Таргетная неинвазивная трансплантация в мозг функционально активных митохондрий для лечения нейродегенеративных заболеваний

Изобретение относится к лечению нейродегенеративного заболевания. Раскрыто применение таргетной неинвазивной трансплантации живых митохондрий в мозг путем интраназального введения для лечения нейродегенеративного заболевания, характеризующегося митохондриальной дисфункцией. Изобретение обеспечивает эффективную доставку митохондрий в мозг. 22 ил., 3 табл., 1 пр.

 

Область техники

Изобретение относится к способу лечения болезни Альцгеймера (БА) и других нейродегенеративных заболеваний, характеризующихся митохондриальной дисфункцией, путем неинвазивной трансплантации функционально активных митохондрий в мозг, используя их для интраназального введения.

Уровень техники

Известно, что митохондрии (MX), будучи представленными во всех клеточных типах за исключением зрелых эритроцитов, участвуют, прежде всего, в производстве энергии в виде АТФ, метаболизме жирных кислот, транспорте ионов и других процессах, необходимых для нормального функционирования и выживаемости клетки. Дисфункция митохондрий сопровождается развитием тяжелой клеточной патологии. С нарушением в деятельности митохондрий связывают такие нейродегенеративные заболевания как болезнь Паркинсона [1, 2], болезнь Альцгеймера [3, 4], мышечная дистрофия [5], макулярная дегенерация [6] и даже возрастная нейродегенерация [7]. В настоящее время целая область интенсивных исследований посвящена разработке «митохондриальной медицины», где мишенью терапевтических воздействий являются сами MX. С этой целью используются различные соединения, не связывающиеся с мембраной MX (2,4-dinitrophenel, несвязывающий протеин-2, -3); субстраты, повышающие эффективность работы электронно-транспортной цепи (ЭТЦ) MX (дихлороацетат, тиамин), улучшающие метаболизм (Метформин) и различные антиоксиданты для борьбы с реактивными кислородными соединениями (РОС) (коэнзим Q10, MitoQ, RP103) [8, 9, 10]. В 2018 году уже насчитывалось более 400 законченных или ведущихся в этом направлении клинических испытаний, зарегистрированных на сайте ClinicalTrials.gov. [11]. Однако до сих пор не найдено эффективное средство для лечения патологий, связанных с недостаточным уровнем производства энергии в клетке или утратой физиологических функций РОС. Поэтому в настоящее время активно развивается направление исследований, связанное с возможностью замены дефектных или разрушенных MX на здоровые, путем трансплантации последних непосредственно в клетки. Важно отметить, что эндогенные MX могут участвовать в процессах «самоизлечения» мозга при травматическом поражении мозга, способствуя ускорению регенерации аксона за счет активации деления MX и их активного движения в аксоплазме к месту поражения [12]. В условиях in vitro при ко-культивировании различных клеток, а также in vivo в условиях нормы и развития патологий отмечен обмен митохондриями между клетками, в частности мезенхимальные мультипотентные стромальные клетки (ММСК), трансплантированными в мозг, или астроцитами и нейронами [8]. Чтобы обеспечить успех трансплантации, используются различные подходы. В Таблице 1 приведены обобщенные данные по использованию разнообразных экспериментальных подходов для трансплантации митохондрий при моделировании различных патологий как ЦНС, так и периферических органов. Проводится либо непосредственное введение выделенных митохондрий в пораженный орган или внутривенно. Также применяют трансплантацию клеток, обогащенных здоровыми MX, в частности мезенхимальных стромальных клеток, выделенных из костного мозга, которые способны формировать туннельные нанотрубочки и по ним осуществлять транспорт митохондрий к другим клеткам [12].

В настоящее время на сайте ClinicalTrials.gov отмечены 4 исследования (NCT01631578, NCT02586298, NCT03384420, NCT02851758) с использованием митохондрий, которые были допущены к клиническим испытаниям и в основном связаны с введением аутологичных митохондрий в ооциты для лечения бесплодия или использования стволовых клеток, обогащенных митохондриями для терапии митохондриальных болезней, таких как синдром Пиарсона или ишемизированного миокарда.

Очевидно, что эффективность действия «митохондриальной терапии» зависит от многих факторов, включая специфику патогенеза и эффективность доставки митохондрий, где основную роль играет способ трансплантации.

На сегодняшний день известными путями доставки митохондрий в опытах in vivo являются непосредственная инъекция в таргетный орган или их внутривенное введение, наряду с введением клеток, обогащенных MX. Однако эти методы имеют свои недостатки и ограничения.

Так, использование введения митохондрий локально в мозг при болезни Альцгеймера, характеризующуюся мозаичным поражением корковых и глубинных структур мозга может оказаться неэффективным, однако при другой нейродегенеративной болезни как болезнь Паркинсона, имеющей точный дефект в черной субстанции, этот метод трансплантации MX может дать хороший эффект.

Системное внутривенное введение MX возможно благодаря их маленькому размеру (~1 мкм в диаметре) даже по сравнению с эритроцитами, имеющими в диаметре размер ~6-8 мкм, при этом полагают, что свободные MX не будут входить в эритроциты и мешать транспорту кислорода. При системном введении митохондрий, в частности, через хвостовую вену, они обнаруживаются, не только в мозге, но и в сердце, печени, почках и мышцах [18], что может оказывать и отрицательное действие, поскольку MX активно участвуют не только в выживании клетки, но и ее гибели как по типу некроза, так и апоптоза [21, 22, 23].

Использование клеток, таких как мезенхимальные стромальные клетки (МСК), в качестве источников митохондрий при любом локальном введении является травматичным, а при внутривенном ведении возникает угроза тромбозов, в некоторых случаях нельзя исключить и ракового перерождения.

В нашем исследовании предлагается использовать интраназальный способ для трансплантации митохондрий в мозг.

Многочисленные кандидаты на лекарственные препараты для лечения ЦНС эффективны во время исследований in vitro, но не эффективны в условиях целостного организма. Одной из важных причин этого может быть как неправильный выбор способа введения, так и использование невалидной модели патологического процесса. Гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), барьер СМЖ - кровь (BCSFB) и арахноидальный барьер не только защищают ЦНС от инвазивных патогенов и различных эндогенных токсичных для мозга веществ, но также являются препятствием и на пути попадания в мозг лекарственных средств при оральном, внутривенном, внутрибрюшинном, внутримышечном и подкожном введениях. Поэтому интраназальный путь представляется хорошей альтернативой, поскольку осуществляет прямое поступление лекарственного средства из носа в мозг, минуя ГЭБ [24]. Данные по возможности использования интраназального введения для трансплантации митохондрий в мозговые структуры отсутствуют. Интраназальное введение имеет ряд преимуществ, таких как прямая доставка «нос-мозг», быстрое начало терапевтического действия и минимальная инвазивность за счет снижения побочных периферических эффектов.

