее к переводу клеток опухоли из фазы G1 клеточного цикла в состояние покоя G0.
Кроме того, можно предложить, что экстракт из листьев аврана лекарственного будет обладать теми же свойствами, что и экстракт аврана лекарственного из листьев и цветков или надземной части, а именно не обладает цито- и генотоксичностью, а, наоборот, выступает в роли генопротектора (Курчатова М.Н., Дурнова Н.А., Полуконова Н.В. «Влияние экстрактов, содержащих биофлавоноиды, на индукцию микроядер диоксидином в эритроцитах крови беспородных белых мышей // Вестник Воронежского государственного университета. Серия: Химия. Биология. Фармация 2014. 2. С. 58-65), не вызывает повреждения ДНК фибробластов, что, в конечном счете, не вызывает стимуляцию роста опухолевых клеток. Также известно, что авран лекарственный обладает доказанным противоопухолевым, иммуномодулирующим и антикахектическим действиями (Патент на изобретение RUS 2519769 21.03.2013. Средство, обладающее противоопухолевым и иммуномодулирующим действием. Полуконова Н.В., Наволокин Н.А., Дурнова Н.А., Маслякова Г.Н., Бучарская А.Б.; Патент на изобретение RUS 2578440 13.04.2015. Средство для лечения опухолевой кахексии. Наволокин Н.А., Полуконова Н.В., Тычина С.А., Мудрак Д.А., Маслякова Г.Н., Бучарская А.Б., Корчаков Н.В.).
Логично предположить, что экстракт аврана из листьев полученный аналогичным способом, как и экстракт из листьев и цветков нетоксичен (Наволокин Н.А., Полуконова Н.В., Маслякова Г.Н., Бучарская А.Б., Дурнова Н.А. Морфология внутренних органов и опухоли лабораторных крыс с перевитым раком печени РС-1 при пероральном введении флавоноидсодержащих экстрактов аврана лекарственного (Gratiola officinalis L.) и кукурузы антоциановой (Zea mays L.) // Саратовский научно-медицинский журнал. 2013. Т. 9. №2. С. 213-220).
Средство представляет собой упаренный экстракт листьев аврана лекарственного, полученный путем измельчения их, экстракции спиртом 96% (Полуконова Н.В., Наволокин НА., Дурнова Н.А., Маслякова Г.Н., Бучарская А.Б. Способ получения сухого экстракта из растительного сырья, обладающего биологической активностью // Патент на изобретение RUS 2482863 15.02.2012).
Всесторонние испытания, направленные на определение путей и механизмов, за счет которых реализуется противоопухолевый эффект экстракта листьев аврана лекарственного, привели к открытию у него способности к замещению опухолевой ткани саркомы соединительной тканью, за счет воздействия на симбиотические отношения между ФАО и опухолевыми клетками, приводящее к замещению опухоли соединительной тканью в экспериментах in vivo.
Дизайн эксперимента in vivo. Использовано 70 самцов белых лабораторных крыс линии Вистар массой 150±50 гр, которым подкожно, в область лопатки, имплантировали по 0,5 мл 25% опухолевой взвеси в растворе Хэнкса саркомы-45, полученной из банка опухолевых штаммов ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. Животные с перевиваемой саркомой методом случайной выборки были разделены на три группы по 10 крыс - первую и вторую опытные, получавшие водный раствор сухого экстракта листьев аврана перорально и внутримышечно в одинаковой дозировке 110 мг/кг и третью - группу сравнения, животные с перевиваемой опухолью, но без воздействия, четвертую группу составили интактные здоровые животные. В опытных группах крысам раствор экстракта листьев аврана вводили перорально и внутримышечно, ежедневно, в течение двух недель, начиная через 78 часов после трансплантации опухоли.
При разработке дизайна экспериментов использовали «Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (Хабриев Р.У., 2005) и «Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств» (Миронов А.Н., 2012). Работу с лабораторными животными осуществляли согласно протоколу исследований, не противоречащих Женевской Конвенции 1985 г. о «Международных принципах биомедицинских исследований с
использованием животных» и Хельсинкской декларацией 2000 г. о гуманном отношении к животным, а также в соответствии с положением приказа №755 МЗ СССР от 12.08.1977 года.
