Способ оценки эффективности химиопрофилактической активности ресвератрола в условиях экспериментального канцерогенеза рака печени

Изобретение относится к области медицины, конкретно к экспериментальной онкологии, фармакологии, а именно к способу оценки эффективности химиопрофилактической активности ресвератрола в условиях экспериментального канцерогенеза рака печени у животных. Способ включает введение вещества, индивидуализацию математической модели, вычисление вероятности развития рака печени. При этом животным вместе с кормом на протяжении 6 месяцев вводят ресвератрол в дозе 100 мг/кг массы тела, а N-нитрозодиэтиламин в дозе 100 мг/л воды в течение 4 месяцев и через 6 месяцев от начала эксперимента определяют биохимические показатели крови (МДА, СОД, АлАТ, АсАТ, Осмотическая резистентность мембран эритроцитов, ГП, КАТ, ЩФ, К⁺-Na⁺-АТФаза), полученные данные вносят в формулу: ВРРП=-123,353+(1,58×А)-(0,15×В)-(0,55×С)-(3,11×D)-(4,32×Е)-(0,88×F)+(13,66×G)+(0,97×Н)-(3,96×I)-(54,85×J), где: ВРРП - вероятность развития рака печени (в %), А - Осмотическая резистентность мембран эритроцитов (в % гемолиза), В - МДА (в Ммоль/л), С - СОД (в %), D - АлАТ (в Ед/л), Е - АсАТ (в Ед/л), F - ГП (в мкмоль/л), G - КАТ (в МЕ/гНb), Н - ЩФ (в нмоль/с*л), I - К⁺-Na⁺-АТФаза (в мкмоль Рн/мл белка/ч), J - введение ресвератрола: 1 - если вводили, 0 - если не вводили. По полученному результату судят о развитии рака печени с последующей оценкой эффективности химиопрофилактической активности ресвератрола: от 0 до 30% - высокая химиопрофилактическая активность; от 30% до 60% - средняя химиопрофилактическая активность; 60-100% низкая химиопрофилактическая активность. Предложенный способ позволяет оценить эффективность химиопрофилактической активности ресвератрола в условиях экспериментального канцерогенеза рака печени и рассчитать индивидуальный прогноз лечения, обладает высокой точностью. 1 табл., 6 пр.

 

Изобретение относится к области медицины, конкретно к экспериментальной онкологии, фармакологии, профилактической медицине и может быть использовано в качестве способа оценки эффективности химиопрофилактической активности ресвератрола у конкретного животного в эксперименте.

Как известно, химиопрофилактика является одной из изучаемых проблем мирового медицинского сообщества. В настоящее время разными авторами доказана химиопрофилактическая активность ряда соединений различной природы, однако не была проведена оценка эффективности химиопрофилактической активности исследуемых соединений.

В связи с этим, применение способа оценки эффективности химиопрофилактической активности используемых соединений, остается актуальным.

Известен способ оценки эффективности лекарственных средств для улучшения когнитивных функций человека (патент №2532379). Заключающийся в определении оценки эффективности лекарственных средств (ЛС) для улучшения когнитивных функций человека. В сыворотке крови пациента определяют содержание белка HLDF, титров идиотипических и антиидиотипических антител к HLDF до и после введения ЛС и на основании полученных данных вычисляют значение показателя MMSE до и после введения ЛС по формуле, после чего проводят сравнение полученных значений показателя MMSE и оценку эффективности ЛС.

Недостатками способа является сложность и дороговизна метода, не возможность использования метода в среднестатистических клинических лабораториях без использования специальной аппаратуры.

Известен способ оценки эффективности противоопухолевой терапии больных раком яичников (патент №2293329). Сущность способа: у больных раком яичников после проведения надвлагалищной ампутации матки с придатками исследуют отделяемое из брюшной полости, определяют уровень активности прекалликреина и калликреина, вычисляют коэффициент отношения первого показателя ко второму. Исследование проводят до начала и после проведения лечения циклофосфаном. При повышении значения коэффициента относительно исходного лечение определяют как эффективное, а при снижении или неизменности значения коэффициента - как неэффективное.

