Лекарственный препарат на основе соединения сурьмы с биосовместимой матрицей
Владельцы патента RU 2752169:
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского» (RU)
Изобретение относится к области медицины, а именно к лекарственному препарату, обладающему бактерицидной активностью, на основе соединения сурьмы с биосовместимой матрицей. Препарат получают способом, включающим приготовление активной субстанции, для чего к полисурьмяной кислоте при постоянном перемешивании добавляют водный раствор однозамещённого фосфата натрия и водный раствор лигнина, проводят реакцию сополимеризации в течение 8-14 часов, приливают к полученному гелю дистиллированную воду до доведения pH = 1, готовят апплицирующий раствор, для чего к дистиллированной воде прибавляют углекислый натрий и хлористый натрий, после чего в емкость к активной субстанции порциями добавляют апплицирующий раствор при перемешивании, затем верхний слой раствора удаляют, а осадок сушат при температуре 25°С. При этом используют следующее соотношение компонентов, мас.%: полисурьмяная кислота - 30,3; однозамещённый фосфат натрия - 13; лигнин - 23,4; углекислый натрий - 7,6; хлористый натрий - 5,4; дистиллированная вода - 20,3. Техническим результатом изобретения является расширение арсенала противомикробных препаратов, обладающих высокой противомикробной активностью и низкой токсичностью. 3 з.п. ф-лы, 1 ил., 6 табл., 3 пр.
Предлагаемое изобретение относится к области медицины, касается лекарственного препарата на основе соединения сурьмы с биосовместимой матрицей, который может быть использован для лечения бактериальных или протозойных инфекционных заболеваний в ветеринарии.
Одной из актуальнейших задач современного российского здравоохранения (ветеринарии) является создание и развитие отечественного производства современных высокоэффективных антибактериальных и противопаразитарных препаратов. Рынок характеризуется высокой потребностью в препаратах данного профиля. Каждая вспышка заболеваний животных приводит к серьезному экономическому ущербу и несет в себе угрозы не только для развития животноводства, но и для населения: более 80% инфекционных заболеваний являются общими для человека и животных.
В настоящее время рынок противопротозойных фармацевтических препаратов разнообразен. Однако, практически все известные и применяемые препараты имеют ряд серьезных недостатков: узкий спектр действия, пагубное воздействие на организм. Следовательно, поиск универсального и безопасного препарата продолжается и является весьма актуальной задачей.
Известен способ получения препарата для инъекций, обладающий противовирусными свойствами, представляющий собой сополимер трехвалентной сурьмы Sb(III) и натрия вольфрамата (GB 1487397, кл. A61K 33/24, C01G 41/00, опубл. 28.09.1977 г.).
Данный препарат обладает высоким токсическим воздействием на организм в виду высокой концентрации трехвалентной сурьмы Sb(III).
Известен способ получения пористых неорганических сорбентов, который включает в себя соединения сурьмы с раствором однозамещенного фосфата натрия и метасиликата натрия с осаждением геля (SU 1156728 А1, кл. B01J 20/00. опубл. 23.05.1985 г.).
Данный сорбент не пригоден для лечения вирусных заболеваний так, как сурьма находится в связанном состоянии, при котором теряются терапевтические свойства.
Известен способ получения лекарственного препарата "Витасорб" (RU 2270684 С1, кл. A61K 33/24, A61P 31/12, опубл. 27.02.2006 г.) для лечения вирусных заболеваний и профилактики инфекционных эпизоотических процессов, включающему действующее вещество на основе сурьмы и силиката натрия, представляющее собой мелкокристаллический сорбент, состоящий из структурных звеньев формулы имеющий размер частиц 1×10-5-9×10-5 мкм, в виде дозы 100-200 мг/кг.
Недостаток данного изобретения заключается в низкой абсорбционной емкости, что приводит к снижению терапевтического эффекта за счет увеличения токсического воздействия продуктов распада вирусов и микроорганизмов.