Обонятельный эпителий локализован на черепной стороне носовой полости и состоит из трех типов клеток: обонятельных сенсорных нейронов, опорных и базальных клеток. Обонятельные сенсорные нейроны регенерируются (нейрогенез) с частотой в 3-4 недели, чтобы сохранить способность обоняния. При этом может происходить снижение барьерной функции из-за сочетания таких факторов, как неполное присутствие или функционирование белков плотных контактов, транспортеров оттока и протеолитических ферментов, что приводит к «негерметичному барьеру». Снижение эффективности барьерной функции может быть использовано для достижения прямой доставки лекарств в мозг. Аксоны обонятельных сенсорных нейронов образуют обонятельный нерв, который проходит через продырявленную пластинку и попадает в обонятельную луковицу. Респираторная и обонятельная область иннервируются ветвями тройничного нерва (глазодвигательный, верхнечелюстной и нижнечелюстной), идущими из ядер тройничного нерва в стволе головного мозга. Однако нижнечелюстной нерв не иннервирует носовой эпителий. Следовательно, иннервация обонятельной области и респираторной области обеспечивается только глазодвигательным и верхнечелюстным нервами. Наконец, свободные нервные окончания этих ветвей тройничного нерва распространяются в поверхностный эпителий, откуда они передают хемосенсорную информацию в мозг. Лекарственные препараты при интраназальном введении могут достигать ЦНС через три транспортных механизма: 1) могут проникать в ЦНС путем транспорта вдоль обонятельного нерва в обонятельную луковицу; 2) через тройничный нерв, пройдя через респираторный и обонятельный эпителий, и 3) могут проникать в системную циркуляцию (кровь) путем абсорбции через артериовенозные анастомозы. Интересно, что расстояние между носовым эпителием и мозговым стволом (тройничный путь) у крыс оценивается в ~20-30 мм, тогда как расстояние от обонятельного эпителия до обонятельной луковицы (обонятельный путь) оценивается в ~4-5 мм. Первые два механизма транспортировки лекарственных препаратов обходят ГЭБ, что приводит к прямому переносу их в мозг. В последнем случае препараты из системного кровообращения могут проникать в мозг, преодолевая ГЭБ, через внутриклеточные механизмы, такие как пассивная диффузия, адсорбционный эндоцитоз и рецептор-опосредованный эндоцитоз. Однако внеклеточный перенос вдоль обонятельных нервов происходит быстрее (от минут до получаса), чем внутриклеточный перенос (от часов до дней). По достижении обонятельной луковицы препараты могут проникать в другие области ЦНС механизмами объемного потока и путем смешивания с энтерстициальной жидкостью мозга (ECF). Таким образом, и респираторный и обонятельный эпителий являются основными абсорбционными областями для доставки лекарств в мозг, однако обонятельный эпителий наиболее важен, поскольку он обеспечивает прямую связь между полостью носа и ЦНС, в обход ГЭБ [24]. Многие исследования на животных показали, что препараты белковой природы, вводимые интраназально, могут проникать в мозг, минуя ГЭБ. Так, у крыс в ЦНС обнаруживали такие белки, как инсулиновый фактор роста 1 (7,65 кДа), эритропоэтин (30-34 кДа), интерферон βlb (18,5 кДа), овальбумин (45 кДа), лептин (16 кДа), фактор роста человеческого нерва (26,5 кДа), фактор роста эндотелия сосудов (38,2 кДа), фактор роста человека β1 (25 кДа) и фактор роста фибробластов человека (17,2 кДа). Предполагается, что доставка в ЦНС происходит по компонентам, связанным с обонятельным и тройничным нервами, с последующим распространением в другие структуры ЦНС в течение 30-60 мин. [25, 26]. При этом в экспериментах на животных интраназальное введение приводило к более высокой биодоступности препарата и уменьшенному распределению его в нецелевые органы, что создавало возможность снижения системных побочных эффектов. Ранее полагали, что размер частиц, проникающих в мозг при интраназальном введении ограничен 1 кДа, однако ряд исследований свидетельствует о возможности доставки в мозг стволовых клеток [27, 28], размер которых существенно превышает размер MX.

Таким образом, интраназальная доставка препаратов имеет ряд существенных преимуществ по сравнению с локальным или внутривенным путями [24].

Преимущества интраназального способа доставки лекарств:

• Большая площадь поверхности слизистой носа для поглощения дозы

• Быстрая абсорбция препарата через высоковаскуляризированную слизистую оболочку

• Быстрое начало действия

• Легкость введения и неинвазивность

• Минует ГЭБ

• Избегание желудочно-кишечного тракта и метаболизма первого прохода

• Улучшенная биодоступность

• Возможен прямой транспорт в ЦНС

• Снижение дозы / снижение побочных эффектов

• Улучшение удобства и соответствия требованиям

• Самостоятельный прием

Ограничения:

•Объем, который может быть доставлен в полость носа, ограничен 25-200 мкл.

• Неблагоприятное воздействие патологических состояний (ринит и т.д.)

• Проницаемость может изменяться из-за движения ресничек

• Проницаемость ограничена из-за ферментативного ингибирования

Несмотря на значительные усилия ученых и врачей всего мира пока не удалось найти эффективного лекарства против большинства нейродегенеративных заболеваний, включая и болезнь Альцгеймера, рост распространенности которых наблюдается во всех развитых странах в основном из-за увеличения продолжительности жизни населения. Поведенческим проявлением БА является прогрессирующая потеря памяти на фоне дисфункции митохондрий и гибели нейронов, главным образом, в коре и гиппокампе - структурах мозга, ответственных за процессы обучения и памяти. Одной из причин неблагоприятной ситуации с терапией БА является отсутствие валидных животных моделей. Модели на трансгенных животных, получивших наиболее широкое распространение, воспроизводят редко встречающуюся наследственную форму БА. К недостаткам этих моделей можно отнести незначительную гибель нейронов, слабую ассоциацию образования амилоидных бляшек и развития дефицита памяти [29], кроме того эти животные часто несут такой комплекс генетических изменений, который никогда одновременно не встречается у больных БА. Поэтому наибольший интерес представляют модели спорадической формы БА, которая встречается в 95% случаев. Трудность моделирования спорадической формы БА заключается в том, что в естественных условиях даже в процессе старения у мышей и крыс - экспериментальных животных, наиболее часто используемых для моделирования, крайне редко спонтанно образуются сенильные бляшки - морфологический признак БА. Тем не менее, к настоящему времени описан ряд экспериментальных подходов, вызывающих появление у животных признаков спорадической формы БА.

Наши исследования для проверки эффективности интраназальной трансплантации функционально активных митохондрий были выполнены на мышах с удаленными обонятельными луковицами - ольфакторно бульбэктомированных (ОБЭ) мышах линии NMRI. Выбор именно этой модели спорадической формы БА был обусловлен ее явными преимуществами перед существующими «инъекционными» моделями с введением в мозг нативных животных разнообразных нейротоксичных субстанций или моделями на животных с ускоренным старением (мыши SAMP8 [30] или крысы OXYS [31], в последнем случае требуется длительное время (до 18 мес) для развития нейродегенеративных изменений альцгеймеровского типа, что, существенно удорожает проведение исследований на этой модели).

Животные с удаленными обонятельными луковицами, прежде всего, воспроизводят характерный для БА признак - избирательную гибель нейронов в определенных областях мозга: в структурах, имеющих непосредственное отношение к процессам обучения и памяти (энторинальной коре, гиппокампе, височной коре), а также в ядерных образованиях, содержащих нейроны, синтезирующие основные нейромедиаторы - ацетилхолин, серотонин, дофамин и норадреналин [32, 33]. Такая мозаичность гибели нейронов обусловлена многочисленными афферентными и эфферентными связями обонятельной луковицы с выше названными структурами мозга, поражаемыми при БА. Локализация амилоидных бляшек в мозге больных БА и у ОБЭ животных не имеет случайный характер и, в основном, приурочена к местам окончаний терминалей холинергических нейронов [34] и повышенной плотности альфа-7-никотиновых ацетилхолиновых рецепторов, с которыми бета-амилоид (Абета) способен образовывать комплексы, инициируя их эндоцитоз [35] с последующей активацией каспаз и гибелью нейронов. Поэтому места скопления бляшек, как правило, совпадают с очагами нейрональной дегенерации. В результате двухстороннего удаления обонятельных луковиц у разных видов грызунов (мышей, морских свинок и крыс) наблюдаются поведенческие, морфологические, биохимические и иммунологические изменения, характерные для развития нейродегенерации альцгеймеровского типа, включающие ухудшение пространственной памяти, повышение уровня мозгового Абета, снижение числа иммунореактивных к холинацетилтрансферазе клеток (ХАТ) и плотности альфа-7-ацетилхолиновых рецепторов [36-40]. Развитие нейродегенерации в мозге после ОБЭ проявляется в увеличении числа клеток с пикнозом, кариолизисом и цитолизом в височной коре и полях гиппокампа, а также в ядрах, синтезирующих серотонин и ацетилхолин. Классические амилоидные бляшки были обнаружены в коре и гиппокампе после ОБЭ у морских свинок, которые, в отличие от мышей и крыс, имеют первичную структуру Абета, сходную с таковой у человека [41]. На переживающих срезах мозга крыс с ОБЭ было выявлено существенное нарушение долговременной потенциации в гиппокампе [42] и снижение уровня синаптофизина, указывая на патологию в синаптической трансмиссии, что характерно и для мозга больных с БА [43]. ОБЭ вызывает иммунодепрессию и уменьшение концентрации TNF-α в плазме периферической крови, подавление его продукции в перитонеальных макрофагах и спленоцитах, угнетение митоген-стимулированной пролиферации Т и В лимфоцитов селезенки, а также снижение продукции NO в макрофагах, как это имеет место и при БА [44]. Важно отметить, что у ОБЭ мышей развивается характерный для БА дефицит энергетического обмена, проявлявшийся в низкой скорости окисления NADH субстрата комплекса I электрон-транспортной цепи, снижении генерированного потенциала на внутренней мембране митохондрий и падении активности цитохромоксидазы (комплекс IV) дыхательной цепи митохондрий на фоне высокого содержания в них растворимого Абета (1-40). Нарушение энергетического метаболизма сопровождалось накоплением продуктов перекисного окисления липидов в митохондриях, что свидетельствовало о развитии окислительного стресса. Аналогичные изменения в митохондриях мозга наблюдаются при спорадической форме этого заболевания у человека [45]. Значительное ускорения отложения амилоидных бляшек отмечено у трансгенной линии мышей B6C3-Tg(APPswe,PSENldE9) 85Dbo/J, подвергнутых ОБЭ. Эти данные позволили сделать заключение о возможности использования ОБЭ животных в качестве валидной модели спорадической формы БА. Массив данных, говорящих в пользу важной роли поражения обонятельной системы, включая дегенерацию митральных клеток обонятельной луковицы, еще более укрепляет правомочность использования ОБЭ как модели спорадической нейродегенерации альцгеймеровского типа. Преимуществом ОБЭ, как модели БА, является полнота воспроизведения данного симптомо-комплекса, сравнительно небольшие сроки, необходимые для развития патологии (1 мес после операции). Однако главным преимуществом этой модели является ее адекватность естественному возникновению и развитию данного заболевания. ОБЭ, грубо имитируя повреждение периферической обонятельной системы, вызывает поведенческие и молекулярно-клеточные нарушения, характерные для БА. Таким образом, сравнительный анализ существующих моделей спорадической наиболее распространенной формы БА с точки зрения полноты воспроизведения молекулярно-клеточных механизмов БА позволяет выделить две модели - крысы с ускоренным старением и ОБЭ животные. Наше исследование эффективности использования митохондрий как лекарственного средства против БА было проведено на ОБЭ мышах, поскольку результаты могут быть получены в значительно более короткий срок.

