Гуманизированные мыши (htnfki/htnfr2ki) на генетической основе c57bi/6 с дополнительной возможностью кондиционного удаления htnfr2 для биомедицинских исследований

Изобретение относится к области биохимии, в частности к изучению генома мыши, который содержит в мышином локусе TNFR2 ген, содержащий со 2-го по 6-й экзоны человека, кодирующий внеклеточную часть TNFR2 человека, связывающуюся с TNF человека, с возможностью кондиционного блокирования активности гена TNFR2 в клетках, экспрессирующих сrе-рекомбиназу. Также раскрыт способ изучения активности терапевтических средств, связывающихся с TNF человека, включающий введение таких средств вышеуказанной мыши. Изобретение также относится к способу изучения активности терапевтических средств агонистов и антагонистов, связывающихся с TNFR2 человека, включающему введение таких средств вышеуказанной мыши. Изобретение эффективно в исследовании свойств лекарственных препаратов, применяемых при терапии аутоиммунных заболеваний. 3 н. и 1 з.п. ф-лы, 2 табл., 4 пр., 3 ил.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области молекулярной иммунологии, обратной генетики, биотехнологии и медицины. Описаны генетически модифицированные мыши, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие белки TNF и TNFR2 человека. Гуманизированные мыши представляют собой удобный инструмент для изучения свойств зарегистрированных и разрабатываемых лекарственных препаратов, применяемых при терапии аутоиммунных заболеваний, которые не активны в обычных линейных мышах. Кроме того, заявляемая линия мышей позволяет изучить физиологическую роль сигналинга через TNFR2 в определенном типе клеток.

Уровень техники

Животные модели, в частности, линейные мыши на различной генетической основе, являются адекватными моделями для изучения аутоиммунной патологии человека. Тем не менее, экстраполирование данных от мышей к людям остается актуальной проблемой. Для преодоления трудностей, связанных с использованием таких моделей, в мире разрабатываются гуманизированные мыши, у которых мишени для изучения патологических процессов и/или фармакологического воздействия аналогичны белкам человека. В частности, остаются востребованными разработки моделей на основе мышиного организма с экспрессией фактора некроза опухоли человека (hTNF) и/или человеческих рецепторов к TNF (hTNFR, CD120), включающих подвиды hTNFR1 (CD120a) (TNFRSF1A: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/7132) и hTNFR2 (CD120b) (TNFRSF1B: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/7133), поскольку увеличенная продукция TNF характерна для многих аутоиммунных заболеваний.

Известны мышиные модели Tg197, Tg211, Tg5453 с трансгенным человеческим TNF, в которых достигается сверхэкспрессия TNF (Keffer J, Probert L, Cazlaris HS, et al. Transgenic mice expressing human tumour necrosis factor: a predictive genetic model of arthritis. EMBO J.1991;10:4025.; Shealy DJ, Wooley PH, Emmell E, Volk A, Rosenberg A, Treacy G, Wagner CL, Mayton L, Griswold DE, Song XY. Anti-TNF-alpha antibody allows healing of joint damage in polyarthritic transgenic mice. Arthritis Res. 2002;4(5):R7.; Brenner D, Blaser H, Мак TW. Regulation of tumour necrosis factor signalling: live or let die. Nat. Rev. Immunol. 2015;15(6):362-74.; Georgopoulos S., Plows D., Kollias G. Transmembrane TNF is sufficient to induce localized tissue toxicity andchronic inflammatory arthritis in transgenic mice, J. Inflamm. 1996;46, 86-97; Zhang H, Hilton MJ, Anolik JH, Welle SL, Zhao C, Yao Z, Li X, Wang Z, Boyce BF and Xing L, 2014, "NOTCH inhibits osteoblast formation in inflammatory arthritis via noncanonical NF-kB", J Clin Invest. 2014;124(7):3200-3214.). В этих мышах удается смоделировать эрозивный полиартрит, вызванный секрецией TNF множеством различных типов клеток организма. Однако, несмотря на допустимость испытаний антицитокиновых и иных препаратов на такой модели, возможность регуляции экспрессии гена TNF у таких мышей возможна лишь путем введения липополисахарида, то есть, возможно увеличение экспрессии TNF, но отсутствует возможность негативной регуляции вплоть до полного выключения активности гена системно или в определенных видах клеток. Помимо этого, случайная интеграция трансгена hTNF в неизвестный локус генома сочетается с плохо регулируемой экспрессией белка hTNF, в результате чего у мышей кроме артрита возможно развитие других различных патологий, вовлекающих множество типов клеток и тканей, что приводит к ограниченной применимости этих мышей. Дополнительным недостатком такой системы является невозможность изучения действия блокаторов в других модельных заболеваниях, для которых анти-TNF терапия показала эффективность (воспалительные заболевания кишечника, псориаз и другие). В дополнение, описанные линии животных экспрессируют одновременно и мышиный TNF, вносящий интерференцию в любые эксперименты, вовлекающие hTNF, учитывая, что оба белка обеспечивают сигналинг через TNFR1.