Практически все противопротозойные препараты оказывают ряд отрицательных побочных действий на организм, включая общую интоксикацию организма продуктами распада паразитов и простейших. Включение в состав противопротозойных препаратов биосовместимой матрицы существенно снижает отрицательное воздействие препарата. В качестве такой биосовместимой матрицы могут выступать - пористые энтеросорбенты, которые не только обеспечивают связывание и доставку активной субстанции лекарственного препарата, но и являются составной частью терапии, конечной целью которой является прекращение действия токсинов различного происхождения и их элиминация из организма (Ю. А. Тунакова, Е. С. Мухаметшина, Ю. А. Шмакова. Оценка сорбционной емкости биополимерных сорбентов на основе лигнина в отношении металлов // Вестник Казанского технологического университета - 2011, Т. 9. С. 74-79. Беляков Н. А. Энтеросорбция - механизм лечебного действия / Н. А. Беляков, А.В. Соломенников // Эфферентная терапия. - 1997, № 2. Решетников В. И. Оценка адсорбционной способности энтеросорбентов и их лекарственных форм / В. И. Решетников // Химико-фармацевтический журнал. - 2003. Т. 37. № 5. С. 28-32.).
В задачу изобретения положено создание нового лекарственного препарата на основе соединения сурьмы с биосовместимой матрицей и способа его получения.
Техническим результатом от использования предлагаемой группы изобретений является расширение арсенала противомикробных препаратов, обладающих высокой противомикробной активностью и низкой токсичностью.
Поставленная задача решается тем, что лекарственный препарат, обладающий бактерицидной активностью, на основе соединения сурьмы с биосовместимой матрицей, полученный способом, включающим приготовление активной субстанции, для чего к полисурьмяной кислоте при постоянном перемешивании добавляют водный раствор однозамещённого фосфата натрия и водный раствор лигнина, проводят реакцию сополимеризации в течение 8-14 часов, приливают к полученному гелю дистиллированную воду до доведения pH = 1, готовят апплицирующий раствор, для чего к дистиллированной воде прибавляют углекислый натрий и хлористый натрий, после чего в емкость к активной субстанции порциями добавляют апплицирующий раствор при перемешивании, затем верхний слой раствора удаляют, а осадок сушат при температуре 25°С, при этом используют следующее соотношение компонентов, мас.%: полисурьмяная кислота - 30,3; однозамещённый фосфат натрия - 13; лигнин - 23,4; углекислый натрий - 7,6; хлористый натрий - 5,4; дистиллированная вода - 20,3; для получения полисурьмяной кислоты к 30,3 % оксида сурьмы (III) добавляют 67,7% дистиллированной воды, после чего смесь нагревают при 100°С в реакторе из нержавеющей стали при атмосферном давлении, затем реакционную смесь промывают дистиллированной водой до достижения промывных вод pH = 6 и высушиваю при температуре 20°С; получение раствора однозамещённого фосфата натрия осуществляют путем растворения 13% однозамещённого фосфата натрия в 87% дистиллированной воды при 20°С; получение раствора лигнина осуществляют путем растворения 23,4% лигнина в 76,6% дистиллированной воды при 20°С.
На фиг. 1 представлена рентгенограмма лекарственного препарата на основе соединения сурьмы с биосовместимой матрицей.
Лекарственный препарат представляет собой полученный совместной поликонденсацией продуктов гидролиза трехокиси сурьмы и лигнина (который выступает в роли биосовместимой матрицы), мелкокристаллический сорбент, действие которого избирательно направлено на подавление жизнедеятельности возбудителей инфекционных заболеваний, таких как бактерии, грибы, простейшие, вирусы, за счет сочетания противомикробного и адсорбционного действия. Механизм противомикробного действия лекарственного препарата состоит в том, что, он приводит к подавлению инфекционной активности возбудителей за счет подавление синтеза нуклеиновых кислот и соответствующих им белков, которые используются организмом паразита и нарушение синтеза клеточной стенки микроорганизмов, паразитов и простейших посредством ингибирования синтеза пептидогликана при воздействии сурьмы. Биосовместимая матрица, в роли которой выступает молекула лигнина, обеспечивает сорбцию (связывание) и выведение из организма токсичных продуктов распада возбудителя. Лигнин является природным этеросорбентом, обладающий высокой биосовместимостью (не вызывает побочных клинических проявлений и индуцирует клеточный или тканевой ответ, необходимый для достижения оптимального терапевтического эффекта) и хорошей сорбционной емкостью.