Недостатками способа является: сложность и дороговизна метода, не возможность использования метода в среднестатистических клинических лабораториях без использования специальной аппаратуры, обязательное проведение оперативного пособия в объеме надвлагалищной ампутации матки с придатками.

Наиболее близким является способ оценки эффективности фармакологических препаратов (патент №2136219).

Способ осуществляется следующим образом. Выполняется мониторно-компьютерный контроль непосредственно до введения или изменения дозы препарата. Проводят индивидуализацию математической модели на основе данных, полученных после выполненного контроля. На основе индивидуализированной модели выявляются ведущий и сопутствующие патологические процессы. Предварительно, используя индивидуализированную модель, выполняют коррекцию показателей функционального состояния в соответствии с анатомо-физиологическими патологическими данными (рост, вес, возраст, вид порока, сопутствующие заболевания и тому подобное) и спецификой регуляции (гиперкинетический тип, глубина наркоза и тому подобное).

Затем вычисляют отклонение показателей функционального состояния от статистической нозологической нормы. Превышающие порог значения определяются как патологические, распределение степени (в относительных величинах) их отклонений - характеристикой тяжести.

После этого выполняют мониторно-компьютерный контроль во время введения или изменения дозы препарата, также после введения в течение времени его действия.

В течение этого периода времени выполняют в реальном времени выделение ведущих и сопутствующих патологических процессов.

Отношение показателей тяжести функционального состояния после и до введения препарата дает оценку эффективности его действия для индивидуального состояния больного. В зависимости от задачи врач может выбрать: - оценку, характеризующую в определенное время действия;

- препарат;

- среднее действие за заданный период;

- максимальный или минимальный эффект;

- стабильное, установившееся действие лечебного препарата, соответствующее выбранной дозе.

Если отношение показателей тяжести функционального состояния до и после введения препарата имеет положительное значение, то устанавливают, что действие препарата эффективно, и наоборот.

Недостатком прототипа является, сложность и дороговизна метода, не возможность использования метода в среднестатистических клинических лабораториях без использования специальной аппаратуры, а также не способность оценить химиопрофилактическую активность соединений.

Целью изобретения является разработка способа оценки эффективности химиопрофилактической активности ресвератрола в условиях экспериментального канцерогенеза рака печени.

Поставленная цель достигается тем, что в предложенном способе проводят изучение биохимических показателей крови экспериментальных животных на модели экспериментального канцерогенеза индуцированного N-нитрозодиэтиламином и имеет следующие существенные признаки: животным ежедневно вводят с кормом ресвератрол в дозе 100 мг/кг в течение 6 месяцев, а N-нитрозодиэтиламин (для создания экспериментального канцерогенеза) в дозе 100 мг/л воды, в течение 4 месяцев, а так же изучают биохимические показатели крови: малонового деальдигида (МДА Ммоль/л), супероксиддисмутазы (СОД %), аланинаминотрансферазы (АлАТ Ед/л), аспартатаминотрансферазы (АсАТ Ед/л), осмотической резистентности мембран эритроцитов (% гемолиза), гидроперекиси (ГП Ммоль/л), каталазы (КАТ Ед. игиб/г Hb), щелочной фосфотазы (ЩФ Ед/л), К⁺-Na⁺-АТФазы (мкмоль Рн/мл белка/час) [Камышников B.C. Клинико-биохимическая лабораторная диагностика. В 2-х томах: справочник / В.С. Камышников. - Минск: Интерпрессервис, 2003 - Т. 1 - 495 с.Т. 2-463 с.].