По окончанию опыта (через 2 недели) крыс выводили из эксперимента и для дальнейшего исследования производили забор опухоли.
Динамику роста опухоли оценивали по изменению ее объема по формуле: V=A×B×C, где А - ширина, В - толщина, С - высота опухоли. Измерения проводили электронным штангенциркулем каждый день от начала эксперимента. Высчитывали индекс торможения роста опухоли - показатель эффективности противоопухолевого препарата, вычисляемый по формуле: ИТ=[(Мконтр-Мопыт)/Мконтр]*100%, где Мконтр - средняя масса опухоли в группе контроль, а Мопыт - опытной группы (вычисляется масса опухоли, полученная на конец эксперимента).
Учитывали наличие атрофических и некробиотических изменений, а также такие цитоморфометрические показатели, как: диаметр раковой клетки и диаметр ядра опухолевой клетки, соотношение диаметров раковой клетки и ее ядра, ядерно-цитоплазматический индекс (ЯЦИ), среднее количество клеток в поле зрения, а также количество уже погибших клеток (отсутствие ядра).
Морфометрические измерения и микрофотографирование проводили не менее чем на 100 клетках или в 10 полях зрения каждого микропрепарата, с помощью Микровизора медицинского проходящего света μVizo-103 (ЛОМО). Использовали увеличение 246 и 774. Статистический анализ выполнен при помощи программного обеспечения STATISTICA 20.0 Interprise. Для сравнения средних полученных показателей был использован критерий Крамера-Уэлча (Т), при котором разность средних арифметических двух выборок (контрольной и экспериментальной) делится на естественную оценку среднего квадратического отклонения этой разности. При данном методе отличия средних определяется при Т≥1,96 с вероятностью в 95%.
Морфологические изменения в саркоме 45. В контроле опухоль в группе животных без воздействия экстракта была в основном сохранна и представляла собой веретеноклеточную саркому, состоящую из плотно расположенных пучков веретеновидных вытянутых клеток, разных размеров и формы, распространяющихся в разных направлениях.
На фиг. 1 А при окраске гематоксилином и эозином при увеличении × 246 представлено морфологическое строение саркомы -45 в группе сравнения: ядра гиперхромные, крупные овально-округлые, веретенообразные, хроматин в виде зернистых скоплений; ядрышки крупные, гаперхромные, чаще по одному; митозов много - до 3 и
более в поле зрения, что в целом свидетельствует о высокой пролиферативной активности клеток саркомы. Для цитоплазмы клеток саркомы -45 характерна повышенная базофилия, свидетельствующая о происходящем в ней интенсивном белковом синтезе, что свойственно растущим, регенерирующим, опухолевым тканям. Опухоль окружена периферической капсулой с полнокровными сосудами. На фиг. 1 Б при увеличении ×774 в центре опухоли наблюдали в единичных случаях очаги дистрофически измененных клеток и маленькие некрозы опухоли (обозначены стрелкой), обусловленные ее быстрым ростом.
В эксперименте под действием экстракта аврана при обоих способах введения отмечали выраженный патоморфоз опухоли на 14 день после введения. На фиг. 2 А при окраске гематоксилином и эозином при увеличении ×246,4 в саркоме под действием экстракта видны обширные, четко отграниченные поля некроза. Стрелкой обозначена четкая граница между некрозом и сохранной тканью опухоли, площадь некроза превышала одно поле зрение при увеличении ×64. На фиг. 2 Б при увеличении ×774,4 в саркоме под действием экстракта аврана заметно уменьшение размеров клеток в отличие от группы сравнения, что говорит об атрофии в жизнеспособных клетках саркомы (обозначена стрелками), появление участков фиброза и выраженная дезорганизации соединительной ткани, в результате чего происходит дезорганизация и опухолевой ткани. Наблюдалась потеря контакта ФАО с клетками опухоли, в дальнейшем приводящая к прекращению опухолевой прогрессии. Большая часть клеток саркомы по размерам ядер сопоставима с клетками неопухолевой ткани, что свидетельствует о резком снижении их пролиферативной активности.