Предлагаемый лекарственный препарат на основе соединения сурьмы с биосовместимой матрицей с помощью предлагаемого способа осуществляют следующим образом.
Получают полисурьмяную кислоту. Для этого к 30,3% оксида сурьмы (III) добавляют 69,7% дистиллированной воды. Смесь нагревают при 100°С в реакторе из нержавеющей стали при атмосферном давлении. Реакционную смесь промывают дистиллированной водой до достижения промывных вод pH = 6 и затем высушиваю при температуре 20°С.
Готовят раствор однозамещённого фосфата натрия. Для этого 13% однозамещённого фосфата натрия растворяют в 87% дистиллированной воды при 20°С.
Готовят раствор лигнина. Для этого 23,4% лигнина растворяют в 76,6% дистиллированной воды при 20°С.
Готовят лекарственный препарат. Для этого к 30,3 % полисурьмяной кислоты при постоянном перемешивании добавляют 13% раствора однозамещённого фосфата натрия и 23,4% раствора лигнина. В течение 8-14 часов проводят реакцию сополимеризации. К полученному гелю приливают дистиллированную воду до доведения pH = 1 и оставляют на 24 часа. Готовят апплицирующий раствор. Для этого к дистиллированной воде добавляют 7,6% углекислого натрия и 5,4% хлористого натрия. При этом используют общее количество дистиллированной воды, составляющее 20,3%. В емкость к гелю, доведенному до pH = 1, небольшими порциями добавляют апплицирующий раствор при перемешивании до pH = 7-8 и оставляют на 1 час. После указанного времени верхний слой раствора (воду) удаляют с помощью делительной воронки. Нижний слой (осадок) сушат при температуре 25°С 24 часа.
Получают лекарственный препарат со структурной формулой
Полученный лекарственный препарат представляет собой мелкокристаллический порошок коричневого цвета, без запаха, не растворимый в воде и в органических растворителях, обладающий сорбционной активностью, с суммарным объемом пор 0,68 г/см3, адсорбционной активностью по йоду 70%.
Для контроля и идентификации активной формы лекарственного препарата был проведен рентгенофазовый анализ с использованием рентгеновском дифрактометре XRD 6000 фирмы Shimadzu (CuKα излучение, геометрия съемки на отражение) с шагом сканирования 0.02°, в интервале 2θ 10-80°.). Рентгенограмма лекарственного препарата представлена на фиг. 1. Расположение пиков на рентгенограмме соответствует полисурьмяной кислоте, уширение пиков соответствует аморфному лигнину.
Для определения бактерицидной активности и цитоксичности полученного препарата были подготовлены:
1. Суспензия нативного препарата. Порошок лекарственного препарата 1 мг взвешивали, добавляли 1 мл стерильный физиологический раствор тщательно растирали и перемешивали шпателем.
2. Надосадок (2-часовой настой). Порошок лекарственного препарата 10 мг взвешивали добавляли 10 мл стерильного физиологического раствора.
Суспензию нативного препарата и надосадок термостатировали в течение 2-х часов при 37°С.
Для определения выраженного бактерицидного эффекта в тестовых системах in vitrо, изучали воздействие препарата на типовые штаммы бактерий.
Для культивирования бактерий использовался мясо-пептонный агар (МПА), pH 7,2-7,4. Суспензии микроорганизмов, содержащую 1,5˙108 микробных тел в 1 мл (начальная концентрация), готовили путем смыва забуфернным физиологическим раствором (pH 7,2-7,4) 24-часовой агаровой культуры.
Бактерицидную активность препарата определяли диффузионным методом в собственной модификации. Разливали МПА в чашки Петри (диаметр пластиковой чаши 8,5 см, высота агара в чашке 0,8 см). После застывания среды в агаре пробивали 4 лунки каждая диаметром 0,7 см. На поверхность агара засевали суспензию микроорганизмов (0,1 мл, 104 кл/мл) сплошным газоном по методу Дригальского. Затем в каждую лунку вносили 0,1 мл суспензии тестируемого препарата.
Результаты учитывали путем измерения диаметры зоны (см) задержки роста бактерий вокруг лунки с препаратом. Все эксперименты повторяли трижды, при оценке бактерицидной активности учитывали средний результат трех повторов.
