Использование cagfbfp в качестве флуоресцентной метки

Настоящее изобретение относится к области биотехнологий, конкретно к флуоресцентному белку. Изобретение позволяет получить новый флуоресцентный белок, который содержит LOV-домен и в котором как минимум один цистеин заменен на аминокислоту, которая не связывается ему ковалентно с флавином при освещении. Изобретение может быть использовано в качестве флуоресцентной метки с целью изучения взаимодействия между белками, фолдинга и локализации белков. 2 н.п. ф-лы. 3 ил., 3 табл., 1 пр.

 

Описание изобретения:

Термин "хромофор" обозначает группу атомов, которая обуславливает цвет химического соединения.

Термин "флуоресценция" означает явление, при котором происходит излучение света веществом, поглотившее свет или другое электромагнитное излучение.

Термин "флуорофор" обозначает молекулу, которая способна к флуоресценции.

Термин "спектр излучения" - зависимость интенсивности испускания от длины волны при фиксированной длине возбуждающего света.

Термин "максимум излучения" - длина волны, при которой интенсивность испускания максимальна в случае конкретной возбуждающей длины волны.

Термин "спектр возбуждения" - зависимость интенсивности излучения (при определенной длине волны) в зависимости от длины волны возбуждения.

Термин "максимум возбуждения" - длина волны возбуждения, при которой интенсивность излучения (на конкретной длине волны) максимальна.

Термин "квантовый выход" - отношение количества испускаемых и поглощенных в результате флуоресценции фотонов.

Термин "молярный коэффициент экстинкции" - коэффициент, определяемый законом Бугера-Ламберта-Бера, измеряется в моль^-1 * см^-1.

Термин "видимый свет" - электромагнитные волны, длина волны которых находится в промежутке 380 нм. - 780 нм.

Термин "яркость флуоресценции белка" - произведения молярного коэффициента экстинкции и квантового выхода, деленное на 1000.

Термин "аминокислотная последовательность" представляет собой порядок чередования аминокислотных остатков в белке.

Под термином "нуклеиновая кислота" стоит понимать одноцепочечную или двуцепочечную молекулу, которая состоит из нуклеотидов. Наиболее распространенная нуклеиновая кислота - дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) и комплементарная ей дезоксирибонуклеиновая кислота (кДНК), к ним также относится и рибонуклеиновая кислота (РНК). ДНК состоит из азотистых оснований аденин (А), гуанин (G), цитозин (С), тимин (Т). Молекула РНК состоит из тех же азотистых оснований, за исключением тимина, который заменен на урацил (U).

Под "комплементарной нуклеиновой кислотой" стоит понимать нуклеиновую кислоту, нуклеотидная последовательность которой состоит из азотистых оснований, каждое из которых способно формировать водородные связи с каждым соответствующим азотистым основанием исходной нуклеотидной кислоты. В случае ДНК-ДНК комплекса, тимину в соответствие ставится аденин (Т-А), а гуанину-цитозин (G-C) и наоборот А-Т и C-G. В случае РНК-ДНК комплекса в образовании водородных связей в рибонуклеиновой кислоте место тимина занимает урацил (U-A; A-U; G-C; С-G). В качестве примера для ДНК фрагмента AGTCATG, комплиментарная нуклеотидная последовательно кДНК фрагмента будет выглядеть следующим образом: TCAGTAC:

5' AGTCATG 3'

3' TCAGTAC 5'

Под термином "тихая мутация" стоит понимать мутацию в нуклеиновой кислоте, которая не приводит к изменению аминокислотной последовательности, кодируемой этой нуклеиновой кислотой.

Под термином "фрагмент" стоит понимать часть аминокислотной или нуклеотидной последовательности, в которой отсутствуют какие-то участки последовательности, и при этом она сохраняет способность к флуоресценции в случае аминокислотной последовательности и кодирует полипептид, который сохраняет способность к флуоресценции в случае нуклеотидной последовательности.

Под термином "гомолог" понимается последовательность нуклеиновой кислоты или аминокислоты, в последовательности которой как минимум один нуклеотид или аминокислота добавляются, удаляются, замещаются или модифицируется другим способом по сравнению с исходной последовательностью нуклеиновой кислоты или аминокислоты. Учитывается, что гомолог обладает теми же свойствами, что и исходная нуклеиновая кислота.

