Способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота

Авторы патента:

Исаева Альбина Геннадьевна (RU)

Петропавловский Максим Валерьевич (RU)

Донник Ирина Михайловна (RU)

Коваленко Анатолий Михайлович (RU)

Оскольская Виктория Юрьевна (RU)

Явников Назар Валентинович (RU)

Беляева Светлана Николаевна (RU)

Кривоногова Анна Сергеевна (RU)

G01N33/53 - иммунологический анализ, анализ биоспецифического связывания, материалы для этого (препараты для терапевтических целей, содержащие антигены или антитела,A61K; гептены вообще, см. соответствующие рубрики в классе C07; пептиды, например протеины, вообще C07K)

G01N33/49 - крови

Владельцы патента RU 2741239:

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Белгородский государственный аграрный университет имени В.Я. Горина" (RU)

Изобретение относится к области ветеринарии и касается способа диагностики лейкоза крупного рогатого скота. Сущность способа заключается в том, что проводят реакцию иммунодиффузии для этого проводят концентрирование иммуноглобулинов, в которых содержатся специфические антитела, путем центрифугирования сыворотки крови при 2 тыс. об/мин в течение 5 минут. Реакцию иммунодиффузии проводят при 37°C в термостате, выдерживая агар с исследуемым материалом 48 часов. Использование способа позволяет выявлять инфицированных лейкозом животных на более ранних стадиях, находящихся в начальный период выработки противолейкозных антител. 1 табл., 7 пр.

Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к способам диагностики лейкоза крупного рогатого скота.

Лейкоз крупного рогатого скота - хроническое инфекционное заболевание, распространенное по всему миру. Лейкозом болеет крупный рогатый скот всех возрастов. Болезнь протекает вначале бессимптомно, затем проявляется персистентным лимфоцитозом и/или образованием опухолевидных разрастаний в кроветворных и других органах и тканях.

Среди болезней животных лейкоз крупного рогатого скота прочно занимает первое место среди инфекционных болезней, поэтому проблема своевременной эффективной диагностики лейкоза крупного рогатого скота стоит остро. В связи с этим совершенствование способов прижизненной диагностики лейкоза крупного рогатого скота актуально.

Известен способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота путем проведения поэтапной иммобилизации на твердом носителе антигена вируса лейкоза. В результате его специфического иммунологического связывания с адсорбированными моноклональными антителами мыши против гликопротеидного антигена вируса лейкоза, внесение и инкубацию контрольных и анализируемых образцов сыворотки крови или молока крупного рогатого скота, внесение и инкубацию антител к иммуноглобулинам крупного рогатого скота, меченных пероксидазой, внесение субстрата ферментативной реакции и учет результатов реакции по величине оптической плотности анализируемых образцов. [RU 2377962 C1, A61D 99/00 (2006.01), 10.01.2010 г.]. Данный метод непрямого иммуноферментного анализа обладает высокой чувствительностью и специфичностью, однако его методика выполнения в три этапа требует специализированного оборудования и высококвалифицированного персонала.

Известен способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота, который включает серологическое исследование крови серонегативных животных на лейкоз с применение РИД в течение 5 дней после учета и оценки реакции на ППД-туберкулин для млекопитающих. При этом ППД-туберкулин для млекопитающих разводят 10% раствором левамизола из расчета 20 мл на 1 млн. ME. [RU 2620558 C1, G01N 33/49 (2006.01), G01N 33/53 (2006.01), G01N 33/531 (2006.01), 26.05.2017 г.]. Данный способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота представляет значимость при проведении диагностических аллергических исследований на туберкулез, тем не менее, он не может применяться регулярно в течение года.