Известна мышиная модель Tg1278TNFKo (Moore A, Allden S, Bourne T, Denis MC, Kranidioti K, Okoye R, Sotsios Y, Stencel Z, Vugler A, Watt G, et al. Collagen II antibody-induced arthritis in Tg1278TNFko mice: optimization of a novel model to assess treatments targeting human TNFα in rheumatoid arthritis. J Transl Med., 2014;12(1):285.; human TNF driven CAIA: https://www.biomedcode.com/gr/en/content/human-tnf-driven-caia), в которой с помощью генетического нокаута выключена экспрессия мышиного TNF. Данная модель обладает преимуществом по сравнению с моделями Tg197, Tg211, Tg5453, так как позволяет исследовать только патологические аутоиммунные процессы костно-хрящевого аппарата, что достигается введением антител к коллагену. Предлагаемая в настоящей заявке модель позволяет проводить исследование функции TNF при экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите. Такие мыши экспрессируют не только hTNF, но и hTNFR2, с дополнительной возможностью регулировать экспрессию hTNFR2 в отдельных видах клеток.

Известна линия модельных животных - мышей hTNFKI на генетическом бэкграунде С57В1/6, в которых функциональный ген TNF мыши был заменен геном hTNF, что позволяло изучать действие лекарственных препаратов (таких как - адалимумаб, цертолизумаб, инфликсимаб), являющихся видоспецифическими блокаторами TNF (Olleros ML, Chavez-Galan L, Segueni N, Bourigault ML, Vesin D, Kruglov AA, Drutskaya MS, Bisig R, Ehlers S, Aly S, Walter K, Kuprash DV, Chouchkova M, Kozlov SV, Erard F, Ryffel B, Quesniaux VF, Nedospasov SA, Garcia I. Control of Mycobacterial Infections in Mice Expressing Human Tumor Necrosis Factor (TNF) but Not Mouse TNF. Infect Immun. 2015;83(9):3612-23.; Atretkhany KS, Nosenko MA, Gogoleva VS, Zvartsev RV, Qin Z, Nedospasov SA, Drutskaya MS. TNF Neutralization Results in the Delay of Transplantable Tumor Growth and Reduced MDSC Accumulation. Front Immunol. 2016;7:147.; Efimov GA, Kruglov AA, Khlopchatnikova ZV, Rozov FN, Mokhonov VV, Rose-John S, Scheller J, Gordon S, Stacey M, Drutskaya MS, Tillib SV, Nedospasov SA. Cell-type-restricted anti-cytokine therapy: TNF inhibition from one pathogenic source. Proc Natl Acad Sci USA. 2016;113(11):3006-11.).