Прототип

Прототипом для предлагаемого нами метода неинвазионной интраназальной трансплантации митохондрий может служить внутривенное введение митохондрий, описанное в трудах конференции Emerging Concepts in Mitochondrial Biology, которая проходила 4-8 февраля 2018 года, в Израиле в Институте Вейсмана (Орехон). Авторы: Eyai.Ekesner, Efrat.Lkesner, Saada-Reich, A.; Rosenmann, H.; Nitzan, K.; Benhamro, S.; Valitsky, M.; Lorberboum- Galski, H. в тезисах под названием Mitochondrial Incorpotion - Characteristics and Treatment for Neurodegenerative Diseases [46].

На культуре клеток авторы показали, что митохондрии могут быть включены в клетки путем простой коинкубации изолированных митохондрий с клетками без необходимости какого-либо вмешательства. Используя метод конфокальной микроскопии авторы в экспериментах in vitro показывали, что изолированные митохондрии очень быстро могут быть включены в различные типы клеток реципиента и сохраняются внутри них в течение нескольких дней, совместно локализуясь с эндогенными митохондриями. В экспериментах in vivo авторы также показали, что внутривенное введение митохондрий человека в мышь является безопасным, а вводимые митохондрии проникают в органы животных, включая печень, сердце и мозг. Этого оказывается достаточным, чтобы у животных с инъекционной моделью болезни Альцгеймера, вызванной внутримозговым введением бета-амилоида, введение экзогенных митохондрий сопровождалось улучшением не только памяти, но и увеличением нейрональной плотности в гиппокампе на фоне снижения микроглиальных и астроглиальных клеток. Авторы считают, что внутривенное введение MX может быть перспективным для лечения нейродегенеративных заболеваний.

На нативных животных - мышах линии NMRI было показано, что трансплантация митохондрий в мозг может быть осуществлена, используя их интраназальное введение, и обеспечивать попадание экзогенных митохондрий в мозг. Подобно прототипу, но на другой модели спорадической формы БА - ОБЭ мышах установлено, что 3-х кратное интраназальное введение митохондрий на протяжении 3-х недель восстанавливает память у этих животных, в то время как ОБЭ мыши, не получавшие введение митохондрий, демонстрируют полную потерю пространственной памяти. Вместе с тем интраназальная трансплантация митохондрий является неинвазивной и не доставляет страдания. В сравнении с внутривенным введением практически исключается попадание митохондрий в другие органы и ткани, кроме мозга, поражаемого при различных нейродегенеративных заболеваниях. При этом исключается также появление тромбов при возможном образовании агрегатов митохондрий в крови. Кроме того предлагаемый метод позволяет производить дозозависимое введение митохондрий, что важно для обеспечения оптимального их количества, необходимого при лечении разных нейродегенеративных заболеваний.

Изобретение решает задачу расширения возможностей адресной в мозг доставки экзогенных митохондрий, обладающих лечебным действием при нейродегенеративных заболеваниях.

Поставленная задача решается за счет использования неинвазивной интраназальной трансплантации живых митохондрий в мозг.

Сущность изобретения

Сущностью изобретения является таргетная трансплантация митохондрий в мозг, используя их неинвазивное интраназальное введение. Предлагаемое изобретение относится к терапевтическим средствам лечения нейродегенеративных заболеваний. При интраназальном введении митохондрии проходят в мозг и локализуются в коре, гиппокампе и обонятельной луковице - структурах, ответственных за обучение и память и поражаемых при ряде нейродегенеративных заболеваний.

Другой аспект изобретения состоит в разработке доз препарата митохондрий, которые зависят от ряда факторов, таких как масса тела пациента, пол и возраст. В отличие от прототипа, обеспечивает возможность дозирования и минимизирует появления побочных эффектов за счет попадания митохондрий в другие органы и ткани, что невозможно избежать при использовании их внутривенного введения.

Техническим результатом изобретения является таргетное попадание митохондрий в мозг и улучшение памяти у животных с индуцированной нейродегенерацией альцгеймеровского типа.

Перечень и описание рисунков

Рисунок 1. Микрофотографии образца раствора с неокрашенными митохондриями в концентрации 1,8 мг/мл.

Рисунок 2. Микрофотографии образца буферного раствора, отфильтрованного от MTR-окрашенных митохондрий в концентрации 1,8 мг/мл.

Рисунок 3. Микрофотографии образца раствора с MTR-окрашенными митохондриями в концентрации 0,3 мг/мл.

Рисунок 4. Микрофотографии образца раствора с MTR-окрашенными митохондриями в концентрации 1,8 мг/мл.

Рисунок 5. Микрофотографии образца раствора с MTR-окрашенными митохондриями в концентрации 3,3 мг/мл.

Рисунок 6. Типичные кривые потребления кислорода митохондриями мозга мыши в присутствии субстратов комплекса (5 мМ малат+5 мМ глутамат калия) (А) и комплекса (10 мМ сукцинат+2,5 мМ глутамат калия) (Б) дыхательной цепи. Состав среды инкубации: 100 мМ KCl, 75 мМ маннитол, 25 мМ сахароза, 5 мМ KH2PO4, 0.5 мМ ЭГТА, 10 мМ Hepes/KOH (рН 7.4). Добавки: 5 мМ малат+5 мМ глутамат калия или 10 мМ сукцинат+2,5 мМ глутамат калия, 200 μМАДФ и 50 μМ 2,4-динитрофенол (ДНФ). Концентрация митохондриального белка в кювете 0.5 мг/мл (n=3).

Рисунок 7. Микрофотографии мазка обонятельных луковиц мыши, которой был введен раствор с неокрашенными митохондриями в концентрации 1,8 мг/мл.

Рисунок 8. Микрофотографии мазка неокортекса мыши, которой был введен раствор с неокрашенными митохондриями в концентрации 1,8 мг/мл.

Рисунок 9. Микрофотографии мазка гиппокампа мыши, которой был введен раствор с неокрашенными митохондриями в концентрации 1,8 мг/мл.

Рисунок 10. Микрофотографии мазка обонятельных луковиц мыши, которой вводился буферный раствор, отфильтрованный от MTR-окрашенных митохондрий в концентрации 1,8 мг/мл.

Рисунок 11. Микрофотографии мазка неокортекса мыши, которой вводился буферный раствор, отфильтрованный от MTR-окрашенных митохондрий в концентрации 1,8 мг/мл.

Рисунок 12. Микрофотографии мазка гиппокампа мыши, которой вводился буферный раствор, отфильтрованный от MTR-окрашенных митохондрий в концентрации 1,8 мг/мл.

Рисунок 13. Микрофотографии мазка обонятельных луковиц мыши, которой был введен раствор MTR-окрашенных митохондрий в концентрации 0,3 мг/мл.

Рисунок 14. Микрофотографии мазка неокортекса мыши, которой был введен раствор MTR-окрашенных митохондрий в концентрации 0,3 мг/мл.

Рисунок 15. Микрофотографии мазка гиппокампа мыши, которой был введен раствор MTR-окрашенных митохондрий в концентрации 0,3 мг/мл.

Рисунок 16. Микрофотографии мазка обонятельных луковиц мыши, которой был введен раствор MTR-окрашенных митохондрий в концентрации 1,8 мг/мл.

Рисунок 17. Микрофотографии мазка неокортекса мыши, которой был введен раствор MTR-окрашенных митохондрий в концентрации 1,8 мг/мл.

Рисунок 18. Микрофотографии мазка гиппокампа мыши, которой был введен раствор MTR-окрашенных митохондрий в концентрации 1,8 мг/мл.

Рисунок 19. Микрофотографии мазка обонятельных луковиц мыши, которой был введен раствор MTR-окрашенных митохондрий в концентрации 3,3 мг/мл.

Рисунок 20. Микрофотографии мазка неокортекса мыши, которой был введен раствор MTR-окрашенных митохондрий в концентрации 3,3 мг/мл.

