Способ получения аттенуированного бесплазмидного штамма f.tularensis 15 cmsa, синтезирующего микобактериальный антиген супероксиддисмутазу а

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ получения штамма. Штамм получают из вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ путем аллельного обмена одной из двух копий гена iglC на рекомбинантный оперон, состоящий из промоторной области groE оперона F. tularensis, лидерной последовательности fopL гена fopA F. tularensis и структурной части модифицированного гена sodA М. tuberculosis. Изобретение позволяет получать аттенуированный штамм F. tularensis, синтезирующий микобактериальный антиген супероксиддисмутазу А. для изучения перспектив использования штамма при разработке живой комбинированной туберкулезно-туляремийной вакцины. 15 ил., 1 табл., 10 пр.

 

Изобретение относится к области медицины и ветеринарии и может найти применение при создании препаратов микробиологического происхождения для профилактики туберкулеза и туляремии в здравоохранении.

В настоящее время в мире от туберкулеза, несмотря на широкомасштабные плановые иммунизации, ежегодно умирает около 3 млн. человек. Это свидетельствует о недостаточной эффективности коммерческой живой вакцины, получаемой на основе штамма Mycobacterium bovis BCG. Новые подходы для создания высокоэффективных вакцин включают конструирование вакцинных штаммов на основе бактериальных штаммов и вирусных векторов, кодирующих иммунодоминантные белки микобактерий, разработку ДНК-вакцин и химических вакцин.

Одним из иммунодоминантных микобактериальных белков является фермент Fe/Mn супероксиддисмутаза A (Fe/Mn SOD А, ЕС 1.15.1.1), секретируемая во внеклеточную среду, состоящая из четырех субъединиц с молекулярной массой 23 кДа и pI 6.0 [Zhanget al., 1991].

Этот белок способен стимулировать протективный клеточный иммунитет и обладает протективной активностью на модели экпериментального туберкулеза морских свинок. Иммунизация, отдельно или в сочетании с другими мажорными внеклеточными белками М. tuberculosis, вызывает существенный защитный иммунитет против аэрозольного заражения вирулентными бактериями М. tuberculosis на высокочувствительной модели туберкулеза легких с использованием морских свинок [Kheraet al., 2005].

Известно, что вакцинный штамм F. tularensis 15 НИИЭГ, полученный в 40-х годах прошлого столетия в России и применяемый на территории стран бывшего СССР, [Олсуфьев и др., 1960], способен активировать иммунную систему макроорганизма и долговременно защищать его не только от туляремийной инфекции, но и формировать неспецифическую защиту от возбудителей листериоза и легионеллеза [Belyi et al., 1996].

Создание рекомбинантных штаммов на основе вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ, экспрессирующих протективные антигены микобактерий, дает возможность изучить перспективность создания эффективных комбинированных противотуберкулезных и противотуляремийных рекомбинантных вакцин [Кравченко и др., 2007].

Технический результат изобретения заключается в разработке метода получения аттенуированного бесплазмидного штамма F. tularensis 15 CMSA, синтезирующего микобактериальный антиген супероксиддисмутазу А. Штамм может быть использован для создания перспективных прототипов рекомбинантных вакцинных штаммов, формирующих специфическую эффективную защиту от внутриклеточных паразитов.

Технический результат изобретения достигается тем, что создан суицидный плазмидный вектор pBCS, позволяющий создавать рекомбинантные опероны генов, кодирующих целевые антигены, локализованные внутри области встраивания в нуклеотидной последовательности хромосомы F. tularensis.

Суицидная плазмида pS51/ΔiglC с рекомбинантным опероном, состоящим из промоторной области groE оперона F. tularensis, лидерной последовательности fopL гeнa fop AF. tularensis и структурной части модифицированного гена sodA М. tuberculosis, фланкированным нуклеотидными последовательностями генома F. tularensis, примыкающими к структурной части гена iglC, позволяет заместить одну копию гена iglC в хромосоме F. tularensisna рекомбинантный оперон groE-fopL-sodA, кодирующий гибридный рекомбинантный белок rFopL-SodA.

Способ создания штамма F. tularensis 15 CMSA заключается в использовании созданного in vitro рекомбинантного фрагмента ДНК, состоящего из промоторной области groE оперона F. tularensis, лидерной последовательности fopL гeнa fop AF. tularensis и структурной части модифицированного гена sodA М. tuberculosis, фланкированного нуклеотидными последовательностями генома F. tularensis, примыкающими к структурной части гена iglC, для проведения алелльного обмена гомологичного нативного фрагмента хромосомы вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ на рекомбинантный фрагмент ДНК.

Отличием предлагаемого способа от ранее применявшегося способа аллельного обмена в геноме F. tularensis является включение в нуклеотидную последовательность ДНК F. tularensis рекомбинантных гетерогенных оперонов, функционально активных в туляремийном микробе, и замена векторов pPV2 и pGM5 на вектор pBCS, сконструированный нами на основе плазмиды pBlueScriptIIKS/SK(+) с введенным в нее геном sacB и геном cat из плазмиды Sa.

В результате был получен аттенуированный бесплазмидный штамм F. tularensis 15 CMSA, синтезирующий ферментативно не активный микобактериальный белок Sod А.

Разработанный способ позволяет создавать аттенуированные бесплазмидные штаммы F. tularensis без дополнительных генов антибиотикоусточивости, синтезирующие гетерогенные протективные антигены, что открывает широкие возможности использования аттенуированных штаммов F. tularensis для создания перспективных эффективных рекомбинантных вакцин для защиты организмов человека и животных от возбудителей внутриклеточных инфекций.

Основные свойства штамма F. tularensis 15 CMSA.

Культурально-морфологические.

Бактерии штамма F. tularensis 15 CMSA представляют собой мелкие кокковидные и палочковидные клетки размерами 0,2-0,7 мкм, неподвижные, грамотрицательные, полиморфные, спор и капсул не образующие. Аэробы, не растут на простых средах без дрожжевого экстракта, ауксотрофы, культивируются при температурах от 15°С до 42°С в полноценных средах с глюкозой и повышенной концентрацией цистеина. Оптимальная температура выращивания 37°С, рН 7,0-7,5.