Наличие выраженного (существенного) бактерицидного эффекта полагали, если суспензия препарата обеспечивала задержку роста бактерий диаметром свыше или равном 2,0 см.
Пример 1
Для проведения испытаний подготавливали суспензию и надосадок (2-часовой настой) лекарственного препарата, полученного следующим образом.
Получали полисурьмяную кислоту. Для этого к 0,5 кг оксида сурьмы (III) добавляли 0,2 л дистиллированной воды. Смесь нагревали при 100°С в реакторе из нержавеющей стали при атмосферном давлении. Реакционную смесь промывали дистиллированной водой до достижения промывных вод pH = 6. Реакционную смесь высушивали при температуре 20°С.
Готовили раствор однозамещенного фосфата натрия. Для этого 0,21 кг однозамещённого фосфата натрия растворяли в 0,5 л дистиллированной воды при 20°С.
Готовили раствор лигнина. Для этого 0,39 кг лигнина растворяли в 0,5 л дистиллированной воды при 20°С.
Готовили лекарственный препарат. К 0,5 кг полисурьмяной кислоты при постоянном перемешивании добавляли 0,2 л раствора однозамещённого фосфата натрия и 0,2 л раствора лигнина. В течение 8 часов проводили реакцию сополимеризации. К полученному гелю приливали воду до доведения pH = 1 и оставляли на 24 часа. Готовили апплицирующий раствор. Для этого к 0,2 л дистиллированной воды добавляли 0,13 кг углекислого натрия и 0,09 кг хлористого натрия. В емкость к гелю, доведенному до pH = 1, небольшими порциями добавляли апплицирующий раствор при перемешивании до pH = 7-8 и оставляли на 1 час. После указанного времени верхний слой раствора (воду) удаляли с помощью делительной воронки. Нижний слой (осадок) сушили при температуре 25°С 24 часа.
Для определения выраженного бактерицидного эффекта в тестовых системах in vitrо, изучали воздействие препаратов (суспензия и надосадок (2-часовой настой)) на типовые штаммы бактерий. Диаметр задержки роста бактерий представлен в таблице 1.
Таблица 1
| Штаммы бактерий | Форма лекарственного препарата | |
| суспензия (1 мг/мл) |
надосадок (2-часовой настой) (1 мг/мл) | |
| Диаметр задержки роста, мм |
||
| Escherichia coli ATCC 35218 | 4,2 | 4,0 |
| Enterococcus faecalis АТСС 29212 |
4,0 | 3,8 |
| Neisseria gonorrhoeae | 3,7 | 3,3 |
| Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 |
3,8 | 3,2 |
| Staphylococcus | 3,1 | 2,8 |
| Streptococcus | 3,0 | 2,8 |
| Neisseria meningitidis | 3,5 | 2,4 |
Для определения цитотоксичности изучали воздействие препарата (суспензия (1мг/мл) и надосадок (2-часовой настой (1мг/мл))) на тест-систему клеток клеточной линии НЕК 293. Действие препарата на клеточные культуры выявляли по жизнеспособности клеток, культивируемых в питательной среде. Результаты представлены в таблице 2.
Таблица 2
| Содержание клеток на мкл | День развития | ||
| 1 | 3 | 5 | |
| Плотность культуры, клеток/мм2 | |||
| 162.5 | 28 | 21 | 17 |
| 325 | 57 | 47 | 40 |
| 487.5 | 89 | 70 | 66 |
| 650 | 103 | 94 | 86 |
Пример 2
Для проведения испытаний подготавливали суспензию и надосадок (2-часовой настой) лекарственного препарата, полученного следующим образом.
Получали полисурьмяную кислоту. Для этого к 0,3 кг оксида сурьмы (III) добавляли 0,2 л дистиллированной воды. Смесь нагревали при 100°С в реакторе из нержавеющей стали при атмосферном давлении. Реакционную смесь промывают дистиллированной водой до достижения промывных вод pH = 6. Реакционную смесь высушиваю при температуре 20°С.
Готовили раствор однозамещенного фосфата натрия. Для этого 0,13 кг однозамещённого фосфата натрия растворяли в 0,3 л дистиллированной воды при 20°С.
