Фенилатное производное, получение и фармацевтическая композиция и применение

Настоящее изобретение относится к вариантам фенилатного производного или его фармацевтически приемлемой соли или стереоизомера, способного ингибировать активность передачи сигнала PD-1/PD-L1, к способу его получения, к содержащей его фармацевтической композиции и к его применению. Один из вариантов фенилатного производного имеет формулу (I)

(I),

где R₁ выбирают из и ; R₂ выбирают из незамещенного или замещенного С₁-С₈-алифатического гидрокарбила, в случае замещения заместитель выбирают из карбамоила (-CONH₂) и гидроксикарбамоила (-CONHOH); R₃ выбирают из замещенного насыщенного С₁-С₈-алкиламино, замещенного N-содержащего С₃-С₆-гетероцикл-1-ила, где каждый является моно- или ди-замещенным заместителем(ями), выбранным(и) из гидрокси, ацетиламино, уреидо (-NH(C=O)NH₂), гидроксиформила (-COOH); Х выбирают из хлора. 5 н. и 14 з.п. ф-лы, 1 табл., 17 пр.

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение раскрывает фенилатное производное, способ его получения и фармацевтическую композицию и их применения. Конкретно изобретение относится к фенилатным производным, представленным формулой (I), их фармацевтически приемлемым солям, их стереоизомерам, способу их получения, фармацевтической композиции, содержащей одно или несколько таких соединений, и применениям соединений при лечении заболеваний, связанных с сигнальными путями PD-1/PD-L1, таких как раковые заболевания, инфекционные болезни и аутоиммунные заболевания.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

С углублением изучения раковой иммунологии обнаружено, что микроокружение опухоли может защищать опухолевые клетки от узнавания и уничтожения иммунной системой человека. Иммунный побег опухолевых клеток играет очень важную роль в появлении и развитии опухоли. В 2013 Science magazine назвал иммунотерапию опухолей первым из десяти последних достижений, снова делая иммунотерапию «центром» в области лечения рака. Активация или ингибирование иммунных клеток регулируется положительными и отрицательными сигналами, причем сигнал 1 программируемой гибели клеток (PD-1)/лиганд PD-1 (PD-L1) является отрицательным иммунным регуляторным сигналом, который ингибирует иммунную активность опухольспецифических CD8+ Т-клеток и опосредует иммунный побег.

Опухолевые клетки ускользают от иммунной системы путем связывания лиганда программируемой гибели клеток (PD-L1) на своей поверхности с белком PD-1 Т-клеток. Микроокружение опухоли вызывает высокую экспрессию молекул PD-1 в инфильтрирующих Т-клетках, и опухолевые клетки в высокой степени экспрессируют PD-1-лиганды PD-L1 и PD-L2, что приводит к непрерывной активации пути PD-1 в микроокружении опухоли. Ингибированные Т-клетки не могут найти опухоль, так что они не могут передать сигнал иммунной системе для нападения и уничтожения опухолевых клеток. PD-1-Антитело против PD-1 или PD-L1 блокирует этот путь путем препятствования связыванию двух белков и частично восстанавливает функцию Т-клеток, давая им возможность убивать опухолевые клетки.

Иммунотерапия на основе PD-1/PD-L1 является новым поколением высокоспецифической иммунотерапии, имеющей целью использование собственной иммунной системы организма для борьбы с опухолями. Она имеет потенциал для лечения многих типов опухолей путем блокады пути передачи сигнала PD-1/PD-L1 для индукции апоптоза. В последнее время ряд удивительных исследований подтвердил, что антитела, ингибирующие PD-1/PD-L1, имеют сильную противоопухолевую активность против ряда опухолей, которая на первый взгляд особенно привлекательна. С 4 сентября 2014 Keytruda® (пембролизумаб) от Merck, США, становится первым одобренным FDA моноклональным антителом к PD-1 для лечения пациентов с запущенной или неоперабельной меланомой, которые не реагировали на другие лекарственные средства. В настоящее время MSD исследует возможности Keytruda в отношении более 30 различных типов рака, включая различные типы рака крови, рака легких, рака молочной железы, рака мочевого пузыря, рака желудка и рака головы и шеи. Фармацевтический гигант Bristol-Myers Squibb 22 декабря 2014 выступил с инициативой по получению ускоренного разрешения Управления по продовольствию и медикаментам США (FDA). Его противораковое иммунотерапевтическое лекарственное средство ниволумаб описывается под товарным знаком Opdivo для лечения пациентов с неоперабельной или метастастатической меланомой, которые не реагируют на другие лекарственные средства, и оно является в реестре в США вторым ингибитором PD-1 после Keytruda от MSD. FDA 4 марта 2015 одобрило ниволумаб для лечения метастатического плоскоклеточного немелкоклеточного рака легких, который прогрессирует во время химиотерапии на основе платины или после химиотерапии. Согласно исследованию фазы Ib KEYNOTE-028 лечения солидных опухолей Keytruda (пембролизумаб), опубликованному MSD, лечение Keytruda достигает в целом степени ответа на лечение (ORR) 28% у 25 пациентов с мезотелиомой плевры (PM). А 48% пациентов имеют устойчивое заболевание, и уровень контроля заболевания достигает 76%. Пациенты с запущенной лимфомой Ходжкина (HL), которые не отвечали на лечение какими-либо одобренными лекарственными средствами, были способны достигнуть полной ремиссии после получения лечения Keytruda от MSD и Opdvio от Bristol-Myers. В 2015 на Ежегодной конференции AACR Leisha A. Emens, MD, PhD, ассоциированный профессор онколог в Центре онкологии Johns Hopkins Kimmel, сообщил, что моноклональное антитело к PD-L1 от Roche MPDL3280A имеет длительное действие при запущенном трижды негативном раке молочной железы.

Иммунотерапия опухолей считается революцией в лечении рака после таргетной противоопухолевой терапии. Однако терапевтическое лекарственное средство на основе моноклональных антител имеет свои собственные недостатки: оно легко разлагается протеазами, так как оно неустойчиво в организме, и его нельзя принимать перорально; оно легко вызывает иммунную перекрестную реакцию; качество продукта затруднительно контролировать и производственная технология высокая; затруднительны получение больших количеств и очистка и высока стоимость; его неудобно использовать, и его можно только инъецировать или капать. Поэтому более хорошим выбором для иммунотерапии являются низкомолекулярные ингибиторы взаимодействия PD-1/PD-L1.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Технической проблемой, которую решает настоящее изобретение, является предоставление фенилатного производного структурной формулы (I), которое ингибирует взаимодействие PD-1/PD-L1, и его стереоизомера и его фармацевтически приемлемой соли, и способа его получения, и их лекарственных композиций, и их применение при предупреждении или лечении заболевания, связанного с путем передачи сигнала PD-1/PD-L1.

(I)

Ниже приводятся технические решения, предлагаемые настоящим изобретением для того, чтобы решить указанную выше техническую проблему.

Первый аспект технического решения относится к фенилатному производному формулы (I), его стереоизомеру и его фармацевтически приемлемой соли:

(I)

в которой

R₁ выбирают из и ;

R₂ выбирают из незамещенного или замещенного С₁-С₈-алифатического гидрокарбонила, когда в случае замещения заместитель выбирают из фтора, хлора, брома, иода, циано, трифторметила, гидрокси, С₁-С₅-алкокси, амино, С₁-С₆-алкиламино, ацетиламино (CH₃CONH-), метансульфонила (-SO₂CH₃), гидроксиформила (-COOH), гидроксикарбамоила (-CONHOH);

R₃ выбирают из замещенного насыщенного С₁-С₈-алкиламино, замещенного ненасыщенного С₂-С₆-алкиламино, замещенного N-содержащего С₂-С₆-гетероцикл-1-ила, где каждый является моно-, ди-, три- или тетразамещенным заместителем(ями), выбранным(и) из водорода, фтора, хлора, брома, иода, гидрокси, С₁-С₅-алкила, С₁-С₅-алкокси, амино, С₁-С₆-алкиламино, ацетиламино, циано, уреидо (-NH(C=O)NH₂), гуанидино (-NH(C=NH)NH₂), уреидоамино (-NH-NH(C=O)NH₂), гуанидиноамино (-NH-NH(C=NH)NH₂), сульфониламино (-NHSO₃H), сульфамоила (-SO₂NH₂), метансульфониламино (-NH-SO₂CH₃), гидроксиформила (-COOH), C₁-C₈-алкоксилкарбонила, сульфгидрила, имидазолила, тиазолила, оксазолила, тетразолила, , и ;

Х выбирают из водорода, фтора, хлора, брома, иода, С₁-С₄-алкила, этенила, трифторметила, метокси.

Предпочтительными являются фенилатные производные, их стереоизомеры и их фармацевтически приемлемые соли, когда соединение представлено формулой (IA)

,

(IA)

в которой

R₂ выбирают из незамещенного или замещенного С₁-С₈-алифатического гидрокарбонила, когда в случае замещения заместитель выбирают из галогена, циано, трифторметила, гидрокси, С₁-С₅-алкокси, амино, С₁-С₆-алкиламино, ацетиламино, метансульфонила (-SO₂CH₃), гидроксиформила (-COOH), гидроксикарбамоила (-CONHOH);

R₃ выбирают из замещенного насыщенного С₁-С₈-алкиламино, замещенного ненасыщенного С₂-С₈-алкиламино, замещенного N-содержащего С₂-С₆-гетероцикл-1-ила, где каждый является моно-, ди-, три- или тетразамещенным заместителем(ями), выбранным(и) из водорода, фтора, хлора, брома, иода, гидрокси, С₁-С₅-алкила, С₁-С₅-алкокси, амино, С₁-С₆-алкиламино, ацетиламино, циано, уреидо (-NH(C=O)NH₂), гуанидино (-NH(C=NH)NH₂), уреидоамино (-NH-NH(C=O)NH₂), гуанидиноамино (-NH-NH(C=NH)NH₂), сульфониламино (-NHSO₃H), сульфамоила (-SO₂NH₂), метансульфониламино (-NH-SO₂CH₃), гидроксиформила (-COOH), C₁-C₈-алкоксилкарбонила, сульфгидрила, имидазолила, тиазолила, оксазолила, тетразолила, , и ;

Х выбирают из водорода, фтора, хлора, брома, иода, С₁-С₄-алкила, этенила, трифторметила, метокси.