При проведении морфометрии наблюдали снижение среднего числа клеток (СКК) в поле зрения в 1,7 раза (при увеличении ×774,4) и увеличение клеток в состоянии некроза и некробиоза, как при внутримышечном, так и при пероральном путях введения экстракта из листьев аврана (табл. 1).
Выявили уменьшение размеров диаметра ядра при внутримышечном в 1,6 раза и в 1,5 раза при пероральном пути введения экстракта листьев аврана и статистически значимое уменьшение среднего диаметра клетки при внутримышечном его введении в 1,5 раза по сравнению с группой, что свидетельствовало об атрофических изменениях в клетках под действием экстракта. При этом значение ядерно-цитоплазматического индекса (ЯЦИ) (табл. 1) также уменьшалось по сравнению с группой сравнения в 1,3 раза при внутримышечном пути введения и 1,2 раза при пероральном пути введения экстракта аврана, что также свидетельствует о замедлении процессов пролиферации в опухолевой ткани.
На фиг. 3 А представлен участок саркомы -45 крыс при окраске соединительной ткани оранжевым, красным, голубым при увеличении × 774 в группе сравнения, в ткани опухоли между клетками выявляли тонкие прослойки соединительной ткани, обозначенные стрелкой. На фиг. 3 Б представлен участок саркомы 45 после перорального введения экстракта аврана: стрелкой показана зона разрастания соединительной ткани (окрашивается в синий цвет) и замещении ею опухолевой ткани саркомы. При введении экстракта аврана, как внутримышечном, так и пероральном, наблюдали появление участков склерозирования самой ткани опухоли.
На фиг. 4 А представлен участок саркомы -45 при увеличении × 774 при окраске метиловым зеленым - пиронином по Браше в группе сравнения: отмечали высокий уровень РНК в ядрах клеток саркомы группы сравнения (красный цвет). Что свидетельствовало об активной транскрипционной активности в клетках опухоли. На фиг. 4 Б представлен участок саркомы при пероральном введении экстракта: отмечали выраженное снижение экспрессии ядерной РНК или совсем ее отсутствие в клетках опухоли, что свидетельствовало об уменьшении транскрипционной активности или разрушении РНК. Окрашивание ядер сохранялось только в немногочисленных клетках под капсулой опухоли, стрелкой обозначена клетка с сохранившейся транскрипционной активностью.
На фиг. 5 А видно, что при гистохимической окраске саркомы -45 лектином зародышей пшеницы WGA (при увеличении ×774) в группе сравнения была отрицательная экспрессия, что свидетельствовало о том, что клетки саркомы были живыми. На фиг. 5 Б при увеличении ×774 видно, что при внутримышечном и пероральном введении экстракта аврана лектин WGA, давал положительную реакцию (коричневое окрашивание образуется в результате связывания с N-ацетил-D-глюкозамином и N-ацетил-нейраминовой кислотой), окрашивая гибнущие клетки опухоли (обозначенные стрелкой).
На фиг. 6 А представлен участок саркомы -45 при увеличении × 774 при иммуногистохимическом окрашивании маркером пролиферации Ki67 (с докрашиванием ядер гематоксилином), позволяющем выделить опухолевые клетки, находящиеся в активной фазе клеточного цикла на всем его протяжении (G1-, S-, G2- и N-фазы). Клетки, находящиеся в активной фазе и окрашенные в коричневый цвет, обозначены стрелкой. Индекс пролиферации составил 0,56, при этом больше половины клеток в поле зрения давали выраженную экспрессию (табл. 2), что указывало на высокую пролиферативную активность опухолевых клеток. На фиг. 6 Б представлен участок саркомы при внутримышечном введении экстракта: маркер пролиферации Ki67 давал чрезвычайно слабую экспрессию, индекс пролиферации при внутримышечном введении составил 0,01, а при пероральном - 0,09, что указывало на резкое снижение пролиферативной активности клеток опухоли, за счет перехода клеток опухоли из фазы G1 клеточного цикла в состояние покоя G0.