Под термином "оптимизированная нуклеиновая кислота под определенную систему экспрессии" стоит понимать нуклеиновую последовательность, которая кодирует ту же аминокислотную последовать, что и исходная нуклеотидная последовательность, но состоит из других нуклеотидных кодонов (последовательность из трех азотистых оснований, которые кодируют аминокислоту), в соответствии с тем, какие кодоны используются экспрессионной системой для синтеза полипептида.

Под "идентичность последовательностей Х%" стоит понимать идентичность последовательностей Х% согласно BLAST алгоритму (алгоритм сравнения пептидных и нуклеотидных последовательностей), который доступен на домашней Веб-странице NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/).

GFP-подобные белки.

GFP (Green Fluorescent Protein - зеленый флуоресцентный белок) -белок, который был получен из медузы Aequorea victoria и широко используется в сфере флуоресцентного мечения как отдельных клеток, так и различных тканей [1].

Существует огромное количество производных и гомологов GFP (GFP-подобные белки), некоторые из которых получены из других организмов [1]. Среди GFP-подобных белков есть те, которые демонстрируют различные флуоресцентные свойства (максимум возбуждения, максимум излучения, квантовый выход, молярный коэффициент экстинкции) [2].

GFP-подобные белки обладают рядом преимуществ: имеются белки с высокой яркостью флуоресценции, происходит автокаталитическая сборка внутреннего хромофора и наличие большого количества белков с различными оптическими характеристиками (спектр излучения, яркость флуоресценции и т.д.):

1) Среди GFP-подобных белков имеются белки, максимумы возбуждения которых варьируются в промежутке от 400 нм. до 610 нм.

2) Среди GFP-подобных белков имеются белки, максимумы излучения которых находятся в промежутке от 450 нм. до 670 нм.

Таким образом, существует множество GFP-подобных белков, которые могут флуоресцировать различными цветами от красного до фиолетового.

Также GFP-подобные белки имеют ряд свойств, которые ограничивают возможности их использования:

1) Для того, чтобы наблюдалась флуоресценция GFP-подобного белка, необходимо наличие в растворе молекулярного кислорода. Это свойство не может быть устранено генетическими модификациями [3]. Таким образом, возникают ограничения на использование GFP-подобных белков в условиях низкого содержания кислорода (опухолевая гипоксия, церебральная ишемия, патогенез и развитие биопленок) [4].

2) GFP-подобные белки обладают весом более 25 кДа, что может вызывать различные стерические ограничения.

LOV-белки.

LOV-домены являются частью большого семейства доменов Per-Arnt-Sim (PAS) и связывают различные флавины (ФМН - флавинмононуклеотид; ФАД-флавинадениндинуклеотид; рибофлавин, которые изображены на рис. 1) в качестве хромофоров, которые под действием освещения ультрафиолетовым и синим светом образуют ковалентную связь с ближайшим цистеином LOV-домена [5].

Большинство содержащих LOV-домены белков представляет из себя олигомерные мультидоменные сенсорные системы, состоящие из светочувствительного домена LOV и присоединенных эффекторных доменов. Типичный размер LOV-доменов составляет 12-19 кДа. Коровая область (ядро) LOV доменов имеет классическую для PAS укладку, которая состоит из пяти антипараллельных бета-цепей (Аβ; Bβ; Gβ; Hβ; Iβ), образующих бета-каркас, и альфа-спиральных соединительных элементов (Сα; Dα; Еα; Fα), совместно нековалентно связывающих хромофор (рис. 2).

Ранее некоторые LOV-домен содержащие белки уже использовались для разработки флуоресцентных меток (белков репортеров) [6], [7]. Такие белки называются FbFPs (FMN-binding fluorescent proteins или же ФМН-связывающие флуоресцентные белки). К таким белкам можно отнести EcFbFP и BsFbFP, которые были сделаны на основе LOV-домен-содержащего белка YtvA из грамположительной почвенной бактерии Bacillus subtilis. Также были создан PpFbFP на основе белка PbSB2-LOV, но уже из грамотрицательной почвенной бактерии Pseudomonas putida. Для всех трех флуоресцентных белков характерна замена цистеина на аланин, который не связывается ковалентно с флавином и таким образом позволяет все время наблюдать флуоресцентную эмиссию полипептидов [8].