Предпочтительными являются фенилатные производные, их стереоизомеры и их фармацевтически приемлемые соли, когда соединение представлено формулой (IA-1)

,

(IA-1)

в которой

R₃ выбирают из замещенного насыщенного С₁-С₈-алкиламино, замещенного ненасыщенного С₂-С₆-алкиламино, замещенного N-содержащего С₂-С₆-гетероцикл-1-ила, где каждый является моно-, ди-, три- или тетразамещенным заместителем(ями), выбранным(и) из водорода, фтора, хлора, брома, иода, гидрокси, С₁-С₅-алкила, С₁-С₅-алкокси, амино, С₁-С₆-алкиламино, ацетиламино, циано, уреидо (-NH(C=O)NH₂), гуанидино (-NH(C=NH)NH₂), уреидоамино (-NH-NH(C=O)NH₂), гуанидиноамино (-NH-NH(C=NH)NH₂), сульфониламино (-NHSO₃H), сульфамоила (-SO₂NH₂), метансульфониламино (-NH-SO₂CH₃), гидроксиформила (-COOH), C₁-C₈-алкоксилкарбонила, сульфгидрила, имидазолила, тиазолила, оксазолила, тетразолила, , и ;

Х выбирают из водорода, фтора, хлора, брома, иода, С₁-С₄-алкила, этенила, трифторметила и метокси.

Предпочтительными являются фенилатные производные, их стереоизомеры и их фармацевтически приемлемые соли, когда соединение представлено формулой (IA-2)

,

(IA-2)

в которой

R₃ выбирают из замещенного насыщенного С₁-С₈-алкиламино, замещенного ненасыщенного С₂-С₆-алкиламино, замещенного N-содержащего С₂-С₆-гетероцикл-1-ила, где каждый является моно-, ди-, три- или тетразамещенным заместителем(ями), выбранным(и) из водорода, фтора, хлора, брома, иода, гидрокси, С₁-С₅-алкила, С₁-С₅-алкокси, амино, С₁-С₆-алкиламино, ацетиламино, циано, уреидо (-NH(C=O)NH₂), гуанидино (-NH(C=NH)NH₂), уреидоамино (-NH-NH(C=O)NH₂), гуанидиноамино (-NH-NH(C=NH)NH₂), сульфониламино (-NHSO₃H), сульфамоила (-SO₂NH₂), метансульфониламино (-NH-SO₂CH₃), гидроксиформила (-COOH), C₁-C₈-алкоксилкарбонила, сульфгидрила, имидазолила, тиазолила, оксазолила, тетразолила, , и ;

Х выбирают из водорода, фтора, хлора, брома, иода, С₁-С₄-алкила, этенила, трифторметила и метокси.

Предпочтительными являются фенилатные производные, их стереоизомеры и их фармацевтически приемлемые соли, когда соединение представлено формулой (IA-3)

,

(IA-3)

в которой

R₃ выбирают из замещенного насыщенного С₁-С₈-алкиламино, замещенного ненасыщенного С₂-С₆-алкиламино, замещенного N-содержащего С₂-С₆-гетероцикл-1-ила, где каждый является моно-, ди-, три- или тетразамещенным заместителем(ями), выбранным(и) из водорода, фтора, хлора, брома, иода, гидрокси, С₁-С₅-алкила, С₁-С₅-алкокси, амино, С₁-С₆-алкиламино, ацетиламино, циано, уреидо (-NH(C=O)NH₂), гуанидино (-NH(C=NH)NH₂), уреидоамино (-NH-NH(C=O)NH₂), гуанидиноамино (-NH-NH(C=NH)NH₂), сульфониламино (-NHSO₃H), сульфамоила (-SO₂NH₂), метансульфониламино (-NH-SO₂CH₃), гидроксиформила (-COOH), C₁-C₈-алкоксилкарбонила, сульфгидрила, имидазолила, тиазолила, оксазолила, тетразолила, , и ;

Х выбирают из водорода, фтора, хлора, брома, иода, С₁-С₄-алкила, этенила, трифторметила и метокси.

Предпочтительными являются фенилатные производные, их стереоизомеры и их фармацевтически приемлемые соли, когда соединение представлено формулой (IA-4)

,

(IA-4)

в которой

R₃ выбирают из замещенного насыщенного С₁-С₈-алкиламино, замещенного ненасыщенного С₂-С₆-алкиламино, замещенного N-содержащего С₂-С₆-гетероцикл-1-ила, где каждый является моно-, ди-, три- или тетразамещенным заместителем(ями), выбранным(и) из водорода, фтора, хлора, брома, иода, гидрокси, С₁-С₅-алкила, С₁-С₅-алкокси, амино, С₁-С₆-алкиламино, ацетиламино, циано, уреидо (-NH(C=O)NH₂), гуанидино (-NH(C=NH)NH₂), уреидоамино (-NH-NH(C=O)NH₂), гуанидиноамино (-NH-NH(C=NH)NH₂), сульфониламино (-NHSO₃H), сульфамоила (-SO₂NH₂), метансульфониламино (-NH-SO₂CH₃), гидроксиформила (-COOH), C₁-C₈-алкоксилкарбонила, сульфгидрила, имидазолила, тиазолила, оксазолила, тетразолила, , и ;

Х выбирают из водорода, фтора, хлора, брома, иода, С₁-С₄-алкила, этенила, трифторметила и метокси.

Предпочтительными являются фенилатные производные, их стереоизомеры и их фармацевтически приемлемые соли, когда соединение представлено формулой (IA-5)

,

(IA-5)

в которой

R₃ выбирают из замещенного насыщенного С₁-С₈-алкиламино, замещенного ненасыщенного С₂-С₆-алкиламино, замещенного N-содержащего С₂-С₆-гетероцикл-1-ила, где каждый является моно-, ди-, три- или тетразамещенным заместителем(ями), выбранным(и) из водорода, фтора, хлора, брома, иода, гидрокси, С₁-С₅-алкила, С₁-С₅-алкокси, амино, С₁-С₆-алкиламино, ацетиламино, циано, уреидо (-NH(C=O)NH₂), гуанидино (-NH(C=NH)NH₂), уреидоамино (-NH-NH(C=O)NH₂), гуанидиноамино (-NH-NH(C=NH)NH₂), сульфониламино (-NHSO₃H), сульфамоила (-SO₂NH₂), метансульфониламино (-NH-SO₂CH₃), гидроксиформила (-COOH), C₁-C₈-алкоксилкарбонила, сульфгидрила, имидазолила, тиазолила, оксазолила, тетразолила, , и ;

Х выбирают из водорода, фтора, хлора, брома, иода, С₁-С₄-алкила, этенила, трифторметила и метокси.

Предпочтительными являются фенилатные производные, их стереоизомеры и их фармацевтически приемлемые соли, когда соединение представлено формулой (IВ)

,

(IB)

в которой

R₂ выбирают из незамещенного или замещенного С₁-С₈-алифатического гидрокарбонила, когда в случае замещения заместитель выбирают из галогена, циано, трифторметила, гидрокси, С₁-С₅-алкокси, амино, С₁-С₆-алкиламино, ацетиламино, метансульфонила (-SO₂CH₃), гидроксиформила (-COOH), гидроксикарбамоила (-CONHOH);

R₃ выбирают из замещенного насыщенного С₁-С₈-алкиламино, замещенного ненасыщенного С₂-С₆-алкиламино, замещенного N-содержащего С₂-С₆-гетероцикл-1-ила, где каждый является моно-, ди-, три- или тетразамещенным заместителем(ями), выбранным(и) из водорода, фтора, хлора, брома, иода, гидрокси, С₁-С₅-алкила, С₁-С₅-алкокси, амино, С₁-С₆-алкиламино, ацетиламино, циано, уреидо (-NH(C=O)NH₂), гуанидино (-NH(C=NH)NH₂), уреидоамино (-NH-NH(C=O)NH₂), гуанидиноамино (-NH-NH(C=NH)NH₂), сульфониламино (-NHSO₃H), сульфамоила (-SO₂NH₂), метансульфониламино (-NH-SO₂CH₃), гидроксиформила (-COOH), C₁-C₈-алкоксилкарбонила, сульфгидрила, имидазолила, тиазолила, оксазолила, тетразолила, , и ;

Х выбирают из водорода, фтора, хлора, брома, иода, С₁-С₄-алкила, этенила, трифторметила и метокси.

Предпочтительными являются фенилатные производные, их стереоизомеры и их фармацевтически приемлемые соли, когда соединение представлено формулой (IВ-1)

,

(IB-1)

в которой

R₃ выбирают из замещенного насыщенного С₁-С₈-алкиламино, замещенного ненасыщенного С₂-С₆-алкиламино, замещенного N-содержащего С₂-С₆-гетероцикл-1-ила, где каждый является моно-, ди-, три- или тетразамещенным заместителем(ями), выбранным(и) из водорода, фтора, хлора, брома, иода, гидрокси, С₁-С₅-алкила, С₁-С₅-алкокси, амино, С₁-С₆-алкиламино, ацетиламино, циано, уреидо (-NH(C=O)NH₂), гуанидино (-NH(C=NH)NH₂), уреидоамино (-NH-NH(C=O)NH₂), гуанидиноамино (-NH-NH(C=NH)NH₂), сульфониламино (-NHSO₃H), сульфамоила (-SO₂NH₂), метансульфониламино (-NH-SO₂CH₃), гидроксиформила (-COOH), C₁-C₈-алкоксилкарбонила, сульфгидрила, имидазолила, тиазолила, оксазолила, тетразолила, , и ;

Х выбирают из водорода, фтора, хлора, брома, иода, С₁-С₄-алкила, этенила, трифторметила и метокси.

Предпочтительными являются фенилатные производные, их стереоизомеры и их фармацевтически приемлемые соли, когда соединение представлено формулой (IВ-2)

,

(IB-2)

в которой

R₃ выбирают из замещенного насыщенного С₁-С₈-алкиламино, замещенного ненасыщенного С₂-С₆-алкиламино, замещенного N-содержащего С₂-С₆-гетероцикл-1-ила, где каждый является моно-, ди-, три- или тетразамещенным заместителем(ями), выбранным(и) из водорода, фтора, хлора, брома, иода, гидрокси, С₁-С₅-алкила, С₁-С₅-алкокси, амино, С₁-С₆-алкиламино, ацетиламино, циано, уреидо (-NH(C=O)NH₂), гуанидино (-NH(C=NH)NH₂), уреидоамино (-NH-NH(C=O)NH₂), гуанидиноамино (-NH-NH(C=NH)NH₂), сульфониламино (-NHSO₃H), сульфамоила (-SO₂NH₂), метансульфониламино (-NH-SO₂CH₃), гидроксиформила (-COOH), C₁-C₈-алкоксилкарбонила, сульфгидрила, имидазолила, тиазолила, оксазолила, тетразолила, , и ;

Х выбирают из водорода, фтора, хлора, брома, иода, С₁-С₄-алкила, этенила, трифторметила и метокси.