Известен способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота провокацией иммунного ответа, включающий серологическое исследование сыворотки крови в РИД с повторным серологическим исследованием крови серо-негативных животных после трехкратного введения инактивированной вакцины против лейкоза крупного рогатого скота с интервалом в 14 дней [RU 2264628 С2, G01N 33/53 (2000.01), 20.11.2005]. Но при сложности осуществления известный способ недостаточно эффективен, что обусловлено строго индивидуальным действием вакцины на фоне вторичных иммунодефицитов.

Диагностику лейкоза осуществляют с использованием серологических, молекулярно-генетических (полимеразной цепной реакции - ПЦР), гематологических, клинических, патоморфологических методов и метода биопробы. В настоящее время в государственных программах по борьбе с лейкозом крупного рогатого скота основу диагностики составляют серологические методы исследования - реакция иммунодиффузии (РИД) и иммуноферментный анализ (ИФА) (Методические указания по диагностике лейкоза крупного рогатого скота, утвержденные Руководителем Департамента ветеринарии Министерства сельского хозяйства Российской Федерации М.В. Кравчук 23 августа 2000 г. N 13-7-2/2130).

Метод реакции иммунодиффузии основан на обнаружении в сыворотке крови животных специфических преципитирующих антител к антигенам вируса лейкоза крупного рогатого скота, которые появляются в крови через 14-60 дней после заражения животных и сохраняются пожизненно. Это связано с тем, что онкогенный процесс у разных животных имеет различный временной характер. Поскольку лейкоз крупного рогатого скота является медленной инфекцией, то существует необходимость в выявлении противовирусных антител в ранней период онкогенеза. Данная реакция позволяет выявлять эти антитела в период от 14 до 60 дней в период инокуляции возбудителя. Но, при незначительных концентрациях антител в исследуемых сыворотках и не соответствующих температурных режимах, при которых наступает связывание (in vivo) антигена с антителом, происходит в незначительных концентрациях (in vitro) при проведении реакции иммунодиффузии, которые не позволяют их выявить и видеть их в виде линий преципитаций.

Задачей изобретения является раннее выявление инфицированных лейкозом животных, находящихся в начальный период выработки противолейкозных антител, сокращая при этом время их нахождения в стаде и способствуя ускорению проведения оздоровительных мероприятий, не требуя значительных материальных и временных затрат.

Это достигается тем, что при предлагаемом способе диагностики лейкоза крупного рогатого скота при проведении пробоподготовки постановки реакции иммунодиффузии для выявления лейкозных животных на первом этапе исследования, проводят концентрирование иммунноглобулинов, в которых содержатся специфические антитела. Данное концентрирование специфических антител заключается в том, что дополнительно проводят центрифугирование сыворотки крови в пробирках Эппендорфа при 2 тыс. об/мин. в течение 5 минут. А саму реакцию проводят при 37°C в термостате, выдерживая агар с исследуемым материалом 48 часов. При этом увеличивается концентрация специфических преципитирующих антител к антигенам вируса лейкоза крупного рогатого скота и повышается температура проведения реакции до 37°C.

Данные выводы были сделаны на основе проведенного опыта. В опыте участвовало 330 голов крупного рогатого скота из неблагополучного хозяйства по лейкозу, ранее не имеющих положительной реакции в реакции иммунодиффузии. Испытуемые сыворотки от этих животных готовили по образцам №№1-7 и проводили в условиях, указанных в соответствующих образцах.

1. Образец №1. После получения сыворотки крови, проводили центрифугирование в пробирках Эппендорфа 2,0 мл при 2 тыс. об/мин. в течение 5 минут. Надосадочную жидкость удаляли, а исследовали лишь осадок после внесения в лунки агаровых палеток, помещая на 48 часов в термостат при 37°C, затем читали реакцию.

2. Образец №2. После получения сыворотки крови, проводили центрифугирование в пробирках Эппендорфа 2,0 мл при 2 тыс. об/мин. в течение 5 минут. Надосадочную жидкость удаляли, а исследовали лишь осадок после внесения в лунки агаровых палеток, помещая на 48 часов в термостат при 40°C, затем читали реакцию.