Рисунок 21. Микрофотографии мазка гиппокампа мыши, которой был введен раствор MTR-окрашенных митохондрий в концентрации 3,3 мг/мл.

Рисунок 22. Влияние интраназальной трансплантации митохондрий в дозе 20 мкг/мышь) на пространственную память мышей, тестируемую в водном лабиринте Морриса, где: А - время (сек) пребывания мышей в секторах водного лабиринта, Б - число заходов в них в %. По оси абсцисс - номера секторов лабиринта Морриса (1-4) и группы животных. Сектор обучения 3 окрашен в черный цвет. По оси ординат - показатели времени пребывания в секторах лабиринта (А) и числа заходов в них (Б). Достоверность отличия данных по Tukey's тесту: * - р<0,05; ** - р<0,01; *** - р<0,001.

Введение препарата митохондрий

Суспензию митохондрий предпочтительно вводят интраназально в виде спрея или в виде капель в нос. Жидкую форму можно вводить через трубку или катетер, например, с помощью шприца.

Суспензия митохондрий может быть приготовлена на водной основе и может содержать различные дополнительные ингредиенты, которые улучшают стабильность митохондрий или улучшают их доставку в мозг при введении через носовые ходы. Такие дополнительные ингредиенты хорошо известны в данной области [47]. Примеры дополнительных ингредиентов для улучшения функционального состояния митохондрий и их сохранности в течение длительного времени: а) субстраты дыхания - пируват, сукцинат, малат; б) агенты, связывающие жирные кислоты - альбумин, ЭГТА; в) агенты для поддержания осмотического давления митохондрий (маннитол, сахароза); г) агенты для ингибирования агрегации (например, ЭГТА); д) агенты, связывающие ионы железа - ЭДТА; е) агентами, управляющими величиной рН (Трис и Хепес). Примеры агентов, способствующих проникновению через мембраны и повышающих эффективность трансплантации митохондрий, включают, но не ограничиваются, например: а) агенты, модулирующие физиологию эпителия; б) хелатирующий агент (например, лимонная кислота); в) аминокислоты или их соли (например, моноаминокарбоновые кислоты, такие как глицин, аланин, фенилаланин, пролин, гидроксипролин и т.д.; гидроксиаминокислоты, такие как серии; аминокислоты, такие как аспарагиновая и глутаминовая кислоты, и т.д., и основные аминокислоты, такие как лизин и т.п., включая их соли щелочных и щелочноземельных металлов); г) ингибитор синтеза жирных кислот; д) ингибитор синтеза холестерина. Агент, усиливающий проникновение через мембрану, также может быть выбран из коротких гидрофильных молекул в низкой концентрации, в том числе, диметилсульфоксид (ДМСО). Дополнительные усилители проникновения через мембраны включают кислоты, такие как капроновая, молочная, яблочная и лимонная кислоты и их соли, триглицерид (например, амилодекстрин, Эстарам 299, Миглиоль 810); циклодекстрины и производные бета-циклодекстрина (например, 2-гидроксипропил-β-циклодекстрин и гептакис (2,6-ди-О-метил-β-циклодекстрин), активаторы пиноцитоза [48], а также другие агенты, способствующие проникновению, которые являются физиологически приемлемыми для интраназального введения.

Неограничивающие примеры биоадгезивных агентов включают, например, карбопол, целлюлозные вещества, крахмал, декстран и хитозан.

Доставка

Агенты, повышающие назальную доставку митохондрий, могут быть смешаны, по отдельности или вместе, с другими веществами, входящими в композицию вместе с митохондриями. Для интраназального введения желательно, чтобы любые существенные изменения в проницаемости слизистой были обратимыми в течение периода действия препарата. Кроме того, препарат не должен вызывать токсичность или вредные изменения в барьерных свойствах слизистой оболочки носа при длительном использовании.

Процедуры, используемые при профилактике и лечении

При профилактике и лечении БА можно интраназально вводить митохондрии или их в комбинации с другими препаратами, которые могут быть полезны при нейродегенеративных заболеваниях. Например, митохондрии можно вводить интраназально в комбинации с приемом внутрь средств, входящих в список:

а) блокаторы ацетилхолинэстеразы, например, донепезил (Aricept ™), галантаминагидробромид (реминил), ривастигмин (экселон) и ипидакрин (нейромидин);

б) средства для улучшения памяти, уменьшающие эксайтотоксичность глутамата, (акатиноламемантин ™);

в) антидепрессанты (пароксетин ™). Обычно используют ингибиторы обратного захвата серотонина (тразодон, буспирон) и трициклические антидепрессанты с минимальным М-холиноблокирующим действием (дезипрамин и нортриптилин);

г) анксиолитические средства (тиоридазин), антипсихотические средства (галоперидол) или бензодиазепины (лоразепам);

д) средства от расстройства сна (дифенгидрамин);

е) противовоспалительные средства (нестероидное средство ибупрофен, диклофенак и т.д.);

ж) антиоксидантные средства (витамин Е или стандартизированный экстракт листьев гинкго билоба (EGb 761), содержащийся в препарате мемоплант);

з) антигипоксические средства (активаторы митохондриального АТФ-зависимого калиевого канала, уридин и т.д.)

и) средства, модулирующие уровень холестерина, например, агенты, которые уменьшают содержание холестерина, статины (аторвастатин, правастатин, симвастатин, ловастатин и флювастатин) и антагонисты гистаминовых (Н2) рецепторов (димебон) (см. международную заявку WO 2013006076).

Устройства для введения

Настоящее изобретение охватывает любое устройство, которое подходит для интраназального введения митохондрий и композиций с ними. Предпочтительно, чтобы устройство позволяло вводить отмеренную дозу композиции. Примеры устройств интраназального введения включают, но не ограничивают, например, катетеры, капельницы, дозаторы, распылители аэрозолей, дозированные ингаляторы и другие устройства.

Для введения композиции в составе жидкости в виде капель, композиция может быть помещена в контейнер и снабжена обычной капельницей, предпочтительно, чтобы капельница имела фиксированный объем для подачи.

MX готовятся экс темперо. Устройство доставки (или его упаковки) может быть снабжено этикеткой и/или с инструкцией по применению, указывающий, что композиция должна быть использована интраназально. На этикетке может быть напечатан штрих-код, в котором зашифрован производитель, время выпуска и другая необходимая информация.

Операция 1. Выделение митохондрий из мозга мышей линии NMRI

Митохондрии были выделены из ткани мозга самцов мышей линии NMRI возрастом 3,5 месяца, с помощью общепринятого метода дифференциального центрифугирования с некоторыми модификациями, предложенными нами ранее [49]. Коротко, процедура включает в себя следующие стадии.

А) После декапитации животного мозг необходимо быстро извлечь и поместить в охлажденный физиологический раствор. Затем его измельчить, промыть дважды в физиологическом растворе от крови. Далее пипеткой убирают физиологический раствор, ткань заливают средой выделения, содержащей 0,225 М маннит, 0,075 М сахарозу, ОДмМ ЭГТА, 0,2% обезжиренный БСА, 10 мМ Хепес/КОН, рН-7,4 (среда #1).

Б) Полученную смесь гомогенизируют вручную до однородного состояния. Соотношение ткани и среды выделения при гомогенизации составляет 1:10. Полученную суспензию центрифугировать при 2000g х 5 мин. Супернатант снова центрифугируют при 12000g х 10 мин. Осадок после второго центрифугирования ресуспендируют в среде промывки, содержащей 0,225 М маннит, 0,075 М сахарозу, 10 мМ Хепес/КОН, рН-7,4 (среда #2), и повторно центрифугируют при 12000g х 10 мин. Затем полученный осадок ресуспендируют в среде #2 в соотношении на 1 г ткани мозга на 0,1 мл среды. Все процедуры необходимо выполнять при +4°С.

Полученная суспензия содержала 35-40 мг митохондриального белка на 1 мл. Концентрация белка была определена по методу Лоури [50]. Калибровочная кривая была построена с использованием БСА, очищенного от жирных кислот (Sigma, cat#A6003). Используемые в дальнейшем митохондриальные суспензии после соответствующего концентрационного разведения в среде #2 содержали 0,3, 1,8 и 3,3 мг/мл, что соответствует приблизительно 2, 10 и 20 мкг вводимого митохондриального белка на 6 мкл раствора (объем раствора для одной интраназальной инъекции).

