Способ прижизненной диагностики туберкулёза крупного рогатого скота

Изобретение относится к области биологии, в частности к иммунологии. Предложен способ прижизненной диагностики туберкулёза крупного рогатого скота. Используют полиморфно-ядерные лейкоциты от крупного рогатого скота, не реагирующего на ППД-туберкулин, из хозяйств, неблагополучных по туберкулёзу. В качестве туберкулёзного антигена используют аллерген туберкулёзный рекомбинантный диаскинтест и ППД-туберкулин для млекопитающих в разведении 1:50. Изобретение обеспечивает повышение достоверности прижизненной диагностики туберкулёза за счет дополнительного выявления возбудителя туберкулёза в измененной Л-форме у животных, не реагирующих на ППД-туберкулин, из неблагополучного по туберкулёзу хозяйства, что способствует более качественному проведению ветеринарно-диагностических мероприятий и дальнейшему оздоровлению хозяйства, предотвращает рецидивы болезни. 1 табл., 1 пр.

 

Изобретение относится к биологии, а именно к разделу иммунологии. Оно может быть использовано для хемилюминесцентного (ХЛ) анализа в ветеринарии, медицине.

В ветеринарии предлагаемый способ можно использовать как дополнительный в комплексе оздоровительных мероприятий в неблагополучных по туберкулезу животноводческих хозяйствах.

Известен «Сборник санитарных и ветеринарных правил. Профилактика и борьба с заразными болезнями, общими для человека и животных» (Туберкулез //Профилактика и борьба с заразными болезнями / Сб. санитарных и ветеринарных правил. - Москва, 1996. - С. 169-171). Неблагополучными считают хозяйства и их обособленные части (фермы, бригады, отделения), а также населенные пункты, в которых выявлены животные, больные туберкулезом. Продолжительность неблагополучия определяется сроком действия ограничений, введенных местной администрацией. Одновременно утверждается комплексный план оздоровления неблагополучных хозяйств (ферм, стад и т.д.), включающие организационно-хозяйственные и ветеринарно-санитарные мероприятия, предусмотренные Правилами. Оздоровление неблагополучных по туберкулезу стад крупного рогатого скота проводят методами систематических диагностических исследований с выделением больных животных или целых неблагополучных групп и последующим их убоем (менее 15% поголовья); единовременной полной заменой поголовья неблагополучного стада (фермы) здоровыми животными (заболевание более 15% поголовья).

В работе Байтеряковой Т.И. «Форма персистирования микобактерий в организме крупного рогатого скота из хозяйств с различным эпизоотическим состоянием» (Байтерякова Т.И.: автореф. канд. дисс., 25 с. Новосибирск, 1983) представлены результаты бактериологических исследований, которые являются решающими при объявлении хозяйства свободным от туберкулеза, где нередко через год, чаще 4-5 лет, в оздоровленных хозяйствах отмечают рецидив болезни. Причину рецидива чаще всего объясняют нарушением условий карантинирования вновь поступающих животных, выпаиванием молодняку необезвреженного обрата, некачественным проведением заключительных мероприятий при снятии ограничений, контактами с туберкулезным скотом на пастбищах, но при этом не учитывается возможность персистенции возбудителя в не обнаруживаемой в организме крупного рогатого скота регламентируемыми методами исследований форме, обусловливающей рецидив.

В работе Земсковой З.С., Дорожковой И.Р. «Скрыто протекающая туберкулезная инфекция» (Земскова З.С., Дорожкова И.Р. Скрыто протекающая туберкулезная инфекция. - М., Медицина, 1984, с. 17-18) отмечено, что существуют измененные формы микобактерий, дефектные по клеточной стенке. Это микроорганизмы с измененной морфологической и (или) культуральной характеристикой в результате повреждения или дефекта их клеточной стенки. Изучение роли таких измененных форм в патогенезе туберкулезной инфекции показало, что в большинстве случаев их вирулентные свойства ослаблены, и они способны вызывать абортивные формы процесса или длительно бессимптомно персистировать в организме.