Также был получен LOV-домен-содержащий флуоресцентный белок iLOV, но уже из растения Arabidopsis thaliana [9], который позже был структурно улучшен до так называемого phiLOV, чья фотостабильность (способность молекулы сохранять свою стабильность при длительном облучении видимым светом от 380 нм до 780 нм) была лучше, чем у предшественника [10].

Помимо этого, были созданы LOV-домен-содержащие флуоресцентные пептиды на основе белков, найденных в термостабильных организмах. Одними из первых таких белков оказались CreiLOV из водоросли Chlamydomonas reinhardtii и VafLOV из другой водоросли Vaucheria frigida [11].

CagFbFP

В бактериальном геноме Chloroflexus aggregans существует белок Cagg_3753 (SEQ ID 4), который содержит LOV-домен [12]. Для создания флуоресцентной метки был создан ген (SEQ ID 1), который кодирует фрагмент белка Cagg_3753 (SEQ ID 4) начиная с 47 аминокислоты и заканчивая 153 аминокислотой, в итоге ген SEQ ID 2 кодирует полипептидный фрагмент SEQ ID 1.

Для того, чтобы использовать полипептидную последовательность SEQ ID 3 в качестве флуоресцентной метки необходима замена цистеина (аминокислота 83 в SEQ ID 4) на любую другу аминокислоту, которая не будет ковалентно связываться с флавином.

Один из возможных вариантов - замена цистеина на аланин (SEQ ID 1).

Кроме того, в последовательности SEQ ID 1 допускается содержание до 5 дополнительных точечных аминокислотных мутаций (помимо мутаций цистеина на другую аминокислоту).

Так же изобретение представляет из себя LOV-домен:

1) Который кодируется нуклеиновой кислотой SEQ ID 2, а также фрагментом или гомологом этой последовательности.

2) Кодируется нуклеиновой кислотой, которая идентична на 70% последовательностям из пункта 1.

3) Кодируется нуклеиновой кислотой, которая допускает тихие мутации в последовательностях из пунктов 1-2.

4) Кодируется нуклеиновой кислотой из пунктов 1-3, которые были оптимизированы под конкретную систему экспрессии.

Флуоресцентный белок SEQ ID 1 обладает следующими свойствами:

1) Его вес составляет не более 12 кДа.

2) Имеет максимум возбуждения в промежутке 430 нм. - 470 нм.

3) Имеет максимум излучения в промежутке 480-520 нм, при облучении длиной волны в 450 нм.

По сравнению со своими аналогами CagFbFP был получен из термофильной Chloroflexus aggregans и является наименьшим по весу мономера белком (табл. 3), также его аминокислотная последовательность CagFbFP идентична менее чем на 55% с любым другим из известных LOV-домен-содержащих белков, которые используются в качестве флуоресцентной метки (табл. 3).

Настоящее изобретение в дальнейшем будет описано при помощи следующих примеров. Следует понимать, что данные примеры приведены только в качестве иллюстрации настоящего изобретения, и настоящее изобретение не ограничено данными примерами. Любая модификация может быть сделана специалистом в области техники в свете настоящего раскрытия в пределах рассматриваемой формулы изобретения.

Пример:

Нуклеиновая кислота (SEQ ID 2), которая кодирует фрагмент белка SEQ ID 4 (полную последовательность можно найти на сайте https://www.uniprot.org/ с уникальным идентификатором B8GAY9) начиная с 47 аминокислоты и заканчивая 153, в которой дополнительно заменен цистеин в 85 положении на аланин, была собрана методами генной инженерии с использованием плазмиды.

Для экспрессии белка использовался бактериальный штамм C41(DE3). Клетки продуцировали белок в течение 7 часов при температуре 37°С. Затем клетки с белком были разрушены в буфере, содержащем 50 mM Tris-HCl рН 8.0; 300 mM NaCl. Лизат был очищен от мембран ультрацентрифугированием при 100000 g в течение 1 часа. Полученный раствор был дополнительно очищен методом металл-аффинной хроматографии, при этом использовалась смола Ni-NTA(Qiagen, Germany). Затем элюат с белком был очищен методом гель-фильтрации (использовалась гель-фильтрационная колонка Superdex® 200 Increase 10/300 GL GE Healthcare Life Sciences, USA) в буфере, который содержит 10 mM NaCl и 10 mM натрий-фосфата при рН 8.0.

