Способ получения анатоксин-вакцины против эшерихиоза животных

Изобретение относится к фармацевтике и ветеринарии. Способ получения вакцины против эшерихиоза животных включает отбор эпизоотических штаммов Escherichia coli, обладающих генами термолабильного, термостабильного и шигаподобного токсинов, их культивирование на питательном бульоне при температуре 37°С в течение 6-7 дней с ежедневным двукратным перемешиванием и дальнейшую инактивацию формалином до его конечной концентрации 0,4% в течение 14 суток с последующим смешиванием в равных объемах и отделением бактериальной массы с помощью стерилизующей фильтрации. Затем добавляют адъюванты, в качестве которых используют препарат пирогенала, содержащий 100 мкг/мл действующего вещества, и 3% водный раствор полиакриловой кислоты, которые вносят в бесклеточную культуральную среду, содержащую термолабильные, термостабильные и шигаподобные токсины Escherichia coli, поочередно с последующим перемешиванием до получения однородной смеси и при следующем соотношении компонентов, мас.%: раствор пирогенала, содержащий 100 мкг/мл действующего вещества, 9-11; 3% водный раствор полиакриловой кислоты 9-11; бесклеточная культуральиая среда, содержащая термолабильные, термостабильные и шигаподобные токсины Escherichia coli, - до 100. Использование данного изобретения позволяет получить вакцину, введение которой обеспечивает более напряженный и продолжительный специфический иммунитет против эшерихиозной инфекции. 7 пр., 5 табл.

 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам конструирования вакцин, и может быть использовано в учреждениях, занимающихся созданием вакцинных препаратов для профилактики эшерихиоза у животных.

Установлено, что эффективными средствами специфической профилактики эшерихиоза у животных являются вакцины, содержащие в своем составе инактивированные экзотоксины патогенных Escherichia coli (Биологические препараты для специфической профилактики и терапии эшерихиоза животных / М.К. Пирожков // Дисс. док. вет. наук. - Москва. 2002. - 298 с.). В настоящее время есть исследования по использованию биопрепаратов, которые включают сразу три вида токсинов патогенных эшерихий: термолабильный (LT) и термостабильный (ST) и шигаподобный (STX) токсины, как в чистом виде, так и в сочетании с адъювантами (Караев Я.М. Иммуногенные и протективные свойства эшерихиозного анатоксина: дис…. канд. вет. наук / Я.М. Караев. - Краснодар: КубГАУ, 2009. - 132 с.; Тищенко А.С. Влияние адъювантов на иммуногенные свойства эшерихиозного анатоксина: дис.… канд. вет. наук / А.С. Тищенко. - Краснодар: КубГАУ, 2011. - 124 с.). Однако этими исследованиями было установлено, что эшерихиозный анатоксин стимулирует клеточные и гуморальные звенья иммунитета в первые сутки после введения препаратов, а использование адъювантов хоть и усиливает иммунный ответ, но на непродолжительное время. Учитывая данные обстоятельства, необходимо искать новые способы повышения иммуногенной активности вакцинных препаратов на основе инактивированных токсинов кишечной палочки. Известна вакцина против эшерихиоза животных (патент РФ №2043771, кл. А61К 39/108, 1995 г.) изготовленная из соматических - Q78, Q141; белковых адгезивных - К88, К99, 987Р, F41; капсульных полисахаридных антигенов - К80. К87, а также включает ТЛ и ТС-анатоксины. В настоящее время данная вакцина прошла модернизацию путем добавления штаммов эшерихий и включением помимо ТЛ и ТС шигаподобных токсинов (VT1 и VT2 анатоксины) кишечной палочки, инактивированных формалином в количестве 0,4% с добавлением в качестве адъюванта геля гидрата окиси алюминия в количестве 25% В 1 см³ вакцины содержится 10 млрд микробных тел эшерихий. Коммерческое название - Вакцина против эшерихиоза животных Вероколивак К88, К99, 987Р, F41, ТЛ-, ТС-, VT1 и VT2 анатоксины (организация-производитель ФГУП «Армавирская биофабрика», Россия) (Вакцинопрофилактика эшерихиоза сельскохозяйственных животных // http://www.armbio.info/verokolivak.html; Вакцина против эшерихиоза животных // http://www.armbio.info/catalog/1006-3).

Недостатком данной усовершенствованной вакцины является то, что в ней содержится очень большое количество балластных антигенов в виде целых клеток Е. coli и нерастворимого минерального адъюванта, а это негативно сказывается на формировании у животных иммунной защиты, а так же развития у привитых животных побочных реакций и осложнений. Кроме того, способ получения такой вакцины очень сложен, поскольку требует раздельного культивирования 18 штаммов эшерихий.