В работе Галатовой Л.В. «Изоляция Л-форм микобактерий из молока коров неблагополучных и оздоровленных стад от туберкулеза» (Галатова Л.В.: автореф. канд. дисс. 17 с. Омск, 1993), автор пишет, что в неблагополучных хозяйствах возбудитель туберкулеза микобактерий способны персистировать в организме крупного рогатого скота в Л-форме. Из молока микобактерий бычьего вида выделены в бактериальной форме и Л-форме в первые 10 дней после отела. Также авторы отмечает, что Л-формы M. bovis способны приживаться в организме морских свинок и вызывать сенсибилизацию тканей кожи к ППД-туберкулину для млекопитающих. В сыворотке крови лабораторных животных Л-формы и культуры - ревертанты микобактерий индуцируют увеличение концентрации нейраминовой кислоты и показателя повреждения нейтрофилов.

В работе Гертман М.И. «Биологические свойства Л-форм Mycobacterium bovis» (Гертман М.И.: автореф. канд. дисс. 19 с. Москва, 1988) представлены результаты исследований биологических свойств Л-форм M. bovis. У крупного рогатого скота неблагополучных по туберкулезу хозяйств возбудитель туберкулеза бычьего вида выделен в бактериальной и Л-форме. Реверсия Л-форм микобактерий в бактериальную форму происходила преимущественно на первом-третьем пассажах. Из 127 выделенных и изученных культур Л-форм микобактерий в M. bovis реверсировало 11 (8,7%), в атипичные - 24 (18,9%). Нестабильные Л-формы и культуры - ревертанты способны вызывать сенсибилизацию организма животных и обуславливать туберкулезные изменения во внутренних органах. В опытах in vitro и in vivo возбудитель туберкулеза бычьего вида, как и возбудитель туберкулеза человеческого вида, под воздействием лекарственных препаратов трансформировался в Л-формы.

Известен «Способ прижизненной дифференциальной диагностики туберкулеза и микобактериозов» (патент RU №2687553 от 15 мая 2019 г. G01N 33/49, G01N 21/76). Изобретение относится к медицине и ветеринарии и касается способа прижизненной дифференциальной диагностики туберкулеза и микобактериозов крупного рогатого скота. Для этого используют индуцированную люминолзависимую хемилюминесценцию, в качестве объекта исследований используют сыворотку от положительно реагирующего на ППД-туберкулин крупного рогатого скота хозяйств с неясной эпизоотической ситуацией. В качестве основного индуктора используют комплексный аллерген из атипичных микобактерий (КАМ), а в качестве дополнительного индуктора используют аллерген туберкулезный рекомбинантный (АТР).

Данный способ применяется для прижизненной диагностики туберкулеза от положительно реагирующего на ППД-туберкулин крупного рогатого скота хозяйств с неясной эпизоотической ситуацией, поэтому он не позволяет дополнительно выявлять больных животных, не реагирующих на ППД-туберкулин, в неблагополучном по туберкулезу хозяйстве.

