Способ насыщения коллагеном трансплантата костной ткани

Изобретение относится к области медицины, в частности к регенераторной медицине, и может быть использовано при изготовлении трансплантатов аллогенной костной ткани для лечения больных в травматологии-ортопедии, нейрохирургии. Способ насыщения коллагеном трансплантата губчатой, компактной костных тканей или их сочетания включает формирование отверстий в компактной костной ткани при ее использовании, затем один или несколько трансплантатов помещают в контейнер, в который добавляют золь с концентрацией коллагена от 0,6 до 1,4% в таком количестве, чтобы он полностью покрывал трансплантат; далее осуществляют центрифугирование в течение 20 минут с ускорением 100g при использовании золя с концентрацией коллагена 0,6-0,79%, 300g – при 0,8-0,99%, 700g – при 1,0-1,19%, 1300g – при 1,2-1,4% соответственно. После центрифугирования оценивают количество оставшегося золя в контейнере, в случае его снижения в контейнер добавляют до исходного значения золь с соответствующей концентрацией коллагена и проводят повторное центрифугирование при тех же режимах. Этапы центрифугирования повторяют до прекращения убыли золя, после чего проводят лиофилизацию коллагена в составе костных трансплантатов в вакуумной сушке. Технический результат - более полное насыщение трансплантата костной ткани любого типа золем коллагена 1 типа с концентрацией от 0,6 до 1,4%. 1 табл., 1 пр., 2 ил.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области медицины, в частности к регенераторной медицине, и может быть использовано при изготовлении трансплантатов аллогенной костной ткани для лечения больных в травматологии-ортопедии, нейрохирургии.

Область техники

Всё чаще при оказании медицинской помощи применяют трансплантаты из аллогенной костной ткани. В зависимости от клинической ситуации востребованы трансплантаты из спонгиозной, компактной костной ткани или их сочетании. Спонгиозная костная ткань отличается ячеистой структурой, облегчающей проникновение прогениторных клеток в трансплантат, легко моделируется по месту, но имеет относительно небольшую прочность. Компактную костную ткань используют для заполнения дефекта в кости, испытывающей существенную нагрузку. Благодаря пластинчатому строению, напоминающему систему вставленных друг в друга цилиндров, она способна выдерживать воздействие не только вдоль оси хода волокон, но и на изгиб, но высокая плотность ткани препятствует ревитализации трансплантата. Бывают и комбинированные трансплантаты, содержащие оба типа костной ткани и сочетающие их свойства. В любом случае как в результате подготовки донорской ткани к безопасному применению, так и в силу особенностей строения ткани порой адгезия клеток на ее поверхности достаточно низкая. Это, в последующем, отрицательно отражается на процессе ревитализации трансплантата в организме пациента.

Одним из способов повышения биосовместимости трансплантатов аллогенной костной ткани является насыщение их коллагеном. Эффект достигается за счет формирования дополнительного слоя низкокомпактизированного коллагена I типа, облегчающего фиксацию клеток на поверхностях трансплантата . Для этого специалисты, как правило, используют его суспензию. Однако поскольку коллаген образует не истинный водный раствор, а коллоидную гидрофильную систему, то успех процедуры насыщения костной ткани коллагеном зависит от концентрации белка. Так, при высокой концентрации коллагена, из-за силы сцепления между молекулами, существенно снижается текучесть и, следовательно, проникающая способность суспензии. С другой стороны, при низких значениях - коллагена может оказаться недостаточно для равномерного распределения в ячейках костного трансплантата после лиофилизации. При этом по мере внедрения в практику способов подготовки костных трансплантатов наиболее актуальным является разработка режимов насыщения костной ткани в зависимости от используемой концентрации коллагена и типа костной ткани для увеличения биосовместимости получаемого трансплантата.