Согласно литературным данным, наиболее эффективной химиопрофилактической дозой ресвератрола является 100 мг/кг массы тела [Schwingel Т.Е., Klein СР., Nicoletti N.F., Dora C.L., Hadrich G., Bica C.G., Lopes T.G., da Silva VD, Morrone F.B. Effects of the compounds resveratrol, rutin, quercetin, and quercetin nanoemulsion on oxaliplatin-induced hepatotoxicity and neurotoxicity in mice // Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 2014. 387(9): 837-848. doi: 10.1007/s00210-014-0994-0].

Полученные данные животных, вносят в статистическую программу SPSS.

Учитывая наличие связи между вышеперечисленными показателями (признаками), в ходе множественного регрессионного анализа получают уравнение регрессии (формулу) для прогностических моделей, с помощью которого прогнозируют развитие рака печени у экспериментальных животных получавших в ходе эксперимента ресвератрол с последующей оценкой эффективность химиопрофилактической активности ресвератрола в отношении развития рака печени:

ВРРП=- 123,353+(1,58 × А) - (0,15 × В) - (0,55 × С) - (3,11 × D) - (4,32 × Е) - (0,88 × F)+(13,66 × G)+(0,97 × Н) - (3,96 × I) - (54,85 × J), где:

ВРРП - вероятность развития рака печени (в %),

А - осмотическая резистентность мембран эритроцитов (в % гемолиза)

В - МДА (в Ммоль/л)

С - СОД (в %)

D - АлАТ (в Ед/л),

Е - АсАТ (в Ед/л),

F - ГП (в мкмоль/л)

G - КАТ (в МЕ/гНb)

Н - ЩФ (в нмоль/с*л)

I - К⁺-Na⁺-АТФаза (в мкмоль Рн/мл белка/час)

J - введение ресвератрола: 1 - если вводили, 0 - если не вводили.

Согласно общепринятым шкалам (Александрович Ю.С., Гордеев В.И. Оценочные и прогностические шкалы в медицине критических состояний. - Изд-во «Сотис». - 2007. - 140 с.) риск развития патологического процесса подразделяется на низкий, умеренный и высокий. При получении значения в пределах 0-30% эффективность химиопрофилактической активности ресвератрола в отношении рака печени низкая, в пределах 30-60% - умеренная, в пределах 60-100% - высокая.

В полученную формулу подставляют данные испытуемого животного и по полученному результату судят о вероятности развития рака печени у конкретного животного.

Затем, на основании полученного прогноза (в процентах) определяют степени эффективности химиопрофилактической активности ресвератрола. Снижение процента вероятности развития рака печени у конкретного животного свидетельствует о химиопрофилактической эффективности ресвератрола в отношении рака печени.

Статистические методы исследования

Статистическая обработка данных представленного нами исследования проведена с применением пакета прикладных программ STATGRAPHICS Plus 5,0 for Windows и SPSS 15,0 for Windows. Применялись стандартные статистические методы [Гублер Е.В. Вычислительные методы анализа и распознавания патологических процессов. - Л.: Медицина. - 1978. - 294 с.], включающие вычисление среднеарифметических, стандартных отклонений, стандартных ошибок среднего, множественный регрессионный анализ. Достоверность различий в группах оценивалась с помощью параметрических методов (t - критерий Стьюдента). Различия при уровне значимости р<0,05 расценивались как достоверные.

По имеющимся у авторов сведениям совокупность существенных признаков, характеризующих сущность заявляемого изобретения, не известна, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «новизна».

По мнению авторов, сущность заявляемого изобретения не следует для специалистов явным образом из известного уровня медицины, так как из него не выявляется вышеуказанная возможность способа оценки химиопрофилактической активности ресвератрола у животных в условиях экспериментального канцерогенеза, включающего введение N-нитрозодиэтиламина с питьем и ресвератрола с кормом в дозе 100 мг/кг, что позволяет сделать вывод о соответствии критерию «изобретательский уровень».