Наиболее близким техническим решением является «Способ прижизненной диагностики туберкулеза» (патент RU №2296334 от 27 марта 2007 г., G01N 33/569, G01N21). Способ прижизненной диагностики туберкулеза включает выделение полиморфно-ядерных лейкоцитов, сохранение их в стабилизирующем растворе, определение индуцированной люминолзависимой хемилюминесценции с использованием в качестве индуктора «дыхательного взрыва» опсонизированного зимозана, в качестве дополнительного индуктора используют специфический туберкулезный антиген в разведении 1:100, представляющий собой специфическую фракцию клеточных стенок микобактерий туберкулеза М. bovis шт. 8, дезинтеграцию которых проводят ультразвуком при параметрах 22 кГц, 0,5 А, и при повышении свечения по сравнению с контролем в 3-5 раз диагностируют туберкулез. Специфичность реакции обусловлена туберкулезным антигеном. Бактериальную массу 2-месячной культуры M. bovis штамм 8, выращенную на синтетической среде ВКЛ, осаждали центрифугированием и промывали дистиллированной водой. Суспензию бактериальных клеток в концентрации 5 мг/мл полувлажной бакмассы подвергали ультразвуковой дезинтеграции на аппарате УЗДН-1, фракции отделяли центрифугированием, осадок ресуспендировали и вновь воздействовали УЗДН-1. Осадок отделяли центрифугированием, а из надосадочной жидкости осаждали протеиновую фракцию. Осадок растворяли в минимальном количестве 0,5%-ного раствора фенола и доводили концентрацию белка до 0,6-0,7 мг/мл. Активность антигена проверяли со специфическими кроличьими антисыворотками, устанавливали рабочий титр не менее 1:400 - 1:800.

Недостатком этого способа является то, что наращивание бактериальной массы микобактерий для приготовления антигена и дальнейшая работа на дезинтеграторе по разрушению бактериальной массы - процесс трудоемкий, его длительность 2-3 мес., также работа с живой культурой патогенных микобактерий представляет определенную опасность для исследователя.

Техническим результатом предлагаемого способа является повышение достоверности прижизненной диагностики туберкулеза за счет дополнительного выявления возбудителя туберкулеза в измененной Л-форме у животных, не реагирующих на ППД-туберкулин, из неблагополучного по туберкулезу хозяйства, что способствует более качественному проведению ветеринарно-диагностических мероприятий и дальнейшему оздоровлению хозяйства, предотвращает рецидивы болезни.

Заявленный технический результат способа прижизненной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота включает выделение полиморфно-ядерных лейкоцитов от крупного рогатого скота, не реагирующего на ППД-туберкулин, из хозяйств, неблагополучных (оздоравливаемых) по туберкулезу, сохранение полиморфно-ядерных лейкоцитов в стабилизирующем растворе, определение индуцированной люминолзависимой хемилюминесценции с использованием в качестве индуктора «дыхательного взрыва» опсонизированного зимозана, в качестве дополнительных индукторов используют аллерген туберкулезный рекомбинантный АТР и ППД-туберкулин для млекопитающих в разведении 1:50.

Приготовление опсонизированного зимозана для определения функциональной (фагоцитирующей) активности лейкоцитов крови.

Взвешивают 20 (30,40) мг зимозана, помещают в мерную колбу, заливают 10-кратным концентратом Хэнкса без фенолового красного (1 мл на 10 мг), кипятят 1 час. Центрифугируют 2 раза по 15 минут при 3000 об/мин. 0,15М NaCl. Опсонизируют нормальной сывороткой (пулом) в термостате 37°С - 30 мин. Центрифугируют, суспендируют осадок в 1-кратном растворе Хэнкса без фенолового красного (1 мг/мл). При высокой активности «дыхательного взрыва» исследуемых лейкоцитов уровень свечения индуцированной хемилюминесценции превышает спонтанную в 10 и более раз.

Аллерген туберкулезный рекомбинантный «ДИАСКИНТЕСТ» Аллерген туберкулезный рекомбинантный (АТР) изготовлен ЗАО «Фармацевтическая фирма «Лекко» (Россия) по генно-инженерной технологии и применяется в медицинской практике для диагностики туберкулеза, оценки активности процесса и выявления лиц с высоким риском развития активного туберкулеза, для дифференциальной диагностики туберкулеза, дифференциальной диагностики инфекционной и поствакцинальной аллергии, оценки эффективности противотуберкулезного лечения в комплексе с другими методами. Аллерген туберкулезный рекомбинантный (АТР) в стандартном разведении представляет собой рекомбинантный белок, продуцируемый генетически модифицированной культурой Escherichia coli BL21(DE3)/PCFP-ESAT, разведенный в стерильном изотоническом фосфатном буфере, с консервантом.