Среда для культивирования штамма F. tularensis 15 СМ8А:культивируется на плотной питательной среда FT-агар (ФБУН ГНЦ ПМБ, Оболенск); плотной питательной среде на основе эритрит-агара с добавлением высушенной крови крупного рогатого скота (ФБУН ГНЦ ПМБ, Оболенск), и жидкой питательной среде: (состав среды на 1 л) 5 г ферментативного гидролизата казеина, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г хлористого натрия, 12 г однозамещенного фосфата калия, рН7,2, 1% глюкоза, 10 мг цистеина, 10 мг хлористого железа [Лапин и др., 2009]. На FT-агаре при температуре 37°С колонии появляются через 48 ч. На плотной среде на основе эритрит-агара за 72 ч образуются колонии диаметром 2,0-2,5 мм, выпуклые, блестящие, гладкие, голубовато-белые, непрозрачные, однородные.

Стабильность. При пересевах на плотных питательных средах штамм F. tularensis 15 CMSA стабилен и не диссоциирует.

Биохимические свойства Клетки штамма F. tularensis 15 CMSA утилизируют цистеин с образованием сероводорода, на среде Даунса ферментируют глюкозу и мальтозу, не ферментируют глицерин, сахарозу и лактозу. Устойчивы к эритромицину, полимиксину, пенициллину, ампициллину, чувствительны к стрептомицину, тетрациклину, доксициклину, гентамицину, канамицину, налидиксовой кислоте, не обладают цитру ллинуреидазн ой и фосфатазной активностью.

Условия хранения культуры штамма: культура штамма F. tularensis 15 CMSA хранится при температуре +4°С на косяках среды FT-агара до 1 месяца.

Способ хранения штамма F. tularensis 15 CMSA: в 40%-ной сахарозо-желатиновой защитной среде в лиофильном состоянии, хранение при температуре (4-8)°С, рекомендуемая перезакладка через 5 лет.

Технологические особенности при культивировании. Технологических особенностей при культивировании штамма F. tularensis 15 CMSA в сравнении с вакциным штаммом F. tularensis 15 НИИЭГ нет.

Изобретение иллюстрируется следующими фигурами.

Фиг. 1 - Нуклеотидные последовательности нативного гена sodAM. tuberculosis (А), модифицированного гена sodATA (Б) и фрагмента плазмиды pPMC1 с промоторной областью гена groE(B).

Фиг. 2 - Схема структуры плазмиды pFSC24.

Фиг. 3 -Схема структуры плазмиды pFSC51.

Фиг. 4 - Схема суицидного вектора pBCS.

Фиг. 5 -Схема суицидной плазмиды pS51/ΔiglC.

Фиг. 6 - Электрофореграмма продуктов ПЦР, полученных на ДНК-матрице мутантных вариантов F. tularensis15 CMSA.

Фиг. 7. - Электрофореграмма (10% ПААГ) индукции синтеза рекомбинатного белка rSodA в клетках штамма Е. coli pET23b(+)SodA в присутствии индуктора ИПТГ.

Фиг. 8. - Электрофореграмма ренатурированного рекомбинантного белка rSodA.

Фиг.9. - Электрофореграмма (А) и иммуноблот (Б) нативного и рекомбинантного белков rSodA с кроличьей поликлональной антисывороткой к рекомбинантному белку rSodA.

Фиг. 10. - Зимограмма нативного и рекомбинантного белков rSodA.

Фиг. 11. - Иммуноблоттинг лизатов рекомбинантных клонов штамма F. tularensis FSC24 с кроличьей моноспецифической поликлональной сывороткой к рекомбинантному белку rSodA.

Фиг. 12. - Иммуноблоттинг лизатов рекомбинантных клонов F. tularensis FSC24 и FSC51 с кроличьей моноспецифической поликлональной сывороткой к рекомбинантному белку rSodA.

Фиг. 13. - Иммуноблоттинг лизатов рекомбинантных клонов F. tularensis 15 CMSA после пассирования в организме белых мышей с кроличьей моноспецифической поликлональной сывороткой к рекомбинантному белку rSodA.

Фиг. 14. - Анализ ферментативной активности клонированного белка SodAe рекомбинантных клонах F. tularensis 15 CMSA.

Фиг. 15. - Иммуноблоттинг лизатов рекомбинантных клонов F. tularensis 15 CMSA после пассирования в организме белых мышей с кроличьей моноспецифической поликлональной сывороткой к рекомбинантному белку rSodA.

Пример 1. Конструирование модифицированного гена sodA24, полученного путем введения в исходный ген sodAM. tuberculosis дополнительных нуклеотидов и замены ряда нуклеотидов, приводящих к адаптации экспрессии гетерологичного гена в клетках туляремийного микроба.

В клонированный ген sodAM. tuberculosis (нуклеотидная последовательность гена soda (NCBIGenBank:AL123456.3 _gene_4033) [locus_tag=Rv3846] [location=4320704..4321327] для создания сайта узнавания для рестриктазы BglII были добавлены нуклеотиды AGATCT. В итоге произошла замена кодона аминокислоты Ala в положении 52 в нативном гене sodA на два кодона для аминокислот Arg и Ser. Кроме этого, в концевой части нативного гена sodA были заменены кодоны, редко встречающиеся в матричных РНК F. tularensis. Такая замена привела к появлению сайта PstI в рекомбинантном гене sodA в положении 504 (Фиг. 1, А).

Методом ПЦР с помощью праймеров Sod-Left/F и BglII-Left/R был синтезирован ампликон с левой структурной частью гена sodA; с помощью пары праймеров BglII-Right/F и Sod-Right-Pst/R был синтезирован ампликон с центральной частью гена sodA, и с помощью пары праймеров Sod-Right-Pst/F и Sod-Right/R был синтезирован ампликон с правой структурной частью гена sodA (Фиг. 1, Б). Во всех случаях в качестве матрицы использовали ДНК М. tuberculosis H37Rv.