Наиболее близким к заявляемому решению является способ получения комбинированного костного аллотрансплантата (патент РФ 2524618), который представляет собой не деминерализованный костный блок, полученный из губчатой кости донора, и содержащий по всему объему костного блока коллаген 1 типа человека в виде губки с мелкоячеистой структурой, полученной при лиофильной сушке костного блока, пропитанного раствором коллагена. Способ получения трансплантата включает изготовление не деминерализованного костного блока из губчатой кости донора, пропитку костного блока раствором коллагена 1 типа человека с последующей лиофилизацией при условиях, обеспечивающих превращение раствора коллагена в губку с мелкоячеистой структурой по всему объему костного блока. Биосовместимый комбинированный костный трансплантат обладает механической прочностью, остеокондуктивным эффектом и стимулирует остеогенез. Лиофилизация представляет последовательное прохождение следующих этапов: замораживание образцов до температуры -40°C, создание вакуума, поддержание данной температуры в течение 1 часа, повышение температуры до +36°C и выдержка образцов в течение 2 часов при данной температуре. Пропитку костного блока раствором коллагена осуществляют путем высверливания сквозных отверстий диаметром 2 мм в различных направлениях костного блока с последующим погружением его в 10% раствор коллагена 1 типа человека и прокачиванием шприцем (без использования иглы) раствора коллагена сквозь указанные отверстия.

Однако данный способ имеет ряд недостатков. Способ предназначен для насыщения коллагеном только трансплантатов, состоящих исключительно из губчатой костной ткани. При этом, не смотря на её пористую структуру, требует дополнительного высверливания сквозных отверстий 2 мм. Прокачивание коллагена шприцем не позволяет использовать золи с низкой текучестью, обусловленной более высокими концентрациями коллагена. При этом отсутствуют критерии оценки полноты насыщения трансплантата золем коллагена. В итоге степень насыщения коллагеном губчатой костной ткани может варьироваться в широких пределах. Кроме того, известный способ неприменим для трансплантатов, поверхность которых представлена компактной костной тканью. Таким образом, известный способ не обеспечивает максимальной насыщенности коллагеном костной ткани с учетом используемой концентрации коллагена и типа костной ткани, которая проявляется в заполнении естественных и сформированных полостей, а также равномерности распределения коллагена по объему трансплантата, что значительно улучшает его остеокондуктивные свойства.

Технической проблемой является преодоление указанных недостатков с обеспечением насыщенности коллагеном костной ткани различных типов при использовании различной концентрации коллагена.

Раскрытие изобретения

Техническим результатом, на достижение которого направлено заявленное изобретение, является более полное насыщение трансплантата костной ткани любого типа золем коллагена 1 типа с концентрацией от 0,6 до 1,4%.

В качестве костной ткани могут быть использованы губчатая, компактная костные ткани или их сочетание. Заявляемый способ расширяет возможности модификации и повышения биосовместимости костных трансплантатов любых типов. При этом способ обеспечивает более полное насыщение костной ткани коллагеном и высокую воспроизводимость.

Технический результат достигается при осуществлении способа насыщения коллагеном трансплантата губчатой, компактной костной ткани или их сочетания, согласно которому при использовании компактной костной ткани в ней формируют отверстия, затем один или несколько трансплантатов помещают в контейнер, в который добавляют золь с концентрацией коллагена от 0,6 до 1,4% в таком количестве, чтобы он полностью покрывал трансплантат; далее осуществляют центрифугирование в течение 20 минут с ускорением 100g при использовании золя с концентрацией коллагена 0,6-0,79%, 300g – при 0,8-0,99%, 700g – при 1,0-1,19%, 1300g – при 1,2-1,4%, соответственно; далее после центрифугирования оценивают количество (уровень) оставшегося золя в контейнере, в случае его снижения – в контейнер добавляют до исходного значения золь с соответствующей концентрацией коллагена и проводят повторное центрифугирование при тех же режимах; этапы центрифугирования повторяют до прекращения убыли золя (макроскопического признака насыщения трансплантата); после чего проводят лиофилизацию коллагена в составе костных трансплантатов в вакуумной сушке.