Совокупность существенных признаков, характеризующих сущность изобретения, может быть многократно использована в медицине с получением результата, заключающегося в эффективном и легко воспроизводимом способе оценки эффективности химиопрофилактической активности ресвератрола у животных путем внесения биохимических показателей крови в формулу, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «промышленная применимость».

Результаты исследования

Эксперимент проведен на 90 крысах самцах линии Вистар, с исходной массой 180-200 г. Содержание животных осуществляли в соответствии с приказом Минздравсоцразвития России №708н от 23 августа 2010 года «Об утверждении Правил лабораторной практики». Животные находились при 12-часовом световом режиме в условиях свободного доступа к воде и пище. Все животные были разделены на две группы, по 30 в каждой: I группа животные интактного контроля; II группа (животные получавшие только N-нитрозодиэтиламин в дозе 100 мг/л ежедневно, в течение 4 месяцев) и III группа - (животные получавшие одновременно, N-нитрозодиэтиламин и ресвератрол в дозе 100 мг/кг веса животного на протяжении 6 месяцев, предварительно равномерно смешав с творогом).

У исследуемых животных, брали кровь, предварительно усыпив внутрибрюшинным введением 0,1- 0,2 мл золетила (Zoletil, Франция).

Осмотическую резистентность эритроцитов определяли спектрофотометрически, путем внесения отмытых эритроцитов в образцы с разным объемным содержанием изотонического и гипертонического растворов хлористого натрия и мочевины.

Изучение осмотической резистентности мембран эритроцитов показало, что количество разрушенных эритроцитов в растворе №1 (40% раствор мочевины) у крыс I (контрольной) группы составило 1,7±0,68%, во II группе животных (получавших только N-нитрозодиэтиламин) - 10,2±0,10% и в III группе животных (получавших одновременно N-нитрозодиэтиламин и ресвератрол), процент гемолиза составил 1,26±0,066% (р<0,001). В растворе №2 (45% мочевины) этот показатель составил 2,18±0,169, 15,84±2,4 и 7,59±2,79 (р<0,002) соответственно. Процент гемолизированных эритроцитов в растворе №4, составил: 35,86±2,3 (р<0,05); 77,42±2,1; 49,83±2,5 (р<0,05) (гемолиз в котором является более показательным, так, как концентрация мочевины в этом растворе составляет 55% и только эритроциты с нормальной стойкостью мембран способны оказывать противодействие, а с ослабленной резистентностью начинают в большей степени разрушаться [«Осмотическая резистентность мембран эритроцитов у крыс с гипер- и гипокальциемией » Козаев А.В., Джиоев И.Г. и соавт.]. Показатель оптической плотности в растворе №7 нами принимался за 100%.

Изучение АлАТ и АсАТ проводили по общеизвестной методике. Как видно из полученных результатов активность АлАТ в сыворотке крови животных получавших наряду с канцерогеном ресвератрол была достоверно ниже активности АлАТ в сыворотке крови животных изолированно получавших канцероген в 2 раза (р<0,05) и достоверно не менялась в сравнениями показателей группы интактного контроля.

Активность АсАТ, составила соответственно по группам, в I - 0,63±0,031; во II - 1,73±0,049 и в III - 0,62±0,033 (р<0,05) и была ниже в группе животных получавших ресвератрол.

При изучении активности ЩФ, так же наблюдалось увеличение активности у животных II группы в 1,24 раза (р<0,05) относительно группы интактного контроля ив 1,11 раза (р<0,05) III группы.

Полученные результаты приведены в таблице 1.