После объединения этих трех ампликонов по сайтам BglII и PstI был получен фрагмент ДНК размером 627 н.п., кодирующий модифицированный ген sodA24, содержащий сайты распознавания для рестриктаз BglII и PstI, фланкированный сайтами распознавания для рестриктаз NdeI и BamHI.

Методом ПЦР с помощью пары праймеров Xpr/F и Ppr/R1 был синтезирован ампликон pro, содержащий промоторную область гена groEF. tularensis (Фиг. 1, В). В качестве матрицы использовали ДНК плазмиды pPMC1 [Кравченко и др., 2007].

Полученные фрагменты ДНК были объединены по сайту NdeI, что привело к появлению фрагмента ДНК размером 974 н.п.с модифицированным опероном sodA2A. Созданный оперон был встроен в векторную плазмиду pPMC1 между сайтами XhoI и BamHI. В результате была получена плазмида pFSC24 размером 5845 н.п. (Фиг. 2), которая методом трансформации была перенесена в клетки вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ. Селекцию плазмидосодержащих клонов проводили на среде с хлорамфениколом 3 мкг/мл. Таким способом был получен штамм F. tularensis FSC24.

Пример 2. Создание рекомбинантного гена sodA51, состоящего из лидерной последовательности гена fopA F. tularensi и структурной части модифицированного гена sodA24M. tuberculosis.

Для секреции продукта модифицированного гена sodA24 в периплазматическое пространство туляремийного микроба был создан рекомбинантный ген sodA51, состоящий из лидерной последовательности FopA-L гена fopA F. tularensis и структурной части модифицированного гена sodA24 М. tuberculosis.

Методом ПЦР с помощью праймеров Xpr/F и Ppr/R1 был синтезирован ампликон с промоторной областью groE оперона F. tularensis. В качестве матрицы использовали ДНК плазмиды pPMC1 (Фиг. 1, В).

С помощью пары праймеров Eco47III-FopA-L/F и NdeI-FopA-L/R был синтезирован ампликон FopA-L. В качестве матрицы использовали ДНК штамма F. tularensis 15 НИИЭГ (Фиг. 1, Г).

С помощью пары праймеров Sod-Right/F и Sod-Left/R был синтезирован ампликон со структурной частью модифицированного гена sodATA. В качестве матрицы использовали ДНК плазмиды pFSC24 (Фиг. 2).

После объединения этих трех фрагментов по сайтам рестрикции NdeI и Eco47III был получен фрагмент ДНК размером 1061 н.п., кодирующий рекомбинантный оперон sodA51, фланкированный сайтами для рестриктаз XhoI и BamHI.

Созданный оперон был встроен в векторную плазмиду pPMC1 между сайтами XhoI и BamHI. В результате была получена плазмида pFSC51, которая методом криотрансформации была перенесена в клетки вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ. Селекцию плазмидосодержащих клонов проводили на среде с хлорамфениколом 3 мкг/мл. Таким способом был получен штамм F. tularensis FSC51 (Фиг. 3).

Пример 3. Создание суицидного вектора для алелльного обмена

Методом ПЦР с помощью праймеров cat/Fcl и cat/Rcl был синтезирован ампликон cat с геном cat плазмиды рС194. В качестве матрицы использовали ДНК плазмиды pPMC1.

С помощью пары праймеров sacB/F и sacB/R был синтезирован ампликон sacB с геном sacB из В. subtilis. В качестве матрицы использовали ДНК плазмиды pPV [Golovliov et al., 2003].

После объединения этих ампликонов по сайтам SalI и XhoI был получен фрагмент ДНК размером 2779 н.п., фланкированный сайтами распознавания для рестриктаз BglII и BamHI.

Созданный фрагмент ДНК был встроен в векторную плазмиду pBlueScriptIIKS/SK(+) по сайту BamHI. В результате был получен суицидный вектор pBCS размером 5740 п.н., который методом электропорации был перенесен в клетки Е. coli DH5α. Селекцию плазмидосодержащих клонов проводили на среде с хлорамфениколом 10 мкг/мл. Функциональную активность гена sacB проверяли по отсутствию роста бактерий на среде с 5% сахарозой. Таким способом был получен штамм E.coli BCS, несущий суицидный вектор pBCS (Фиг. 4).

Пример 4. Создание фрагмента ДНК, содержащего рекомбинантный оперон sodA5 (groE-fopA-sodA), фланкированный нуклеотидными последовательностями генома F. tularensis, примыкающими к структурной части гена iglC.

Методом ПЦР с помощью праймеров 23 Sal-Left/F и Xhol-Left/R был синтезирован ампликон SL размером 1583 н.п. с фрагментом генома F. tularensis, расположенным слева от гена iglC; с помощью пары праймеров 23 Bam-Right/F и Sal I-Right/R был синтезирован ампликон SR размером 1565 н.п с фрагментом генома F. tularensis, расположенным справа от гена iglC. Во всех случаях в качестве матрицы использовали ДНК штамма F. tularensis 15 НИИЭГ. Из плазмиды pFSC51 с помощью рестриктаз XhoI и BamHI был выделен фрагмент с рекомбинантным опероном sodA51.

После объединения этих трех фрагментов по сайтам XhoI и BamHI был получен фрагмент ДНК размером 4209 н.п., содержащий рекомбинантный оперон sodASX, встроенный в участок генома F. tularensis вместо гена iglC и фланкированный сайтами распознавания рестриктазы Sail (Фиг. 5).Созданный фрагмент ДНК был встроен в плазмиду pBCS в сайт SaiI полилинкера. В результате была получена суицидная плазмида pS51/Δigl С размером 9949 п.н., которая методом трансформации была перенесена в клетки Е. coli DH5α. Селекцию плазмидосодержащих клонов проводили на среде с хлорамфениколом 10 мкг/мл. Функциональную активность гена sacB проверяли по отсутствию роста на среде с 5% сахарозой. Далее полученные клоны анализировали в полимеразной цепной реакции с двумя парами праймеров Xpr/F и Sod-Left на наличие модифицированного оперона sodA51, с парами праймеров 23 Sal-Left/F и 23 XhoILeft /R, 23 Bam-Right/F и 23 Sall-Right/RHa наличие фрагментов хромосомы F. tularensis, фланкирующих модифицированный оперон.