Операция 2. Мечение митохондрий мозга мышей линии NMRI с помощью MitoTracker Red CMXRos (MTR, Invitrogen, cat # M7512) для контроля их доставки в мозг при интраназальном способе трансплантации

Митохондрии, выделенные из мозга мышей линии NMRI, были помечены флуоресцентным зондом MitoTracker Red CMXRos (MTR) (Invitrogen, cat#M7512) для визуализации и отслеживания в условиях in vitro и in vivo. Окрашивание проводили в соответствии с рекомендациями производителя. Коротко, к полученным митохондриям в концентрации 20 мг/мл добавляли 5 мМ глутамат, 5 мМ малат и 10 мМ сукцинаткалия в качестве субстратов дыхания и инкубировали с 1 мкМ MTR в течение 5 минут при комнатной температуре, избегая попадания света. С целью промывки от не связавшегося красителя, суспензию митохондрий центрифугировали при 12000g х 10 мин, 4°С. Затем полученный осадок митохондрий повторно ресуспендировали в среде #2, дополненной субстратами дыхания, и вновь центрифугировали для промывки от MTR. Результирующая суспензия окрашенных и отмытых от несвязавшегося красителя митохондрий после концентрационного разведения до 0,3 мг/мл (2 мкг/6 мкл), 1,8 мг/мл (10 мкг/6 мкл) и 3,3 мг/мл (20 мкг/6 мкл) в среде #2, дополненной субстратами дыхания, была использована для дальнейшей визуализации в условиях in vitro и in vivo с помощью флуоресцентного микроскопа (Leica DM IL LED Fluo, Germany). В тандеме был проведен тест, подтверждающий отсутствие свободного (не связавшегося с митохондриями) флуоресцентного красителя в суспензии изолированных митохондрий. Для этого MTR-окрашенные митохондрии в концентрации 1,8 мг/мл были взяты в отдельный стерильный шприц объемом 1 мл, и медленно пропущены через фильтр Nalgene с диаметром пор 0,2 мкм (Thermo Scientific cat # 723-2520), помещенный на конце шприца. Поскольку фильтр препятствует прохождению митохондриальных частиц, полученный раствор («буферный раствор, отфильтрованный от MTR-окрашенных митохондрий») был использован в качестве доказательства отсутствия несвязавшегося флуоресцентного зонда в дальнейших экспериментах по визуализации MTR-окрашенных митохондрий in vitro и in vivo.

Операция 4. Проверка функциональной активности выделенных митохондрий перед их интраназальной трансплантацией

Основным показателем функциональной активности митохондрий является их способность к окислительному фосфорилированию. Эта способность, в свою очередь, зависит от целостности внутренней мембраны органелл и может резко снижаться при нарушениях в процессе получения чистой митохондриальной фракции [51]. Наиболее распространенным методом количественного анализа эффективности окислительного фосфорилирования является определение показателей дыхательного контроля, АДФ/О и времени фософорилирования [52, 53]. Дыхательный контроль представляет собой отношение скорости потребления кислорода энергизованными митохондриями (при наличии субстратов дыхания и АДФ - состояние 3 по Б. Чансу) к скорости потребления кислорода при наличии субстратов без добавления АДФ (состояние 4 по Б. Чансу). После добавления АДФ, оценка качества препарата митохондрий проводится также по вычислению соотношения количества АДФ к количеству израсходованного кислорода (АДФ/О) и времени, затраченного на фосфорилирование всего добавленного АДФ (Т_ф). В работе проводили измерение указанных показателей эффективности окислительного фосфорилирования митохондрий, изолированных из ткани мозга мышей. Скорость потребления кислорода митохондриями оценивали при помощи респирометра высокого разрешения («Oroboros-2k», Австрия). Измерение скорости дыхания митохондрий проводилось в 2 мл среды инкубации с добавлением субстратов I комплекса I (5 мМ малата и 5 мМ глутамата калия) или комплекса II (10 мМ сукцината калия) дыхательной цепи (4 состояние по Чансу), и последующим добавлением 200 мкМ АДФ (3 состояние по Чансу) и разобщителя окислительного фосфорилирования 50 мкМ 2,4-диниторофенола (разобщенное дыхание).

Операция 5. Интраназальное введение разных концентраций меченых митохондрий нативным мышам NMRI в объеме 6 мкл на одно животное.

Эксперименты проводили на нативных 6-ти месячных самцах мышей линии NMRI, содержащихся в клетках по 2-3 особи в специально оборудованном помещении в условиях естественного освещения при температуре 21-23°С со свободным доступом к воде и гранулированному корму. Все работы с животными выполнялись в соответствии с требованиями, изложенными в постановлении 118 Национального Института Здоровья США и одобренными Комитетом по уходу и использованию животных в эксперименте (NIH Publications N 8023, 119 revised 1978), а также с положениями Приказа Минздрава СССР от 12.08.1977 №755 «О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных» наряду с решением Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других целях (Страсбург, 1986) и принципами Хельсинской Декларации (2000). Все протоколы исследований одобрены Комиссией ИТЭБ РАН по этике и гуманному отношению к экспериментальным животным (Приказ №173/К от 03.10.2011, Протокол №09 от 01.03.2019).

Препарат митохондрий, используемый для интраназального введения, был получен из мозга самца мыши линии NMRI возрастом 3,5 месяца, в соответствии с описанной выше методикой. Свежеприготовленную суспензию меченых митохондрий в концентрациях: 0,3 мг/мл, 1,8 мг/мл и 3,3 мг/мл однократно вводили мышам интраназально в объеме 6 мкл на одно животное, по 3 мкл в каждую ноздрю. Контрольные животные получали интраназальное введение буферного раствора, отфильтрованного от MTR-окрашенных митохондрий в концентрации 1,8 мг/мл, или немеченые митохондрии (1,8 мг/мл) в том же объеме. Все животные с интраназальным введением находились под наблюдением в течение суток. Токсичности интраназального введения MX не выявлено.

Первая серия экспериментов посвящена исследованию проникновения митохондрий в мозг после их интраназального введения. Были сформированы следующие группы животных:

1-я группа - контрольные животные, получающие раствор с неокрашенными митохондриями в концентрации 1,8 мг/мл.

2-я группа - контрольные животные, которым вводится буферный раствор, отфильтрованный от MTR-окрашенных митохондрий в концентрации 1,8 мг/мл.

3-я группа - животные, которым вводится раствор MTR-окрашенных митохондрий в концентрации 0,3 мг/мл.

4-я группа - животные, получающие раствор MTR-окрашенных митохондрий в концентрации 1,8 мг/мл.

5-я группа - животные, которым вводится раствор MTR-окрашенных митохондрий в концентрации 3,3 мг/мл.

Через 48 часов после интраназального введения животным в стерильных условиях быстро осуществляли декапитацию и на холоду извлекали мозг. Для исследования были выделены следующие структуры: гиппокамп, неокортекс и обонятельные луковицы, которые помещались в холодильник при -20°С. В этот же день из каждой структуры готовили гомогенат в физиологическом растворе, часть которого в виде мазка помещали на предварительно очищенное предметное стекло и проводили микроскопическое исследование с использованием флуоресцентного микроскопа (Leica DM IL LED Fluo (Germany)). Наличие окрашенных флуоресцентным красителем митохондрий в каждом поле зрения (х20, не менее 10 полей зрения) оценивали визуально в красной области спектра и производили фотосъемку.

На рисунках 1-5 приведены микрофотографии суспензий MTR-окрашенных митохондрий (1 мкл) в разных концентрациях, а также буферный раствор, отфильтрованный от MTR-окрашенных митохондрий в концентрации 1,8 мг/мл (контроль 1) и суспензия немеченых митохондрий 1,8 мг/мл (контроль 2) непосредственно перед их интраназальным введением. А - флуоресценция в красной области спектра; Б - изображение раствора в проходящем свете. Шкала - 25 мкм.

Перед трансплантацией митохондрий в мозг проводили оценку качества изолированных митохондрий, выделенных из мозга мыши. В качестве оценки эффективности окислительного фосфорилирования митохондрий использовали показатели дыхательного контроля, АДФ/О и времени фосфорилирования. Типичные полярографические кривые, отражающие изменение концентрации кислорода в кювете и скорость потребления кислорода в суспензии митохондрий мозга мыши, представлены на рисунке 6.

По полученным полярографическим графикам, рассчитывали показатели дыхательного контроля (ДК), который равен отношению скоростей V₃ к V₄, соотношение добавленного АДФ к количеству израсходованного кислорода (АДФ/О) и время фосфорилирования АДФ (Тф) (таблица 2).

Состав среды инкубации: 100 мМКО, 75 мМ маннитол, 25 мМ сахароза, 5 мМ KH2PO4, 0.5 мМ ЭГТА, 10 мМ Hepes/KOH (рН 7.4). Добавки: 5 мМ малат+5 мМ глутамат калия или 10 мМ сукцинат+2,5 мМ глутамат калия, 200 μМАДФ и 50 μМ 2,4-динитрофенол (ДНФ). Концентрация митохондриального белка в кювете 0.5 мг/мл (n=3).