Готовили раствора лигнина. Для этого 0,23 кг лигнина растворяли в 0,4 л дистиллированной воды при 20°С.
Готовили лекарственный препарат. К 0,31 кг полисурьмяной кислоты при постоянном перемешивании добавляли 0,2 л раствора однозамещённого фосфата натрия и 0,2 л раствора лигнина. В течение 12 часов проводили реакцию сополимеризации. К полученному гелю приливали воду до доведения pH = 1 и оставляли на 24 часа. Готовили апплицирующий раствор. Для этого к 0,2 л дистиллированной воды добавляли 0,07 кг углекислого натрия и 0,05 кг хлористого натрия. В емкость к гелю, доведенному до pH = 1, небольшими порциями добавляли апплицирующий раствор при перемешивании до pH = 7-8 и оставляют на 1 час. После указанного времени верхний слой раствора (воду) удаляли с помощью делительной воронки. Нижний слой (осадок) сушили при температуре 25°С 24 часа.
Для определения выраженного бактерицидного эффекта в тестовых системах in vitrо, изучали воздействие препаратов (суспензия и надосадок (2-часовой настой)) на типовые штаммы бактерий. Диаметр задержки роста бактерий представлен в таблице 3.
Таблица 3
| Штаммы-бактерий | Форма лекарственного препарата | |
| Суспензия (1 мг/мл) |
надосадок (2-часовой настой) (1 мг/мл) |
|
| Диаметр задержки роста, мм |
||
| Escherichia coli ATCC 35218 | 3,8 | 3,3 |
| Enterococcus faecalis АТСС 29212 |
3,7 | 3,2 |
| Neisseria gonorrhoeae | 3,0 | 2,9 |
| Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 |
3,5 | 3,2 |
| Staphylococcus | 2 | 1,9 |
| Streptococcus | 2,1 | 1,9 |
| Neisseria meningitidis | 2,5 | 2,0 |
Для определения цитотоксичности изучали воздействие препарата (суспензия (1мг/мл) и надосадок (2-часовой настой (1мг/мл))) на тест-систему клеток клеточной линии НЕК 293. Действие препарата на клеточные культуры выявляли по жизнеспособности клеток, культивируемых в питательной среде. Результаты представлены в таблице 4.
Таблица 4
| Содержание клеток на мкл | День развития | ||
| 1 | 3 | 5 | |
| Плотность культуры, клеток/мм2 | |||
| 162.5 | 7 | 30 | 32 |
| 325 | 28 | 63 | 86 |
| 487.5 | 60 | 153 | 279 |
| 650 | 102 | 247 | 421 |
Пример 3
Для проведения испытаний подготавливали суспензию и надосадок (2-часовой настой) лекарственного препарата, полученного следующим образом.
Получали полисурьмяную кислоту. Для этого к 0,44 кг оксида сурьмы (III) добавляли 0,5 л дистиллированной воды. Смесь нагревали при 100°С в реакторе из нержавеющей стали при атмосферном давлении. Реакционную смесь промывали дистиллированной водой до достижения промывных вод pH = 6. Реакционную смесь высушивали при температуре 20°С.
Готовили раствор однозамещенного фосфата натрия. Для этого 0,19 кг однозамещённого фосфата натрия растворяли в 0,4 л дистиллированной воды при 20°С.
Готовили раствор лигнина. Для этого 0,34 кг лигнина растворяли в 0,5 л дистиллированной воды при 20°С.
Готовили лекарственный препарат. К 0,44 кг полисурьмяной кислоты при постоянном перемешивании добавляли 0,2 л раствора однозамещённого фосфата натрия и 0,2 л раствора лигнина. В течение 14 часов проводили реакцию сополимеризации. К полученному гелю приливали воду до доведения pH = 1 и оставляли на 24 часа. Готовили апплицирующий раствор. Для этого к 0,2 л дистиллированной воды добавляли 0,11 кг углекислого натрия и 0,08 кг хлористого натрия. В емкость к гелю, доведенному до pH = 1, небольшими порциями добавляли апплицирующий раствор при перемешивании до pH = 7-8, и оставляют на 1 час. После указанного времени верхний слой раствора (воду) удаляли с помощью делительной воронки. Нижний слой (осадок) сушили при температуре 25°С 24 часа.