Таким образом, технический результат достигается за счет формирования центробежной силы такой величины, при которой коллаген остаётся равномерно распределённым в золе и в его составе проникает в трансплантат костной ткани.

Осуществление изобретения

При проведении исследований оптимальных параметров процесса насыщения костной ткани определяли максимальную величину ускорения центрифугирования (допустимый режим), при которой золь коллагена сохраняет целостность, а не разделяются на фракции. Исследование проводили на образцах золей с концентрациями коллагена 0,6-0,79%, 0,8-0,99%, 1,0-1,19%, 1,2-1,4%, 1,7%. По 10 мл каждого раствора помещали в отдельную центрифужную пробирку типа Falcon объемом 15 мл. Пробирки центрифугировали в течение 20 минут с ускорением 100 g и выше. После центрифугирования визуально оценивали разделение коллагенового раствора на фракции. Если золь сохранялся в виде единой коллоидной системы, режим центрифугирования считали «допустимым», если происходило разделение золя на фракции, режим центрифугирования считали «недопустимым». Допустимый режим последовательно увеличивали с шагом 100 g и проводили центрифугирование вплоть до достижения режима, при котором появлялось разделение золя коллагена на фракции. В процессе исследования были определены максимальные режимы ускорения, при которых, не происходило разделения коллагена на фракции («максимально допустимый» режим). Результаты опытов представлены в таблице 1.

Таблица 1. Определение величины максимального режима ускорения, при котором не происходит разделения коллагенового раствора на фракции

Концентрация коллагена в растворе, %	Величина максимально допустимого режима центрифугирования, g
пределы	среднее
0,6 – 0,79	0,7	100
0,8 – 0,99	0,9	300
1,0 – 1,19	1,1	700
1,2-1,39	1,3	1300
1,7%	1,7	2700

Таким образом, максимально допустимым режимом центрифугирования золя с концентрацией коллагена 0,6-0,79% является ускорение 100 g; 0,8-0,99% – 300 g, 1,0-1,19% – 700 g, 1,2-1,4% - 1300 g, 1,7% – 2700 g соответственно.

Далее оценивали возможность, используя максимально допустимые режимы, насыщать золем коллагена костные трансплантаты, состоящие из губчатой, компактной костной ткани или их сочетания. Для этого в трансплантатах компактной костной ткани или включающих её формировали отверстия диаметром 2 мм. Отверстия располагали в «шахматном» порядке, с плотностью 5 отверстий на 6,25 см² поверхности трансплантата (квадрат 2,5*2,5 см), на всю толщину компактной костной ткани. Если трансплантат состоял только из губчатой костной ткани - его не перфорировали. По одному образцу трансплантатов губчатой, компактной костной ткани и их сочетания помещали в один контейнер. Затем в контейнер добавляли золь с концентрацией коллагена 0,6%; 0,7%; 0,79%; 0,8%; 0,9%; 0,99%; 1,0 %; 1,1%; 1,19%; 1,2%; 1,3%; 1,4%; 1,7% в таком количестве, чтобы трансплантат был полностью погружен в него. А на контейнере отмечали исходный уровень золя, его концентрацию.

Контейнеры закрывали и центрифугировали 20 минут с ускорением, допустимым для советующих концентраций золя. После первого центрифугирования визуально оценивали уровень раствора коллагена и сохранение целостности коллоидной системы. На основании этих критериев давали характеристику выбранному режиму:

• Достаточный и допустимый – режим, при котором уровень золя коллагена убывал и коллоидная система оставалась стабильной. В этом случае в ёмкость добавляли раствор коллагена до исходной метки;

• Достаточный, но недопустимый - режим, при котором уровень золя коллагена убывал, но происходило расслоение коллоидной системы. В этом случае режим уменьшали на 20%. В ёмкость добавляли раствор коллагена до исходной метки, осадок перемешивали и повторяли процедуру центрифугирования с последующей оценкой;

• Недостаточный, но допустимый - режим, при котором уровень золя коллагена не убывал, но коллоидная система оставалась стабильной. В этом случае режим увеличивали на 100g и повторяли центрифугирование, оценку.