Состав среды инкубации: 100 мМ KCl, 75 мМ маннитол, 25 мМ сахароза, 5 мМ KH2PO4, 0.5 мМ ЭГТА, 10 мМ Hepes/KOH (рН 7.4). Добавки: 5 мМ малат+5 мМ глутамат калия или 10 мМ сукцинат+2,5 мМ глутамат калия, 200 μМАДФ и 50 μМ 2,4-динитрофенол (ДНФ).

Скорости митохондриального дыхания V, нмоль О₂/мин⋅мг; АДФ/О, μМ/нмоль O₂; t, с; ДК - дыхательный контроль, V₃/V₄. Концентрация митохондриального белка в кювете 0.5 мг/мл (n=3).

На основании полученных результатов можно заключить, что митохондрии, изолированные из мозга мышей, имеют высокие значения показателей ДК (6.17±0.30 и 4.28±0.20) и АДФ/О (2.96±0.09 и 2.04±0.08), регистрируемые при использовании субстратов как комплекса I (сукцинатдегидрогеназы), так и комплекса II (НАДН-дегидрогеназы) дыхательной цепи, соответственно. Высокие значения дыхательного контроля и АДФ/О, а также короткое время Т_ф предполагает, что изолированные митохондрии способны эффективно окислять добавленные субстраты, проявляют высокую ферментативную активность дыхательных комплексов и АТФазы, а также имеют низкий уровень утечки H⁺ через внутреннюю мембрану митохондрий, то есть являются хорошо сопряженными и функционально активными.

Таким образом, полученный препарат изолированных митохондрий мозга мышей имеет высокое качество и может быть использован с целью терапии митохондриальной недостаточности.

Далее осуществляли интраназальное введение раствора мышам в соответствии с экспериментальной группой животного. Животных, получавших интраназально суспензию мх, держали под наблюдением в течение суток. По результатам наблюдения острой токсичности мх при их интраназальной трансплантации не выявлено. Наибольший интерес представляло оценить возможность проникновения препарата окрашенных митохондрий в обонятельные луковицы - первой мозговой структуре на пути митохондрий в мозг при интраназальном введении, а также в неокортекс и гиппокамп - зоны мозга, принимающие непосредственное участие в обучении и памяти и, главным образом, страдающие при БА.

На следующих рисунках (№№7-21) приведены репрезентативные микрофотографии мазков соответствующих структур мозга нативных мышей спустя 48 часов после интраназального введения как контрольных растворов, так и суспензий митохондрий, окрашенных флуоресцентным красителем MTR. Для каждого рисунка: А - флуоресценция, наблюдаемая в красной области спектра; Б - изображение мазка соответствующей области в проходящем свете. Шкала - 50 мкм.

Из представленных выше результатов первой серии экспериментов по трансплантации меченых митохондрий в мозг после их интраназального введения следует, что действительно митохондрии способны проникать в исследуемые структуры головного мозга, о чем свидетельствует наличие флуоресцирующих частиц в красной области спектра, соответствующей используемому митохондриальному красителю MTR, и по виду имеющих полное сходство с их изображением в суспензии до их интраназального введения (микрофотографии на рисунках 3А-5А). Важным доказательством локализации введенных митохондрий в мозге является наличие дозозависимости в количестве флуоресцирующих частиц от концентрации меченых митохондрий во вводимой интраназально суспензии. На микрофотографиях структур мозга контрольных животных, как и ожидалось, флуоресценция отсутствовала. При сравнении мазков обонятельных луковиц, в случае трех различных концентраций трансплантируемых окрашенных митохондрий, отчетливо видно возрастание их количества в структуре, наблюдаемое с увеличением концентрации. В отношении же гиппокампа и неокортекса следует отметить, что, как и следовало ожидать, проникновение митохондрий через 48 часов в эти структуры было меньше, чем в обонятельные луковицы. Если при концентрации 0,3 мг/мл окрашенных трансплантируемых митохондрий в растворе, флуоресценция в красной области спектра в неокортексе и гиппокампе отсутствовала, то при концентрациях 1,8 мг/мл и 3,3 мг/мл на фотографиях мазков, представленных на рисунках 17А, 18А, 20А и 21А, отчетливо видна флуоресценция в данных структурах, что очень важно, поскольку именно эти структуры головного мозга поражаются при БА и участвуют в выполнении таких высших мозговых функций как обучение и память. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о возможности таргетной доставки трансплантируемых в мозг функционально активных митохондрий путем их интраназального введения.

Следующая серия экспериментов была посвящена вопросу эффективности митохондриальной трансплантации в мозг при развитии индуцированного нейродегенеративного процесса альцгеймеровского типа.

Методика исследования:

А) Операция бульбэктомии

В возрасте трех месяцев у мышей проводят операцию удаления обонятельных луковиц (бульбэктомию) в стерильных условиях под нембуталовым наркозом (40 мг/кг, внутрибрюшинно), для местного обезболивания при скальпировании подкожно вводят 0,5% раствор новокаина. Двустороннее удаление обонятельных луковиц осуществляют путем их аспирации через трепанационное отверстие. Контролем служили ложнооперированные (ЛО) животные, которых подвергали аналогичной процедуре, но без удаления обонятельных луковиц.

Через две недели после операции мышам микропипеткой вводят в нос по 6 мкл суспензии митохондрий в концентрации 3,3 мкг/мкл. Препарат вводили троекратно в течение трех недель (два раза до обучения и один раз в начале обучения).

Б) Обучение в водном лабиринте Морриса и тестирование пространственной памяти.

Мышей обучают навигационному рефлексу нахождения спасательной платформы в водном лабиринте Морриса [54]. Экспериментальная камера представляла собой пластиковый круглый бассейн диаметром 80 см, заполненный на 30 см водой температурой 23°С. Площадь бассейна условно делилась на четыре равных сектора, в одном из которых находилась погруженная в воду спасательная платформа диаметром 5 см. Вода забелялась молоком для того, чтобы животные не могли визуально обнаружить спасательную платформу.

Предварительно все экспериментальные и контрольные мыши проверяются на умение плавать и сохранность зрения, что особенно важно для ОБЭ мышей. Для этого проводятся пробы в бассейне с водой и в присутствии видимой, не погруженной под воду спасательной платформы. Определяют латентный период достижения животным видимой платформы. В наших опытах животные всех трех экспериментальных групп показали статистически неразличимые значения латентных периодов. Далее ежедневно в течение пяти дней проводят по четыре сеанса обучения в условиях погруженной под поверхность воды спасательной платформы. Животных в течение 60 секунд обучают находить спасательную невидимую платформу. По окончании обучения у мышей тестируют пространственную память в отсутствие спасательной платформы в течение одной минуты. Состояние пространственной памяти оценивают по двум критериям: времени пребывания в секторах бассейна и числу заходов в них, выраженное в %.

В) Результаты по эффективности мозговой трансплантации митохондрий на память ОБЭ мышей

Детально анализируют результаты трехразовой интраназальной трансплантации митохондрий на протяжении трех недель на пространственную память ОБЭ животных, представляющих модель спорадической формы БА.

Результаты однофакторного анализа (One-Way ANOVA) данных по тестированию памяти в разных экспериментальных группах представлены в Таблице 3.

One-way ANOVA анализ эффекта интраназальной трансплантации митохондрий на время пребывания мышей в секторах водного лабиринта Морриса выявил значительное предпочтение сектора обучения 3 в группах ЛО и ОБЭ+МХ животных (р«0.0001 и р<0,001379 соответственно). Достоверность фактора различения секторов лабиринта была также значима и для группы ОБЭ мышей (р<0.021923), но как показал Post Нос анализ, это было обусловлено достоверным превышением времени пребывания ОБЭ мышей в 4-м индифферентном секторе лабиринта по сравнению с таргетным 3-им сектором. Post-Hoc анализа с использованием критерия Tukey'sHSD выявил, что 3-ий таргетный сектор по времени пребывания в нем выделяли только мыши в группах ЛО и ОБЭ+МХ, но не ОБЭ. Аналогичные данные были получены и при исследовании способности ОБЭ+МХ мышей выделять сектор обучения по числу заходов в него (р<0.0001), в то время как ОБЭ мыши, не получавшие введение митохондрий, показали наименьшее число заходов в таргетный сектор по сравнению с другими индифферентными отсеками. На рисунке 22 (А и Б) показано влияние интраназального введения суспензии митохондрий на пространственную память мышей, тестируемую в водном лабиринте Морриса, где А - время пребывания мышей в секторах водного лабиринта, Б - число заходов в них. Черные столбики соответствуют показателям в секторе обучения. Достоверность отличия данных по критерию Tukey's HSD: * - р<0,05; ** - р<0,01; *** - р<0,001.