Изучение МДА проводили по общеизвестной методике. Принцип метода основан на образовании окрашенного комплекса при взаимодействии малонового диальдигида с тиобарбитуровой кислотой [Камышников B.C. Клинико-биохимическая лабораторная диагностика. В 2-х томах: справочник / В.С. Камышников. - Минск: Интерпрессервис, 2003 - Т. 1 - 495 с. Т. 2-463 с.]. Полученные результаты показали достоверное снижение уровня продукта пероксидации липидов в эритроцитах группы животных получавших наряду с канцерогеном ресвератрол в 1,3 раза (р<0,05) в группе животных получавших ресвератрол, по сравнению с уровнем МДА в эритроцитах животных получавших изолировано канцероген и практически не отличался от группы интактного контроля. (Таблица1).

Определение СОД проводили по общеизвестной методике [Камышников B.C. Справочник по клинико- биохимическим исследованиям и лабораторной диагностике / В.С. Камышников. - 3 е изд. - М.: МЕД пресс информ, 2009 - 896 с.]. По нашим данным, активность СОД в III группе была достоверно выше чем у животных во II в 1,4 раза (р<0,05) и достоверно не отличалась от животных I группы. Полученные результаты приведены в таблице 1.

Определение активности каталазы в эритроцитах

Принцип метода Е. Beutler [Анализы крови и мочи / Л.А. Данилова. - 4-е изд., испр. - СПб.: Салит-медкнига, 2003. - 122 с.] основан на определении скорости разложения перекиси водорода в единицу времени, что можно наблюдать спектрофотометрически при длине волны 230 нм.

Изучение активности каталазы показало, что у животных II группы наблюдалось снижение активности в 1,6 раза (р<0,05) относительно III группы и в 1,2 раза (р<0,05) относительно I группы (Таблица 1).

Определение гидроперекиси: Принцип метода определения перекисей липидов по Гаврилову В.Б., Гавриловой А.Р., Мажуль Л.М. [Анализы крови и мочи / Л.А. Данилова. - 4-е изд., испр. - СПб.: Салит-медкнига, 2003. - 122 с.] основан на способности тиобарбитуровой кислоты реагировать с малоновым диальдигидом, образующегося из гидроперекисей ненасыщенных жирных кислот. Уровень ГП у животных II группы был выше уровня I и III групп в 1,3 раза (р<0,05) и достоверно не отличались друг от друга (Таблица 1).

Определение Na⁺-К⁺-АТФазы в гемолизате эритроцитов:

Принцип метода. Метод основан на определении неорганического фосфора, образующегося при инкубации гемолизата эритроцитов с АТФ. Активность общей (Mg2+, Na+, К+) - АТФазы определяется в присутствии ионов Mg2+, Na+, K+. Активность Mg2+-АТФазы - только с ионами магния; Na+, K+ -АТФазы - по разнице между общей активностью и активностью Mg2+- АТФазы.

Достоверных различий с группой интактного контроля не наблюдалось, однако относительно II группы активность Na⁺-K⁺АТФазы была достоверно выше в 1,45 раза (р<0,05), что в свою очередь подтверждает наличие мембраностабилизирующей активности ресвератрола, проявляющуюся в снижении вязкости билипидного слоя клеточной мембраны, усиливающейся при воздействии свободных радикалов.

Полученные данные вносят в статистическую программу SPSS. В результате чего получают формулу для прогностических моделей, с помощью которой прогнозируют развитие рака печени у экспериментальных животных (Таблица 1).

Примеры конкретного выполнения:

Пример расчета вероятности развития рака печени 1.

Животное из группы интактных крыс имело следующие биохимические показатели крови:

Осмотическая резистентность мембран эритроцитов - 32,02 (в % гемолиза); МДА- 46,41 (Ммоль/л); СОД - 78,6 (в %); АлАТ - 0,81 (Ед/л); АсАТ - 0,61 (Ед/л); ГП - 6,24 (мкмоль/л); КАТ - 6,81 (МЕ/гНb); ЩФ - 70,65 (нмоль/с*л); К⁺-Na⁺-АТФаза - 6,2 (мкмоль Рн/мл белка/час).

Прогноз развития рака печени, по полученной формуле составил 3,3%.