Известно, что взаимодействие hTNF с мышиной формой TNFR2 как in vitro, так и in vivo недостаточно эффективно, и может приводить к нежелательным эффектам в экспериментах (Bossen С, Ingold K, Tardivel A, Bodmer JL, Gaide О, Hertig S, Ambrose С, Tschopp J, Schneider P. Interactions of tumor necrosis factor (TNF) and TNF receptor family members in the mouse and human. J Biol Chem. 2006;281(20):13964-71.). Так, мыши с hTNF имеют пониженное содержание Т-регуляторных клеток и более выраженные клинические симптомы экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЕАЕ), что указывает на возможную протективную роль TNFR2 в контроле нейровоспаления (Tsakiri N, Papadopoulos D, Denis MC, Mitsikostas DD, Kollias G. TNFR2 on nonhaematopoietic cells is required for Foxp3+ Treg-cell function and disease suppression in EAE. Eur J Immunol. 2012;42:403-412.).Однако, протективная роль TNFR2 утрачивается при гуманизации только гена цитокина, но не его рецептора. Механизмы этого явления оставались непонятыми до работы заявителей. В отличие от упомянутой линии мышей, предлагаемая в настоящей заявке мышиная модель содержит также последовательность рецептора TNF человека 2 типа (TNFR2). Следует подчеркнуть, что TNFR1 одинаково хорошо обеспечивает сигналинг в ответ на TNF как мыши, так и человека, поэтому для его функциональности гуманизация не требуется. Описанные в литературе мышиные модели с гуманизацией по TNFR1 были созданы для изучения блокаторов этого рецептора (Dong Y, Fischer R, Naude PJ, Maier O, Nyakas C, Duffey M, Van der Zee EA, Dekens D, Douwenga W, Herrmann A, Guenzi E, Kontermann RE, Pfizenmaier K, Eisel UL. Essential protective role of tumor necrosis factor receptor 2 in neurodegeneration. Proc Natl Acad Sci USA. 2016;113(43):12304-12309.).

Известна мышиная модель Tg197hTNFR1KI со спонтанно развивающимся артритом (human TNF-TNFR1 driven arthritis (Tg197hTNFR1KI): https://www.biomedcode.com/gr/en/content/human-thf-tnfr1-driven-arthritis-tg197htnfr1ki).

В данной модели сверхэкспрессия человеческого TNF происходит на фоне гуманизации рецептора TNFR1, что позволяет проводить доклинические испытания как блокаторов TNF, так и блокаторов TNFR1 (подчеркнем еще раз, что для функциональности системы гуманизация этого рецептора не требовалась). Тем не менее, указанная модель не позволяет изучать эффекты, опосредованные TNFR2-рецептором; более того, в данной модели невозможно регулировать степень экспрессии TNFR1, что существенно ограничивает применимость этой модели. В отличие линии мышей Tg197hTNFR1KI, предлагаемая заявителем модель позволяет избирательно изучать эффекты взаимодействия TNF-TNFR2, а также регулировать экспрессию TNFR2 на отдельных клетках. Это важно, поскольку ранее была установлена межвидовая вырожденность взаимодействия человеческого TNF с мышиным TNFR1, но не с мышиным TNFR2.

Известны мышиные линии TgE1322, TgE1334 и TgE1335, содержащие полную последовательность человеческого трансгена TNFR2 (Douni Е, Kollias G. A critical role of the p75 tumor necrosis factor receptor (p75TNF-R) in organ inflammation independent of TNF, lymphotoxin alpha, or the p55TNF-R. J. Exp. Med. 1998; 188(7):1343-1352.; http://www.informatics.jax.org/allele/MGI:5645569). Однако в этих линиях сохранена экспрессия мышиного TNF, и нет возможности кондиционного нокаута TNFR2.

Наконец, описана модель на основе мышиного организма, содержащая гуманизированные TNFR1 и TNFR2, но не имеющая гуманизированного TNF (Dong Y, Fischer R, Naude PJ, Maier O, Nyakas C, Duffey M, Van der Zee EA, Dekens D, Douwenga W, Herrmann A, Guenzi E, Kontermann RE, Pfizenmaier K, Eisel UL. Essential protective role of tumor necrosis factor receptor 2 in neurodegeneration. Proc Natl Acad Sci USA. 2016;113(43):12304-12309.). Она была создана для изучения эффектов агонистов и антагонистов этих рецепторов. Для этой модели описана протективная роль TNFR2 в отношении нейродегенерации. Однако данная модель не позволяет изучать эффекты блокирования человеческого TNF препаратами, находящимися в доклинической разработке.