Предпочтительными являются фенилатные производные, их стереоизомеры и их фармацевтически приемлемые соли, когда соединение представлено формулой (IВ-3)

,

(IB-3)

в которой

R₃ выбирают из замещенного насыщенного С₁-С₈-алкиламино, замещенного ненасыщенного С₂-С₆-алкиламино, замещенного N-содержащего С₂-С₆-гетероцикл-1-ила, где каждый является моно-, ди-, три- или тетразамещенным заместителем(ями), выбранным(и) из водорода, фтора, хлора, брома, иода, гидрокси, С₁-С₅-алкила, С₁-С₅-алкокси, амино, С₁-С₆-алкиламино, ацетиламино, циано, уреидо (-NH(C=O)NH₂), гуанидино (-NH(C=NH)NH₂), уреидоамино (-NH-NH(C=O)NH₂), гуанидиноамино (-NH-NH(C=NH)NH₂), сульфониламино (-NHSO₃H), сульфамоила (-SO₂NH₂), метансульфониламино (-NH-SO₂CH₃), гидроксиформила (-COOH), C₁-C₈-алкоксилкарбонила, сульфгидрила, имидазолила, тиазолила, оксазолила, тетразолила, , и ;

Х выбирают из водорода, фтора, хлора, брома, иода, С₁-С₄-алкила, этенила, трифторметила и метокси.

Предпочтительными являются фенилатные производные, их стереоизомеры и их фармацевтически приемлемые соли, когда соединение представлено формулой (IВ-4)

,

(IB-4)

в которой

R₃ выбирают из замещенного насыщенного С₁-С₈-алкиламино, замещенного ненасыщенного С₂-С₆-алкиламино, замещенного N-содержащего С₂-С₆-гетероцикл-1-ила, где каждый является моно-, ди-, три- или тетразамещенным заместителем(ями), выбранным(и) из водорода, фтора, хлора, брома, иода, гидрокси, С₁-С₅-алкила, С₁-С₅-алкокси, амино, С₁-С₆-алкиламино, ацетиламино, циано, уреидо (-NH(C=O)NH₂), гуанидино (-NH(C=NH)NH₂), уреидоамино (-NH-NH(C=O)NH₂), гуанидиноамино (-NH-NH(C=NH)NH₂), сульфониламино (-NHSO₃H), сульфамоила (-SO₂NH₂), метансульфониламино (-NH-SO₂CH₃), гидроксиформила (-COOH), C₁-C₈-алкоксилкарбонила, сульфгидрила, имидазолила, тиазолила, оксазолила, тетразолила, , и ;

Х выбирают из водорода, фтора, хлора, брома, иода, С₁-С₄-алкила, этенила, трифторметила и метокси.

Предпочтительными являются фенилатные производные, их стереоизомеры и их фармацевтически приемлемые соли, когда соединение представлено формулой (IВ-5)

,

(IB-5)

в которой

R₃ выбирают из замещенного насыщенного С₁-С₈-алкиламино, замещенного ненасыщенного С₂-С₆-алкиламино, замещенного N-содержащего С₂-С₆-гетероцикл-1-ила, где каждый является моно-, ди-, три- или тетразамещенным заместителем(ями), выбранным(и) из водорода, фтора, хлора, брома, иода, гидрокси, С₁-С₅-алкила, С₁-С₅-алкокси, амино, С₁-С₆-алкиламино, ацетиламино, циано, уреидо (-NH(C=O)NH₂), гуанидино (-NH(C=NH)NH₂), уреидоамино (-NH-NH(C=O)NH₂), гуанидиноамино (-NH-NH(C=NH)NH₂), сульфониламино (-NHSO₃H), сульфамоила (-SO₂NH₂), метансульфониламино (-NH-SO₂CH₃), гидроксиформила (-COOH), C₁-C₈-алкоксилкарбонила, сульфгидрила, имидазолила, тиазолила, оксазолила, тетразолила, , и ;

Х выбирают из водорода, фтора, хлора, брома, иода, С₁-С₄-алкила, этенила, трифторметила и метокси.

Наиболее предпочтительные соединения выбирают из соединений, перечисленных далее:

(S)-N-(4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-(карбамоилметокси)бензил)серин

;

гидрохлорид N-ацетиламиноэтил-4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-метоксибензиламина

;

N-ацетиламиноэтил-4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-аллилоксибензиламин

;

N-ацетиламиноэтил-4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-(проп-2-инилокси)бензиламин

;

N-ацетиламиноэтил-4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-(циклопропилметокси)бензиламин

;

N-(4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-(N,N-диметилкарбамоилметокси)бензил)серин

;

N-(4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-(3-метилбут-2-енилокси)бензил)серин

;

N-(4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-(циклопропилметокси)бензил)треонин

;

2-(4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-(циклопропилметокси)бензиламино)-3-гидроксипропанамид

;

N-ацетиламиноэтил-4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-(циклопропилметокси)бензиламин

;

N-(4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-(циклопропилметокси)бензил)цитруллин

;

N-(4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-(N-метокси-N-метилкарбамоилметокси)бензил)серин

;

N-(4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-(2-морфолино-2-оксоэтокси)бензил)серин

;

(S)-N-(4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-(циклопропилметокси)бензил)серин

;

(S)-N-(4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-(N-гидроксикарбамоилметокси)бензил)пипеколиновая кислота

;

(S,S)-N-(4-(2-бром-3-(2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-ил)бензилокси)-5-хлор-2-(карбамоилметокси)бензил)-4-гидроксипролин

;

(S,S)-N-(4-(2-бром-3-(2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-ил)бензилокси)-5-хлор-2-(циклопропилметокси)бензил)-4-гидроксипролин

.

Фармацевтически приемлемая соль включает соль, образованную с неорганической кислотой, соль, образованную с органической кислотой, соль с ионом щелочного металла, соль с ионом щелочноземельного металла или соль, образованную с органическим основанием, которое дает физиологически приемлемый катион, и аммониевую соль.

Указанную неорганическую кислоту выбирают из хлороводородной кислоты, бромоводородной кислоты, фосфорной кислоты или серной кислоты; указанную органическую кислоту выбирают из метансульфоновой кислоты, п-толуолсульфоновой кислоты, трифторуксусной кислоты, лимонной кислоты, малеиновой кислоты, винной кислоты, фумаровой кислоты или молочной кислоты; указанный ион щелочного металла выбирают из иона лития, иона натрия, иона калия; указанный ион щелочноземельного металла выбирают из иона кальция, иона магния; указанное органическое основание, которое дает физиологически приемлемый катион, выбирают из метиламина, диметиламина, триметиламина, пиперидина, морфолина или трис(2-гидроксиэтил)амина.

Второй аспект настоящего изобретения относится к способу получения соединений первого аспекта.

Способ получения соединений формулы (I) согласно их структуре подразделяется на пять стадий.

(а) 2-Бром-3-иодтолуол 1 и бензолбороновую кислоту или замещенную бензолбороновую кислоту или бензиловый эфир борной кислоты или замещенный бензиловый эфир борной кислоты как исходные материалы вводят во взаимодействие в реакции сочетания по Судзуки, и получают промежуточное соединение 2;

(b) промежуточное соединение 2 как исходный материал подвергают бромированию по метильной группе с помощью реагента бромирования, и получают бромсодержащее промежуточное соединение 3;

(с) промежуточное соединение 3 как исходный материал вводят во взаимодействие с замещенным 2.4-дигидрокси-Х-замещенным бензальдегидом в щелочной среде, и получают промежуточное соединение 4 простой бензилариловый эфир;

(d) промежуточное соединение 4 как исходный материал вводят во взаимодействие с галогенидом в щелочной среде, и получают промежуточное соединение 5;

(е) содержащее альдегидную группу промежуточное соединение 5 как исходный материал конденсируют с содержащим аминогруппу или иминогруппу HR₃, и полученный продукт восстанавливают, получая целевое соединение I.

Каждый из R₁, R₂, R₃ и X имеет значения, описанные в первом аспекте.

Кроме того, исходные материалы и промежуточные соединения в указанной выше реакции получаются легко, и каждая стадия реакции может быть легко выполнена согласно описанию в литературе или специалистом в данной области техники обычным методом органической химии. Соединение формулы I может существовать в сольватированной или несольватированной формах, и кристаллизация из различных растворителей может привести к различным сольватам. Фармацевтически приемлемые соли соединения формулы I включают соли присоединения различных кислот, такие как соли присоединения следующих неорганических или органических кислот: хлороводородной кислоты, бромоводородной кислоты, фосфорной кислоты, серной кислоты, метансульфоновой кислоты, п-толуолсульфоновой кислоты, трифторуксусной кислоты, лимонной кислоты, малеиновой кислоты, винной кислоты, фумаровой кислоты, молочной кислоты. Фармацевтически приемлемые соли соединения формулы I также включают соли различных щелочных металлов, такие как литиевые, натриевые, калиевые соли; соли различных щелочноземельных металлов, такие как кальциевые, магниевые соли, и соли аммония; и соли различных органических оснований, которые дают физиологически приемлемые катионы, такие как соли метиламина, диметиламина, триметиламина, пиперидина, морфолина, и соли трис(2-гидроксиэтил)амина. Все эти соли в объеме изобретения можно получить обычными способами. Во время получения соединений формулы (I) и их сольватов или солей в различных условиях кристаллизации может иметь место поликристалличность или эвтектика.

Третий аспект настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, включающей фенилатное производное по первому аспекту настоящего изобретения и его стереоизомер и его фармацевтически приемлемую соль в качестве активного ингредиента и фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент.

Изобретение также относится к фармацевтической композиции, включающей соединение по изобретению в качестве активного ингредиента. Фармацевтическую композицию можно получить согласно способам, известным в технике. Любую лекарственную форму, подходящую для применения человеком или животным, можно получить в твердой или жидкой форме, объединяя соединение по изобретению с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми эксципиентами и/или адъювантами. Содержание соединения по настоящему изобретению в его фармацевтической композиции обычно составляет от 0,1 до 95 мас.%.

Соединение по настоящему изобретению или фармацевтическую композицию, содержащую такое соединение, можно вводить в стандартной лекарственной форме энтеральным или парентеральным путем, таким как пероральный, внутривенный, внутримышечный, подкожный, назальный пути, через слизистую оболочку полости рта, глаза, легкие и дыхательные пути, кожу, влагалище, прямую кишку и т.д..

Лекарственная форма может представлять собой жидкую лекарственную форму, твердую лекарственную форму или полутвердую лекарственную форму. Жидкие лекарственные формы могут представлять собой раствор (включая раствор и коллоидный раствор), эмульсию (включая тип м/в, тип в/м и двойную эмульсию), суспензию, инъекцию (включая водную инъекцию, инъекцию из порошка и инфузию), глазные капли, капли в нос, лосьоны, линименты и т.д.; твердые лекарственные формы могут представлять собой таблетки, диспергируемые таблетки, жевательные таблетки, шипучие таблетки, таблетки, диспергируемые в полости рта), капсулы (включая твердые капсулы, мягкме капсулы, энтеросолюбильные капсулы), гранулы, порошки, пилюли, dropping pills, суппозитории, пленки, пэтчи, газовые (порошковые) спреи, спреи и т.д.; полутвердые лекарственные формы могут представлять собой мази, гели, пасты и т.д..

Соединения по настоящему изобретению могут быть введены в состав обычных препаратов, а также препаратов с пролонгированным высвобождением, препаратов с регулируемым высвобождением, таргетных препаратов и различных систем доставки микрочастицами.