Животное дожило до конца эксперимента и после вскрытия опухолевого процесса в печени обнаружено не было, то есть фактические данные соответствовали ранее рассчитанной ВРРП.

Пример расчета вероятности развития рака печени 2.

Животное из группы, получавших наряду с канцерогеном ресвератрол, имело следующие биохимические показатели крови:

Осмотическая резистентность мембран эритроцитов - 49,0 (в % гемолиза); МДА - 55,89 (Ммоль/л); СОД - 76,0 (в %); АлАТ - 1,49 (Ед/л); АсАТ - 0,63 (Ед/л); ГП - 6,58 (мкмоль/л); КАТ - 8,45 (МЕ/гНb); ЩФ - 99,56 (нмоль/с*л); К⁺-Na⁺-АТФаза - 6,8 (мкмоль Рн/мл белка/час), данная крыса получала ресвератрол в дозе 100 мг/кг массы тела.

Прогноз развития рака печени, по полученной формуле составил 20,9%.

Животное дожило до конца эксперимента и после вскрытия опухолевого процесса в печени обнаружено не было, то есть фактические данные соответствовали ранее рассчитанной ВРРП.

Пример расчета вероятности развития рака печени 3.

Животное из группы, получавших наряду с канцерогеном ресвератрол, имело следующие биохимические показатели крови:

Осмотическая резистентность мембран эритроцитов - 55,6 (% гемолиза); МДА - 57,9 (Ммоль/л); СОД - 58,7 (%); АлАТ - 2,4 (Ед/л); АсАТ - 0,9 (Ед/л); ГП - 6,2 (мкмоль/л); КАТ - 6,7 (МЕ/гНb); ЩФ - 114,3 (нмоль/с*л); К⁺-Na⁺-АТФаза - 4,9 (мкмоль Рн/мл белка/час), данная крыса получала ресвератрол в дозе 100 мг/кг массы тела.

Прогноз развития рака печени, по полученной формуле составил 34,8%.

Животное дожило до конца эксперимента и при вскрытии выявленные морфологические изменения были классифицированы как доброкачественные (гемангиомы в печени и гепатоцеллюлярные аденомы), то есть фактические данные соответствовали ранее рассчитанной ВРРП.

Пример расчета вероятности развития рака печени 4.

Животное из группы крыс, получавших изолированно канцероген, имело следующие биохимические показатели крови:

Осмотическая резистентность мембран эритроцитов - 52,8 (% гемолиза); МДА - 55,8 (Ммоль/л); СОД - 55,1 (%); АлАТ - 2,4 (Ед/л); АсАТ - 1,1 (Ед/л); ГП - 8,2 (мкмоль/л); КАТ - 4,9 (МЕ/гНb); ЩФ - 110,1 (нмоль/с*л); К⁺-Na⁺-АТФаза - 5,1 (мкмоль Рн/мл белка/час).

Прогноз развития рака печени, по полученной формуле составил 55,5%.

Животное дожило до конца эксперимента и при вскрытии выявленные морфологические изменения были классифицированы как доброкачественные (гепатоцеллюлярные аденомы, холангиомы на фоне цирротических изменений), то есть фактические данные соответствовали ранее рассчитанной ВРРП.

Пример расчета вероятности развития рака печени 5.

Животное из группы крыс, получавших изолированно канцероген, имело следующие биохимические показатели крови:

Осмотическая резистентность мембран эритроцитов - 69,07 (% гемолиза); МДА - 72,56 (Ммоль/л); СОД - 53,1 (%); АлАТ - 3,06 (Ед/л); АсАТ -0,85 (Ед/л); ГП - 8,58 (мкмоль/л); КАТ - 4,3 (МЕ/гНb); ЩФ - 123,43 (нмоль/с*л); К⁺-Na⁺-АТФаза - 4,5 (мкмоль Рн/мл белка/час).