Таким образом, в настоящее время уровень техники не позволяет на животных моделях одновременно решать проблемы изучения взаимодействия hTNF и hTNFR2, включая эффекты hTNF-блокаторов. Также не описано ожидаемых последствий кондиционного инактивирования hTNFR2 в тех или иных видах клеток. В то же время, авторами настоящего изобретения при применении предлагаемой модели был достигнут неожиданный технический результат, заключавшийся в том, что при избирательном отключении hTNFR2 в регуляторных Т-лимфоцитах (Treg) у дважды гуманизированных (hTNF/hTNFR2) животных снижается способность иммунной системы контролировать Th17-зависимый иммунный ответ, что приводит к ухудшению течения аутоиммунного энцефаломиелита, сопровождающемуся уменьшением содержания и активности Treg. (Atretkhany K.-N, Mufazalov I.A., Dunst J., Kuchmiy A., Gogoleva V.S., Andruszewski D., Drutskaya M.S., Faustman D.L., Schwabenland M., Prinz M., Kruglov A.A., Waisman A., Nedospasov S.A. Intrinsic TNFR2 signaling in T regulatory cells provides protection in CNS autoimmunity. Proc Natl Acad Sci U S A. 2018 Dec 18; 115(51): 13051-13056. doi: 10.1073/pnas. 1807499115.).

Раскрытие сущности изобретения

Задача данного изобретения заключается в создании трансгенных мышей, геном которых содержит ген, кодирующий человеческие белки TNF и TNFR2, с возможностью кондиционного блокирования активности гена TNFR2 в определенном типе клеток.

Сущность данного изобретения заключается в создании и применении генетически модифицированных мышей, представляющих собой удобный инструмент для исследования свойств зарегистрированных и разрабатываемых лекарственных препаратов, применяемых при терапии аутоиммунных и других заболеваний и для изучения физиологической роли сигналинга через TNFR2.

При создании настоящего изобретения была осуществлена двойная гуманизация мышей по генам TNF и TNFR2, причем в обоих случаях ген человека вставлялся точно в геномное положение соответствующего гена мыши. Кроме того, уникальный дизайн конструкции для генетического редактирования дополнительно позволяет осуществлять тканеспецифическую и/или индуцибельную инактивацию TNFR2, поскольку в конструкт были введены 2 loxP сайта узнавания Cre-рекомбиназы. Так, путем скрещивания с линиями вспомогательных трансгенных мышей, несущих Cre-рекомбиназу под контролем того или иного тканеспецифического или индуцибельного промотора, можно установить физиологическую роль сигнала TNFR2 на разных клетках. Оказалось, что такая двойная гуманизация приводит к восстановлению содержания Т-регуляторных клеток. Кроме того, у таких мышей развивается аутоиммунный энцефаломиелит, протекающий аналогично мышам дикого типа без гуманизации. Таким образом, дважды гуманизированные мыши обладают функциональными сигнальными путями, обеспечиваемыми взаимодействиями hTNF как с TNFR1, так и с hTNFR2, и являются уникальной моделью для изучения агонистов или антагонистов hTNF и hTNFR2 in vivo, а также позволяют изучать физиологическую роль TNFR2 в любом типе клеток. Данные мыши позволяют изучать патогенетические механизмы аутоиммунного энцефаломиелита, ревматоидного артрита, воспалительных заболеваний кишечника, аутоиммунные поражения щитовидной железы, системную красную волчанку и другие аутоиммунные болезни, и синдромы, не ограниченные данным списком.

Краткое описание таблиц и фигур

Табл. 1. Специфические ДНК праймеры для генетического редактирования и типирования.

Фиг. 1. Схема hTNFR2 вектора.

Условные обозначения: BstBI, HpaI, NotI, BamHI, Sad, SalI - сайты ферментов рестрикции, DTα - ген дифтерийного токсина, HS-TK - тимидинкиназная кассета, NEO кассета - ген устойчивости к неомицину, ех - экзоны

Фиг. 2. Гуманизация мышиного локуса TNFR2

А) Схематическое изображение мышиного локуса после рекомбинации с hTNFR2 вектором; Б) Схематическое изображение мышиного локуса TNFR2 локуса после сайт-специфической FLP опосредованной рекомбинации

Фиг. 3. Исследование агонистов TNFR2.

А: гистограммы распределения жизнеспособных TCRb+CD4+FoxP3+ клеток, меченых красителем Cell Trace Violet (CTV), полученных от мышей hTNFKI × hTNFR2KI и культивируемых в присутствии IgG2b и блокирующего анти-hTNFR2-антитела, а также в присутствии IgG1 или стимулирующего анти-hTNFR2-антитела. Б: Ингибирование пролиферации Treg, вызванное блокирующими антителами к hTNFR2, введенными в организм мышей hTNFKI × hTNFR2KI, а также активация пролиферации Treg, вызванная введением стимулирующих антител к hTNFR2. Показаны значимые различия по одностороннему Т-критерию: *Р<0.05; ****Р<0.0001.