Для того, чтобы сформировать таблетки с соединением по настоящему изобретению, можно широко использовать различные эксципиенты, известные в технике, включая разбавители, связующие, смачиватели, вещества, способствующие распадаемости таблеток, лубриканты и глиданты. Разбавитель может представлять собой крахмал, декстрин, сахарозу, глюкозу, лактозу, маннит, сорбит, ксилит, микрокристаллическую целлюлозу, сульфат кальция, гидрофосфат кальция, карбонат кальция и т.д.; смачиватель может представялть собой воду, этанол или изопропанол и т.д.; связующее может представлять собой крахмальный сироп, декстрин, сироп, мед, раствор глюкозы, микрокристаллическую целлюлозу, смолу акации, желатин, карбоксиметилцеллюллозу натрия, метилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, этилцеллюлозу, акриловую смолу, карбомер, поливинилпирролидон, полиэтиленгликоль и т.д.; вещества, способствующие распадаемости, могут представлять собой сухой крахмал, микрокристаллическую целлюлозу, гидроксипропилцеллюлозу с низкой степенью замещения, сшитый поливинилпирролидон, кроскармелозу натрия, карбоксиметилкрахмал натрия, гидрокарбонат натрия и лимонную кислоту, полиоксиэтиленсорбитановый эфир жирной кислоты, додецилсульфонат натрия и т.д.; лубрикант и глидант могут представлять собой тальк, диоксид кремния, стеарат, винную кислоту, жидкий парафин, полиэтиленгликоль и т.д..

Таблетки также могут быть получены как таблетки с покрытием, такие как таблетки с сахарным покрытием, таблетки с пленочным покрытием, таблетки с энтеросолюбильным покрытием, или как двухслойные таблетки и многослойные таблетки.

Для того, чтобы получить стандартную дозу в виде капсулы, активный ингредиент соединение по настоящему изобретению можно смешать с разбавителем, глидантом, и смесь можно непосредственно поместить в твердую или мягкую капсулу. Активный ингредиент также можно включить в гранулу или пилюлю с разбавителем, связующим, веществом, способствующим распадаемости, и затем поместить в твердую или мягкую капсулу. Различные разбавители, связующие, смачиватели, вещества, способствующие распадаемости, и глиданты для получения таблеток с соединением по изобретению также можно использовать для получения капсул с соединением по изобретению.

Для того чтобы подготовить соединение по изобретению для инъекции, можно использовать в качестве растворителя воду, этанол, изопропанол, пропиленгликоль или их смесь. Кроме того, можно добавить солюбилизатор, сорастворитель, регулятор рН и регулятор осмотического давления, которые обычно используют в технике. Солюбилизатором или сорастворителем может являться полоксамер, лецитин, гидроксипропил-β-циклодекстрин и т.д.; регулятор рН может представлять соой фосфат, ацетат, хлороводородную кислоту, гидроксид натрия и т.д.; регулятором осмотического давления может являться хлорид натрия, маннит, глюкоза, фосфат, ацетат и т.д.. Для получения лиофилизированного порошка для инъекции также можно добавлять маннит, глюкозу и т.п. в качестве наполнителя для лиофилизации.

Кроме того, в фармацевтические препараты при необходимости также могут быть добавлены красители, консерванты, отдушки, корригенты или другие добавки.

Соединение или фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить любым известным способом введения с целью введения и усиления терапевтического действия.

Дозировка соединения или фармацевтической композиции по настоящему изобретению может быть введена в широком интервале, в зависимости от характера и тяжести заболевания, которое предупреждают или от которого лечат, индивидуального состояния пациента или животного, пути введения и лекарственной формы и т.д.. Как правило, подходящая суточная доза соединения по изобретению будет колебаться от 0,001 до 150 мг/кг массы тела, предпочтительно от 0,01 до 100 мг/кг массы тела. Вышеуказанные дозировки могут вводиться в однократной дозе или в разделенных дозах, в зависимости от клинического опыта врача и схемы приема, включая применение других терапевтических средств.

Соединения или композиции по изобретению можно вводить одни или в комбинации с другими терапевтическими или симптоматическими средствами. Когда соединение по настоящему изобретению действует синергично с другими терапевтическими средствами, его дозировку следует отрегулировать в соответствии с фактической ситуацией.

Четвертый аспект настоящего изобретения относится к фенилатному производному или его стереоизомеру или его фармацевтически приемлемой соли, которые используют для получения лекарственного средства, применимого для предупреждения и/или лечения заболевания, ассоциированного с путем передачи сигнала PD-1/PD-L1.

Заболевание, ассоциированное с путем передачи сигнала PD-1/PD-L1, выбирают из рака, инфекционных заболеваний и аутоиммунных заболеваний. Рак выбирают из рака кожи, рака легких, опухоли мочевых путей, гематологической опухоли, рака молочной железы, глиомы, опухоли пищеварительной системы, опухоли репродуктивной системы, лимфомы, опухоли нервной системы, опухоли головного мозга, рака головы и шеи. Инфекционное заболевание выбирают из бактериальной инфекции и вирусной инфекции. Аутоиммунное заболевание выбирают из органоспецифического аутоиммунного заболевания, системного аутоиммунного заболевания, причем органоспецифическое аутоиммунное заболевание включает хронический лимфоцитарный тиреоидит, гипертиреоидизм, инсулинозависимый сахарный диабет, тяжелую псевдопаралитическую миастению, неспецифический язвенный колит, злокачественную анемию с хроническим атрофическим гастритом, легочный геморрагический синдром с нефритом, первичный билиарный цирроз, цереброспинальную форму рассеянного склероза и острый идиопатический полиневрит. И системные аутоиммунные заболевания включают ревматоидный артрит, системную красную волчанку, системный васкулит, склеродерму, пузырчатку, дерматомиозит, смешанное заболевание соединительной ткани, аутоиммунную гемолитическую анемию.

ПОЛЕЗНЫЕ ТЕХНИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ

Соединения по настоящему изобретению имеют высокую ингибирующую активность в отношении взаимодействия PD-1/PD-L1 и относительно хорошую растворимость. Они имеют очень хорошую способность связывать белок PD-L1. Эти соединения также имеют способность облегчать ингибирование IFN-γ PD-L1. Фармакодинамические исследования in vivo показывают, что соединения могут существенно ингибировать рост подкожных опухолей как по объему опухоли, так и по массе. Число лимфоцитов в крови и селезенке мышей может явно возрасти.

ПРИМЕРЫ

Изобретение дополнительно поясняется следующими далее примерами; однако изобретение не ограничивается пояснительными примерами, приведенными в настоящем описании ниже.

Измерительный прибор. Спектроскопию ядерного магнитного резонанса выполняют с использованием спектрометра ядерного магнитного резонанса Vaariaan Mercury 300. Масс-спектрометрию выполняют с использованием масс-спектрометра ZAD-2F и масс-спектрометра VG300.

Пример 1. (S)-N-(4-(2-Бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-(карбамоилметокси)бензил)серин

(1) 2-Бром-3-фенилтолуол.

В 50-мл колбу при перемешивании загружают 2-бром-3-иодтолуол (350 мг) и смесь диоксан/вода. Раствор барботируют аргоном в течение 10 мин для удаления растворенного кислорода. Затем последовательно добавляют фенилбороновую кислоту (172,65 мг), карбонат цезия (961,2 мг) и трифенилфосфинпалладий (40,91 мг). Смесь перемешивают в течение 12 час при 80-100°С под аргоном. Реакцию останавливают. После охлаждения до комнатной температуры смесь фильтруют через диатомовую землю. Фильтрат концентрируют при пониженном давлении и экстрагируют водой и этилацетатом три раза. Органическую фазу объединяют, промывают крепким рассолом и сушат над безводным сульфатом натрия. Органический слой фильтруют и упаривают в вакууме досуха. Сырой остаток очищают колоночной хроматографией на силикагеле (петролейный эфир), и получают бесцветное масло (221 мг). ¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆), δ 7,49-7,29 (м, 7H, Ar-H), 7,14 (д, 1H, Ar-H), 2,42 (с, 3H, Ar-CH₃).

(2) 2-Бром-3-(бромметил)-1,1'-бифенил

Взвешивают 2-бром-3-фенилтолуол (234 мг) и растворяют в 20 мл CCl₄ в 100-мл колбе. К этому раствору при перемешивании добавляют NBS (178 мг). Смесь нагревают до 80°С и кипятят с обратным холодильником. Затем добавляют бензоилпероксид (4 мг), и через 2 часа снова добавляют бензоилпероксид (4 мг), и реакцию продолжают еще в течение 2 час. Реакцию останавливают. После охлаждения до комнатной температуры смесь гасят водой и экстрагируют дихлорметаном. Органическую фазу промывают крепким рассолом и сушат над безводным сульфатом натрия. Органический слой фильтруют и упаривают в вакууме досуха, и получают желтое масло (192 мг), которое используют на следующей стадии без дополнительной очистки.

(3) 4-(2-Бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-гидроксибензальдегид

Взвешивают 2,4-дигидрокси-5-хлорбензальдегид (73,94 мг) и растворяют в 6 мл безводного ацетонитрила В 50-мл колбе, и затем добавляют гидрокарбонат натрия (98,88 мг). После перемешивания при комнатной температуре в течение 40 мин к реакционной смеси постепенно, по каплям, при постоянном давлении в капельной воронке добавляют 2-бром-3-фенилбензилбромид (192 мг, растворенные в 8 мл ДМФА), и греют при кипячении с обратным холодильником до завершения реакции. После охлаждения до комнатной температуры смесь экстрагируют водой и этилацетатом. Органическую фазу промывают крепким рассолом и сушат над безводным сульфатом натрия, затем фильтруют и упаривают в вакууме досуха. Сырой остаток очищают колоночной хроматографией на силикагеле, и получают 4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-гидроксибензальдегид (152 мг) в виде белого твердого вещества. ¹H ЯМР (500 МГц, ДМСО-d₆) δ 11,18 (с, 1H, -OH), 10,09 (с, 1H, -CHO), 7,74 (с, 1H, -ArH), 7,66 (д, 1H, -ArH), 7,57 (т, 1H, -ArH), 7,51 (м, 2H, -ArH), 7,46 (д, 1H, -ArH), 7,42 (д, 3H, -ArH), 6,85 (с, 1H, -ArH), 5,37 (с, 2H, -CH₂-).

(4) 4-(2-Бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-(карбамоилметокси)бензальдегид

В 50-мл колбе 4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-гидроксибензальдегид (100 мг) растворяют в 6 мл ДМФА, и затем добавляют карбонат цезия (127,53 мг). После перемешивания при комнатной температуре в течение 15 мин добавляют по каплям раствор 2-бромацетамида (68,25 мг) в ДМФА (4 мл). После перемешивания смеси при 80°С в течение 2 час реакцию останавливают. После охлаждения до комнатной температуры смесь экстрагируют водой и этилацетатом. Органическую фазу промывают крепким рассолом и сушат над безводным сульфатом натрия, затем фильтруют и упаривают в вакууме досуха. Сырой остаток очищают колоночной хроматографией на силикагеле, и получают белое твердое вещество (60 мг). ¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО-6d) δ 10,28 (с, 1H, -CHO), 7,74 (с, 1H, -ArH), 7,72-7,63 (м, 2H, -ArH), 7,58-7,36 (м, 8H, -ArH, -CONH2), 7,11 (с, 1H, -ArH), 5,44 (с, 2H, -CH2-), 4,75 (с, 2H, -CH2-). MС (FAB): 476 (М+1).