Для определения выраженного бактерицидного эффекта в тестовых системах in vitrо изучали воздействие препаратов (суспензия и надосадок (2-часовой настой)) на типовые штаммы бактерий. Диаметр задержки роста бактерий представлен в таблице 5.
Таблица 5
| Штаммы-бактерий | Форма лекарственного препарата | |
| суспензия (1 мг/мл) |
надосадок (2-часовой настой) (1 мг/мл) |
|
| Диаметр задержки роста, мм |
||
| Escherichia coli ATCC 35218 | 3,7 | 3,3 |
| Enterococcus faecalis АТСС 29212 |
3,7 | 3,2 |
| Neisseria gonorrhoeae | 3,0 | 2,9 |
| Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 |
3,5 | 3,1 |
| Staphylococcus | 2 | 1,8 |
| Streptococcus | 2,0 | 1,8 |
| Neisseria meningitidis | 2,5 | 2,0 |
Для определения цитотоксичности изучали воздействие препарата (суспензия (1мг/мл) и надосадок (2-часовой настой (1мг/мл)) на тест-систему клеток клеточной линии НЕК 293. Действие препарата на клеточные культуры выявляли по жизнеспособности клеток, культивируемых в питательной среде. Результаты представлены в таблице 6.
Таблица 6
| Содержание клеток на мкл | День развития | ||
| 1 | 3 | 5 | |
| Плотность культуры, клеток/мм2 | |||
| 162.5 | 8 | 30 | 32 |
| 325 | 28 | 63 | 89 |
| 487.5 | 61 | 150 | 268 |
| 650 | 107 | 234 | 389 |
Из представленных примеров видно, что время 8 часов достаточно для формирования активной субстанции лекарственного препарата, при которой данный препарат проявляет выраженный бактерицидный эффект. Однако за 8 часов происходит неполное связывание сурьмы и как следствие наличие отрицательного цитотоксического эффекта и подавление числа здоровых клеток. Формирования активной субстанции в течение 12 часов достаточно для проявления выраженного бактерицидного эффекта и наличия положительного цитотоксического эффекта. Увеличении времени получения активной субстанции до 14 часов не оказывает существенного влияния на проявление бактерицидного и цитотоксического эффектов.
1. Лекарственный препарат, обладающий бактерицидной активностью, на основе соединения сурьмы с биосовместимой матрицей, полученный способом, включающим приготовление активной субстанции, для чего к полисурьмяной кислоте при постоянном перемешивании добавляют водный раствор однозамещённого фосфата натрия и водный раствор лигнина, проводят реакцию сополимеризации в течение 8-14 часов, приливают к полученному гелю дистиллированную воду до доведения pH = 1, готовят апплицирующий раствор, для чего к дистиллированной воде прибавляют углекислый натрий и хлористый натрий, после чего в емкость к активной субстанции порциями добавляют апплицирующий раствор при перемешивании, затем верхний слой раствора удаляют, а осадок сушат при температуре 25°С, при этом используют следующее соотношение компонентов, мас.%:
полисурьмяная кислота - 30,3;
однозамещённый фосфат натрия - 13;
лигнин - 23,4;
углекислый натрий - 7,6;
хлористый натрий - 5,4;
дистиллированная вода - 20,3.
2. Лекарственный препарат по п. 1, отличающийся тем, что для получения полисурьмяной кислоты к 30,3 % оксида сурьмы (III) добавляют 67,7% дистиллированной воды, после чего смесь нагревают при 100°С в реакторе из нержавеющей стали при атмосферном давлении, затем реакционную смесь промывают дистиллированной водой до достижения промывных вод pH = 6 и высушивают при температуре 20°С.
3. Лекарственный препарат по п. 1, отличающийся тем, что получение раствора однозамещённого фосфата натрия осуществляют путем растворения 13% однозамещённого фосфата натрия в 87% дистиллированной воды при 20°С.
4. Лекарственный препарат по п. 1, отличающийся тем, что получение раствора лигнина осуществляют путем растворения 23,4% лигнина в 76,6% дистиллированной воды при 20°С.