Прогноз развития рака печени, по полученной формуле составил 85,6%.

Животное не дожило до конца эксперимента и пало на 5-м месяце исследования, вскрыто, обнаружен опухолевый процесс в печени дифференцированный морфологически как гепатоцеллюлярная карцинома, то есть фактические данные соответствовали ранее рассчитанной ВРРП.

Пример расчета вероятности развития рака печени 6.

Животное из группы крыс, получавших изолированно канцероген, имела следующие биохимические показатели крови:

Осмотическая резистентность мембран эритроцитов - 70,68 (% гемолиза); МДА - 77,94 (Ммоль/л); СОД - 58,34 (%); АлАТ - 2,77 (Ед/л); АсАТ - 1,08 (Ед/л); ГП - 7,58 (мкмоль/л); КАТ - 5,43 (МЕ/гНb); ЩФ - 119,56 (нмоль/с*л); К⁺-Na⁺-АТФаза - 4,7 (мкмоль Рн/мл белка/час).

Прогноз развития рака печени, по полученной формуле составил 96,2%.

Животное не дожило до конца эксперимента и пало на 5-м месяце исследования, вскрыто, обнаружен опухолевый процесс в печени дифференцированный морфологически как гепатоцеллюлярная карцинома в сочетании с холангиоцеллюлярным раком, то есть фактические данные соответствовали ранее рассчитанной ВРРП.

Таким образом, проведение расчетов по представленной выше формуле, которое можно производить с помощью калькулятора или программы Microsoft Excel, позволяет с достаточно высокой точностью оценивать эффективность химиопрофилактической активности, что может быть использовано, как в эксперименте, так и клинической практики и может способствовать подбору наиболее эффективного лекарственного соединения. Заявляемый способ по сравнению с известными, имеет преимущества заключающиеся в том, что позволяет использовать данный способ для оценки эффективности химиопрофилактической активности соединений растительного происхождения, обладает высокой точностью, позволяет рассчитать индивидуальный прогноз лечения, с минимальными материальными затратами, доступен для широкого использования.

Способ оценки эффективности химиопрофилактической активности ресвератрола в условиях экспериментального канцерогенеза рака печени у животных, включающий введение вещества, индивидуализацию математической модели, вычисление вероятности развития рака печени, отличающийся тем, что животным вместе с кормом на протяжении 6 месяцев вводят ресвератрол в дозе 100 мг/кг массы тела, а N-нитрозодиэтиламин в дозе 100 мг/л воды в течение 4 месяцев и через 6 месяцев от начала эксперимента определяют биохимические показатели крови (МДА, СОД, АлАТ, АсАТ, Осмотическая резистентность мембран эритроцитов, ГП, КАТ, ЩФ, К⁺-Na⁺-АТФаза), полученные данные вносят в формулу

ВРРП=-123,353+(1,58×А)-(0,15×В)-(0,55×С)-(3,11×D)-(4,32×Е)-(0,88×F)+(13,66×G)+(0,97×Н)-(3,96×I)-(54,85×J), где:

ВРРП - вероятность развития рака печени (в %),

А - Осмотическая резистентность мембран эритроцитов (в % гемолиза),

В - МДА (в Ммоль/л),

С - СОД (в%),

D - АлАТ (в Ед/л),

Е - АсАТ (в Ед/л),

F - ГП (в мкмоль/л),

G - КАТ (в МЕ/гНb),

Н - ЩФ (в нмоль/с*л),

I - К⁺-Na⁺-АТФаза (в мкмоль Рн/мл белка/ч),

J - введение ресвератрола: 1 - если вводили, 0 - если не вводили,

и по полученному результату судят о развитии рака печени с последующей оценкой эффективности химиопрофилактической активности ресвератрола:

от 0 до 30% - высокая химиопрофилактическая активность;

от 30 до 60% - средняя химиопрофилактическая активность;

60-100% - низкая химиопрофилактическая активность.