Способ индукции абскопального противоопухолевого эффекта в экспериментальной модели карциномы эрлиха

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной онкологии, и может быть использовано для индукции абскопального противоопухолевого эффекта в экспериментальной модели карциномы Эрлиха. Осуществляют подкожную билатеральную перевивку асцитной карциномы Эрлиха мышам, формирование опухолевых контралатеральных узлов на нижних конечностях и последующее локальное облучение одного из опухолевых узлов. Через 5 суток после одномоментной билатеральной перевивки опухоли и формирования опухолевых узлов с двух сторон проводят локальное однократное облучение одного из опухолевых узлов γ-лучами ⁶⁰Co в дозе 30 Гр, без предварительной стимуляции иммунитета животных. Способ обеспечивает создание экспериментальной модели для реализации абскопального эффекта в отношении удаленной опухоли без использования дополнительных индукторов за счет подбора оптимальных доз и режимов лучевой терапии, что приводит к системной активации иммунно-опосредованного противоопухолевого ответа, в том числе и на удаленные метастатические опухолевые очаги. 2 ил., 3 табл.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальным исследованиям в онкологии, и может быть использовано для реализации абскопального радиационного эффекта, а именно в системной активации иммунно-опосредованного противоопухолевого ответа, в том числе и на удаленные метастатические опухолевые очаги при локальном воздействии радиации c целью изучения механизмов данного эффекта.

Известно, что лучевая терапия это одна из ведущих терапевтических опций в комплексном лечении онкологического больного. Исследования и достижения данного метода лечения в основном сосредоточены на поиске снижения токсичности и улучшения терапевтического потенциала лучевой терапии при лечении локализованных опухолей.

Однако известно, что лучевое воздействие может быть рассмотрено, как индуктор системных иммунологических реакций, приводящих к развитию противоопухолевого эффекта.

Последнее время появились экспериментальные разработки, исследующие возможности системной активации иммунитета и реализации иммуноопосредованного системного противоопухолевого ответа в отношении удаленных метастазов при локальном воздействии лучевой терапии на опухоль, так называемый «абскопальный эффект». Данные исследования предоставляют широкую возможность для разработки новых, более эффективных схем лучевой терапии у онкологических больных.

Термин «абскопальный» был впервые введен в 1953 году R.H.Mole для описания ответа на облучение опухолевыми клетками, расположенными на удалении от облученного участка (MoleRH.Whole body irradiation — radiobiology or medicine?Br J Radiol. 1953; 26:234–241; Andrews, JR. The Radiobiology of Human Cancer Radiotherapy. Univ. Park Press; 1978; Hu ZI, McArthur HL, Ho AY. The abscopal effect of radiation therapy: what is it and how can we use it in breast cancer? Curr Breast Cancer Rep. 2017; 9:45–51; Siva S, MacManus MP, Martin RF, Martin O. An Abscopal effects of radiation therapy: a clinical review for the radiobiologist. CancerLett.2013; 356:82–90).

За прошедшие годы этот редкий биологический эффект был зарегистрирован для нескольких видов рака, включая меланому, почечно-клеточный рак, рак молочной железы, гепатоцеллюлярный рак и другие метастатические солидные опухоли (PostowMA, etal.Immunologic correlates of the abscopal effect in a patient with melanoma. N Engl J Med. 2012; 366:925–931; Wersall PJ, et al. Regression of non-irradiated metastases after extracranial stereotactic radiotherapy in metastatic renal cell carcinoma.ActaOncol. 2006; 45:493–497; Ohba K., et al. Abscopal regression of hepatocellular carcinoma after radiotherapy for bone metastasis. Gut. 1998; 43:575–577; Golden EB, et al. Local radiotherapy and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor to generate abscopal responses in patients with metastatic solid tumours: a proof-of-principle trial. LancetOncol.2015; 16:795–803).