Таким способом был получен штамм Е. coli S51/ΔiglC, несущий суицидную плазмиду pS51/ΔiglC (Фиг. 5).

Пример 5. Интеграция модифицированного оперона sodA51 в хромосому F. tularensis 15 НИИЭГ.

Препарат ДНК суицидной плазмиды pS51/ΔiglC был выделен из клеток Е. coli S51/ΔiglC и использован для плазмидной электропорации клеток F. tularensis 15 НИИЭГ. Трансформанты с интегрированной плазмидой отбирали на плотной питательной среде FT-агар, в качестве селективного агента использовали хлорамфеникол 3 мкг/мл. Через 120 ч инкубации при температуре 37°С отобранные клоны были проверены в ПЦР с четырьмя вариациями четырех праймеров: 5'SalI 2.5 F/3'SODLeftR; 5' SODLeftF/3' SalI 2.5R; 5' SODLeftF/3' SalI 2.5R и 5'SalI 2.5 F/3'SODLeftR (Фиг. 5).

По данным анализа были отобраны четыре клона, содержащих суицидную плазмиду pS51/ΔiglC, два из которых были интегрированы по левому «плечу» от гена iglC и два клона - по правому «плечу» от гена iglC (Фиг. 6).Для дальнейшей селекции бактерий, в которых произошел аллельный обмен гена iglC на модифицированный ген sodA51, клоны были высеяны на плотную питательную среду на основе эритрит-агара с черным альбумином с 5% сахарозы. Выросшие изолированные клоны проверяли на наличие фенотипа Cm^S (проверено 140 клонов) и отсутствие гена cat методом ПЦР с праймерами Cat/Fcl и Cat/Rcl (Фиг. 4).

Проверка в полимеразной цепной реакции с помощью праймеров Xpr/F и Sod-Left/R (Фиг. 6) показала наличие модифицированного гена sodA51, встроенного в хромосому штамма F. tularensis 15 НИИЭГ. Таким образом был получен штамм F. tularensis 15 CMSA. После культивирования штамма в жидкой питательной среде в течение 18 ч при температуре 37°С бактерии были высеяны на FT-агар до изолированных колоний. ПЦР-анализ 28 выросших клонов с праймерами Xpr/F и Sod-Left/R дал положительные результаты.

Пример 6. Получение сыворотки, специфической к rSodA белку туберкулезного микроба.

Для получения рекомбинантного белка SodA был создан штамм-продуцент Е. coli с использованием плазмидного вектора pET23b(+)(Novagen, USA).

6.1. Клонирование гена sodA в экспрессирующем векторе в клетках Е. coli

Структурная часть гена sodA была получена ПЦР-амплификацией с использованием матричной ДНК штамма М. tuberculosis H37Rv и пары праймеров SA/F и SA/R, рассчитанных на основе известной нуклеотидной последовательности генома М. tuberculosis H37Rv. Праймер SA/F на 5'-конце содержал сайт рестрикции для фермента BamHI - а праймер SA/R на 5'-конце содержал сайт рестрикции для фермента EcoRI -

Ампликон был обработан рестриктазами BamHI и EcoRI и встроен в плазмиду pET23b(+) между сайтами BamHI и EcoRI. Полученную рекомбинантную плазмиду pET23b(+)SodA трансформировали в клетки Е. coli BL21. Селективный отбор плазмидосодержащих клонов Е. coli проводили на среде LA с добавлением ампициллина до 100 мкг/мл. Среди трансформантов методом ПЦР с помощью праймеров SA/F и SA/R был отобран клон Е. coli BL21(pET23b(+)SodA). При клонировании гена белка rSodA в вектор pET23b в результате генно-инженерных манипуляций со стороны N-концевой части белка появляются дополнительно 14 аминокислот, а в С-концевой части белка появляется последовательность из 13 дополнительных аминокислот и шести гистидинов, позволяющих проводить выделение белка с помощью аффинной хроматографии. В таблице 1 приведены расчетные параметры нативного и рекомбинантного белков rSodA.

Появление в гене рекомбинантного белка rSodA дополнительных аминокислотных последовательностей привело к увеличению молекулярной массы рекомбинантного белка rSodA с 23,0 кДа до 26,5 кДа.

Полученный рекомбинантный штамм Е. coli BL21(pET23b(+)SodA) синтезировал рекомбинантный белок rSodA с кажущейся молекулярной массой 27,6 кДа, близкой к расчетной (таблица 1), уровень которого увеличивался при добавлении индуктора изопропил-бета-D-галактопиранозида (ИПТГ) (Фиг. 7). Кажущиеся молекулярные массы белков рассчитывали по электрофореграмме с помощью программы CaptMW.

6.2. Выделение и очистка рекомбинантного белка rSodA

Бактериальную массу клеток штамма Е. coli BL21(pET23b(+)SodA получали согласно инструкции производителя (Novagen, USA). Индукцию синтеза белка проводили в течение 2,5 ч при температуре 37°С и концентрации 2 мМ ИПТГ. Основная часть целевого белка находилась в составе телец включения. Отмытые тельца включения растворяли в присутствии 8 М мочевины и 6 М хлорида гуанидина на ледяной бане при перемешивании в течение 1-2 ч. Нерастворимые компоненты отделяли центрифугированием при 23 000 об/мин в течение 1 ч. Супернатант пропускали через мембранный фильтр с диаметром пор 0,22 мкм и наносили на колонку с 2 мл Ni²⁺-хелатирующей сефарозы (Pharmacia Biotech, Швеция), уравновешенной буфером для связывания с 8 М мочевины. Затем белок с колонки элюировали буфером для элюции с градиентом концентрациями имидазола 0,02-0,5 М. Рекомбинантный белок rSodA слабо связывался с сорбентом и элюировался при концентрации имидазола 0,06 М. Ренатурацию элюированного рекомбинантного белка rSodA проводили диализом против 20 мМ натрий-фосфатного буфера рН 7,2. Электрофореграмма ренатурированного рекомбинантного белка rSodA приведена на Фиг. 8.