Известно применение пирогенала и полиакриловой кислоты по-отдельности в качестве адъювантов для усиления иммуногенности эшерихиозного анатоксина, содержащим инактивированные токсины (TL, TS, STX) Е. coli (Терехов, В.И. Влияние различных адъювантов на иммуногенные свойства эшерихиозного анатоксина / В.И. Терехов, Я.М. Караев, А.С. Тищенко, А.В. Иванов // Тр. / КубГАУ. - 2009. - Вып. №1 (ч. 1) Серия: Ветеринарные науки. - С. 100-102.; Тищенко А.С. и др. Влияние бактериального полисахарида и полиэлектролита на иммуногенные свойства эшерихиозного анатоксина // Молодой ученый. - 2016. - №20 (124). - С. 113-115.; Тищенко А.С., Терехов В. И., Сердюченко И.В. Иммуногенность эшерихиозного анатоксина при использовании с пирогеналом и полиакриловой кислотой // Научное обеспечение агропромышленного комплекса: сб. ст. по материалам X Всерос. конф. молодых ученых. - Краснодар: КубГАУ, 2017 - С. 287-288.).

Недостатком известных исследований является то, что эшерихиозный анатоксин с использованием в качестве адъюванта пирогенала и эшерихиозный анатоксин с использованием в качестве адъюванта полиакриловой кислоты обладали низкими иммуногенными свойствами, что негативно сказывалось на формировании и продолжительности поствакцинальной защиты у животных против токсинов кишечной палочки. Кроме того, биологической моделью в этих исследованиях выступали белые крысы и кролики и неизвестно, как будут проявлять себя компоненты вакцины на телятах и поросятах.

Известно применение адъювантов, в том числе полиакриловой кислоты и пирогенала, в сочетании с эшерихиозным анатоксином в опытах на стельных коровах и супоросных свиноматках (Тищенко А.С. Влияние адъювантов на иммуногенные свойства эшерихиозного анатоксина: дис…канд. вет. наук / А.С. Тищенко. - Краснодар: КубГАУ, 2011. - 124 с.; Тищенко, А.С. Оценка гуморального иммунного ответа у супоросных свиноматок, иммунизированных эшерихиозным анатоксином в сочетании с адъювантами / А.С. Тищенко, В.И. Терехов // Тр. / КубГАУ. - 2011. - Вып. №2 (29). - С. 144-147; Терехов, В.И. Влияние адъювантов на иммуногенные свойства эшерихиозного анатоксина при вакцинации стельных коров / В.И. Терехов, А.С. Тищенко // Ветеринария Кубани. - 2011. - №3. - С. 19-21; Тищенко А.С, Новикова Е.Н., Винокурова Д.П., Киященко А.А., Кремянский В.В. Распространение эшерихиоза поросят и способ его специфической профилактики / Политематический сетевой электронный научный журнал Кубанского государственного аграрного университета. - 2018. - №137. - С. 220-229), а также определена профилактическая эффективность данных препаратов
(Тищенко, А.С. Профилактическая эффективность эшерихиозного анатоксина при эшерихиозе поросят и телят / А.С. Тищенко, В.И. Терехов // Опыт международного сотрудничества в области экологии, лесного хозяйства, ветеринарной медицины и охотоведения: материалы II-й Междунар. науч.-практ. конф. / КубГАУ. - Краснодар, 2010. - С. 380-381).

Недостатком известных исследований является то, что эшерихиозный анатоксин с использованием по отдельности в качестве адъювантов пирогенала и полиакриловой кислоты обладали непродолжительным иммунным ответом, что отражалось на эффективности специфической профилактики эшерихиоза. Кроме того, адъювантные компоненты, применяемые с эшерихиозным анатоксином по-отдельности, в целом обладают слабой иммуногенно-стью и могут проявлять ректогенность.

Наиболее близким по технической сущности является способ получения эшерихиозного анатоксина (патент №2432174 от 27.10.2011, МПК А61К 39/108, C12N 1/20, А61Р 1/00), в котором, отбирают и раздельно культивируют эпизоотические штаммы Escherichia coli, обладающие генами термолабильного, термостабильного и шигаподобного токсинов, на питательном бульоне при температуре 37°С в течение 6-7 дней с ежедневным двукратным перемешиванием. Инактивацию культур проводят путем добавления формалина до концентрации не более 0,4%, при температуре 37°С в течение 14 суток с ежедневным двукратным перемешиванием. После чего отбирают и смешивают культуры в равных соотношениях, отделяют бактериальную массу с помощью стерилизующей фильтрации и получают комплексный препарат.