Известно, что гибель опухолевых клеток под влиянием ионизирующего излучения является иммуноопосредованной и взаимосвязана с целостностью иммунной системы хозяина. В целом участие иммунной системы в реализации противоопухолевого ответа при воздействия лучевой терапии на удаленные метастазы подтверждено (DemariaS, etal.Ionizing radiation inhibition of distant untreated tumors (abscopal effect) is immune mediated. Int J RadiatOncolBiol Phys. 2004; 58:862–870; Chakravarty PK, et al. Flt3-ligand administration after radiation therapy prolongs survival in a murine model of metastatic lung cancer. Cancer Res. 1999; 59:6028–6032; Camphausen K, et al. Radiation abscopal antitumor effect is mediated through p53. CancerRes. 2003; 63:1990–1993).

Однако возможные механизмы и биологические маркеры, определяющие вероятность развития абскопального эффекта на настоящий момент четко не определены.

Полученные к настоящему моменту данные позволяют предположить, что лучевая терапия может индуцировать иммунный ответ организма и возможно изменить репертуар иммунокомпетентных клеток или активировать экспрессию в опухоли факторов, создающих иммуногенный фон.

Однако, радиационно индуцированный ответ - явление в клинической практике редкое, активация иммунитета и запуск каскада гибели опухолевых клеток в месте облучения далеко не всегда опосредует эффект в отношении удаленных очагов. Факторы, определяющие возможность развития данного эффекта у конкретного больного на настоящий момент не установлены.

Решающее значение в достижении абскопального эффекта имеют дозы и подбор взаимодополняющей комбинации терапевтических воздействий (лучевая терапия+ таргетная терапия или иммунотерапия). Важным, по всей видимости, является и особое состояние иммунной системы реципиента.

В связи с этим актуальным представляется разработка оптимальных экспериментальных моделей для изучения иммуноопосредованного антиметастатического воздействия локального облучения.

Известно несколько экспериментальных моделей для изучения абскопального эффекта.

Так для оценки не собственно абскопального эффекта (реализация противопухолевого эффекта на удаленные не облучаемые очаги), а эффекта исходной иммунной инициации и анализа изменений в облучаемой опухолевой ткани применяется модель с одной опухолью. Для этого или культивируемые in vitro опухолевые клетки или опухолевые клетки животного донора вводят подкожно и через 1-3 недели (в зависимости от типа опухоли) проводят обучение опухолевого очага. Данные эффекты изучены в отношении меланомы (опухолевые линии -B16-F10/OVA, B16-F10, MeWo, однократное облучение в дозах 15, 20, 25 и 35 Gy, и фракционное по 5 и 15 Gy до суммарной дозы 15 и 45 Gy, соответственно), колоректальной карциномы (опухолевые линии -МС38, МС38/SY, СТ25 однократное облучение в дозе 15, 20 и 35 Gy и 2 фракционное облучение по 15 Gy, при усилении эффекта посредством одновременного применения дендритно-клеточных вакцин) (BurnetteBC, LiangH, LeeY, etal.The efficacy of radiotherapy relies upon induction of type I interferon-dependent innate and adaptive immunity. Cancer Res. 2011; Deng L, Liang H, Xu M, et al. STING-dependent cytosolic DNA sensing promotes radiation-induced type I interferon-dependent antitumor immunity in immunogenic tumors. Immunity. 2014; Lugade AA, Moran JP, Gerber SA, Rose RC, Frelinger JG, Lord EM. Local radiation therapy of B16 melanoma tumors increases the generation of tumor antigen-specific effector cells that traffic to the tumor. J Immunol. 2005; Lugade AA, Sorensen EW, Gerber SA, Moran JP, Frelinger J G, Lord EM. Radiation-induced IFN-production within the tumor microenvironment influences antitumor immunity. J Immunol.2008; Gerber SA, Sedlacek AL, Cron KR, Murphy SP, Frelinger JG, Lord EM. IFN-gamma mediates the antitumor effects of radiation therapy in a

murine colon tumor. Am J Pathol, 2013).