На фиг. 7 представлены результаты имунногистохимического окрашивания участка саркомы -45 маркером апоптоза р53 с докрашиванием ядер гематоксилином: на фиг. 7 А при увеличении ×2 46 и на фиг. 7 Б при увеличении × 774 в группе сравнения: экспрессия отсутствовала. На фиг. 7 В при пероральном пути введения экстракта аврана при увеличении × 774 и на фиг. 1С - при внутримышечном введении экстракта при увеличении ×774 отмечали появление умеренной, как цитоплазматической, так и ядерной экспрессии маркера апоптоза р53 (обозначены стрелками). Данная реакция была наиболее выражена в зонах наибольшего повреждения опухоли и в клетках с более конденсированным хроматином. При внутримышечном введении экстракта процент экспрессировавших клеток достигал 69%, а при пероральном пути - 39%, экспрессия была особенно выражена при внутримышечном пути и была более слабой при пероральном введении.
Полученные нами гистологические данные свидетельствуют об атрофии саркомы под действием экстракта аврана вполне согласуются с уменьшением ее объема. Так, при внутримышечном введении экстракта аврана в дозировке 110 мг/кг/сут в течение двух недель отмечали (Т>1,96) замедление темпов роста перевиваемой саркомы по сравнению с контролем с 4 дня от начала эксперимента. На момент окончания эксперимента объем опухоли в группе с внутримышечным введением аврана лекарственного (5,30±1,94 см3) был на 71,6% меньше (Т>1,96), чем в контроле (18,01±3,39 см3).
При пероральном ведении экстракта листьев аврана 110 мг/кг/сут в течение двух недель наблюдали (Т>1,96) замедление темпов роста опухоли по сравнению с группой сравнения только с 5-го дня от начала эксперимента. На момент окончания эксперимента объем опухоли в исследуемой группе был на 61,7% меньше объема группы сравнения (7,07±0,30; 18,01±3,39, соответственно).
На фиг. 8. представлена динамика роста объема перевитой саркомы -45 в группе сравнения и в группах с пероральным и внутримышечным введением экстракта аврана лекарственного. Значком «*» отмечена Т>1.96 достоверность различий более 95% при анализе значений группы с пероральным введением и группой сравнения. Индекс торможения по массе опухоли составил 60,7% для перорального введения и 70,6% для внутримышечного пути введения экстракта аврана (табл. 3). Максимально индекс торможения при внутримышечном введении составил 84,2%. В двух случаях макроскопически на конец эксперимента привитая опухоль не определилась.
Пример 1. Морфологические изменения в саркоме 45 и ее динамика роста при пероральном введении экстракта из листьев аврана крысам
Лабораторной крысе линии Вистар массой 183 гр подкожно в область лопатки имплантировали по 0,5 мл 25% опухолевой взвеси в растворе Хэнкса саркомы-45. Животному с перевивитой саркомой вводили водный раствор сухого экстракта из листьев аврана перорально в дозировке ПО мг/кг, ежедневно, в течение двух недель, начиная
через 78 часов после трансплантации опухоли. По окончанию опыта через 2 недели крысу вывели из эксперимента для дальнейшего исследования производили забор опухоли.
Под действием экстракта из листьев аврана отмечали выраженный патоморфоз опухоли на 14 день после введения. Под действием экстракта гистологически наблюдали обширные, четко отграниченные поля некроза, атрофия в живых клетках саркомы, появление участков фиброза и выраженная дезорганизации соединительной ткани. При проведении морфометрии наблюдали снижение среднего числа клеток по сравнению с цифрами известными для данной опухоли и появление клеток в состоянии некроза и некробиоза. Выявили уменьшение размеров диаметра ядра, что свидетельствовало об атрофических изменениях в клетках под действием экстракта.
При окраске оранжевым, красным, голубым ткани саркомы под действием экстракта была выявлена зона разрастания соединительной ткани и замещении ею опухолевой ткани саркомы, что говорит об склерозировании самой ткани опухоли.