(5) (S)-N-(4-(2-Бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-(карбамоилметокси)бензил)серин

4-(2-Бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-(карбамоилметокси)бензальдегид (80 мг) растворяют в 5 мл ДМФА, и затем добавляют этиловый эфир серина (49 мг) и ледяную уксусную кислоту (57 мг). После перемешивания при комнатной температуре в течение 20 мин добавляют цианоборогидрид натрия (25 мг), и смесь перемешивают при 25°С в течение 14 час. Реакцию останавливают. Смесь экстрагируют водой и этилацетатом. Органическую фазу промывают крепким рассолом и сушат над безводным сульфатом натрия, затем фильтруют и упаривают в вакууме досуха. Остаток растворяют в этаноле и кипятят с обратным холодильником до завершения реакции. Смесь упаривают в вакууме досуха. Сырой остаток очищают колоночной хроматографией на силикагеле, и получают этил-(S)-N-(4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-(карбамоилметокси)бензил)серинат (70 мг) в виде бледно-желтого масла. Затем это масло растворяют в смеси метанол/Н₂О (4 мл/1 мл), и добавляют моногидрат гидроксида лития (20 мг). После перемешивания при комнатной температуре в течение 2 час к смеси на ледяной бане добавляют несколько капель уксусной кислоты для доведения рН до кислотного. Смесь упаривают в вакууме, и получают (S)-N-(4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-(карбамоилметокси)бензил)серин (45 мг) в виде белого твердого вещества. ¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ 8,03 (с, 1H, -ArH), 7,62 (д, J=6,7 Hz, 1H, -ArH), 7,56-7,35 (м, 9H, -ArH, -CONH₂), 7,00 (с, 1H, -ArH), 5,32 (с, 2H, -CH₂-), 4,60 (м, 2H, -CH₂-), 4,03 (м, 2H, -CH₂-), 3,78-3,56 (м, 3H, -CH₂-, -CH-). MС (FAB): 565 (М+1).

Пример 2. Гидрохлорид N-ацетиламиноэтил-4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-метоксибензиламина

(1) 4-(2-Бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-метоксибензальдегид

Взвешивают 4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-гидроксибензальдегид (100 мг, 0,24 ммоль) и растворяют в 5 мл безводного ТГФ, и затем добавляют карбонат цезия (93,4 мг, 0,29 ммоль). После перемешивания смеси в течение 15 мин на ледяной бане под аргоном добавляют иодметан (110 мкл, 1,8 ммоль). Реакционную смесь приводят к комнатной температуре, реакцию продолжают в течение 3 час, и затем смесь экстрагируют этилацетатом и водой три раза. Органические фазы объединяют, промывают крепким рассолом и сушат над безводным сульфатом натрия. Сырой остаток очищают колоночной хроматографией на силикагеле, и получают белое твердое вещество (78,2 мг). ¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆) δ 10,13 (с, 1H, -CHO), 7,66 (с, 1H, -ArH), 7,51 (с, 1H, -ArH), 7,44 (к, 3H, -ArH), 7,39 (с, 1H, -ArH), 7.36 (с, 2H, -ArH), 7,34 (с, 1H, -ArH), 7,06 (с, 1H, -ArH), 5,44 (с, 2H, -CH₂-), 3,97 (с, 3H, -OCH₃).

(2) Гидрохлорид N-ацетиламиноэтил-4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-метоксибензиламина

4-(2-Бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-метоксибензальдегид (50 мг, 0,116 ммоль) растворяют в 5 мл ДМФА, и затем добавляют N-(2-амипоэтил)ацетамид (35,54 мг, 0,348 ммоль), и добавляют по каплям ледяную уксусную кислоту (42,11 мг, 0,696 ммоль). После перемешивания при комнатной температуре в течение 20 мин добавляют цианоборогидрид натрия (18 мг, 0,29 ммоль), и смесь перемешивают при 25°С в течение 14 час. Реакцию останавливают. Смесь экстрагируют водой и этилацетатом. Органическую фазу промывают крепким рассолом и сушат над безводным сульфатом натрия, затем фильтруют и упаривают в вакууме досуха. Сырой остаток очищают колоночной хроматографией на силикагеле, и получают вязкий продукт. Добавляют 10 мл насыщенного раствора HCl в метаноле и перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Смесь упаривают в вакууме досуха, промывают диэтиловым эфиром, и получают порошок бледно-желтого твердого вещества (28 мг). ¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆) δ 9,31 (с, 1H, HCl), 9,04 (с, 1H, -NH-), 8,33 (с, 1H, -CONH-), 7,61 (м, 2H, -ArH), 7,48 (с, 1H, -ArH), 7,42 (м, 2H, -ArH), 7,37 (м, 1H, -ArH), 7,33 (м, 3H, -ArH), 6,95 (с, 1H, -ArH), 5,32 (с, 2H, -CH₂-), 3,98 (с, 2H, -CH₂-), 3,85 (с, 3H, -OCH₃), 3,16 (м, 2H, -CH₂-), 2,86 (м, 2H, -CH₂-), 1,78 (с, 3H, -COCH₃). MС (FAB): 517 (М).

Пример 3. N-Ацетиламиноэтил-4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-аллилоксибензиламин

Процедура такая же, как в примере 1, за исключением того, что вместо 2-бромацетамида используют 3-бромпроп-1-ен, вместо этилового эфира серина используют N-(2-аминоэтил)ацетамид, и получают белое твердое вещество. ¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆) δ 8,10 (с, 1H, -CONH-), 7,61 (д, 1H, -ArH), 7,54 (д, 1H, -ArH), 7,51- 7,46 (м, 1H, -ArH), 7,43 (д, 2H, -ArH), 7,39 (д, 1H, -ArH), 7,35 (с, 2H, -ArH), 7,33 (с, 1H, -ArH), 6,95 (с, 1H, -ArH), 6,04 (м, 1H, -CH=), 5,39 (д, 1H, =CH₂), 5,31 (с, 2H, -CH₂-), 5,24 (д, 1H, =CH₂), 4,68 (д, 2H, -CH₂-), 3,98 (с, 2H, -CH₂-), 2,85 (т, 2H, -CH₂-), 1,79 (с, 3H, -COCH₃). MS (FAB): 545 (М+1).

Пример 4. N-Ацетиламиноэтил-4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-(проп-2-инилокси)бензиламин

Процедура такая же, как в примере 1, за исключением того, что вместо 2-бромацетамида используют 3-бромпроп-1-ин, и вместо этилового эфира серина используют N-(2-аминоэтил)ацетамид, и получают белое твердое вещество. ¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆) δ 8,50 (с, 1H, -NH-), 8,08 (т, 1H, -CONH-), 7,63 (дд, 1H, -ArH), 7,57 (с, 1H, -ArH), 7,49 (т, 1H, -ArH), 7,44 (м, 1H, -ArH), 7,42 (с, 1H, -ArH), 7,41-7,37 (м, 1H, -ArH), 7,36 (м, 2H, -ArH), 7,34 (к, 1H, -ArH), 7,09 (с, 1H, -ArH), 5,31 (с, 2H, -CH₂-), 4,93 (д, 2H, -CH₂-), 3,95 (с, 2H, -CH₂-), 3,59 (т, 1H, CH), 3,27-3,28 (м, 2H, -CH₂-), 2,83 (м, 2H, -CH₂-), 1,79 (с, 3H, -COCH₃). MС (FAB): 543 (М+1).

Пример 5. N-Ацетиламиноэтил-4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-(циклопропилметокси)бензиламин

Процедура такая же, как в примере 1, за исключением того, что вместо 2-бромацетамида используют (бромметил)циклопропан, и вместо этилового эфира серина используют N-(2-аминоэтил)ацетамид, и получают белое твердое вещество. ¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆) δ 8,06 (с, 1H, -CONH-), 7,59 (м, 1H, -ArH), 7,51-7,46 (м, 2H, -ArH), 7,43 (м, 2H, -ArH), 7,40 (с, 1H, -ArH), 7,34 (м, 3H, -ArH), 6,91 (д, 1H, -ArH), 5,36-5,26 (м, 2H, -CH₂-), 3,94-3,88 (м, 2H, -CH₂-), 3,29-3,19 (м, 4H, -CH₂-), 2,76 (м, 2H, -CH₂-), 2,34 (м, 1H, -CH₂-), 2,02 (м, 1H, -CH₂-), 1,78 (с, 3H, -COCH₃-), 1,27-1,15 (м, 1H, -CH-), 0,53 (м, 1H, -CH₂-), 0,31 (м, 1H, -CH₂-). MС (FAB): 559 (М+1).

Пример 6. N-(4-(2-Бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-(N,N-диметилкарбамоилметокси)бензил)серин

Процедура такая же, как в примере 1, за исключением того, что вместо 2-бромацетамида используют N,N-диметил-2-бромацетамид, и получают белое твердое вещество. ¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ 7,65 (д, J=7,1 Гц, 1H, -ArH), 7,45 (ддд, J=23,8, 18,3, 6,8 Гц, 8H, -ArH), 7,03 (с, 1H, -ArH), 5,25 (д, J=42,2 Гц, 2H, -CH2-), 5,05 (с, 2H, -CH2-), 4,05 (дд, J=32,7, 13,2 Гц, 2H, -CH2-), 3,78-3,56 (м, 3H, -CH2-, -CH-), 2,99 (с, 3H, -CH3), 2,83 (с, 3H, -CH3). MС (FAB): 593 (М+1).

Пример 7. N-(4-(2-Бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-(3-метилбут-2-енилокси)бензил)серин

Процедура такая же, как в примере 1, за исключением того, что вместо 2-бромацетамида используют 1-бром-3-метилбут-2-ен, и получают белое твердое вещество. ¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ 7,64 (дд, J=7,7, 1,7 Гц, 1H, -ArH), 7,55-7,49 (м, 1H, -ArH), 7,49-7,45 (м, 3H, -ArH), 7,43 (дт, J=5,6, 2,3 Гц, 1H, -ArH), 7,40-7,36 (м, 3H, -ArH), 6,92 (с, 1H, -ArH), 5,46-5,40 (м, 1H, =CH), 5,33 (с, 2H, -CH₂-), 4,65 (д, J=6,5 Гц, 2H, -CH₂-), 3,88 (д, J=2,5 Гц, 2H, -CH₂-), 3,64 (ддд, J=17,3, 11,0, 6,2 Гц, 2H, -CH₂-), 3,15-3,09 (м, 1H, -CH-), 1,72 (д, J=1,0 Гц, 6H, -CH₃). MС (FAB): 576 (М+1).