Другой известный тип экспериментальных моделей используется для изучения отсроченного системного эффекта – иммуноопосредованной защиты от рецидива или возможного развития метастазов. При этом животным трансплантируется опухоль, которая излечивается посредством лучевой терапии, а затем этому же животному повторно трансплантируется опухоль, которая в случае достижения длительного системного противопухолевого ответа не приживается. В подобных моделях изучены ответы мышиных карцином и карциномы легких человека (опухолевая линия LLC, однократное облучение в дозе 60 Gy с усилением эффекта посредством введения FLt3-лигандов) а также почечно-клеточный рака (опухолевая линия RENCA, три фракции по 1 и 2 Gy и однократное облучение в дозах 5 и 50 Gy с усилением эффекта посредством введения различных типов клеточных вакцин и цитокинов) и индуцированные метилхолантреном фибросаркомы (однократное облучение в дозе 60 Gy) (ChakravartyPK, GuhaC, AlfieriA, etal.Flt3L therapy following localized tumor irradiation generates long-term protective immune response in metastatic lung cancer: Its implication in designing a vaccination strategy. Oncology. 2006; Dranoff G, Jaffee E, Lazenby A, et al. Vaccination with irradiated tumor cells engineered to secrete murine granulocyte-macrophage colony-stimulating factor stimulates potent, specific, and long-lasting anti-tumor immunity. Proc Natl AcadSci USA. 1993; Nishisaka N, Maini A, Kinoshita Y, et al. Immunotherapy for lung metastases of murine renal cell carcinoma: Synergy between radiation and cytokine-producingtumor vaccines. J Immunother. 1999;Schaue D, Ratikan JA, Iwamoto KS, McBride WH. Maximizing tumor immunity with fractionated radiation. Int J RadiatOncolBiol Phys. 2012; Klug F, Prakash H, Huber PE, et al. Low-dose irradiation programs macrophage differentiation to an iNOS(+)/M1 phenotype that orchestrates effective T cell immunotherapy. Cancer Cell.2013; Teitz-Tennenbaum S, Li Q, Rynkiewicz S, et al. Radiotherapy potentiates the therapeutic efficacy of intratumoral dendritic cell administration. Cancer Res. 2003; Filatenkov A, Baker J, Mueller AM, et al. Ablative tumor radiation can change the tumor immune cell microenvironment to induce durable complete remissions. Clin Cancer Res. 2015; Vaage J. Influence of tumor antigen on maintenance versus depression of tumor-specific immunity.Cancer Res. 1973;Woglom WH. The duration and extent of induced resistance toward tumor transplantation in mice. JExpMed. 1912).

Недостатком данных моделей является невозможность изучения абскопального эффекта в отношении удаленных очагов.