Осуществление изобретения

С помощью технологии рекомбинантной ДНК создается генетическая конструкция для гомологичной рекомбинации, позволяющая осуществить функциональную «гуманизацию» гена TNFR2 мыши. Для генетического «нокина» (т.е. для вставления гена человека не в произвольный, а в гомологичный участок генома мыши) лиганд-связывающей части человеческого рецептора вектор содержит соответствующий фрагмент геномной последовательности человека, выбранной на основании предварительного анализа, а также протяженные участки генома мыши, позволяющие провести прицельную интеграцию функциональной части конструкта. Дальнейшие экспериментальные процедуры являются стандартными для этой технологии редактирования генома и описаны (ЕР 2832221 А1 «Humanized mouse» 04.02.2015).

Полученные в результате этих процедур гомозиготные hTNFR2KI мыши с удаленной neo-кассетой скрещиваются с hTNFKI мышами с последующими скрещиваниями и выведением чистой двойной гомозиготной линии мышей, гуманизированных по генам TNF и TNFR2. Такие мыши являются уникальными и не имеют аналогов. Предложенная стратегия модификации гена TNFR2 с последующим скрещиванием новой линии мышей с «гуманизированными» по гену TNF мышами позволяет восстановить эффективную передачу сигнала человеческого цитокина TNF в организме мыши. Такие линии мышей представляют собой большую прикладную ценность, как модели для предклинических испытаний новых лекарств - ингибиторов TNF, агонистов и антагонистов TNFR2, а также для фундаментальных исследований механизмов иммунорегуляции.

Приведенные далее примеры следует рассматривать в качестве иллюстрации, а не ограничения. Квалифицированный специалист сможет оценить, что варианты осуществления данного изобретения не ограничены примерами, приведенными в данном документе. Квалифицированный специалист учтет, что указанные и связанные с ними варианты осуществления данного изобретения можно применять и для иных целей, помимо перечисленных в данном документе. Подразумевается, что такие модификации попадают в пределы области, покрываемой прилагаемой формулой изобретения.

Пример 1

Получение мышей, гуманизированных по TNFR2 и дважды гуманизированных по TNF и TNFR2.

С помощью технологии рекомбинантной ДНК создали конструкцию для гомологичной рекомбинации, позволяющей осуществить функциональную «гуманизацию» гена TNFR2 мыши, схема которой представлена на Фиг. 1. Для генетического «нокина» лиганд-связывающей части человеческого рецептора вектор содержал соответствующий фрагмент геномной последовательности человека, выбранной на основании предварительного in silico анализа.

Гомозиготные hTNFR2KI мыши без neo-кассеты скрещивали с ранее полученными hTNFKI мышами с последующими скрещиваниями и выведением гомозиготной линии мышей, гуманизированных по генам TNF и TNFR2.

Данные моделирования показали, что замена со 2-го по 6-ой экзон в гене TNFR2 позволяет изменить сродство рецептора мыши к фактору некроза опухоли человека, так как эти экзоны кодируют все внеклеточные участки рецептора, необходимые для взаимодействия с лигандом. Важно, что при такой частичной гуманизации гена в рецепторе сохраняется «мышиная» внутриклеточная часть для правильной передачи сигнала в организме мыши. Фрагмент гена человека в составе генетического конструкта для генетического редактирования был окаймлен «плечами» гомологии (примерно 4,5 тпн) из соответствующего локуса мышиного генома, за счет чего достигалась сайт-специфичность рекомбинации в локусе TNFR2 мыши. В соответствие со стандартными процедурами отбора рекомбинантных клонов эмбриональных стволовых клеток, вектор для «нокина» содержал маркеры позитивной и негативной селекции:

А) Ген устойчивости к неомицину служил маркером позитивной селекции. Следует отметить, что neo-кассета обрамлена FRT сайтами и, таким образом, может быть удалена из генома механизмом сайт-специфической FLP-опосредованной рекомбинации. Удаление neo-кассеты позволяет почти полностью восстановить структуру интрона, что является преимуществом выбранной стратегии геномного редактирования.