Пример 8. N-(4-(2-Бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-(циклопропилметокси)бензил)треонин

Процедура такая же, как в примере 1, за исключением того, что вместо 2-бромацетамида используют (бромметил)циклопропан, и вместо этилового эфира серина используют этиловый эфир треонина, и получают белое твердое вещество. ¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆) δ м.д. 7,65-6,86 (м, 10H, Ar-H), 5,27 (с, 2H, CH₂), 3,90-3,81 (м, 5H, CH₂×2, CH), 2,93 (д, J=4,0 Гц, 1H, CH), 1,21 (м, 1H, CH), 1,11 (д, J=4,0 Гц, 3H, CH₃), 0,52-0,32 (м, 4H, CH₂×2). MС (FAB): 576 (М+1).

Пример 9. 2-(4-(2-Бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-(циклопропилметокси)бензиламино)-3-гидроксипропанамид

Процедура такая же, как в примере 1, за исключением того, что вместо 2-бромацетамида используют (бромметил)циклопропан, и вместо этилового эфира серина используют 2-амино-3-гидроксипропанамид, и получают белое твердое вещество. ¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆) δ м.д. 7,63-6,82 (м, 12H, Ar-H, CONH₂), 5,26 (с, 2H, CH₂), 3,85 (к, 2H, J=4,0 Гц, CH₂), 3,66-3,40 (м, 4H, CH₂×2), 2,97 (с, 1H, CH), 1,17 (м, 1H, CH), 0,55-0,26 (м, 4H, CH₂×2). MС (FAB): 561 (М+1).

Пример 10. N-Ацетиламиноэтил-4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-(циклопропилметокси)бензиламин

Процедура такая же, как в примере 1, за исключением того, что вместо 2-бромацетамида используют (бромметил)циклопропан, и вместо этилового эфира серина используют N-(2-аминоэтил)ацетамид, и получают белое твердое вещество. ¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆) δ 7,78 (м, 1H, CONH), 7,62-6,80 (м, 10H, Ar-H), 5,26 (с, 2H, CH2), 3,86 (д, J=8,0 Гц, 2H, CH2), 3,61 (с, 2H, CH2), 3,10 (к, J=4,0 Гц, 2H, CH2), 2,52 (т, J=4.0 Гц, 2H, CH2), 1,75 (с, 3H, CH3), 1,17 (м, 1H, CH), 0,55-0,26 (м, 4H, CH₂×2). MС (FAB): 559 (М+1).

Пример 11. N-(4-(2-Бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-(циклопропилметокси)бензил)цитруллин

Процедура такая же, как в примере 1, за исключением того, что вместо 2-бромацетамида используют (бромметил)циклопропан, и вместо этилового эфира серина используют этиловый эфир цитруллина, и получают белое твердое вещество. ¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆) δ м.д. 7,58-6,73 (м, 10H, Ar-H), 5,29 (с, 1H, CONH), 5,20 (с, 2H, CH₂), 3,82 (д, J=4,0 Гц, 2H, CH₂), 3,68 (к, J=16,0 Гц, 2H, CH₂), 2,86 (к, J=8,0 Гц, 1H, CH), 1,68-1,36 (м, 4H, CH₂×2), 0,81 (м, 2H, CH₂), 1,19 (м, 1H, CH), 0,52-0,27 (м, 4H, CH₂×2). MС (FAB): 632 (М+1).

Пример 12. N-(4-(2-Бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-(N-метокси-N-метилкарбамоилметокси)бензил)серин

Процедура такая же, как в примере 1, за исключением того, что вместо 2-бромацетамида используют 2-бром-N-метокси-N-метилацетамид, и получают белое твердое вещество. ¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆) δ 7,66 (д, J=7,3 Гц, 1H, -ArH), 7,52 (д, J=7,7 Гц, 1H, -ArH), 7,49 (с, 1H, -ArH), 7,47 (с, 1H, -ArH), 7,45 (с, 1H, -ArH), 7,43 (с, 1H, -ArH), 7,38 (д, J=6,7 Гц, 3H, -ArH), 7,14 (с, 1H, -ArH), 5,75 (д, J=0,9 Гц, 1H), 5,28 (с, 3H, -OCH₃), 4,69-4,52 (м, 3H, -NCH₃), 4,12 (д, J=12,5 Гц, 2H, -CH₂-), 4,00 (д, J=15,7 Гц, 2H, -CH₂-), 3,79 (д, J=12,4 Гц, 2H, -CH₂-), 3,75 (д, J=5,5 Гц, 2H, -CH₂-). MС (FAB): 609 (М+1).

Пример 13. N-(4-(2-Бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-(2-морфолино-2-оксоэтокси)бензил)серин

Процедура такая же, как в примере 1, за исключением того, что вместо 2-бромацетамида используют 2-бром-1-морфолиноэтанон, и получают белое твердое вещество. ¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆) δ 7,65 (дд, J=7,7, 1,7 Гц, 1H, -ArH), 7,55-7,51 (м, 1H), 7,50 (с, 1H, -ArH), 7,48 (т, J=1,8 Гц, 1H, -ArH), 7,46 (к, J=1,3 Гц, 1H, -ArH), 7,45-7,41 (м, 1H, -ArH), 7,40 (д, J=1,7 Гц, 2H, -ArH), 7,38 (дк, J=4,3, 1,9 Гц, 2H, -ArH), 7,00 (с, 1H), 5,30 (с, 2H, -CH₂-), 5,05 (с, 2H, -CH₂-), 4,19-4,02 (м, 2H, -CH₂-), 4,02-3,91 (м, 2H,-CH₂-), 3,74 (дд, J=11,2, 4,5 Гц, 2H, -CH₂-), 3,67 (к, J=6,7, 5,0 Гц, 2H, -CH₂-), 3,62-3,58 (м, 2H, -CH₂-), 3,55-3,52 (м, 2H,-CH₂-), 3,25-3,21 (м, 1H,-CH-). MС (FAB): 635 (М+1).

Пример 14. (S)-N-(4-(2-Бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-(циклопропилметокси)бензил)серин

Процедура такая же, как в примере 1, за исключением того, что вместо 2-бромацетамида используют (бромметил)циклопропан, и получают белое твердое вещество. ¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d₆) δ 7,68-7,58 (м, 1H, -ArH), 7,55-7,47 (м, 3H, -ArH), 7,47-7,41 (м, 2H, -ArH), 7,38 (м, 3H, -ArH), 6,93 (м, 1H, -ArH), 5,34-5,20 (м, 2H, -CH₂-), 4,20-4,02 (м, 1H, -CH₂-), 3,94 (м, 2H, -CH₂-), 3,93-3,91 (м, 1H, -CH₂-), 3,76-3,62 (м, 2H, -CH₂-), 3,25-3,17 (м, 1H, -CH₂-), 1,26 (м, 1H, -CH-), 0,56 (м, 1H, -CH₂-), 0,42-0,28 (м, 1H, -CH₂-). MС (FAB): 562 (М+1).

Пример 15. (S)-N-(4-(2-Бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-(N-гидроксикарбамоилметокси)бензил)пипеколиновая кислота

Процедура такая же, как в примере 1, за исключением того, что вместо 2-бромацетамида используют 2-бром-N-гидроксиацетамид, и вместо этилового эфира серина используют (S)-этилпиперидин-2-карбоксилат, и получают белое твердое вещество. ¹H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 8,21 (с, 1H, -ArH), 7,81-7,32 (м, 9H, -ArH), 5,43-5,19 (с, 2H, -CH₂-), 4,18-4,00 (м, 2H, -CH₂-), 3,78-3,56 (м, 2H, -CH₂-), 3,16 (д, J=11,0 Гц, 1H, -CH-), 2,94-2,86 (м, 1H, -CH₂-), 2,28-2,22 (м, 1H, -CH₂-), 1,91-1,85 (м, 2H, -CH₂-), 1,56-1,40 (м, 3H, -CH₂-), 1,36-1,30 (м, 1H, -CH₂-). MС (FAB): 605 (М+1).

Пример 16. (S,S)-N-(4-(2-Бром-3-(2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-ил)бензилокси)-5-хлор-2-(карбамоилметокси)бензил)-4-гидроксипролин

(1) 2-Бром-3-(2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-ил)толуол

Процедура такая же, как в примере 1, за исключением того, что вместо фенилбороновой кислоты используют 2-(2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-ил)-4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан, вместо трифенилфосфинпалладия используют [1,1'-бис(дифенилфосфино)ферроцен]дихлорпалладий(II), и вместо карбоната цезия используют карбонат калия, и получают 2-бром-3-(2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-ил)толуол в виде бледно-желтого масла. ¹H ЯМР (400 МГц, хлороформ-d) δ: 7,21 (д, 2H, -ArH), 7,11 (м, 1H, -ArH), 6,90 (д, 2H, -ArH), 6,86 (д, 1H, -ArH), 4,30 (м, 4H, -OCH₂CH₂O-), 2,48 (с, 3H, -CH₃).

(2) (S,S)-N-(4-(2-Бром-3-(2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-ил)бензилокси)-5-хлор-2-(карбамоилметокси)бензил)-4-гидроксипролин

Процедура такая же, как в примере 1, за исключением того, что вместо 2-бром-3-метил-1,1'бифенила используют 2-бром-3-(2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-ил)толуол, и вместо этилового эфира серина используют (S,S)-этил-4-гидроксипролинат, и получают (S,S)-N-(4-(2-бром-3-(2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-ил)бензилокси)-5-хлор-2-(карбамоилметокси)бензил)-4-гидроксипролин в виде белого твердого вещества. МС (FAB): 622 (М+1).

Пример 17. (S,S)-N-(4-(2-Бром-3-(2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-ил)бензилокси)-5-хлор-2-(циклопропилметокси)бензил)-4-гидроксипролин

(1) 2-Бром-3-(2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-ил)толуол

Процедура такая же, как в примере 1, за исключением того, что вместо фенилбороновой кислоты используют 2-(2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-ил)-4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан, вместо трифенилфосфинпалладия используют [1,1'-бис(дифенилфосфино)ферроцен]дихлорпалладий(II), и вместо карбоната цезия используют карбонат калия, и получают 2-бром-3-(2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-ил)толуол в виде бледно-желтого масла. ¹H ЯМР (400 МГц, хлороформ-d) δ: 7,21 (д, 2H, -ArH), 7,11 (м, 1H, -ArH), 6,90 (д, 2H, -ArH), 6,86 (д, 1H, -ArH), 4,30 (м, 4H, -OCH₂CH₂O-), 2,48 (с, 3H, -CH₃).

(2) (S,S)-N-(4-(2-Бром-3-(2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-ил)бензилокси)-5-хлор-2-(циклопропилметокси)бензил)-4-гидроксипролин

Процедура такая же, как в примере 1, за исключением того, что вместо 2-бром-3-метил-1,1'-бифенила используют 2-бром-3-(2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-ил)толуол, вместо 2-бромацетамида используют (бромметил)циклопропан, и вместо этилового эфира серина используют (S,S)-этил-4-гидроксипролинат, и получают (S,S)-N-(4-(2-бром-3-(2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-ил)бензилокси)-5-хлор-2-(циклопропилметокси)бензил)-4-гидроксипролин в виде белого твердого вещества. МС (FAB): 646(М+1).