Полученные данные показывают, что у ОБЭ мышей значительно ухудшается пространственная память, в то время как у ОБЭ животных, которым интраназально вводят суспензию митохондрий в дозе 20 мкг/животное троекратно на протяжении 3-х недель, память оставалась сохранной и эти животные могли выделять сектор, в котором при обучении находилась спасательная платформа, как и ЛО животные. Положительный эффект препарата митохондрий наблюдали по обоим критериям оценки состояния памяти. Время пребывания в секторе обучения составило у ЛО, ОБЭ и ОБЭ мышей, получавших интраназально суспензию функционально активных митохондрий, 22±1,5>11,4±0,8<19,3±1.4 сек соответственно. Процентная доля числа заходов в сектор обучения от общего числа заходов во все секторы составила у ЛО, ОБЭ и ОБЭ мышей, получавших препарат митохондрий, 35.3±2.2>21.7±1.3<30.7±1.6% соответственно. В целом, результаты тестирования пространственной памяти у ОБЭ животных свидетельствуют, что интраназальное введение суспензии митохондрий предотвращает ухудшение пространственной памяти, вызванное удалением обонятельных луковиц.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о наличии нейропротекторного эффекта трансплантации суспензии митохондрий при их интраназальном введении, что проявляется в сдерживании развития потери пространственной памяти у ОБЭ мышей, являющихся моделью наиболее распространенной спорадической формы БА.

Простота введения препарата, эффективность низких доз, что сводит к минимуму появление неблагоприятных побочных эффектов свидетельствуют о целесообразности разработки на этой основе нового лечебного препарата против БА.

Промышленное использование

Фармакологическая композиция, содержащая суспензию функционально активных митохондрий, может найти профилактическое и/или терапевтическое использование для лечения БА. Высокая эффективность композиции на основе суспензии митохондрий позволяет повысить эффективность и сократить сроки лечения БА.

Фармакологическая композиция не обладает токсичностью и биосовместима с организмом млекопитающих, в том числе и человека, так как в ней в качестве основного элемента используется суспензия функционально активных митохондрий. Низкая токсичность композиции позволяет повысить эффективность лечения за счет одновременного комбинированного воздействия суспензии митохондрий дополнительных лекарственных средств и биологически активных агентов.

Это особенно важно при лечении сопутствующих заболеваний, осложняющих лечение БА.

Композиция имеет высокую растворимость и быстро проникает в межклеточное пространство организма, что позволяет лечить заболевания мозга. Композиция совместима с любыми фармацевтически пригодными носителями, не снижающими биологическую активность и жизнеспособность митохондрий. Полученные результаты, приведенные выше, являются экспериментальным доказательством эффективности применения суспензии митохондрий при развитии нейродегенеративного процесса альцгеймеровского типа. Простота введения препарата, эффективность низких доз сводит до минимума появление неблагоприятных побочных эффектов.

Список использованных литературных источников

1. Mizuno Y, Ohta S, Tanaka M, Takamiya S, Suzuki K, et al. Deficiencies in complex I subunits of the respiratory chain in Parkinson's disease. BiochemBiophys Res Commun. 1989; 163:1450-1455.

2. Winklhofer KF, Haass C. Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease. BiochimBiophysActa. 2010; 1802:29-4.

3. Swerdlow RH, Khan SM. A "mitochondrial cascade hypothesis" for sporadic Alzheimer's disease. Med Hypotheses. 2004; 63:8-20.

4. Tobore TO. On the central role of mitochondria dysfunction and oxidative stress in Alzheimer's disease. Neurol Sci. 2019; 40(8): 1527-1540. DOI: 10.1007/s 10072-019-03 863-x

5. Onopiuk M, Brutkowski W, Wierzbicka K, Wojciechowska S, Szczepanowska J, etal. Mutationindystrophin-encodinggeneaffectsenergy metabolism in mouse myoblasts. BiochemBiophysResCommun. 2009; 386:463-466.

6. Burdon RH. Superoxide and hydrogen peroxide in relation to mammalian cell proliferation. Freeradicalbiology&medicine. 1995; 18:775-794.

7. Lin MT, Beal MF. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases. Nature. 2006; 443:787-795.

8. Gollihue JL, Rabchevsky AG. Prospects for therapeutic mitochondrial transplantation. Mitochondrion. 2017;35:70-79.

9. Wang W, Karamanlidis G, Tian R. Novel targets for mitochondrial medicine. SciTransl Med. 2016;8:326rv3.

10. Hattab AW, Zarante AM, Almannai M, Scaglia F. Therapies for mitochondrial diseases and current clinical trials. Mol Genet Metab. 2017;122:1-9.

11. Chang Chu-Yuan, Liang Min-Zong and Chen Linyi Current progress of mitochondrial transplantation that promotes neuronal regeneration Translational Neurodegeneration 2019, 8:17; 1-12. https://doi.org/l0.1186/s40035-019-0158-8.

12. Chien L, Liang MZ, Chang CY, Wang C, Chen L. Mitochondrial therapy promotes regeneration of injured hippocampal neurons. BiochimBiophysActa.2018; 1864:3001-3012.

13. Islam MN, Das SR, Emin MT, Wei M, Sun L, Westphalen K, Rowlands DJ, QuadriSK, Bhattacharya S, Bhattacharya J. Mitochondrial transfer from bone-marrow-derived stromal cells to pulmonary alveoli protects against acute lung injury Nat Med. 2012 Apr 15;18(5):759-765. doi: 10.1038/nm.2736.

14. Masuzawa A, Black KM, Pacak CA, Ericsson M, Barnett RJ, Drumm C, Seth P, Bloch DB, Levitsky S, Cowan DB, McCully JD. Transplantation of autologously derived mitochondria protects the heart from ischemiareperfusion injury. Am J PhysiolHeartCircPhysiol. 2013;304:H966-982.

15. Hayakawa K, Esposito E, Wang X, Terasaki Y, Liu Y, Xing C, Ji X, Lo EH. Transfer of mitochondria from astrocytes to neurons after stroke. Nature. 2016;535:551-555.

16. Chang JC, Wu SL, Liu KH, Chen YH, Chuang CS, Cheng FC, Su HL, Wei YH, KuoSJ, Liu CS. Allogeneic/xenogeneic transplantation of peptide-labeled mitochondria in Parkinson's disease: restoration of mitochondria functions and attenuation of 6-hydroxydopamine-induced neurotoxicity. Transl Res. 2016; 170:40-56.

17. Kaza AK, Wamala I, Friehs I, Kuebler JD, Rathod RH, Berra I, Ericsson M, Yao R, Thedsanamoorthy JK, Zurakowski D, et al. Myocardial rescue with autologous mitochondrial transplantation in a porcine model of ischemia/ reperfusion. J ThoracCardiovasc Surg. 2017; 153:934-943.

18. Shi X, Zhao M, Fu C, Fu A. Intravenous administration of mitochondria for treating experimental Parkinson's disease. Mitochondrion. 2017;34:91-100.

19. Gollihue JL, Patel SP, Eldahan КС, Cox DH, Donahue RR, Taylor BK, Sullivan PG, Rabchevsky AG. Effects of Mitochondrial Transplantation on Bioenergetics, Cellular Incorporation, and Functional Recovery after Spinal Cord Injury. J Neurotrauma. 2018;35(15): 1800-1818.

20. Fu A, Shi X, Zhang H, Fu B. Mitotherapy for fatty liver by intravenous Administration of Exogenous Mitochondria in male mice. Front Pharmacol. 2017;8:241-249.doi: 10.3389/fphar.2017.00241.

21. Riedl SJ, Salvesen GS. The apoptosome: signalling platform of cell death. Nat Rev Mol Cell Biol. 2007; 8:405-413.

22. Ankarcrona M, Dypbukt JM, Bonfoco E, Zhivotovsky B, Orrenius S, et al. Glutamate-induced neuronal death: a succession of necrosis or apoptosis depending on mitochondrial function. Neuron. 1995; 15:961-973.

23. Eguchi Y, Shimizu S, Tsujimoto Y. Intracellular ATP levels determine cell death fate by apoptosis or necrosis. Cancer Res. 1997; 57:1835-1840.

24. Ruigrok, M. J. Emerging insights for translational pharmacokinetic and pharmacokinetic-pharmacodynamic studies: towards prediction of nose-to-brain transport in humans [Electronic resource] / M. J. R. Ruigrok, de Lange E. C. M. // The AAPS journal. - 2015. - V. 17. - №3. - P. 493-505. https://link.springer.com/article/10.1208/sl2248-015-9724-x

25. Singh A. K. Nasal cavity, a promising transmucosal platform for drug delivery and research approaches from nasal to brain targeting [Electronic resource] / A. K. Singh, Singh A., Madhv N. V. // Journal of drug delivery and therapeutics. 2012. 2(3): 22-33. http://www.jddtonline.info/index.php/jddt/article/view.File/l63/82

26. Ghori, M. U. Nasal Drug Delivery Systems: An Overview [Electronic resource] / M. U. Ghori [et al.] // American Journal of Pharmacological Sciences. 2015.. 3(5): 110-119. http://pubs.sciepub.com/aips/3/5/2/.