Согласно приведенным данным, чистота очищенного препарата белка rSodA составила не менее 90%.

6.3.Получение кроличьей поликлональной антисыворотки к рекомбинантному белку rSodA

Кролик массой 2 кг был трехкратно иммунизирован возрастающим количеством препарата ренатурированного рекомбинантного белка rSodA в дозах 150, 200 и 250 мкг/животное с интервалом 14 дней в присутствии сначала полного, затем неполного адьюванта Фрейнда в соотношении 1:1. Препарат вводили подкожно в несколько точек в области спины и через 7 дней после последней иммунизации кровь отбирали из краевой ушной вены. Титр специфических антител к белку rSodA определяли ИФА с препаратом очищенного белка SodA в качестве адсорбированного антигена. Гомологичность нативного и клонированного белков SodAn специфичность антител в антисыворотке оценивали иммуноблоттингом (Фиг. 9).После ренатурации ферментативная активность у очищенного рекомбинантного белка rSodA, оцениваемая методом [Edwards et al., 2001] отсутствовала (Фиг. 10, линия 2), в отличие от нативного белка SodA в составе клеточного ультразвукового дезинтеграта микобактерий (Фиг. 10, линия 1).

Пример 7. Экспрессия рекомбинантного гена sodA24 в составе плазмиды в бактериальных клетках F. tularensis FSC24

Экспрессию рекомбинантного гена sodA24 М. tuberculosis в клетках штамма туляремийного микроба оценивали иммуноблоттингом с кроличьей поликлональной антисывороткой к рекомбинантному белку rSodA (Фиг. 11).Все отобранные клоны, несущие рекомбинатную плазмиду с геном химерного белка FopL-SodA, экспрессировали ген, кодирующий белок, реагирующий с кроличьей моноспецифической поликлональной сывороткой к белку rSodA. Продукт модифицированного гена sodA24 не обладал ферментативной активностью в реакции с тетразолиевым синим.

Пример 8. Экспрессия рекомбинантного оперона sodA51 в составе плазмиды в бактериальных клетках штамма F. tularensis FSC51

Мутантные клоны были проверены в иммуноблоте с кроличьей моноспецифической поликлональной сывороткой к рекомбинантному белку rSodA, в результате чего был отобран один клон F. tularensis FSC51 (Фиг. 12), экспрессирующий рекомбинантный оперо sodA51, синтезирующий химерный белок в составе плазмиды на уровне, существенно превышающем уровень синтеза штаммом F. tularensis FSC24.

Все случайно отобранные клоны, несущие рекомбинантный оперон sodA51 с геном химерного белка FopL-SodA в составе плазмиды в клетках штамма F. tularensis FSC51, экспрессировали ген и синтезировали иммунологически активный белок, реагирующий с кроличьей моноспецифической поликлональной сывороткой к белку rSodA.

Пример 9. Экспрессия рекомбинантного оперона sodA51, встроенного в хромосому клеток штамма F. tularensis 15 CMSA

Четыри мутантных клона были проверены иммуноблоттингом с кроличьей моноспецифической поликлональной сывороткой к рекомбинантному белку rSodA. В качестве отрицательного контроля был использован лизат реципиентного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ. В качестве положительного контроля - рекомбинантный белок rSodA М. tuberculosis, выделенный из штамма Е. coli BL21(pET23b(+)SodA) (Фиг. 13).

Все отобранные клоны, несущие рекомбинантный оперон sodA51 с геном химерного белка FopL-SodA в составе хромосомы в клетках штамма F. tularensis 15 CMSA, экспрессировали ген и синтезировали иммунологически активный белок, реагирующий с кроличьей моноспецифической поликлональной сывороткой к белку rSodA.

Клоны F. tularensis 15 CMSA№№ 1-3 были проверены на наличие ферментативной активности клонированного белка SodA [Edwards et al., 2001]. В качестве отрицательного контроля использовали соответствующее количество лизата реципиентного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ. В качестве положительного контроля использовали ультразвуковой лизат штамма H37Rv М. tuberculosis (Фиг. 14). Показано, что клонированный белок SodA в проверенных рекомбинантных клонах F. tularensis 15 CMSA ферментативной активностью не обладает.

Пример 10. Оценка приживаемости и стабильности штамма F. tularensis 15 CMSA

Штамм F. tularensis 15 CMSA пассировали в организмах беспородных белых мышей (доза введения культур - 1×10³ КОЕ/мышь подкожно). Через 6 суток животные были умерщвлены, селезенки изъяты и гомогенизированы в 5 мл ЗФР, (рН 7,6), полученные суспензии органов титровали до 7 разведения с шагом 1:10 и из разведений высевали по 0,1 мл на плотную питательную среду с добавлением полимиксина 100 мкг/мл. По результатам высевов оказалось, что средняя обсемененность селезенок животных составила 3,2×10⁶ КОЕ/на орган.

11 случайно отобранных изолированных клонов, полученных из селезенок инфицированных мышей, были проверены иммуноблоттингом с кроличьей моноспецифической поликлональной сывороткой к рекомбинантному белку rSodA (Фиг. 15).В результате было показано, что все 11 клонов сохранили способность синтезировать белок rSodA.

Источники информации, использованные при экспертизе:

1. Кравченко Т.Б., Платонов М.Е., Вахрамеева Г.М., Баннов В.А., Кудрявцева Т.Ю., Мокриев Mycobacterium tuberculosis AG85BH ESAT-6 в клетках Francisella tularensis 15/10. // Биохимия - 2007. - том 72, вып. 7, с. 905-914.

2. Лапин А.А., Павлов В.М., Мокриевич среда для молекулярно-генетических исследований Francisella tularensis. // Пробл. особо опасных инф. - 2009. - V. 102. - N. 4. - P. 66-67.