Фармакологические эксперименты

1. Оценка активности in vitro. Применяют набор Cisbio для анализа связывания PD-1/PD-L1 для метода детекции уровня ферментов in vitro.

Принципы и методы скрининга низкомолекулярных ингибиторов PD-1/PD-L1

1) Принцип. Белок PD-1 имеет метку HIS, и PD-1 лиганд PD-L1 имеет метку hFc. Меченное Eu анти-hFc антитело и меченное XL665 анти-HIS антитело комбинируют с вышеуказанными двумя белками соответственно. После возбуждения лазером энергия может передаваться от донора Eu к рецептору XL665, давая возможность свечения XL665. После добавления ингибиторов (соединений или антител) блокировка связывания PD-1 и PD-L1 делает расстояние между Eu и XL665 значительным, энергия не может передаваться, и XL665 не дает свечения.

2) Экспериментальный метод. Конкретным методом можно назвать набор Cisbio's PD-1/PD-L1 Kit (пункт 64CUS000C-2). Реагенты следует распределять в следующем порядке. В случае 384-луночного белого планшета для ELISA в каждую лунку добавляют 2 мкл разбавителя или целевого соединения, разведенного разбавителем, и затем добавляют 4 мкл белка PD-1 и 4 мкл белка PD-L1 на лунку и инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре; и добавляют 10 мкл смеси анти-Tag1-Eu3⁺ и анти-Tag2-XL665 на лунку, инкубируют в течение 1 часа - 4 час при комнатной температуре, и измеряют сигналы флуоресценции при 665 нм и 620 нм прибором Envison. Степень HTRF=(665 нм/620 нм) * 10⁴. Детектируют 8-10 концентраций для каждого соединения, и вычисляют IC₅₀ с помощью программы Graphpad.

3) Результаты скрининга приводятся в таблице 1.

Таблица 1. Оценка ингибирующей активности соединений примеров на молекулярном уровне в отношении взаимодействия между PD-1 и PD-L1

Пример	IC50(M)	Пример	IC50(M)
1	3,12×10-7	10	1,00×10-6
2	7,32×10-7	11	1,41×10-6
3	1,26×10-7	12	1,91×10-7
4	1,80×10-6	13	4,13×10-8
5	1,15×10-6	14	4,17×10-8
6	4,25×10-8	15	1,83×10-7
7	1,82×10-8	16	1,82×10-7
8	1,02×10-8	17	4,05×10-8
9	8,16×10-8

2. Способность соединений примеров ослаблять ингибирование IFNγ лигандом PD-L1

Уровень экспрессии IFNγ может отражать пролиферативную активность Т-лимфоцитов. С использованием экстрагированных человеческих РВМС (мононуклеарные клетки периферической крови), на базе которых Т-лимфоциты могут активироваться анти-CD3/анти-CD28 антителами, добавляют лиганд PD-L1 для ингибирования Т-лимфоцитов, и исследуют способность соединений примеров ослаблять ингибирование PD-L1.

Конкретная процедура следующая. Используют раствор для выделения лимфоцитов человека DAKEWE (DKW-KLSH-0100) для экстрагирования PBMC из цельной человеческой крови, и PBMC инокулируют в 96-луночный планшет с 3×10⁵ клетками на лунку. Соответственно добавляют белок человека PD-L1 (конечная концентрация 5 мкг/мл), анти-CD3/анти-CD28 антитело (конечная концентрация 1 мкг/мл) и пропорциональное разведение соединений примеров. Через 72 часа детектируют уровень экспрессии IFNγ в супернатанте с помощью тест-набора Cisbio IFNγ. Экспериментальные результаты показывают, что ингибирование PD-L1 уровня экспрессии IFNγ может быть частично ослаблено соединениями примеров при 10 нМ.

3. Эффективность соединений примеров in vivo

Методы фармакодинамики описаны далее.

Метод с подкожным ксенотрансплантатом опухоли следующий. Культивированные определенные опухолевые клетки получают, собирают центрифугированием, промывают стерильным физиологическим раствором два раза и затем считают. Концентрацию клеток доводят до 5×10⁶/мл физиологическим раствором, и 0,2 мл клеточной суспензии инокулируют в правую подмышечную впадину мышей C57BL/6 или Bablc. На следующий день после инокуляции животных произвольно делят на две группы. В каждой группе находится по 6-7 мышей. После взвешивания животных дозируют один раз каждый день для контроля за размером опухоли. Когда размер опухоли достигает определенной величины, мышей взвешивают, берут кровь из глазниц мышей, и затем мышей умерщвляют путем разрыва шейных позвонков. Собирают ткань опухоли, ткань тимуса и ткань селезенки и соответственно взвешивают. Наконец, вычисляют степень ингибирования роста опухоли, и степень ингибирования роста опухоли используют для оценки уровня противоопухолевого действия.

Метод с моделью метастаза в легком B16F10 следующий. Культивированные клетки опухоли B16F10 получают и центрифугируют, промывают стерильным физиологическим раствором два раза и затем считают. Концентрацию клеток доводят до 2,5×10⁶/мл физиологическим раствором. Инъецируют 0,2 мл клеток мышам C57BL/6 через хвостовую вену, и опухолевые клетки будут накапливаться в легких мышей. На следующий день после инокуляции животных произвольно делят на две группы. В каждой группе находится по 6-7 мышей. После взвешивания животных дозируют один раз каждый день. Через 3 недели мышей взвешивают и умерщвляют, ткань легких собирают и взвешивают, и после фиксирования в жидкости Буэна считают число опухолей легких. Наконец вычисляют степень ингибирования роста опухоли, и степень ингибирования роста опухоли используют для оценки уровня противоопухолевого действия.

Метод с моделью гидроторакса легких при раке Льюиса следующий. Подкожную опухоль ксенотрансплантата рака легких Льюиса гомогенизируют и промывают два раза стерильным физиологическим раствором два раза, и концентрацию клеток доводят до 2,5×10⁵/мл физиологическим раствором. Инъецируют 0,2 мл клеток мышам C57BL/6 в полость грудной клетки. На следующий день после инокуляции животных произвольно делят на две группы. В каждой группе находится по 6-7 мышей. После взвешивания животных дозируют один раз каждый день. Животных умерщвляют, когда масса животных в контрольной группе внезапно падает. Жидкость из полости грудной клетки извлекают шприцем, и регистрируют объем жидкости.

При исследовании механизма на вышеописанных моделях для измерения общей доли Т-клеток различных типов приспосабливают метод проточной цитометрии. Конкретные стадии следующие. Образцы сначала обрабатывают. Для ткани крови берут кровь из глазной орбиты. Используют лизат красных клеток для извлечения красных кровяных клеток, и затем для промывки используют PBS буфер. После промывки клетки собирают. В случае опухоли и селезенки ткани измельчают гомогенизатором, затем разбавляют PBS буфером и затем фильтруют через сито 300 меш. После подсчета клеток для каждого образца 1×10⁶ клеток добавляют в пробирку Эппендорфа и окрашивают для антитела подачи. После инкубации в течение 1 часа на льду каждый образец промывают 2 раза PBS буфером. Популяцию клеток анализируют прибором проточным цитометром VERSE от BD Company. Общее число клеток в ткани опухоли составляет 1×10⁵, и общее число клеток в тканях крови и селезенки составляет 1×10⁴. После проточной цитометрии анализируют отношение Т-клеток к общему числу клеток.

(1) Модель с подкожным ксенотрансплантатом высокометастатической меланомы B16F10. В случае высокометастатической меланомы B16F10 соединения примеров могут существенно ингибировать рост подкожной опухоли относительно объема или массы опухоли.

Из анализа механизма следует, что соединения примеров могут повышать пропорцию опухольинфильтрирующих лимфоцитов и пропорцию лимфоцитов в селезенке.

(2) Модель метастазов высокометастатической меланомы B16F10 в легких

В случае моделей метаститического рака легких с высокометастатической меланомой B16F10 соединения примеров могут существенно ингибировать ряд метастазов легких.

Из анализа механизма следует, что соединения примеров могут повышать процент лимфоцитов в мышиной крови.

(3) Модель с подкожным ксенотрансплантатом рака молочной железы ЕМТ6 у мышей

В случае модели с подкожным ксенотрансплантатом рака молочной железы ЕМТ6 у мышей соединения примеров оказывают некоторое ингибирующее действие на рак молочной железы ЕМТ6 у мышей, и комбинация соединений примеров и СТХ может существенно повысить степень ингибирования СТХ роста опухоли.

(4) Модель гидроторакса при раке легких Льюиса

Соединения примеров оказывают существенное ингибирующее действие на модели гидроторакса при раке легких Льюиса и могут снизить коэффициент состояния гидроторакса.

(5) Модель с подкожным ксенотрансплантатом рака толстой кишки МС38 у мышей

В случае модели с подкожным ксенотрансплантатом рака толстой кишки МС38 у мышей соединения примеров оказывают существенное ингибирующее действие на рак толстой кишки МС38 у мышей и в комбинации с СТХ оказывают синергетическое противоопухолевое действие на этот рак.

4. Взаимодействие соединение примера/антитело к PD-L1 с белком PD-L1 проверяли с помощью Biacore

1) Принцип эксперимента

Поверхностный плазмон является видом электромагнитной волны металла, вызываемой взаимодействием фотона и электрона при свободном колебании. Поверхностный плазмонный резонанс (ППР) является оптическим феноменом, который происходит на поверхности двух видов сред, который может быть вызван фотоном или электроном. Феномен полного отражения света от высокоплотной среды в светорассеивающую среду будет формировать волну, нераспространяющуюся в светорассеивающую среду. Когда полная отраженная нераспространяющаяся волна соответствует плазменной волне на поверхности металла, может иметь место резонанс, энергия отраженного света снижается, и в спектре энергии отраженного света появляется резонансный пик. Такой резонанс называют поверхностным плазмонным резонансом. Угол падения при поверхностном плазмонном резонансе называют углом ППР. ППР-Биосенсор обеспечивает в реальном времени чувствительный метод детекции без меток для мониторинга взаимодействия молекул. Сенсор обнаруживает изменение угла ППР, и ППР также соответствует показателю преломления поверхности металла. Когда аналит связан на поверхности чипа, это ведет к изменению показателя преломления поверхности чипа, что ведет к изменению угла ППР. Это является базовым принципом обнаружения межмолекулярного взаимодействия ППР-биосенсором в реальном времени. В анализе взаимодействия изменение угла ППР регистрируется на сенсорной карте в реальном времени.

(2) Экспериментальные методы

Белок PD-L1 захватывают на канале чипа NTA методом поимки, и буферной системой является PBS-P+, pH 7,4, 0,01% ДМСО. Получают ряд концентраций соединений и антител к PD-L1 и для определения взаимодействия пропускают по поверхности чипа.