3. Образец №3. После получения сыворотки крови, проводили центрифугирование в пробирках Эппендорфа 2,0 мл при 1 тыс. об/мин. в течение 5 минут. Надосадочную жидкость удаляли, а исследовали лишь осадок после внесения в лунки агаровых палеток, помещая на 48 часов в термостат при 37°C, затем читали реакцию.

4. Образец №4. После получения сыворотки крови, проводили центрифугирование в пробирках Эппендорфа 2,0 мл при 1 тыс. об/мин. в течение 5 минут. Надосадочную жидкость удаляли, а исследовали лишь осадок после внесения в лунки агаровых палеток, помещая на 48 часов в термостат при 24°C, затем читали реакцию.

5. Образец №5. После получения сыворотки крови, проводили центрифугирование в пробирках Эппендорфа 2,0 мл при 2 тыс. об/мин. в течение 3 минут. Надосадочную жидкость удаляли, а исследовали лишь осадок после внесения в лунки агаровых палеток, помещая на 48 часов в термостат при 32°C, затем читали реакцию.

6. Образец №6. После получения сыворотки крови, проводили центрифугирование в пробирках Эппендорфа 2,0 мл при 2 тыс. об/мин. в течение 2 минут. Надосадочную жидкость удаляли, а исследовали лишь осадок после внесения в лунки агаровых палеток, помещая на 48 часов в термостат при 40°C, затем читали реакцию.

7. Образец №7. Стандартное проведение реакции иммунодиффузии. После получения сыворотки крови, центрифугирование не проводили. Исследуемый материал сразу помещали в лунки с агаром. После проводили учет реакции (проведено согласно Методическим указаниям по диагностике лейкоза крупного рогатого скота от 23 августа 2000 г. N 13-7-2/2130).

Результаты проведения реакции иммунодиффузии с испытуемыми сыворотками животных, ранее нереагирующих серологически, приведены в таблице.

В результате опыта сделали вывод, что предлагаемый способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота основан на установленной прямой связи концентрации антител в испытуемой сыворотке и абсолютного связывания антител с антигенами при более физиологически приближенного к in vivo (37°C) реакции антигена с антителом, что приводит к повышению чувствительности реакции иммуннодиффузии (образец №1) и позволяет выявлять на 35% больше инфицированных вирусом лейкоза животных по сравнению с постановкой стандартной реакции иммунодиффузии.

Применение предлагаемого способа диагностики лейкоза крупного рогатого скота позволяет выявлять инфицированных лейкозом животных на более ранних стадиях, находящихся в начальный период выработки противолейкозных антител, что позволяет сократить время их нахождения в стаде и способствует ускорению проведения оздоровительных мероприятий, не требуя значительных материальных и временных затрат.

Источники информации

1. RU 2377962 C1, A61D 99/00 (2006.01), 10.01.2010 г.

2. RU 2620558 C1, G01N 33/49 (2006.01), G01N 33/53 (2006.01), G01N 33/531 (2006.01), 26.05.2017 г.

3. RU 2264628 C2, G01N 33/53 (2000.01), 20.11.2005 г.

4. Методические указания по диагностике лейкоза крупного рогатого скота, утвержденные Руководителем Департамента ветеринарии Министерства сельского хозяйства Российской Федерации М.В. Кравчук 23 августа 2000 г. N 13-7-2/2130.

Способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота, включающий проведение пробоподготовки способа постановки реакции иммунодиффузии для выявления инфицированных лейкозом животных на первом этапе исследования, при этом проводят концентрирование иммуноглобулинов, в которых содержатся специфические антитела, путем центрифугирования сыворотки крови в пробирках Эппендорфа при 2 тыс. об/мин в течение 5 минут, а саму реакцию проводят при 37°C в термостате, выдерживая агар с исследуемым материалом 48 часов.