Препарат содержит два связанных между собой антигена CFP10 и ESAT6, присутствующих в вирулентных штаммах микобактерий туберкулеза и отсутствующих в вакцинном штамме БЦЖ. (Рекомендации по применению аллергена туберкулезного рекомбинантного в стандартном разведении (раствора для внутрикожного введения), приказ №855 от 29 октября 2009 г., Министерство здравоохранения и социального развития Российской Федерации). Иммунологические свойства. Действие препарата аллерген туберкулезный рекомбинантный (АТР) основано на выявлении клеточного иммунного ответа на специфические для Mycobacterium bovis и Mycobacterium tuberculosis антигены.

ППД-туберкулин для млекопитающих. Интернет-сайт: nt-kursk.ru. ППД-туберкулин изготовлен из белковой фракции продуктов роста и термического разрушения возбудителя туберкулеза бычьего вида на синтетической питательной среде. Основная фракция - белок, содержание которого составляет 73-90%, 4-5% - полисахариды, 1-2% нуклеиновые кислоты, до 11% - липиды. Белок состоит из 18 аминокислот, из которых 49,9% представлены глутаминовой и аспарагиновой кислотами, а также лейцином, аланином и аргинином (В.П. Шишков, В.П. Урбан. Туберкулез сельскохозяйственных животных. - М.: Агропромиздат, 1991, с. 87-90. - Научные труды ВАСХНИЛ).). Предназначен для аллергической диагностики туберкулеза у крупного рогатого скота, верблюдов, буйволов, оленей, свиней, коз, овец и других млекопитающих. Выпускается ФГУП «Курская биофабрика».

Приготовление дополнительных индукторов - готовили разведения согласно «Схеме последовательного разведения сыворотки» (Ж. Ветеринарная лабораторная практика, 1963, Москва, Т. 1, с. 13).

Из таблицы 1 видно, что оптимальным для ППД является разведение 1:50 для использования in vitro, для АТР оптимальным является стандартное разведение, применяемое in vivo, и способное индуцировать ХЛ in vitro.

Приготовление люминола - люминол-гидразид - 3 - фталевой кислоты), 40 мг люминола растворяли горячим (~95-98°С) раствором 0, 01 Н NaOH на дезинтеграторе MSE при амплитуде 16 microns до получения прозрачного раствора, в течение 7-10 мин. Определяли рН 7,2 и доводили общий объем до 20 мл 1-кратным раствором Хэнкса без фенолового красного.

Для регистрации спонтанной и индуцированной хемилюминесценции использовали иммунохимический анализатор «Флюорофот» (ООО «СКБ «ПРОБАНАУЧПРИБОР», Россия, г. Санкт-Петербург). Функционирование осуществляли под управлением подключаемой к анализатору ПЭВМ с программным управлением. Измеряли ХЛ монохроматического излучения находящейся в лунке жидкости (опытные и контрольные образцы), возникающего в результате химической реакции с участием люминофора фотоэлектронным умножителем (ФЭУ) в режиме значений интенсивности хемилюминесценции.

Регистрацию проводили в цифровых показателях - единицы счета числа фотонов (условные единицы, у.е.) при длине волны λ 460, 545, 642 нм. При интерпретации полученных результатов учитывали степень превышения уровня свечения исследуемой пробы по сравнению с отрицательным контролем антигена.

Способ осуществляют следующим образом: проводят забор крови с Трилоном Б от всего поголовья крупного рогатого скота (с 2-х месячного возраста) из хозяйств, неблагополучных по туберкулезу.

Выделяют полиморфно-ядерные лейкоциты, включая нейтрофилы и лимфоциты, путем предварительного лизиса эритроцитов гипотоническим лизисом дистиллированной водой с последующим центрифугированием и отмыванием выделенных лейкоцитов 1-кратным раствором Хэнкса без фенолового красного, трилоном Б. Определяют жизнеспособность клеток 1%-ным трипановым синим в камере Горяева (90-95%) и концентрацию (2 млн.кл./1 мл). (См. Патент на изобретение RU №2296334 от 27.03.2007 г).