27. Jiang Yl, Zhu J, Xu G, Liu X. Intranasal delivery of stem cells to the brain. Expert Opin Drug Deliv. 2011;8(5):623-632. doi: 10.1517/17425247.2011.566267.

28. Li G, Bonamici N, Dey M, Lesniak MS, Balyasnikova IV Intranasal delivery of stem cell-based therapies for the treatment of brain malignancies. Expert Opin Drug Deliv. 2018;15(2): 163-172. doi: 10.1080/17425247.2018.1378642.

29. Irizarry, M. C. APPSw transgenic mice develop age-related Aβ deposits and neuropil abnormalities, but no neuronal loss in CA1 [Text] / M. C. Irizarry [et al.] // Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. - 1997. -V. 56. - №9. - P. 965-973.

30. Morley, J.E. The senescence accelerated mouse (SAMP8) as a model for oxidative stress and Alzheimer's disease [Electronic resource] / J. E. Morley [et al.] // Biochimica et BiophysicaActa (BBA)-Molecular Basis of Disease. - 2012. - T. 1822. - №5. - C. 650-656. Access: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0925443911002754, free. - Title from screen.

31. Kolosova N.G. Senescence-accelerated OXYS rats: A genetic model of premature aging and age-related diseases [Electronic resource] / N. G. Kolosova [et al.] // Advances in Gerontology. - 2014. - V. 4. - №4. - P. 294-298. Access: https://www.researchgate.net/profile/Natalya_Kolosova/publication/278715099_Se nescence-accelerated_OXYS_rats_A_genetic_model_of_premature_aging_and_agerelated_diseases/links/5587cbcl08ae71f6ba916e56.pdf, free. - Title from screen.

32. C. Changes in the serotonergic system in the main olfactory bulb of rats unilaterally deprived from birth to adulthood [Electronic resource] / C. Gomez [et al.] // Journal of neurochemistry. - 2007. - V. 100. - №4. - P. 924-938. Access: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.l 11 l/j.l471-4159.2006.04229.x/full, free. - Title from screen.

33. C. Differential effects of unilateral olfactory deprivation on noradrenergic and cholinergic systems in the main olfactory bulb of the rat [Electronic resource] / C. Gomez [et al.] // Neuroscience. - 2006. - V. 141. - №4. - P. 2117-2128. Access:

https://www.researchgate.net/profile/Laura_Orio2/publication/6975759_Differenti al_effects_of_unilateral_olfactory_deprivation_on_noradrenergic_and_cholinergic _systems_in_the_main_olfactory_bulb_of_the_rat/links/56c 1998108aeedba0565a6 23.pdf, free. - Title from screen.

34. Kus, L. Distribution of high affinity choline transporter immunoreactivity in the primate central nervous system [Electronic resource] / L. Kus [et al] // Journal of Comparative Neurology. - 2003. - V. 463. - №3. - P. 341-357. Access: https://s3.amazonaws.com/academia.edu.documents/42880344/Distribution_of_hig h_affinity_choline_tr20160220-27776-

ld9uhqh.pdf?AWSAccessKeyId=AKIAIWOWYYGZ2Y53UL3A&Expires=1506 953533&Signature=StvoqMqRPtjUlFSPvFmbXjUK8Hyo%3D&response-content-disposition=inline%3B%20filename%3DDistribution_of_high_affinity_choline_tr. pdf, free. - Title from screen.

35. Wang, H.Y. β-Amyloidl-42 binds to α7 nicotinic acetylcholine receptor with high affinity implications for Alzheimer's disease pathology [Electronic resource] / H. Y. Wang [et al.] // Journal of Biological Chemistry. - 2000. - V. 275. - №8. - P. 5626-5632. Access: http://www.jbc.org/content/275/8/5626.long, free. - Title from screen.

36. Александрова, И.Ю. Повышенный уровень бета-амилоида в мозге у бульбэктомированных мышей [Текст] / И.Ю. Александрова [и др.] // Биохимия. - 2004. - Т. 69. - №4. - С. 218-224.

37. Nesterova, I.V. Bulbectomy-induced loss of raphe neurons is counteracted bt antidepressant treatment [Text] / I. V. Nesterova [et al.] // Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. - 1997. - V. 21. - №1. - P. 127-140.

38. Бобкова, H.B. Состояние холинергических структур переднего мозга у бульбэктомированных мышей [Текст] / Н. В. Бобкова, Нестерова И.В., Нестеров В.И. // Бюлл. экспер. биол. - 2001. - Т. 131. - №. 5. - С.507-511.

39. Kamynina, A.V. Vaccination with peptide 173-193 of acetylcholine receptor α7-subunit prevents memory loss in olfactory bulbectomized mice [Text] / A.V. Kamynina [et al.] // Journal of Alzheimer's Disease. - 2010. - V. 21. - №1. - P. 249-261.

40. Бобкова, H.B. Влияние пассивной иммунизации антителами против экстрацеллюлярного фрагмента a7-ACHR на нейродегенеративный процесс альцгеймеровского типа [Текст] / Н. В. Бобкова [и др.] // Вестник новых медицинских технологий. - 2009. - Т. 16. - №1. - С. 214-216.

41. Beck, М., Guinea pigs as a nontransgenic model for APP processing in vitro and in vivo [Text] / M. Beck, Bigl V., Roβner S. // Neurochemical research. - 2003. - V. 28. - №3-4. - P. 637-644.

42. Battaglia, F. Cortical plasticity in Alzheimer's disease in humans and rodents [Text] / F. Battaglia [et al.] // Biological psychiatry. - 2007. - V. 62. - №12. - P. 1405-1412.

43. Reddy, P.H. Differential loss of synaptic proteins in Alzheimer's disease: implications for synaptic dysfunction [Text] / Reddy P. H. [et al.] // Journal of Alzheimer's Disease. - 2005. -V. 7. - №2. - P. 103-117.

44. Новоселова, Е.Б. Иммунный статус бульбэктомированных мышей [Текст] / Е.Б. Новоселова [и др.] // Доклады РАН. - 2003. - Т. 393. -№6. - С. 824-826.

45. Аветисян, А.В. Функциональное нарушение митохондрий неокортекса и гиппокампа у мышей с бульбэктомией - модели болезни Альцгеймера [Текст] / А.В. Аветисян [и др.] // Биохимия. - 2016. - Т. 81. - №6. - С. 802-812.

46. Eyai.E.kesner, Efrat.Lkesner, Saada-Reich, A.; Rosenmann, Н.; Nitzan, К.; Benhamro, S.; Valitsky, M.; Lorberboum-Galski, H. Mitochondrial Incorpotion - Characteristics and Treatment for Neurodegenerative Diseases. EmergingConceptsinMitochondrialBiology 2018 4-8 February, abstract

47. Zhang Z, Ma Z, Yan C, Pu K, Wu M, Bai J, Li Y, Wang Q. Muscle-derived autologous mitochondrial transplantation: A novel strategy for treating cerebral ischemic injury. Behav Brain Res. 2019, 356:322-331. DOI: 10.1016/j.bbr.2018.09.005

48. Conner SD., Schmid SL. Regulated portals of entry into the cell. Nature, 2003, 422(6927):37-44. DOI:10.1038/nature01451

49. Venediktova NI, Gorbacheva OS, Belosludtseva NV, Fedotova IB, Surina NM, Poletaeva II, Kolomytkin OV, Mironova GD. Energetic, oxidative and ionic exchange in rat brain and liver mitochondria at experimental audiogenic epilepsy (Krushinsky-Molodkina model). J Bioenerg Biomembr. 2017, 49:149-158. DOI 10.1007/s 10863-016-9693-5

50. Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 1951, 193(1):265-275.

51. Chinopoulos C, Zhang SF, Thomas B, Ten V, Starkov AA. Isolation and functional assessment of mitochondria from small amounts of mouse brain tissue / // Neurodegeneration. 2011, 793:311-324.

52. Wen Y, Li W, Poteet EC, Xie L, Tan C, Yan LJ, Ju X, Liu R, Qian H, Marvin MA, Goldberg MS, She H, Mao Z, Simpkins JW, Yang SH. Alternative mitochondrial electron transfer as a novel strategy for neuroprotection / Y. Wen [et. al] // Journal of Biological Chemistry. 2011, 286(18): 16504-16515.

53. M, Del Hoyo P, MA, Rubio JC, A, Castellano G, Colina F, Arenas J, Solis-Herruzo JA. Defective hepatic mitochondrial respiratory chain in patients with nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology. 2003, 38(4):999-1007.

54. Morris R. Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat // Journal of neuroscience methods. - 1984. - Т. 11. - №. l. - C. 47-60.

Применение таргетной неинвазивной трансплантации живых митохондрий в мозг путем интраназального введения для лечения нейродегенеративного заболевания, характеризующегося митохондриальной дисфункцией