При пероральном ведении экстракта из листьев аврана 110 мг/кг/сут в течение двух недель на момент окончания эксперимента объем опухоли у животного был (7,2 см3) на 61,7% меньше объема группы сравнения (18,5 см3).
Пример 2. Морфологические изменения в саркоме 45 и ее динамика роста при внутримышечном введении экстракта крысам
Лабораторной крысе линии Вистар массой 183 гр подкожно в область лопатки имплантировали по 0,5 мл 25% опухолевой взвеси в растворе Хэнкса саркомы-45. Животному с перевивитой саркомой вводили водный раствор сухого экстракта из листьев аврана внутримышечно в дозировке 110 мг/кг, ежедневно, в течение двух недель, начиная через 78 часов после трансплантации опухоли. По окончанию опыта через 2 недели крысу вывели из эксперимента, для дальнейшего исследования производили забор опухоли.
Под действием экстракта из листьев аврана отмечали выраженный патоморфоз опухоли на 14 день после введения. Под действием экстракта гистологически наблюдали обширные, четко отграниченные поля некроза, атрофия в живых клетках саркомы, появление участков фиброза и выраженная дезорганизации соединительной ткани. При проведении морфометрии наблюдали снижение среднего числа клеток по сравнению с цифрами известными для данной опухоли и появление клеток в состоянии некроза и некробиоза. Выявили уменьшение размеров диаметра ядра, что свидетельствовало об атрофических изменениях в клетках под действием экстракта.
При окраске оранжевым, красным, голубым ткани саркомы под действием экстракта была выявлена зона разрастания соединительной ткани и замещении ею опухолевой ткани саркомы, что говорит об склерозировании самой ткани опухоли.
При внутримышечном введении экстракта из листьев аврана в дозировке 110 мг/кг/сут в течение двух недель отмечали (Т>1,96) замедление темпов роста перевиваемой саркомы по сравнению с контролем с 4 дня от начала эксперимента. На момент окончания эксперимента объем опухоли в группе с внутримышечным введением аврана лекарственного (5,30±1,94 см3) был на 71,6% меньше (Т>1,96), чем в контроле (18,01±3,39 см3).
Таким образом, впервые описано противоопухолевое средство на основе растительного экстракта из листьев аврана лекарственного, вызывающее в экспериментах in vivo замещение опухолевой ткани соединительной. Также, средство вызывает переход подавляющего большинства клеток опухоли из фазы G1 клеточного цикла в состояние покоя G0, на что указывает резкое снижение значения индекс пролиферации, выявленное маркером пролиферации Ki67, что особенно выражено при внутримышечном введении экстракта из листьев аврана лекарственного. Под действием экстракта из листьев аврана на фоне резкого снижения (более 80%) динамики перевиваемой саркомы -45 крыс в экспериментах in vivo наблюдались: появление участков склероза и дезорганизации соединительной ткани и что важно склерозирование наблюдалось самой ткани опухоли, а также значимое снижение среднего числа опухолевых клеток (в 1,7 раз), за счет гибели клеток в основном путем апоптоза (69%); выраженная степень атрофических изменений в оставшихся живых опухолевых клетках, выраженное уменьшение в них транскрипционной активности ядерной РНК и резкое снижение пролиферативной активности.
Средство может быть использовано как самостоятельное - для лечения злокачественных новообразований, так и при создании комбинированных химиопрепаратов.
Средство, вызывающее в экспериментах in vivo замещение опухолевой ткани соединительной и переводящее клетки опухоли из фазы G1 клеточного цикла в состояние покоя G0, представляющее собой сухой экстракт листьев аврана лекарственного, полученный путем измельчения их, экстракции спиртом 96% на водяной бане до кипения и кипячения в течение 14-15 минут, выпаривания при температуре 55-60°C, разведения выпаренного остатка сначала дистиллированной водой при температуре 40-50°C, затем добавления хлороформа в пропорции 4/5 части воды и 1/5 части хлороформа, охлаждения до комнатной температуры и центрифугирования со скоростью 1500 оборотов в минуту в течение 15 минут с последующим отделением водной фракции и высушиванием ее.