Стандартной системой для индукции и изучения абскопальных эффектов как таковых является экспериментальная модель, в которой животному подкожно имплантируются две опухоли (левый, правый бок или левая, правая задняя конечность) и облучается только одна из них. В случае достижения абскопального эффекта наблюдается задержка роста необлученного опухолевого очага, либо даже регрессия. Данная экспериментальная модель может быть реализована различными способами. Первый способ – стандартный, описанный выше, альтернативно вторичная опухоль вводится внутривенно или в селезенку, что приводит к множественным диссеминированным опухолевым узлам в определенном органе (легкие, печень). В данном случае конечной точкой является количественное определение роста опухоли в необлученном органе (простой подсчет или определение веса органа, инфильтрированного опухолью. В случае реализации абскопального эффекта степень роста опухоли в необлученном очаге заметно уменьшается. И классический и альтернативный варианты данной модели реализованы в отношении мышиной нейробластомы (линия С1300, облучение в режиме фракционирования до суммарной дозы 9,12, 112 Gy по 3 Gy однократно), ортотопическойглиобластомы (линия GL261/Luc, однократная доза в 10 Gy) и колоректальных раков (линии CT26 и MC38, однократные дозы 20 и 30 Gy и фракционные дозы по 8 и 6 Gy до суммарной дозы 24 и 30 Gy), лимфомы (линия SL2, однократная доза в 20 Gy), рака простаты (линия RM-1, однократная доза в 5 Gy), рака молочной железы (линия TM40D, однократная доза в 1 и 6Gy и линия TSA, однократная доза в 20 Gy и фракционные дозы по 8 и 6 Gy до суммарной дозы 24 и 30 Gy, линия 67NR, фракционная доза по 3 Gy до суммарной 24 Gy, а также линия FM3А, однократная доза 6 Gy), мезотелиомы (АВ12б фракционировано по 5 Gy до суммарной дозы 15 Gy) (TatsutaK, TanakaS, TajiriT, etal. Complete elimination of established neuroblastoma by synergistic action of gamma-irradiation And DCs treated with rSeV expressing interferon-beta gene. Gene Ther. 2009; Zeng J, See AP, Phallen J, et al. Anti-PD-1 blockade and stereotactic radiation produce long-term survival in mice with intracranial gliomas. Int J RadiatOncolBiol Phys. 2013; Everse LA, Renes IB, Jurgenliemk-Schulz IM, et al. Local low-dose interleukin-2 induces systemic immunity when combined with radiotherapy of cancer. A pre-clinical study.Int J Cancer. 1997;Chhikara M, Huang H, Vlachaki MT, et al. Enhanced therapeutic effect of HSV-tk+GCV gene therapy and ionizing radiation for prostate cancer. MolTher. 2001; Vlachaki MT, Chhikara M, Aguilar L, et al. Enhanced therapeutic effect of multiple injections of HSV-TK + GCV gene therapy in combination with ionizing radiation in a mouse mammary tumor model. Int J RadiatOncolBiol Phys. 2001; Dewan MZ, Galloway AE, Kawashima N, et al. Fractionated but not single-dose radiotherapy induces an immune-mediated Abscopal effect when combined with anti-CTLA-4 antibody. Clin Cancer Res. 2009; Habets TH, Oth T, Houben AW, et al. Fractionated radiotherapy with 3 x 8 Gy induces systemic anti-tumour responses and abscopaltumour inhibition without modulating the humoral anti-tumour response. PLoS ONE. 2016; Kanegasaki S, Matsushima K, Shiraishi K, Nakagawa K, Tsuchiya T. Macrophage inflammatory protein derivative ECI301 enhances the alarmin-associated abscopal benefits of tumor radiotherapy. Cancer Res. 2014).

Другой вариант данной модели, когда одна опухоль прививается животному внутривенно и формирует органные опухолевые очаги, а затем облучается половина пораженного органа. Однако общепризнано, что данная модель является неудачной, поскольку контролировать зону облучения затруднительно. Данный подход использован в оценке абскопального эффекта при колоректальном раке (МС38, однократная доза в 7,5 Gy) и мышином почечноклеточном раке (RENCA, малые дозы облучения) (WuL, WuMO, DelaMazaL, etal.Targeting the inhibitory receptor CTLA-4 on T cells increased abscopal effects in murine mesothelioma model. Oncotarget. 2015;Younes E, Haas GP, Dezso B, et al. Local tumor irradiation augmentsthe response to IL-2therapy in a murine renal adenocarcinoma. CellImmunol. 1995).

Недостатками данных экспериментальных моделей являются отсутствие конкретных рекомендаций в отношении дозы (существенный диапазон), определяющей абскопальный эффект, а также использование дополнительных иммунологических индукторов (цитокины, клеточные вакцины, ингибиторы контрольных точек иммунитета) противоопухолевого ответа, что не позволяет оценить собственно эффект лучевого воздействия.

Общими недостатками данных экспериментальных моделей являются отсутствие конкретных рекомендаций в отношении дозы (существенный диапазон), определяющей абскопальный эффект, а также использование дополнительных иммунологических индукторов (цитокины, клеточные вакцины, ингибиторы контрольных точек иммунитета) противоопухолевого ответа, что не позволяет оценить собственно эффект лучевого воздействия.

Во всех перечисленных экспериментальных моделях для получения абскопального эффекта использованы дополнительные индукторы (цитокины) и/или нет четкого контроля зоны облучения, что существенно снижает ценность предложенной модели в отношении реализации абскопального эффекта.

Самыми близкими являются работы:

1. Абляционное облучение опухоли может изменить микроокружение опухолевых иммунных клеток и индуцировать длительную полную ремиссию (Filatenkov A, Baker J, Mueller AM, et al. Ablative tumor radiation can change the tumor immune cell microenvironment to induce durable complete remissions. Clin Cancer Res. 2015).