Изобретение относится к иммунологии, медицинской и ветеринарной диагностике и представляет собой способ проведения иммунохроматографической серодиагностики. Способ иммунохроматографической серодиагностики с последовательным добавлением реагентов для определения специфических антител посредством использования (1) мультимембранного композита, в котором на функциональном участке иммобилизуется антиген патогенного организма, (2) раствора, содержащего меченый иммуноглобулин-связывающий белок; (3) смывающего буфера характеризуется тем, что на разные участки начальной мембраны мультимембранного композита последовательно добавляются: проба, раствор, содержащий меченый иммуноглобулин-связывающий белок; и смывающий буфер; при этом зоны для нанесения реагентов располагаются следующим образом: зона для меченого иммуноглобулин-связывающего белка располагается между зоной для нанесения пробы и зоной для нанесения смывающего буфера; зона для нанесения пробы соприкасается с рабочей мембраной тест-полоски, на которой располагается аналитическая зона, и при этом отсутствует подложка для нанесения конъюгата.

Способ прогнозирования риска развития жизнеугрожающих осложнений у пациентов с инфарктом миокарда на фоне хронической обструктивной болезни легких // 2740896

Изобретение относится к области медицины, а именно к терапии, кардиологии и пульмонологии. Раскрыт способ прогнозирования развития жизнеугрожающих осложнений у пациентов с инфарктом миокарда на фоне хронической обструктивной болезни легких на основе определения в плазме крови уровня гомоцистеина, в котором для прогнозирования кардиогенного шока и отека легких как жизнеугрожающих осложнений у пациентов с инфарктом миокарда на фоне хронической обструктивной болезни легких определяют уровень гомоцистеина в плазме крови методом иммуноферментного анализа в сочетании с определением фенотипа хронической обструктивной болезни легких и далее рассчитывают вероятность развития кардиогенного шока и отека легких.

Способ прогнозирования преэклампсии у беременных с гестационным сахарным диабетом // 2740852

Изобретение относится к медицине, в частности к акушерству и гинекологии, и раскрывает способ прогнозирования преэклампсии у беременных с гестационным сахарным диабетом.

Способ прогнозирования осложненного течения родового акта у юных первородящих женщин // 2740803

Изобретение относится к области медицины, а именно к акушерству и гинекологии. Предложен способ прогноза осложненного течения родового акта у юных первородящих.

Способ неинвазивной молекулярно-биологической диагностики болезней пульпы // 2740429

Изобретение относится к медицине и касается способа неинвазивной молекулярно-биологической диагностики болезней пульпы, где в дентинной жидкости исследуемого зуба определяют уровень экспрессии белка альфа-1-антихимотрипсин методом иммуноферментного анализа и при значениях более 5.35 нг/мл диагностируют начальный пульпит с развитием обратимого воспаления в тканях пульпы, при значениях 2.06-5.34 нг/мл - острый пульпит с необратимым воспалением в тканях пульпы, а при значениях альфа-1-антихимотрипсин менее 1.54 нг/мл у пациентов диагностируют хронические формы пульпита с низкими репаративными возможностями пульпы.

Способ выявления пациентов с повышенным риском развития рака простаты // 2740382

Изобретение относится к области медицины, а именно к медицинской биохимии и онкологии, и предназначено для выявления пациентов с повышенным риском развития рака простаты.

Способ прогнозирования трансформации хронических диссеминированных энцефаломиелитов в рассеянный склероз у детей // 2740243

Изобретение относится к области медицины, а именно клинической лабораторной диагностике и инфекционным болезням центральной нервной системы у детей, и может быть использовано в широкой клинической практике для прогноза трансформации диссеминированных энцефаломиелитов в рассеянный склероз у детей.

Способ выбора тактики лечения пациентов с регионарной лимфаденопатией неясного генеза при аденокарциноме желудка // 2740145

Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии. Предложен способ выбора тактики лечения пациентов с регионарной лимфаденопатией неясного генеза при аденокарциноме желудка.