Полученный очищенный белок CagFbFP (SEQ ID 1), может флуоресцировать в зеленой области. Такой белок имеет максимум возбуждения в промежутке длин волны 430-470 нм и максимум излучения в промежутке 480-520, при облучении CagFbFP светом с длиной волны 450 нм (рис. 3).

ССЫЛКИ:

[1] М. V. Matz, K. A. Lukyanov, and S. A. Lukyanov, 'Family of the green fluorescent protein: journey to the end of the rainbow', Bioessays, vol. 24, no. 10, pp. 953-959, 2002.

[2] G. J. Kremers, S. G. Gilbert, P. J. Cranfill, M. W. Davidson, and D. W. Piston, 'Fluorescent proteins at a glance. ', J Cell Sci, vol. 124, no. 2, pp. 157-160, 2011.

[3] R. M. Wachter, 'Chromogenic cross-link formation in green fluorescent protein', Acc. Chem. Res., vol. 40, no. 2, pp. 120-127, 2007.

[4] C. Coralli, M. Cemazar, C. Kanthou, G. M. Tozer, and G. U. Dachs, 'Limitations of the reporter green fluorescent protein under simulated tumor conditions', Cancer Res., vol. 61, no. 12, pp. 4784-4790, 2001.

[5] M. Salomon, J. M. Christie, E. Knieb, U. Lempert, and W. R. Briggs, 'Photochemical and mutational analysis of the FMN-binding domains of the plant blue light receptor, phototropin', Biochemistry, vol. 39, no. 31, pp. 9401-9410, 2000.

[6] A. Mukherjee and С.M. Schroeder, 'Flavin-based fluorescent proteins: emerging paradigms in biological imaging', Curr. Opin. Biotechnol, vol. 31, pp. 16-23, 2015.

[7] A. M. Buckley, J. Petersen, A. J. Roe, G. R. Douce, and J. M. Christie, 'LOV-based reporters for fluorescence imaging', Curr. Opin. Chem. Biol, vol. 27, pp. 39-45,2015.

[8] T. Drepper et al., 'Reporter proteins for in vivo fluorescence without oxygen', Nat. Biotechnol, vol. 25, no. 4, pp.443-445, 2007.

[9] S. Chapman et al., 'The photoreversible fluorescent protein iLOV outperforms GFP as a reporter of plant virus infection', Proc. Natl. Acad. Sci, vol. 105, no. 50, pp. 20038-20043, 2008.

[10] J. M. Christie et al, 'Structural tuning of the fluorescent protein iLOV for improved photostability', J. Biol. Chem., vol. 287, no. 26, pp. 22295-22304, 2012.

[11] A. Mukherjee, K. В. Weyant, U. Agrawal, J. Walker, I. K. Cann, and С.M. Schroeder, 'Engineering and characterization of new LOV-based fluorescent proteins from Chlamydomonas reinhardtii and Vaucheria frigida', ACS Synth. Biol., vol. 4, no. 4, pp. 371-377, 2014.

[12] S. T. Glantz et al., 'Functional and topological diversity of LOV domain photoreceptors', Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 113, no. 11, pp. E1442-E1451, 2016.

Использование CagFbFP в качестве флуоресцентной метки.

Таблица 1

SEQ ID 3 - аминокислотная последовательность Cagg_3753 начиная с 47 аминокислоты и заканчивая 153 аминокислотой.

SEQ ID 1 - аминокислотная последовательность CagFbFP, в которой заменен цистеин (39 аминокислота) на аланин

SEQ ID 4 - полная аминокислотная последовательно белка Cagg_3753, часть которой (с 47 по 153 аминокислоты) содержит CagFbFP.

Таблица 2

Нуклеиновая кислота, кодирующая SEQ ID 1, которая оптимизирована для экспрессии в Е. coli.

Таблица 3.

В таблице указаны длины и веса мономеров основных LOV-домен-содержащих белков и их идентичность аминокислотной последовательности по отношению к CagFbFP (SEQ ID 1).

1. Белок, аминокислотная последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 1, предназначенный для использования в качестве флуоресцентной метки, имеющий максимум возбуждения в промежутке между 430-470 нм, имеющий максимум излучения в промежутке между 480-520 нм при облучении образца длиной волны в 450 нм.

2. Нуклеиновая кислота, кодирующая флуоресцентный белок по п. 1.