В отличие от известного способа в заявляемом техническом решении использована клеточная линия более агрессивной опухоли (асцитная карцинома Льюиса), которая была привита одномоментно билатерально (воспроизведен мультицентричный рост опухоли). Для получения абскопального эффекта в прототипе была использована внутриопухолевая вакцинация аутологичной дендритной вакциной. В предлагаемой модели за счет другого временного интервала облучения абскопальный эффект получен без использования дополнительных средств воздействия на опухоль или иммунитет.

2. Фракционная лучевая терапия 3 х 8 гр индуцирует системные противоопухолевые реакции и абскопальное ингибирование опухоли без модуляции гуморального противоопухолевого ответа (HabetsTH, OthT, HoubenAW, etal.Fractionated radiotherapy with 3 x 8 Gy induces systemic anti-tumour responses and abscopal tumour inhibition without modulating the humoral anti-tumour response. PLoSONE. 2016).

Отличием от известного способа является то, в предлагаемом способе опухоль прививалась одномоментно с двух сторон (в прототипе с разницей в 2 дня). В прототипе фракционно до суммарной дозы в 24 Гр облучалась большая по размеру (условно первичная опухоль), регресс оценивали во вторичной опухоли. В предлагаемом нами решении опухоли прививались сразу, разницы в размерах облучаемого и необлучаемого опухолевого узла не было. Также в заявляемом способе облучение было не фракционным, к опухолевому очагу сразу подведена доза в 30 Гр. Отличием заявляемого способа также является использование более агрессивной мышиной асцитной карциномы молочной железы.

Техническим результатом заявляемого изобретения является разработка экспериментальной модели для реализации абскопального эффекта в отношении удаленной опухоли без использования дополнительных индукторов путем подбора оптимальных доз и режимов лучевой терапии.

Технический результат достигается тем, что также как и в известном способе мышам подкожно билатерально прививают опухоль асцитной карциномы Эрлиха, формируют опухолевые очаги и облучают опухолевый очаг.

Особенность заявляемого способа заключается в том, что через 5 суток после одномоментной билатеральной перевивки опухоли и формирования опухолевых узлов с двух сторон проводят локальное однократное облучение одного из опухолевых узлов γ-лучами⁶⁰Co в дозе 30 Гр, без предварительной стимуляции иммунитета животных.

Изобретение иллюстрируется подробным описанием, таблицами, примерами и иллюстрациями, на которых изображено:

Фиг. 1 - график динамики роста опухолевого штамма карциномы Эрлиха, трансплантированной в обе лапы мышам-самцам F₁ (СВАхС57ВL6), и локального облучения (5 сутки опухолевого роста) правого опухолевого узла в дозе 30 Гр., кривые: синяя - рост контрольной опухоли; розовая - рост немишенной опухоли (абскопальный эффект); зеленая - рост мишенной опухоли (30 Гр).

Фиг. 2 – фото животных: а) контрольная мышь и б) опытный образец с выраженной регрессией немишенного (необлученного опухолевого узла).

Способ осуществляют следующим образом.

(СВАхС57Вl6) массой 23-25г.,полученных из питомника «Столбовая». Животные находились в стандартных полипропиленовых боксах для содержания животных в условиях вивария, при естественном световом режиме, на стандартном пищевом рационе со свободным доступом к поилкам с водой.

Клетки асцитной карциномы Эрлиха в объеме 0,1 мл перевивали подкожно в область бедра обеих лап животных. Через 5 суток после перевивки опухоли 10 животных подвергали ионизирующему излучению локально на правую лапу в дозе 30 Гр (опытная группа). Облучение проводили гамма-лучами ⁶⁰Со на установке «Луч» с мощностью 0,952 Гр/мин. 10 необлученных животных с перевитой опухолью составили группу контроля.

При проведении локального облучения и для повышения точности наведения животное обездвиживают путем фиксации. На протяжении 20 суток после облучения измеряют объем опухолей на обеих лапах – облученной и необлученной и вычисляют процент торможения роста опухоли (уменьшение объема опухоли) по отношению к контрольным животным. Контролем служили мыши, которым была также перевита опухоль в обе лапы.