Способ прогнозирования на ранних стадиях хронической обструктивной болезни легких риска прогрессирования заболевания // 2740071

Изобретение относится к медицине, а именно к пульмонологии, и касается способа прогнозирования прогрессирования хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ). Сущность спрособа заключается в том, что у пациента в венозной крови определяют относительное число гранулоцитов, экспрессирующих Toll-подобный рецептор 2 (CD282+ гранулоциты); относительное число гранулоцитов, экспрессирующих рецептор к интерлейкину-6 (CD126+ гранулоциты); относительное количество Т-регуляторных клеток (CD4+CD25+CD127-).

Способ прогнозирования бесплодия у женщин с гипоталамическим синдромом // 2740013

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу прогнозирования бесплодия у женщин с гипоталамическим синдромом, заключающемуся в том, что в периферической крови женщин репродуктивного возраста с гипоталамическим синдромом одновременно определяют уровни провоспалительных цитокинов: интерлейкина - 1 бета - IL-1β, интерлейкина - 6 - IL-6, интерлейкина - 8 - IL-8, фактора некроза опухолей - альфа - TNF-α, интерферона - гамма - IFN-g и уровни противовоспалительных цитокинов: интерлейкина - 4 - IL-4, интерлейкина - 10 - IL-10 в зависимости от дня менструального цикла, а именно на 5 и 21 день и в зависимости от индекса массы тела - ИМТ больше или равно 30, и при уровнях цитокинов на 5-й день менструального цикла: IL-1β от 2,7 до 3,9 пг/мл, IL-6 от 5,5 до 6,8 пг/мл, IL-8 от 2,9 до 3,7 пг/мл, TNF-α от 3,9 до 4,8 пг/мл, IFN-g от 3,1 до 4,5 пг/мл, IL-4 от 2,8 до 3,3 пг/мл, IL-10 от 5,1 до 6,9 пг/мл, и на 21 день менструального цикла при уровнях IL-1β от 2,9 до 4,3 пг/мл, IL-6 от 6,2 до 7,6 пг/мл, IL-8 от 3,2 до 4,1 пг/мл, TNF-α от 4,9 до 5,7 пг/мл, IFN-g от 3,3 до 4,9 пг/мл, IL-4 от 2,9 до 3,6 пг/мл, IL-10 от 5,3 от 7,4 пг/мл прогнозируют бесплодие у женщин с гипоталамическим синдромом.

Способ дифференциальной диагностики форм воспаления бактериального риносинусита // 2741211

Изобретение относится к медицине и касается способа дифференциальной диагностики форм воспаления бактериального риносинусита, включающего обследование больных, где способ осуществляют на основании трех достоверных информативных лабораторных показателей, а именно удельной светосуммы спонтанной продукции нейтрофилов, удельной светосуммы фМЛФ-стимулированной продукции нейтрофилов, и удельной максимальной интенсивности свечения фМЛФ-стимулированной продукции нейтрофилов; далее осуществляют комплексную математическую оценку показателей по формуле, где у - форма воспаления бактериального риносинусита, при значении у=0-0,4 диагностируют хроническую форму воспаления бактериального риносинусита, а при значении y=0,6 и выше - острую форму воспаления бактериального риносинусита; при попадании значения у в математической формуле в промежуток от 0,41 до 0,59 проводят анализ показателей путем их сопоставления с установленными пороговыми величинами, которые составляют для удельной светосуммы спонтанной продукции нейтрофилов - 7,631 PPs, для удельной светосуммы фМЛФ-стимулированной продукции нейтрофилов - 82,158 PPs, для удельной максимальной интенсивности свечения фМЛФ-стимулированной продукции нейтрофилов - 0,136 PPs; при значениях показателей выше пороговых величин диагностируют острую форму воспаления бактериального риносинусита, а при значениях ниже пороговых величин - хроническую форму воспаления бактериального риносинусита.