Суспензию полученных отмытых лейкоцитов ресуспендируют в стабилизирующем растворе (см. Патент на изобретение RU №2280689 от 27.07.2006 г.).

В качестве основного индуктора используют опсонизированный зимозан, в качестве дополнительного индуктора используют аллерген туберкулезный рекомбинантный АТР и ППД-туберкулин для млекопитающих.

В плоскодонный 96-луночный планшет последовательно добавляют: 20 мкл раствора люминола, 50 мкл суспензии лейкоцитов, по 50 мкл специфических индукторов (аллерген туберкулезный рекомбинантный АТР, ППД-туберкулин для млекопитающих) и 50 мкл раствора Хэнкса без фенолового красного для отрицательного контроля антигена, с последующей регистрацией спонтанной и индуцированной ХЛ. Оценку результатов проводят в количественных (условных ед.) показателях.

Для выполнения поставленной задачи проведена серия экспериментов на морских свинках. При проведении экспериментов лабораторных животных содержали в условиях вивария, кормление осуществляли согласно «Правилам работы с использованием лабораторных животных» №755 от 12.08.1977 г.

Опыт 1. Объект исследований - лейкоциты крови от 45 морских свинок

Опытную группу №1 - морские свинки (20 голов), экспериментально заразили 3-4 недельной культурой M. bovis штамм 14 в бактериальной форме в дозе 1 мг/1 мл растворителя внутримышечно в область внутренней поверхности бедра.

Опытную группу №2 - морские свинки (20 гол.), экспериментально заразили культурой M. bovis штамм 14 в Л-форме, полученной на среде ПС-1 на основе солевого раствора Хэнкса и гексадекана, в дозе 1 мл микробной взвеси внутримышечно в область внутренней поверхности бедра.

Контрольной группе - здоровые морские свинки (5 гол.) ввели физиологический раствор в дозе 1 мл также внутримышечно в область внутренней поверхности бедра.

Забор крови проводили на 7-й, 14-й, 28-й, 45-й дни после заражения. Аллергические исследования ППД-туберкулином для млекопитающих в дозе 25 ME внутрикожно проводили перед заражением (отрицательный результат-отсутствие инфильтрата и гиперемии), на 7-й, 13-й, 27-й, 44-й дни после заражения. Через 48 ч проводили учет реакции и отбор проб для лабораторных исследований, также определяли индекс пораженности внутренних органов по А.И. Тогуновой (Тогунова А.И. Накожная вакцинация против туберкулеза в эксперименте /Дисс. канд., М., 1951).

На 7-е сутки после заражения морских свинок аллергические реакции на ППД-туберкулин отсутствовали, патологоанатомические изменения не отмечались ни в одной группе.

При исследовании на 14-е сутки после заражения аллергические реакции также отсутствовали в обеих группах, но стали проявляться первые клинические и патологоанатомические признаки туберкулеза, которые нарастали по мере увеличения срока наблюдения. При патологоанатомической экспертизе установлено, что в опытной группе №1, зараженной M. bovis шт. 14 в бактериальной форме, у животных были увеличены паховые лимфатические узлы, но печень, легкие, селезенка оставались без изменений. Индекс пораженности по группе - 2,4.

Во 2-й опытной группе, зараженной M. bovis шт. 14 в Л-форме, при патологоанатомической экспертизе внутренних органов наблюдали увеличение селезенки, появление мелких белых очагов в печени, увеличение паховых лимфоузлов. Индекс пораженности по группе - 6,4.

Аллергические реакции на ППД-туберкулин появились на 28-й день после заражения и сохранились весь период наблюдения, но степень выраженности аллергических реакций во всех случаях была невысокой. В месте введения заражающей суспензии наблюдали инфильтраты и увеличение региональных лимфоузлов.