На протяжении пострадиационного периода у животных измеряли длину и ширину опухолевых узлов на обеих лапах, вычисляя объем опухоли по формуле: V= (а*в²) /2, где а - больший, а в - меньший размер узла.

Процент(%)торможения роста опухоли после облучения, если таковое было, вычисляли по формуле по отношению к правой или левой лапе контрольных животных:

( V_к – V_о) /V_к 100%.

Статистически значимые различия между группами оценивали с помощью t-критерия Стьюдента. Уровень статистической значимости принимали за р<0,05.

Через 6 суток после ионизирующего воздействия в 30 гр, объем опухоли на правой облученной лапе уменьшился в 2,3 раза, регрессия опухоли по отношению к контролю была достоверно значима и составила 57,1% (p = Объем опухоли на левой необлученной лапе незначительно уменьшился по отношению к объему опухоли в контроле - регрессия составила 10,3%. Через 8 суток от локального облучения в 30 Гр отмечено развитие регрессии немишенной опухоли. Регрессия опухоли на облученной лапе составила 83,8%, а на левой необлученной – 31,1%, что было достоверно значимо по отношению к объему опухоли в эти сроки у контрольной группы мышей (р= и р=, соответственно) (Таблица 1).

Как видно из таблицы 1, через 6 суток после ионизирующего воздействия в 30 гр объем опухоли на правой облученной лапе уменьшился в 2,3 раза, регрессия опухоли по отношению к контролю была достоверно значима и составила 57,1% (p =0,001). Объем опухоли на левой необлученной лапе незначительно уменьшился по отношению к объему опухоли в контроле - регрессия составила 10,3%. Через 8 суток от локального облучения в 30 Гр отмечено развитие регрессии немишенной опухоли. Регрессия опухоли на облученной лапе составила 83,8%, а на левой необлученной – 31,1%, что было достоверно значимо по отношению к объему опухоли в эти сроки у контрольной группы мышей (р=0,001).

Таблица 1

Динамика роста опухолевого штамма карциномы Эрлиха у мышей- самцов F₁ (СВАхС57ВL6) после локального облучения (5 сутки опухолевого роста) правого опухолевого узла в дозе 30 Гр

Время после облучения	Объем опухоли, см	Локализация опухоли	контроль	Опытная группа	Процент уменьшения объема опухоли
1 сутки после облучения (6 сутки роста опухоли		Справа	0,87±0,05	0,91±0,05	-
Слева		0,84±0,1	0,84±0,04	-
3 сутки после облучения (8сутки роста опухоли)		Справа	0,74±0,03	0,7±0,03	5,4%
Слева		0,76±0,04	0,86±0,07	-13,2%
6 сутки после облучения (11сутки роста опухоли)		Справа	0,91±0,04	0,39±0,02	57.1% *
Слева		0,97±0,11	0,87±0,06	10,3%
8 сутки после облучения (13 сутки роста опухоли)		Справа	1,36±0,08	0,22±0,03	83,8%*
Слева		1,48±0,12	1,02±0,06	31,1%*
10 сутки после облучения (15 сутки роста опухоли)		Справа	1,55±0,16	0,59±0,14	61,9%*
Слева		1,89±0,13	0,96±0,11	49,2%*
13 сутки после облучения (18 сутки роста опухоли)		Справа	2,3±0,19	0,39±0,09	83,9%*
Слева		2,65±0,07	1,85±0,13	30,2%*
17 сутки после облучения (22 сутки роста опухоли)		Справа	3,52±0,1	0,74±0,12*	79,0%*
Слева		3,31±0,25	1,75±0,14*	47,13%*
20 сутки после облучения (25 сутки роста опухоли)		Справа	4,3±0,15	0,98±0,19*	77,2%*
Слева	4,05±0,17	2,54±0,30*	36,7%*
Продолжительность жизни, сут	31,2±0,04

Примечание: Различия между контрольной и опытной группой статистически достоверны р<0,05.

Абскопальный эффект сохранялся на протяжении всего времени наблюдения. Через 10 суток после облучения процент торможения роста опухоли составил 61,9 и 49,2% соответственно. С учетом процента снижения темпа опухолевого роста, максимальный ответ немишенной опухоли – снижение темпа роста необлученной опухоли на 47,13% относительно контроля (р=0,0001) зафиксирован на 17 сутки после облучения (22 сутки опухолевого роста).