(3) Экспериментальные результаты

Предварительно определено, что белком, с которым связываются соединения примеров, является PD-L1. Дополнительные эксперименты с Biacore подтверждают, что соединения примеров имеют сильную способность связывать PD-L1.

1. Фенилатное производное формулы (I) или его фармацевтически приемлемая соль или стереоизомер:

(I),

где R₁ выбирают из и ;

R₂ выбирают из незамещенного или замещенного С₁-С₈-алифатического гидрокарбила, в случае замещения заместитель выбирают из карбамоила (-CONH₂) и гидроксикарбамоила (-CONHOH);

R₃ выбирают из замещенного насыщенного С₁-С₈-алкиламино, замещенного N-содержащего С₃-С₆-гетероцикл-1-ила, где каждый является моно- или ди-замещенным заместителем(ями), выбранным(и) из гидрокси, ацетиламино, уреидо (-NH(C=O)NH₂), гидроксиформила (-COOH);

Х выбирают из хлора.

2. Фенилатное производное по п.1, представленное формулой (IA), или его фармацевтически приемлемая соль или стереоизомер:

(IA),

где R₂ выбирают из незамещенного или замещенного С₁-С₈-алифатического гидрокарбила, когда в случае замещения заместитель выбирают из карбамоила (-CONH₂) и гидроксикарбамоила (-CONHOH);

R₃ выбирают из замещенного насыщенного С₁-С₈-алкиламино, замещенного N-содержащего С₃-С₆-гетероцикл-1-ила, где каждый является моно- или ди-замещенным заместителем(ями), выбранным(и) из гидрокси, ацетиламино, уреидо (-NH(C=O)NH₂), гидроксиформила (-COOH);

Х выбирают из хлора.

3. Фенилатное производное по п.2, представленное формулой (IA-1), или его фармацевтически приемлемая соль или стереоизомер:

(IA-1),

где R₃ выбирают из замещенного насыщенного С₁-С₈-алкиламино, замещенного N-содержащего С₃-С₆-гетероцикл-1-ила, где каждый является моно- или ди-замещенным заместителем(ями), выбранным(и) из гидрокси, ацетиламино, уреидо (-NH(C=O)NH₂), гидроксиформила (-COOH);

Х выбирают из хлора.

4. Фенилатное производное по п.2, представленное формулой (IA-2), или его фармацевтически приемлемая соль или стереоизомер:

(IA-2),

где R₃ выбирают из замещенного насыщенного С₁-С₈-алкиламино, замещенного N-содержащего С₃-С₆-гетероцикл-1-ила, где каждый является моно- или ди-замещенным заместителем(ями), выбранным(и) из гидрокси, ацетиламино, уреидо (-NH(C=O)NH₂), гидроксиформила (-COOH);

Х выбирают из хлора.

5. Фенилатное производное по п.2, представленное формулой (IA-5), или его фармацевтически приемлемая соль или стереоизомер:

(IA-5),

где R₃ выбирают из замещенного насыщенного С₁-С₈-алкиламино, замещенного N-содержащего С₃-С₆-гетероцикл-1-ила, где каждый является моно- или ди-замещенным заместителем(ями), выбранным(и) из гидрокси, ацетиламино, уреидо (-NH(C=O)NH₂), гидроксиформила (-COOH);

Х выбирают из хлора.

6. Фенилатное производное по п.1, представленное формулой (IВ), или его фармацевтически приемлемая соль или стереоизомер:

(IB),

где R₂ выбирают из незамещенного или замещенного С₁-С₈-алифатического гидрокарбила, в случае замещения заместитель выбирают из карбамоила (-CONH₂) и гидроксикарбамоила (-CONHOH);

R₃ выбирают из замещенного насыщенного С₁-С₈-алкиламино, замещенного N-содержащего С₃-С₆-гетероцикл-1-ила, где каждый является моно- или ди-замещенным заместителем(ями), выбранным(и) из гидрокси, ацетиламино, уреидо (-NH(C=O)NH₂), гидроксиформила (-COOH);

Х выбирают из хлора.

7. Фенилатное производное по п.6, представленное формулой (IВ-1), или его фармацевтически приемлемая соль или стереоизомер:

(IB-1),

где R₃ выбирают из замещенного насыщенного С₁-С₈-алкиламино, замещенного N-содержащего С₃-С₆-гетероцикл-1-ила, где каждый является моно- или ди-замещенным заместителем(ями), выбранным(и) из гидрокси, ацетиламино, уреидо (-NH(C=O)NH₂), гидроксиформила (-COOH);

Х выбирают из хлора.

8. Фенилатное производное по п.6, представленное формулой (IВ-2), или его фармацевтически приемлемая соль или стереоизомер:

(IB-2),

где R₃ выбирают из замещенного насыщенного С₁-С₈-алкиламино, замещенного N-содержащего С₃-С₆-гетероцикл-1-ила, где каждый является моно- или ди-замещенным заместителем(ями), выбранным(и) из гидрокси, ацетиламино, уреидо (-NH(C=O)NH₂), гидроксиформила (-COOH);

Х выбирают из хлора.

9. Фенилатное производное по п.6, представленное формулой (IВ-5), или его фармацевтически приемлемая соль или стереоизомер:

(IB-5),

где R₃ выбирают из замещенного насыщенного С₁-С₈-алкиламино, замещенного N-содержащего С₃-С₆-гетероцикл-1-ила, где каждый является моно- или ди-замещенным заместителем(ями), выбранным(и) из гидрокси, ацетиламино, уреидо (-NH(C=O)NH₂), гидроксиформила (-COOH);

Х выбирают из хлора.

10. Фенилатное производное формулы (I) или его фармацевтически приемлемая соль или стереоизомер:

(I),

где R₁ выбирают из и ;

R₂ выбирают из незамещенного или замещенного С₁-С₈-алифатического гидрокарбила, в случае замещения заместитель выбирают из карбамоила (-CONH₂) и гидроксикарбамоила (-CONHOH);

R₃ выбирают из

;

Х выбирают из хлора.

11. Фенилатное производное по п.10, представленное формулой (IA), или его фармацевтически приемлемая соль или стереоизомер:

(IA),

где R₂ выбирают из незамещенного или замещенного С₁-С₈-алифатического гидрокарбила, в случае замещения заместитель выбирают из карбамоила (-CONH₂) и гидроксикарбамоила (-CONHOH);

R₃ выбирают из

;

Х выбирают из хлора.

12. Фенилатное производное по п.11, представленное формулой (IA-1), или его фармацевтически приемлемая соль или стереоизомер:

(IA-1),

где R₃ выбирают из

;

Х выбирают из хлора.

13. Фенилатное производное по п.1 или его фармацевтически приемлемая соль или стереоизомер, где R₃ представляет собой насыщенный С₁-С₈-алкиламино, замещенный уреидо (-NH(C=O)NH₂) и гидроксиформилом (-COOH).

14. Фенилатное производное по п.1 или его фармацевтически приемлемая соль или стереоизомер, причем соединение выбирают из:

(S)-N-(4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-(карбамоилметокси)бензил)серина

;

гидрохлорида N-ацетиламиноэтил-4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-метоксибензиламина

;

N-ацетиламиноэтил-4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-аллилоксибензиламина

;

N-ацетиламиноэтил-4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-(проп-2-инилокси)бензиламина

;

N-ацетиламиноэтил-4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-(циклопропилметокси)бензиламина

;

N-(4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-(3-метилбут-2-енилокси)бензил)серина

;

N-(4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-(циклопропилметокси)бензил)треонина

;

N-ацетиламиноэтил-4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-(циклопропилметокси)бензиламина

;

N-(4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-(циклопропилметокси)бензил)цитруллина

;

(S)-N-(4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-(циклопропилметокси)бензил)серина

;

(S)-N-(4-(2-бром-3-фенилбензилокси)-5-хлор-2-(N-гидроксикарбамоилметокси)бензил)пипеколиновой кислоты

;

(S,S)-N-(4-(2-бром-3-(2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-ил)бензилокси)-5-хлор-2-(карбамоилметокси)бензил)-4-гидроксипролина

;

(S,S)-N-(4-(2-бром-3-(2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-ил)бензилокси)-5-хлор-2-(циклопропилметокси)бензил)-4-гидроксипролина

.

15. Фенилатное производное по п.1 или его стереоизомер или фармацевтически приемлемая соль, причем фармацевтически приемлемая соль включает соль, образованную с неорганической кислотой, соль, образованную с органической кислотой, соль с ионом щелочного металла, соль с ионом щелочноземельного металла или соль, образованную с органическим основанием, которое дает физиологически приемлемый катион, и аммониевую соль.

16. Фенилатное производное по п.15 или его стереоизомер или фармацевтически приемлемая соль, причем неорганическую кислоту выбирают из хлороводородной кислоты, бромоводородной кислоты, фосфорной кислоты или серной кислоты; органическую кислоту выбирают из метансульфоновой кислоты, п-толуолсульфоновой кислоты, трифторуксусной, лимонной кислоты, малеиновой кислоты, винной кислоты, фумаровой кислоты, лимонной кислоты или молочной кислоты; ион щелочного металла выбирают из иона лития, иона натрия, иона калия; ион щелочноземельного металла выбирают из иона кальция и иона магния; и органическое основание, которое дает физиологически приемлемые катионы, выбирают из метиламина, диметиламина, триметиламина, пиперидина, морфолина или трис(2-гидроксиэтил)амина.

17. Способ получения фенилатного производного по любому из пп.1-14 или его стереоизомера или его фармацевтически приемлемой соли:

для получения соединений формулы (I), причем согласно их структуре способ подразделяется на две стадии:

(а) 2-гидрокси-4-(2-бром-3-замещенный бензилокси)-Х-замещенный бензальдегид 1 как исходный материал вводят во взаимодействие с R₂-галогенидом в щелочной среде и получают содержащее альдегидную группу промежуточное соединение 2;

(b) содержащее альдегидную группу промежуточное соединение 2 как исходный материал конденсируют с содержащим аминогруппу или иминогруппу HR₃, полученный продукт восстанавливают и получают целевое соединение I;

причем каждый из R₁, R₂, R₃ и X имеет значения, указанные в любом из пп.1-14.

18. Фармацевтическая композиция для ингибирования активности передачи сигнала PD-1/PD-L1, отличающаяся тем, что она включает фенилатное производное по любому из пп.1-16 или его стереоизомер или фармацевтически приемлемую соль в качестве активного ингредиента и один или несколько фармацевтически приемлемых носителей или эксципиентов,

где содержание соединения по любому из пп.1-16 или его стереоизомера или его фармацевтически приемлемой соли в фармацевтической композиции составляет от 0,1 до 95 мас.%.

19. Применение фенилатного производного по любому из пп.1-16 или его стереоизомера или его фармацевтически приемлемой соли при изготовлении лекарственного средства для ингибирования активности передачи сигнала PD-1/PD-L1.