На 45-е сутки после заражения положительную реакцию на ППД-туберкулин регистрировали только у одной морской свинки в каждой опытной группе. При патологоанатомической экспертизе у животных обеих опытных групп отмечали множественные туберкулезные. поражения в органах и лимфатических узлах, в печени - мелкие очажки и очаги по всей поверхности глинистого цвета; в селезенке - выраженную зернистость, в легких - мелкие множественные и сливные очаги, в месте введения заражающей суспензии - язвы с казеозным содержимым. Индекс пораженности по группе - 5,68 и 11,4 соответственно.

При исследовании в ХЛ крови зараженных животных - ХЛ отрицательного контроля спонтанной ХЛ (без антигена) - 4,74±1,22 условн. ед., положительный контроль с ППД (с 7-го дня после заражения и в последующие дни) - 35,96±7,43 условн. ед.

показатели ХЛ исследуемых проб клеток крови опытных животных, зараженных бактериальной формой M. bovis, с аллергеном туберкулезным рекомбинантным АТР - 7-й день - 22,58 условн. ед.;

14-й день - 54,28 условн. ед.;

28-й день -23,81 условн.ед.;

45-й день - 60,97 условн. ед.;

показатели ХЛ исследуемых проб клеток крови опытных животных, зараженных M. bovis Л-формой, с аллергеном туберкулезным рекомбинантным АТР - 7-й день 41,95 условн. ед.;

14-й день 42,85 условн. ед.;

28-й день - 23,81 условн. ед.,

45-й день - 41,46 условн. ед.

У здоровых животных в контрольной группе во все сроки исследований показатели ХЛ индуцированной не превышали уровня спонтанной.

Достоверность результатов ХЛ исследований в опытах подтверждена результатами бактериологических исследований - при посеве биоматериала от животных и 1-й, и 2-й опытных групп на плотные питательные среды Левенштейна-Йенсена наблюдали сплошной рост M. bovis на 27-35-е сутки культивирования в виде мелких шероховатых колоний цвета слоновой кости, на полужидкой среде ПС-1 для выращивания Л-форм микобактерий роста не наблюдали.

В результате ХЛ исследований клеток крови морских свинок, экспериментально зараженных М. bovis шт. 14, установлено превышение уровня сверхслабого свечения опытных проб с аллергеном туберкулезным рекомбинантным над отрицательным контролем антигена во все сроки исследований не только в бактериальной, но и Л-формах микобактерий:

на 7-е сутки в 4,7-8,8 раз; 14-е сутки в 11,4-9,0 раза; 28-е сутки в 5,0-5,0 раза; на 45-е сутки в 12,8-8,7 раза.

Таким образом, аллерген туберкулезный рекомбинантный при использовании in vitro в ХЛ клеток крови морских свинок, экспериментально зараженных М. bovis шт. 14 и в бактериальной и Л-форме, является специфичным.

Пример 1

Работа проведена в неблагополучном по туберкулезу хозяйстве СПК «Украинский» Исилькульского района Омской области, которое находится в приграничной зоне.

При анализе эпизоотической ситуации в данном хозяйстве установлено, что хозяйство периодически неблагополучно по туберкулезу крупного рогатого скота.

В 2007 г. нами, совместно с областной станцией по борьбе с болезнями животных (ОСББЖ), исследованы ППД-туберкулином для млекопитающих 1706 голов крупного рогатого скота, из них положительно реагировали на ППД-туберкулин 141 головы крупного рогатого скота, из которых при контрольно-диагностическом убое у 64 выявлены туберкулезные изменения в заглоточных, бронхиальных, средостенных лимфоузлах. При культуральном исследовании патологического материала на плотных питательных средах Фаст-3Л, Левенштейна-Йенсена выделена культура бычьего вида бактериальной формы, на полужидкой среде ПС-1 выделена 1 культура микобактерий бычьего вида в Л-форме. Биологическая проба на морских свинках положительная. При ХЛ исследованиях во всех исследуемых пробах крови (64 пробы) регистрировали превышение уровня ХЛ исследуемых проб по сравнению с отрицательным контролем, но вместе с тем регистрировали низкие показатели генерации активных форм кислорода и низкую скорость активации кислородзависимого метаболизма.