Гибель животных в группах – опытной и контрольной началась через 28 суток после инокуляции опухоли сначала в облученной группе, а затем в контрольной.

Таким образом, облучение правого опухолевого узла в дозе 30 Гр на ранней стадии роста (5 сутки после инокуляции) вызывает торможение роста левого необлученного опухолевого узла с 10 до 49% по отношению роста опухоли в контроле (Фиг.2).

Дополнительно была изучена иммунная реактивность животных на стадии абскопального эффекта.

Иммунную реактивность опытных мышей с перевитой опухолью Эрлиха в обе лапы в районе бедра и облученных в дозе 30 Грнефракционно локально на правую лапу гамма- лучами ⁶⁰Со на установке «Луч» определяли по содержанию антителообразующих клеток (АОК) в селезенке (системный ответ) после иммунизации тимусзависимым антигеном – эритроцитами барана. Антиген вводили через 9 суток после облучения (14 сутки опухолевого роста) внутрибрюшинно в дозе 1х10⁸ клеток на мышь. Количество АОК определяли безгелевым методом локального гемолиза по Каннингему на 4 сутки после иммунизации (См. Таблицу 2).

Таблица 2

Иммунологические показатели (М±m) у мышей-самцов F1 (CBAxC57Bl6) после инокуляции опухолевого штамма асцитной карциномы Эрлиха в обе лапы и локального облучения (5 сут) правого опухолевого узла в дозе 30 Гр

Группы животных	Селезенка
Масса, мг	Клеточность, 1х106	АОК, 1х103
Контрольные	199±21,8 (100±12,5)	135±13,9 (100±10,3)	369±10,0 (100±2,7)
Контроль-Опухоль	264±49,3 (133±24,6)	150±7,3 (111±5,4)	249±23,7* (67,5±6,4)
Опыт	135±14,2** (67,8±7,1)	66,0±5,1** (48,9±3,8)	55,0±18,3** (14,9±5,0)

Примечание: в скобках - % к контролю, * - статистически значимые различия с группой контрольных животных, ** - статистически значимые различия с группой опухолевых животных.

Как показали результаты исследования, иммунореактивность животных с перевитой опухолью в оба бедра (14 сутки после инокуляции) снижается до 67,5±6,4% от показателя иммунной реактивности контрольных животных. При этом масса и клеточность селезенки опухолевых животных статистически значимо не отличалась от показателей у контрольных особей.

Иммунореактивность опухолевых (14 сутки после инокуляции) животных после локального облучения в дозе 30 Гр снизилась в 4,5 раза по отношению к данному показателю у опухолевых необлученных мышей. Содержание АОК в селезенке составило 14,9±5,0% от показателя у интактных мышей.

То есть, несмотря на агрессивность опухолевого процесса и большую дозу радиационного воздействия, иммунная система остается чувствительной к антигенному стимулу.

На следующем этапе с целью изучения возможности усиления полученного абскопального эффекта и снижения дозной нагрузки в данной экспериментальной модели изучено воздействие фракционного облучения10 гр до суммарной дозы в 30 Гр.

Исследования выполнены на половозрелых мышах-самцах гибридах F1 (СВАхС57Вl6) массой 23-25 г, полученных из питомника «Столбовая». Животные находились в стандартных полипропиленовых боксах для содержания животных в условиях вивария, при естественном световом режиме, на стандартном пищевом рационе со свободным доступом к поилкам с водой.

В работе использовали штамм 7-ми дневных опухолевых клеток карциномы Эрлиха. Асцит в объеме 0,1 мл трансплантировали животным подкожно в область бедра обеих лап, получая солидную форму опухолевого роста. Через 5 суток после инокуляции опухолевых клеток, правый опухолевый узел облучали трехкратно через сутки локально γ-лучами⁶⁰Co на установке «Луч» в дозе 10Гр с мощностью дозы 0,532 Гр/мин. Суммарная доза облучения составила 30Гр на правый опухолевый узел. Контролем служили необлученные мыши, которым была также перевита опухоль в обе лапы. Каждая исследованная группа мышей состояла из 8 особей. Полученные в ходе исследования данные представлены в таблице3.