• Недостаточный, не допустимый - режим, при котором уровень золя коллагена не убывал, а коллоидная система расслаивалась. Далее не использовали.

Центрифугирование, визуальную оценку уровня и добавление золя коллагена повторяли до тех пор, пока уровни золя до и после центрифугирования не становились идентичными, что расценивали как макроскопический признак насыщения трансплантата. Затем трансплантаты лиофилизировали, распиливали и исследовали. С помощью флуоресцентного микроскопа вызывали аутофлуоресценцию коллагена и оценивали его проникновения в кость. В качестве контроля использовали образцы трансплантатов губчатой, компактной костной ткани или их сочетание, не подвергавшиеся насыщению коллагеном.

Наличие коллагена внутри костных трансплантатов определяли с помощью конфокального микроскопа, используя эффект автофлуоресценции коллагена (λ возбуждения – 404 нм). Коллаген в составе костных трабекул имеет интенсивную гомогенную автофлуоресценцию (40 фут-кандел и выше), при этом неразличимы фибриллярные или сетчатые структуры. Напротив, коллаген, полученный после лиофилизации коллагенового раствора, имеет диффузно-сетчатый вид, уровень автофлуоресценции варьирует в зависимости от концентрации исходного раствора. В заключение соотносили полученные результаты и макроскопические признаки, использовавшиеся для оценки достаточности и допустимости режима.

На спилах контрольных костных трансплантатов можно было отчетливо наблюдать костные трабекулы, а также полости между ними, в которых диффузный коллаген отсутствовал (фиг. 1а). В образцах костных трансплантатов всех типов, подвергшихся насыщению золями с концентрациями коллагена от 0,6 до 1,4%, можно было видеть диффузную автофлуоресценцию лиофилизированного коллагена между трабекулами (фиг. 1б-д) с интенсивностью от 7 до 15 фут-кандел, что свидетельствует о проникновении золя коллагена на всю глубину трансплантата. В то же время, на образцах, центрифугировавшихся в золях с 1,7% коллагена, автофлуоресценции не выявляли (фиг. 1е), что говорит о низкой плотности коллагена. Таким образом, можно заключить, что достигнутая плотность коллагена внутри трабекул является адекватной при использовании 0,6-1,4% раствора коллагена. Раствор с концентрацией коллагена 1,7% не позволяет эффективно насыщать коллагеном трансплантаты костной ткани.

В соответствии с полученными результатами исследований насыщение коллагеном трансплантата губчатой, компактной костной ткани или их сочетания проводят следующим способом.

В трансплантатах компактной костной ткани или её содержащих дрелью со сверлом 1-2 мм формируют отверстия. При этом отверстия могут быть расположены в «шахматном» порядке, например, с плотностью 5 отверстий на 6,25 см² поверхности трансплантата (квадрат 2,5*2,5 см), на всю толщину. Трансплантаты, содержащие только губчатую костную ткань, насыщают без формирования дополнительных перфораций.

Один или несколько трансплантатов помещают в контейнер, в который затем добавляют золь с концентрацией коллагена от 0,6 до 1,4% в таком количестве, чтобы он полностью покрывал трансплантаты. Полученный уровень отмечают на контейнере. Затем его герметично закрывают и центрифугируют 20 минут с ускорением 100g при использовании 0,6-0,79% золя коллагена, 300g – при 0,8-0,99%, 700g – при 1,0-1,19%, 1300g – 1,2-1,39%, соответственно. После центрифугирования визуально оценивают уровень золя. В случае его снижения – восстанавливают до исходного значения золем с соответствующей концентрацией коллагена и повторно центрифугируют контейнер. Этапы «оценка уровня золя», «восстановления уровня» и «центрифугирование» повторяют до прекращения убыли уровня золя (макроскопического признака насыщения трансплантата). В заключение коллаген в составе костных трансплантатов лиофилизируют в вакуумных сушках.