3. Мокриевич А.Н., Комбарова Т.И., Павлов В.М., Бахтеева И.В., Титарева Г.М., Кравченко Т.Б., Миронова Р.И., Вахрамеева Г.М., Дятлов И.А. Патент 2013147130/10 от 20.01.2014 «Штамм Francisella tularensis 15/23-1Δrec со сниженной реактогенностью для создания живой туляремийной вакциныи способ его получения».

4. Олсуфьев Н.Г., Руднев Г.П. (под ред). Туляремия. Медицина, Москва; 1960. С. 460.

5. Павлов В.М., Дятлов И.А. Молекулярно-генетические исследования бактерий рода Francisella и их прикладное значение. - Москва, 2012. С. 267.

6. Belyi Y.F., Tartakovskii I.S., Mesheryakova I.S, Petrosov V.V, Prosorovskii S.V. Live tularemia vaccine confers protection against lethal Legionella and Listeria inf.-213.

7. Golovliov I., Sjostedt A., Mokrievich A., Pavlov V. A method for allel ections in experimental animals. // FEMS Immunol Med Microbiol. - 1996. - Vol. 13. - N. 3. - P. 211ic replacement in Francisella tularensis. // FEMS Microbiol. Lett. - 2003. - N. 222. - P. 273-280.

8. Edwards К.M., Cynamon M.H., Voladri R.K., Hager C.C., DeStefano M.S., Tham К.Т., Lakey D.L., Bochan M.R., Kernodle D.S. Iron-cofactored superoxide dismutase inhibits host responses to Mycobacterium tuberculosis // Am. J. Res. Crit. Care Med. - 2001. - Vol. 164. - N. 12. - P. 2213-2219.

9. Khera A., Singh R., Shakila H., Rao V., Dhar N., Narayanan P.R., Parmasivan C.N., Ramanathan V.D., Tyagi A.K. Elicitation of efficient, protective immune responses by using DNA vaccines against tuberculosis. // Vaccine - 2005 - V. 23 - P. 5655-5665.

10. Zhang Y., Lathigra R., Garbe Т., Catty D. and Young D. Genetic analysis of superoxide dismutase, the 23 kilodalton antigen of Mycobacterium tuberculosis. // Mol. Microbiol. - 1991. - V. 5. - P. 381-391.

--->

А. Нуклеотидная последовательность гена

sodA(NCBIGenBank:AL123456.3_gene_4033)[locus_tag=Rv3846]

[location=4320704..4321327]

1 GTGGCCGAATACACCTTGCCAGACCTGGACTGGGACTACGGAGCACTGGAACCGCACATC

61 TCGGGTCAGATCAACGAGCTTCACCACAGCAAGCACCACGCCACCTACGTAAAGGGCGCC

121 AATGACGCCGTCGCCAAACTCGAAGAGGCGCGCGCCAAGGAAGATCACTCAGCGATCTTG

181 CTGAACGAAAAGAATCTAGCTTTCAACCTCGCCGGCCACGTCAATCACACCATCTGGTGG

241 AAGAACCTGTCGCCTAACGGTGGTGACAAGCCCACCGGCGAACTCGCCGCAGCCATCGCC

301 GACGCGTTCGGTTCGTTCGACAAGTTCCGTGCGCAGTTCCACGCGGCCGCTACCACCGTG

361 CAGGGGTCGGGCTGGGCGGCACTGGGCTGGGACACACTCGGCAACAAGCTGCTGATATTC

421 CAGGTTTACGACCACCAGACGAACTTCCCGCTAGGCATTGTTCCGCTGCTGCTGCTCGAC

481 ATGTGGGAACACGCCTTCTACCTGCAGTACAAGAACGTCAAAGTCGACTTTGCCAAGGCG

541 TTTTGGAACGTCGTGAACTGGGCCGATGTGCAGTCACGGTATGCGGCCGCGACCTCGCAG

601 ACCAAGGGG TTGATATTCGG CTGA

Б. Нуклеотидная последовательность гена SodA24

Sod-Left/F АААCAT ATG GCT GAA TAC ACA TTG CCA GAC

Met Ala Glu Tyr Thr Leu Pro Asp Leu Asp Trp Asp Tyr Gly Ala Leu Glu

1 ATG GCT GAA TAC ACA TTG CCA GAC CTG GAC TGG GAC TAC GGA GCA CTG GAA

TAC CGA CTT ATG TGT AAC GGT CTG GAC CTG ACC CTG ATG CCT CGT GAC CTT

Pro His Ile Ser Gly Gln Ile Asn Glu Leu His His Ser Lys His His Ala

52 CCG CAC ATC TCG GGT CAG ATC AAC GAG CTT CAC CAC AGC AAG CAC CAC GCC

GGC GTG TAG AGC CCA GTC TAG TTG CTC GAA GTG GTG TCG TTC GTG GTG CGG

Thr Tyr Val Lys Gly Ala Asn Asp Ala Val Ala Lys Leu Glu Glu Ala Arg

103 ACC TAC GTA AAG GGC GCC AAT GAC GCC GTC GCC AAA CTC GAA GAG GCG CGC

TGG ATG CAT TTC CCG CGG TTA CTG CGG CAG CGG TTT GAG CTT CTC CGC GCG

BglII-Left /R 5’-TATTCTAGATCTGCGCGCCTCTTCGAGTTTGG-3’