Б) Для отрицательной селекции, позволяющей отобрать клоны ЭСК с успешно прошедшей гомологичной рекомбинацией, вектор содержал ген дифтерийного токсина (DTa кассета). При ошибочной рекомбинации между вектором и геномом, наряду с человеческой вставкой, в геном может случайно встроиться и DTα кассета, что приводит к спонтанной экспрессии дифтерийного токсина, и, как результат, к гибели «неправильных» клонов. Вторым маркером негативной селекции являлась стандартная тимидинкиназная кассета, для селекции на среде с ганцикловиром. Как результат, использование двух маркеров отрицательной селекции повысило эффективность выбраковки ложноположительных клонов. Работа по клонированию состояла из двух ключевых стадий: сначала были отдельно «собраны» плечи гомологии и человеческий фрагмент в векторе pBS KS II+, далее основные составные части были поочередно клонированы в вектор для «нокина» pFLRT. На каждом этапе последовательности вновь генерированных фрагментов анализировали реакцией рестрикции и подтверждали секвенированием.

Редактирование гена TNFR2 производили в ЭСК линии BRUCE4, полученной из линии мышей C57BL/6. Основным преимуществом использования ЭСК BRUCE4 для инъекции в бластоцисты C57BL/6 является существенное сокращение этапа по возвратному скрещиванию генетически измененных мышей, в целях помещения внесенной мутации на нужную генетическую основу для последующего иммунологического анализа. Для анализа сайт-специфичности замены мышиной последовательности рецептора на человеческую последовательность в локусе TNFR2 использовали методику саузерн - блот гибридизации. Далее полученные химерные мыши скрещивали с мышами, несущими Flp-рекомбиназу для удаления neo-кассеты. Отсутствие neo-кассеты было проверено в потомстве F1 с помощью специфических ДНК праймеров и ПЦР (Фиг. 2., Табл. 1.).

Гомозиготные hTNFR2KI мыши без neo-кассеты скрещивали с ранее полученными hTNFKI мышами с выведением двойной гомозиготной линии мышей, гуманизированных по генам и TNF, и TNFR2.

Пример 2

Характеристика мышей, дважды гуманизированных по TNF и TNFR2

Клеточные суспензии для анализа готовили путем механической гомогенизации селезенки и лимфоузлов в фосфатно-солевом буферном растворе с добавлением 2% FCS. Для получения лимфоцитов, инфильтрирующих ЦНС, головной и спинной мозг мыши выделяли, обрабатывали ферментами, после чего клетки центрифугировали в градиенте плотности 30/37/70 Percoll.

Было выявлено, что содержание эффекторных Treg с фенотипом CD44hiCD62Llo во вторичных лимфоидных органах было увеличено у мышей с hTNFKI по сравнению с мышами дикого типа и полученной линией hTNFKI × hTNFR2KI. Тем не менее, общее количество Treg не отличалось между мышами hTNFKI и hTNFKI × hTNFR2KI. При анализе функциональности сигналинга через TNFR2 в Treg-клетках, вызываемого hTNF, было выявлено, что только Treg, полученные от мышей hTNFKI × hTNFR2KI пролиферируют в ответ на введение hTNF.

При моделировании экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЕАЕ) выяснили, что у мышей hTNFKI × hTNFR2KI течение ЕАЕ соответствовало таковому у мышей дикого типа. При этом у мышей, гуманизированных только по hTNF, течение ЕАЕ отличалось большей тяжестью симптомов и значительной инфильтрацией тканей ЦНС Т-лимфоцитами, характеризующейся сниженным количеством и активностью Treg и увеличением количества Th17-клеток. Подобных явлений не наблюдали у мышей hTNFKI × hTNFR2KI, как и у мышей дикого типа. Таким образом, выявили, что сигналинг, опосредованный TNFR2 необходим для адекватного функционирования Treg, контролирующих функции Th17-клеток при ЕАЕ, а модель hTNFKI × hTNFR2KI более корректно отражает патогенез ЕАЕ.

Пример 3

Кондиционная инактивация гена TNFR2 у мышей, гуманизированных по TNF и TNFR2

Кондиционный нокаут TNFR2 в клетках Treg достигали путем удаления экзонов 2-6 гена hTNFR2 после скрещивания мышей hTNFKI × hTNFR2KI и трансгенной мыши FoxP3-Cre.