Пример

Апробацию заявляемого способа провели на 4 трансплантатах кортикальной костной ткани, 4 трансплантатах губчатой костной ткани, 4 трансплантатах, содержащих компактную и губчатую костную ткань. В компактной костной ткани дрелью со сверлом 1-2 мм сформировали отверстия в «шахматном» порядке, с плотностью 5 отверстий на 6,25 см2 поверхности трансплантата (квадрат 2,5*2,5 см), на всю толщину компактной костной ткани. Трансплантаты губчатой костной ткани дополнительно не перфорировали.

Все образцы равномерно разложили в 4-е контейнера, так чтобы в каждом были все три типа костных трансплантатов. Затем в контейнеры внесли золь с концентрацией коллагена от 0,6 до 1,4% в таком количестве, чтобы он полностью покрывал трансплантаты. Полученный уровень отметили на контейнере. Затем их герметично закрыли и центрифугировали 20 минут с ускорением 100g при заполнении золем с 0,6-0,79% коллагена, 300g – при 0,8-0,99%, 700g – при 1,0-1,19%, 1300g – 1,2-1,39%, соответственно. После первого центрифугирования во всех контейнерах отмечали снижения уровня золя. Для его восстановления в контейнеры добавляли золь с соответствующей концентрацией коллагена, после чего центрифугирование повторяли. Всего было 2 повтора этапов «оценка уровня золя», «восстановления уровня» и «центрифугирование». После прекращения убыли уровня золя (макроскопического признака насыщения трансплантата) образцы были лиофилизированы в вакуумных сушках.

При исследовании коллаген-насыщенных трансплантатов костной ткани с помощью флуоресцентного микроскопа отметили во всех образцах диффузную автофлуоресценцию лиофилизированного коллагена между трабекулами с интенсивностью от 7 до 15 фут-кандел.

Затем коллаген-насыщенные трансплантаты костной ткани совмещали с культурой фибробластов человека линии М-22. Суспензию клеток наносили в чашки Петри, в которых находились фрагменты костных трансплантатов, насыщенных коллагеновыми растворами разной концентрации (опыт), а также костные трансплантаты без коллагена (контроль). Культивирование клеток проводили в стандартных условиях, морфофункциональный анализ клеток проводили на 3 и 7 сутки с момента посева. Было установлено, что на контрольных образцах губчатой кости (без коллагена) клетки не адгезировали в течение всего срока культивирования (фиг. 2а). На остальных образцах (с коллагеном) наблюдалась адгезия клеток, при этом наибольшее количество клеток было отмечено на поверхности трансплантатов с 0,7% коллагена – в этом случае через 3 суток культивирования количество клеток составило 6 тыс/см², через 7 суток – 9 тыс/см²; на поверхности трансплантатов с 0,9% коллагена число клеток через 3 и 7 суток составляло 2 и 4 тыс/см². При этом не наблюдалось снижения структурной целостности клеток, как на поверхности трансплантатов, так и на дне чашек Петри.

Способ насыщения коллагеном трансплантата губчатой, компактной костных тканей или их сочетания, включающий формирование отверстий в компактной костной ткани при ее использовании, затем один или несколько трансплантатов помещают в контейнер, в который добавляют золь с концентрацией коллагена от 0,6 до 1,4% в таком количестве, чтобы он полностью покрывал трансплантат; далее осуществляют центрифугирование в течение 20 минут с ускорением 100g при использовании золя с концентрацией коллагена 0,6-0,79%, 300g – при 0,8-0,99%, 700g – при 1,0-1,19%, 1300g – при 1,2-1,4% соответственно; после центрифугирования оценивают количество оставшегося золя в контейнере, в случае его снижения в контейнер добавляют до исходного значения золь с соответствующей концентрацией коллагена и проводят повторное центрифугирование при тех же режимах; этапы центрифугирования повторяют до прекращения убыли золя, после чего проводят лиофилизацию коллагена в составе костных трансплантатов в вакуумной сушке.