BglII

~~~~~~~~

Arg Ser Lys Glu Asp His Ser Ala Ile Leu Leu Asn Glu Lys Asn Leu Ala

154 AGA TCT AAG GAA GAT CAC TCA GCG ATC TTG CTG AAC GAA AAG AAT CTA GCT

TCT AGA TTC CTT CTA GTG AGT CGC TAG AAC GAC TTG CTT TTC TTA GAT CGA

BglII-Right /F 5’-CGGTCTAGATCTAAGGAAGATCACTCAGCG-3’

Phe Asn Leu Ala Gly His Val Asn His Thr Ile Trp Trp Lys Asn Leu Ser

205 TTC AAC CTC GCC GGC CAC GTC AAT CAC ACC ATC TGG TGG AAA AAC CTG TCG

AAG TTG GAG CGG CCG GTG CAG TTA GTG TGG TAG ACC ACC TTT TTG GAC AGC

Pro Asn Gly Gly Asp Lys Pro Thr Gly Glu LeuAlaAlaAlaIleAla Asp

256 CCT AAC GGT GGT GAC AAG CCT ACT GGC GAA CTA GCT GCA GCT ATC GCT GAC

GGA TTG CCA CCA CTG TTC GGA TGA CCG CTT GAT CGA CGT CGA TAG CGA CTG

Ala Phe Gly Ser Phe Asp Lys Phe ArgAla Gln Phe His AlaAlaAla Thr

307 GCG TTC GGA AGC TTC GAC AAG TTC CGT GCG CAG TTC CAC GCG GCT GCT ACT

CGC AAG CCT TCG AAG CTG TTC AAG GCA CGC GTC AAG GTG CGC CGA CGA TGA

Thr Val Gln Gly Ser Gly Trp AlaAla Leu Gly Trp Asp Thr Leu Gly Asn

358 ACT GTG CAG GGA TCA GGC TGG GCG GCA CTG GGC TGG GAC ACA CTC GGC AAC

TGA CAC GTC CCT AGT CCG ACC CGC CGT GAC CCG ACC CTG TGT GAG CCG TTG

Lys Leu Leu Ile Phe Gln Val Tyr Asp His Gln Thr Asn Phe Pro Leu Gly

409 AAG CTG CTG ATA TTC CAG GTT TAC GAC CAC CAG ACG AAC TTC CCG CTA GGC

TTC GAC GAC TAT AAG GTC CAA ATG CTG GTG GTC TGC TTG AAG GGC GAT CCG

Ile Val Pro Leu Leu Leu Leu Asp Met Trp Glu His Ala Phe Tyr Leu Gln

Sod-Right-Pst/F ACCTGCAG TAC AAGAACGTC AAA GTC GAC

Pst I

------

460 ATT GTT CCG CTA CTA CTA CTA GAC ATG TGG GAA CAC GCT TTC TAC CTG CAG

TAA CAA GGC GAT GAT GAT GAT CTG TAC ACC CTT GTG CGA AAG ATG GAC GTC

Sod-Right-Pst/R GGCTGCAGGTAGAAAGCGTGTTCCCACATGTCTAGTAGTAGTAGCG

Tyr Lys Asn Val Lys Val Asp Phe Ala Lys Ala Phe Trp Asn Val Val Asn

511 TAC AAG AAC GTC AAA GTC GAC TTT GCC AAG GCG TTT TGG AAC GTC GTG AAC

ATG TTC TTG CAG TTT CAG CTG AAA CGG TTC CGC AAA ACC TTG CAG CAC TTG

TrpAla Asp Val Gln Ser Arg Tyr AlaAlaAla Thr Ser Gln Thr Lys Gly

562 TGG GCC GAT GTG CAG TCA CGT TAT GCG GCT GCG ACT TCT CAG ACT AAG GGA

ACC CGG CTA CAC GTC AGT GCA ATA CGC CGA CGC TGA AGA GTC TGA TTCCCT

Leu Ile Phe Gly ***

613 TTG ATA TTC GGC TAA

AAC TAT AAG CCG ATT

Sod-Right/RAAA GGA TCCTTA GCC GAA TAT CAA TCCСTT AG

В. Фрагмент нуклеотидной последовательности плазмидного вектора рРМС1 с

промоторной областью гена groE

XhoI

~~~~~~~~

NheI

~~~~~~~~

1 GCTAGCTCGAGAATAACTTAAGGGTAACTAGCCTCGCCGGCAATAGTTACC

CGA TCG AGC TCT TAT TGA ATT CCC ATT GAT CGG AGC GGC CGT TAT CAA TGG

52 CTT ATT ATC AAG ATA AGA AAG AAA AGG ATT TTT CGC TAC GCT CAA ATC CTT

GAA TAA TAG TTC TAT TCT TTC TTT TCC TAA AAA GCG ATG CGA GTT TAG GAA

103 TAA AAA AAC ACA AAA GAC CAC ATT TTT TAA TGT GGT CTT TAT TCT TCA ACT

ATT TTT TTG TGT TTT CTG GTG TAA AAA ATT ACA CCA GAA ATA AGA AGT TGA

154 AAA GCA CCC ATT AGT TCA ACA AAC GAA AAT TGG ATA AAG TGG GAT ATT TTT

TTT CGT GGG TAA TCA AGT TGT TTG CTT TTA ACC TAT TTC ACC CTA TAA AAA

205 AAA ATA TAT ATT TAT GTT ACA GTA ATA TTG ACT TTT AAA AAA GGA TTG ATT

TTT TAT ATA TAA ATA CAA TGT CAT TAT AAC TGA AAA TTT TTT CCT AAC TAA

256 CTA ATG AAG AAA GCA GAC AAG TAA GCC TCC TAA ATT CAC TTT AGA TAA AAA

GAT TAC TTC TTT CGT CTG TTC ATT CGG AGG ATT TAA GTG AAA TCT ATT TTT

307 TTT AGG AGG CAT ATC AAA TGA ACT TTA ATA AAA TTG ATT TAG ACA ATT GGA

AAA TCC TCC GTA TAG TTT ACT TGA AAT TAT TTT AAC TAA ATC TGT TAA CCT

358 AGA GAA AAG AGATAT TTA ATC ATT ATT TGA ACC AAC AAA CGA CTT TTA GTA

TCT CTT TTC TCT ATA AAT TAG TAA TAA ACT TGG TTG TTT GCT GAA AAT CAT

409 TAA CCA CAG AAA TTG ATA TTA GTG TTT TAT ACC GAA ACA TAA AAC AAG AAG

ATT GGT GTC TTT AAC TAT AAT CAC AAA ATA TGG CTT TGT ATT TTG TTC TTC

460 GAT ATA AAT TTT ACC CTG CAT TTA TTT TCT TAG TGA CAA GGG TGA TAA ACT

CTA TAT TTA AAA TGG GAC GTA AAT AAA AGA ATC ACT GTT CCC ACT ATT TGA

511 CAA ATA CAG CTT TTA GAA CTG GTT ACA ATA GCG ACG GAG AGT TAG GTT ATT

GTT TAT GTC GAA AAT CTT GAC CAA TGT TAT CGC TGC CTC TCA ATC CAA TAA

562 GGG ATA AGT TAG AGC CAC TTT ATA CAA TTT TTG ATG GTG TAT CTA AAA CAT

CCC TAT TCA ATC TCG GTG AAA TAT GTT AAA AAC TAC CAC ATA GAT TTT GTA

613 TCT CTG GTA TTT GGA CTC CTG TAA AGA ATG ACT TCA AAG AGT TTT ATG ATT

AGA GAC CAT AAA CCT GAG GAC ATT TCT TAC TGA AGT TTC TCA AAA TAC TAA

664 TAT ACC TTT CTG ATG TAG AGA AAT ATA ATG GTT CGG GGA AAT TGT TTC CCA

ATA TGG AAA GAC TAC ATC TCT TTA TAT TAC CAA GCC CCT TTA ACA AAG GGT

715 AAA CAC CTA TAC CTG AAA ATG CTT TTT CTC TTT CTA TTA TTC CAT GGA CTT

TTT GTG GAT ATG GAC TTT TAC GAA AAA GAG AAA GAT AAT AAG GTA CCT GAA

766 CAT TTA CTG GGT TTA ACT TAA ATA TCA ATA ATA ATA GTA ATT ACC TTC TAC

GTA AAT GAC CCA AAT TGA ATT TAT AGT TAT TAT TAT CAT TAA TGG AAG ATG

817 CCA TTA TTA CAG CAG GAA AAT TCA TTA ATA AAG GTA ATT CAA TAT ATT TAC

GGT AAT AAT GTC GTC CTT TTA AGT AAT TAT TTC CAT TAA GTT ATA TAA ATG

868 CGC TAT CTT TAC AGG TAC ATC ATT CTG TTT GTG ATG GTT ATC ATG CAG GAT

GCG ATA GAA ATG TCC ATG TAG TAA GAC AAA CAC TAC CAA TAG TAC GTC CTA

Xpr/F- AGA TAG GCC TAA TGA CTG G

919 TGT TTA TGA ACT CTA TTC AGG AAT TGT CAG ATA GGC CTA ATG ACT GGCTTT

ACA AAT ACT TGA GAT AAG TCC TTA ACA GTC TAT CCGGAT TAC TGA CCG AAA

XhoI