Таблица 3

Динамика роста карциномы Эрлиха у мышей-самцов гибридов F1(CBAxC57BL6) после фракционированного локального облучения γ-лучами ⁶⁰Co на установке «Луч» с мощность 0,532 Гр/мин. правого опухолевого узла в суммарной дозе 30 Гр (10 Гр через сутки) и % торможения (ТРО) роста опухоли

Группы животных	Сутки после облучения	Объем опухоли (M±m), см3
Правый узел	% ТРО	Левый узел	% ТРО
Контрольные		0,81±0,03		0,70±0,04
Облученные	2	0,66±0,04	18,5	0,74±0,03
Контрольные		1,0±0,03		0,97±0,05
Облученные	4	0,72±0,03*	28,0	0,93±0,03	4,1
Контрольные		1,50±0,05		1,47±0,08
Облученные	8	0,71±0,03*	52,7	1,47±0,12
Контрольные		1,65±0,11		1,61±0,11
Облученные	9	0,68±0,03*	58,8	1,53±0,10	5,0
Контрольные		1,85±0,06		1,63±0,17
Облученные	10	0,76±0,05*	58,9	1,84±0,15
Контрольные		2,25±0,11		2,32±0,12
Облученные	11(7сут.30Гр)	0,80±0,04*	64,4	1,92±0,13*	17,2
Контрольные		2,22±0,13		2,63±0,10
Облученные	14	1,19±0,08*	46,4	2,32±0,11	11,8
Контрольные		2,30±0,11		3,07±0,30
Облученные	15	1,32±0,08	42,6	2,55±0,16	16,9

Как видно из таблицы 3, через четверо суток после набранной дозы облучения 20 Гр наблюдается регрессия мишенной опухоли, составляющая 28% торможения ее роста. Через восемь суток после облучения при суммарно набранной дозе в 30 Гр торможение роста мишенной опухоли увеличивается в 1,9 раза, составляя 52,7%, а через 9 суток – 58,8%. Абскопальной регрессии немишенного опухолевого узла в эти сроки не выявлено. Через 11 суток после (7 сутки после набранной дозы) ионизирующего воздействия при 64,4% торможении роста мишенного узла была обнаружена абскопальная регрессия немишенного узла, составляющая 17,2% торможения его роста. В последующие сутки наблюдения процент торможения роста мишенной опухоли снижался, а процент торможения немишенного опухолевого узла не имел статистически значимых различий с контролем. Продолжительность жизни опухолевых животных при щадящей ионизирующей нагрузке значимо не отличалась от однократной нагрузки в дозе 30Гр.Абсокапальный эффект при фракционировании дозы в 30 Гр (трижды по 10 Гр) получить не удается.

Таким образом поставленная задача решена: разработана экспериментальная модель, позволившая получить абскопальный эффект на билатеральной высокоагрессивной асцитной опухоли рака молочной железы (карцинома Эрлиха) путем локального одномоментного облучения одного опухолевого узла в дозе 30 Гр.

Использование данной экспериментальной модели позволяет получить значимый абскопальный эффект и в дальнейшем изучать иммунологические механизмы, опосредующие развитие радиационного абскопального эффекта, то есть системную активацию иммунитета при локальном воздействии радиации и исследовать способы, усиливающие данный биологический феномен в том числе и в отношении мультицентричных опухолей.

Способ индукции абскопального противоопухолевого эффекта в экспериментальной модели карциномы Эрлиха, включающий подкожную билатеральную перевивку асцитной карциномы Эрлиха мышам, формирование опухолевых контралатеральных узлов на нижних конечностях и последующее локальное облучение одного из опухолевых узлов, отличающийся тем, что через 5 суток после одномоментной билатеральной перевивки опухоли и формирования опухолевых узлов с двух сторон проводят локальное однократное облучение одного из опухолевых узлов γ-лучами ⁶⁰Co в дозе 30 Гр, без предварительной стимуляции иммунитета животных.