У полученной линии мышей наблюдали увеличенное содержание эффекторных Т-лимфоцитов с фенотипом CD44hiCD62Llo во вторичных лимфоидных органах по сравнению с мышами с сохранным TNFR2-сигналингом. Содержание Т-клеток с фенотипом FoxP3+CD4+ также было увеличено, но количество CD44^hiCD62L^lo Treg не изменилось. Описанное изменение баланса клеток было следствием нарушения функций, лишенных TNFR2. Так, в этих клетках была снижена экспрессия ключевых молекул FoxP3, CD25, CTLA-4, и GITR, а ингибиторная активность в отношении пролиферации Т-лимфоцитов in vitro у таких Treg была снижена.

Пример 4

Изучение терапевтических средств, связывающихся с TNFR2 при введении мышам, гуманизированным по TNF и TNFR2

Открытие протективной функции TNFR2 в аутоиммунитете сделало актуальным поиск агентов, которые модулировали бы активность этого рецептора, в частности, являлись бы его агонистами. С другой стороны, открытие про-туморогенных свойств TNFR2 при некоторых неоплазиях сделало актуальным поиск антагонистов этого рецептора. При введении антагонистов hTNFR2 мышам hTNFKI × hTNFR2KI нарушалась пролиферация Treg, в то время как введение агонистов вызывало умеренный пролиферативный ответ (Фиг. 3). Таким образом, модель оказалась применима для изучения веществ, мишенью которых является hTNFR2.

A01K67/0278

ГУМАНИЗИРОВАННЫЕ МЫШИ (HTNFKI/HTNFR2KI)НА ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ОСНОВЕ C57Bl/6 С ДОПОЛНИТЕЛЬНОЙ ВОЗМОЖНОСТЬЮ КОНДИЦИОННОГО УДАЛЕНИЯ HTNFR2 ДЛЯ БИОМЕДИЦИНСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Таблица 1.

SEQID NO	Название праймеров	Последовательность	Аллель	Длинафрагмента
1	hTNFR2KI-FW	5’-cagagagaacccagaggagg-3’	hTNFR2 KIneo+	203bp
2	hTNFR2KI-RV	5’-accctagtcatgtctgcagg-3’
3	hTNFR2KI-FW	5’-cagagagaacccagaggagg-3’	mTNFR2 WT	476bp
4	mTNFR2-RV	5’-ggcactcgtacccaggttcc-3’
5	hp75FW	5’-atggttttactgagagcccacg-3’	hTNFR2 KIneo-	461 bp
6	NEOp75RW	5’-caaattaagggccagctcattcc-3’
7	hp75FW	5’-atggttttactgagagcccacg-3’		615 bp
8	mp75RW	5’-gagatcaagtccagccttagg-3’
9	hTNFR2KI-FW	5’-cagagagaacccagaggagg-3’	hTNFR2 KO	303bp
10	hTNFR2KO-RV	5’-gagactcaactcttctacacttgc-3’
11	FLPe-FW	5’-ggcagaagcacgcttatcg-3’	FLPe	343bp
12	FLPe-RV	5’-gacaagcgttagtaggcacat-3’
13	FoxP3-Cre-FW	5’-ctgcttccttcacgacattcaac-3’	FoxP3-Cre	368bp
14	FoxP3-Cre-RV	5’-aagtgctttgtgcgagtggagagc-3’
15	hTNFKI 1	5’-atgtaccgcagtcaagatatg-3’	hTNF-KI/WT	335bp (KI) 472bp (WT)

1. Мышь для экспериментальных исследований, геном которой содержит в мышином локусе TNFR2 ген, содержащий со 2-го по 6-й экзоны человека, кодирующий внеклеточную часть TNFR2 человека, связывающуюся с TNF человека, с возможностью кондиционного блокирования активности гена TNFR2 в клетках, экспрессирующих cre-рекомбиназу.

2. Мышь по п. 1, отличающаяся тем, что дополнительно содержит ген TNF человека в точной позиции отсутствующего гена TNF мыши.

3. Способ изучения активности терапевтических средств, связывающихся с TNF человека, включающий введение таких средств мыши по п. 2, в условиях, когда в системе присутствует протективный сигнал от TNFR2.

4. Способ изучения активности терапевтических средств агонистов и антагонистов, связывающихся с TNFR2 человека, включающий введение таких средств мыши по п. 2.