~~~~~~~~

970 TAT AAT ATG AGA TAA TGC CGA CTG TAC TTT CTC GAG TGT ATG GAT TAG TCG

ATA TTA TAC TCT ATT ACG GCT GAC ATG AAA GAG CTC ACA TAC CTA ATC AGC

HindIII

~~~~~~~~

1021 AGC TAA AAA GCT CAT ATT TTT TAT ATT CAA ACT ATA TCC CTT CAA GCT TTG

TCG ATT TTT CGA GTA TAA AAA ATA TAA GTT TGA TAT AGG GAA GTT CGA AAC

1072 AAA AAT AAA CTT AAT TAT TAT ATA TGT TAT TTA GCT AGT TTT TTT AAT TAA

TTT TTA TTT GAA TTA ATA ATA TAT ACA ATA AAT CGA TCA AAA AAA TTA ATT

-35 signal groES

~~~~~~~~

1123 AGT TAA AAT CGA GAG CTT GTT TGA CAA AAA AAC AAA AAA ATT TCT TGA AAA

TCA ATT TTA GCT CTC GAA CAA ACT GTT TTT TTG TTT TTT TAA AGA ACT TTT

-10 signal groES

~~~~~~~~

XbaI

~~~~~~~~

1174 TTT TTT TTT TGA CTC AAT ATC TAG ACT TGC AAG AGC TTG GAA CTT TGA

GATAAA AAA AAA ACT GAG TTA TAG ATC TGA ACG TTC TCG AAC CTT GAA ACT

CTA

1225 TGT TCT AAG ATG CAT ACA AAT TCA AAA TGC TTA AAC AAA AAT AAT TTA ACA

ACA AGA TTC TAC GTA TGT TTA AGT TTT ACG AAT TTG TTT TTA TTA AAT TGT

SD groES-overlappon

~~~~~ ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~

1276 AAG GAG TAA GAT TGT TAT GAA CAT TCG TCC ATT ACA AGA TAG AGT ATT AGT

TTC CTC ATT CTA ACA ATA CTT GTA AGC AGG TAA TGT TCT ATC TCA TAA TCA

groES-overlappon

~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~

SD(inner)

~~~~~

TCG TCG TGC AGA AGG AGA AAA ATG ATG

AGC AGC ACG TCT TCC TCT TTT TACTAC

PprR1- AAA CAT ATGA TTT TCT CCT TCT GCA CGA C

<---

Способ получения из вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ аттенуированного бесплазмидного штамма F. tularensis 15 CMSA, синтезирующего микобактериальный антиген супероксиддисмутазу А, заключается в аллельном обмене одной из двух копий гена iglC в хромосоме F. tularensis 15 НИИЭГ на находящийся в суицидном плазмидном векторе pBCS рекомбинантный фрагмент ДНК, состоящий из фрагмента генома F. tularensis, расположенного слева от гена iglC, промоторной области groE оперона F. tularensis, лидерной последовательности fopL гена fopA F. tularensis , структурной части модифицированного гена sodA М. tuberculosis, кодирующего ферментативно неактивный белок SOD A М. tuberculosis, и фрагмента генома F. tularensis, расположенного справа от гена iglC, причем модификация гена sodA проведена путем введения дополнительных нуклеотидов AGATCT, приводящая к замене кодона аминокислоты Ala в положении 52 в нативном гене soda на два кодона для аминокислот Arg и Ser, а в концевой части гена sodA были заменены кодоны, редко встречающиеся в матричных РНК F. tularensis, что привело к появлению сайта PstI в рекомбинантном гене sodA в положении 504.