В областной ветеринарной лаборатории из патологического материала также была выделена культур бычьего вида на плотной питательной среде. По результатам проведенных исследований объявлено неблагополучие по туберкулезу в данном хозяйстве. Проведен комплекс ветеринарно-санитарных, ветеринарно-диагностических и хозяйственных мероприятий, получен двукратный отрицательный результат при плановых аллергических исследованиях, после чего ограничения были сняты.

Однако в дальнейшем - в 2010, 2014, 2018 гг. при плановых аллергических исследованиях выявлены положительно реагирующие на ППД-туберкулин животные. При контрольно-диагностических убоях во внутренних органах обнаружены изменения, характерные для туберкулеза. При лабораторных исследованиях биоматериала от этих животных выделена культура микроорганизмов, идентифицированная, как микобактерия туберкулеза бычьего вида. Биологическая проба на морских свинках положительная. После этого снова объявлялось неблагополучие, проводился комплекс ветеринарно-диагностических, ветеринарно-санитарных и хозяйственных мероприятий, после получения двукратного отрицательного результата аллергических исследований ограничения по туберкулезу в данном хозяйстве снимались. На сегодняшний день неблагополучным по туберкулезу остается центральная ферма Украинка.

На основании этих данных считаем, что возбудитель туберкулеза постоянно циркулирует в стаде в обычной (бактериальной), или, чаще всего, в измененной Л-форме и остается не выявленным при бактериологических исследованиях. Для Л-форм микобактерий характерна ослабленная вирулентность, связанная с дефектом клеточной стенки, что позволяет микобактерий длительно находиться в макроорганизме. В советские времена, при миграции людей, завозе и последующих перегруппировках животных из близлежащих районов (теперь приграничных), были завезены инфицированные животные. Вначале они давали небольшие аллергические реакции без видимых туберкулезных изменений на убое. Не выявленный возбудитель туберкулеза в Л-форме, переходя от одного животного к другому (пассажируя), постепенно усиливал свою патогенность (вирулентность). Впоследствии, при сопутствующих неблагоприятных условиях кормления и содержания, у животных со снижением общей резистентности и ослаблением иммунитета, в частности, гиперчувствительности замедленного типа (ГЧЗТ), возбудитель туберкулеза из измененной Л-формы переходил (реверсировал) в основную, бактериальную форму, при этом резко повышал свою вирулентность и давал картину туберкулезных изменений в органах, и, соответственно, повторную вспышку эпизоотии в хозяйстве.

Использование предлагаемого способа позволит повысить достоверность прижизненной диагностики туберкулеза за счет дополнительного выявления возбудителя туберкулеза в измененной Л-форме у животных, не реагирующих на ППД-туберкулин, из неблагополучного по туберкулезу хозяйства, что способствует более качественному проведению ветеринарно-диагностических мероприятий и дальнейшему оздоровлению хозяйства, предотвращает рецидивы болезни.

Способ прижизненной диагностики туберкулёза крупного рогатого скота, включающий выделение полиморфно-ядерных лейкоцитов, сохранение их в стабилизирующем растворе, определение индуцированной люминолзависимой хемилюминесценции с использованием в качестве индуктора «дыхательного взрыва» опсонизированного зимозана, в качестве дополнительного индуктора используют туберкулёзный антиген, отличающийся тем, что используют полиморфно-ядерные лейкоциты от крупного рогатого скота, не реагирующего на ППД-туберкулин, из хозяйств, неблагополучных по туберкулёзу, а в качестве туберкулёзного антигена используют аллерген туберкулёзный рекомбинантный диаскинтест и ППД-туберкулин для млекопитающих в разведении 1:50.