Недостатком данного способа является отсутствие адъювантов, и как следствие низкая иммуногенная активность препарата.

Техническим результатом изобретения является повышение эффективности специфической профилактики эшерихиоза у телят и поросят, повышение иммуногенности, безвредности и безопасности вакцины.

Технический результат достигается тем, что в способе получения вакцины против эшерихиоза животных, включающем отбор эпизоотических штаммов Escherichia coli, обладающих генами термолабильного, термостабильного и шигаподобного токсинов, их культивировании на питательном бульоне при температуре 37°С в течение 6-7 дней с ежедневным двукратным перемешиванием, затем их инактивируют формалином до его конечной концентрации 0,4% в течение 14 суток с ежедневным двукратным перемешиванием, затем отбирают и смешивают культуры в равных соотношениях, согласно изобретению, добавляют адъюванты, в качестве которых используют раствор пирогенала, содержащий 100 мкг/мл действующего вещества и 3% раствор полиакриловой кислоты, которые вносят в бесклеточную культуральную среду, содержащую термолабильные, термостабильные и шигаподобные токсины Escherichia coli поочередно с последующим перемешиванием до получения однородной смеси, при следующем соотношении компонентов, масс. %:

раствор пирогенала, содержащий 100 мкг/мл действующего вещества	9-11
3% водный раствор полиакриловой кислоты	9-11
бесклеточная культуральная среда, содержащая
инактивироваиные термолабильные,
термостабильные и шигаподобиыс токсины
Escherichia coli	до 100.

Новизна технического решения состоит в том, что за счет использования бесклеточных культур эпизоотических штаммов Escherichia coli, продуцирующих термолабильный, термостабильный и шигаподобный токсины, инактивированных формалином, при совместном использовании адъювантов: растворов пирогенала и полиакриловой кислоты обеспечивается повышение иммуногенных свойств вакцины и эффективность профилактики эшерихиоза у телят и поросят, а также безвредность биопрепарата за счет отсутствия после применения поствакцинальных реакций.

В патентной и научно-технической литературе не обнаружена аналогичная заявляемой совокупность признаков, что позволяет судить об изобретательском уровне заявляемого предложения.

Предложенный способ получения вакцины соответствует критерию «промышленная применимость» поскольку легко воспроизводим, не требует сложного технологического оборудования и условий.

Способ получения анатоксин-вакцины против эшерихиоза животных осуществляют следующим образом.

Первоначальные этапы получения эшерихиозного анатоксина осуществляли по патенту РФ на изобретение №2432174 от 27.10.2011, МПК А61К 39/108, C12N 1/20, А61Р 1/00.

Предварительно из эпизоотических штаммов Escherichia coli отобрали штаммы, обладающие генами термолабильного, термостабильного и шига-подобного токсинов. Для этого использовали тест-системы «АмплиСенс E.coli-tox» (Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии МЗ РФ, г. Москва). Подтверждение токсинообразования на искусственной питательной среде осуществляли с помощью биотеста на инфузориях-стилонихиях (патент РФ на изобретение 2262529 от 20.10.2005, МПК C12N 1/10, C12Q 1/10). По известному патенту, для испытания по выживаемости инфузорий использовали культуру кишечной палочки, выращенную на бульоне Хоттингера со сроком инкубации 1-3 суток, затем среду с инфузориями смешивали с бульонной культурой кишечной палочки в соотношении 3:1. При наличии в культуральной среде экзотоксинов, количество погибших инфузорий должно быть не менее 70-80%, в то время как количество погибших инфузорий в контрольной пробе, не содержащей токсин, не должно превышать 5%.

Отобранные штаммы по отдельности засевали в пробирки с 10 мл питательного бульона для накопления токсинов кишечной палочки, в состав которой входят кислотный гидролизат крови (9-11%), аутолизат пекарских дрожжей (9-11%), пептон (0,9-1,1%), нария хлорид (0,4-0,6%), двузаме-щенный фосфорнокислый натрий (0,05-0,15%) и калия хлорид (0,01-0,03%) (патент РФ на изобретение 2342425 от 27.12.2008, МПК C12N 1/20, C12Q 1/04). Затем их помещали в термостат и культивировали при 37°С в течение 6-8 ч до появления легкой мути, свидетельствующей о росте микроорганизмов. Далее полученные культуры переносили в колбы с 200-300 мл аналогичного питательного бульона и инкубировали при 37°С в течение: продуцирующие термолабильный и термостабильный - 6 суток, а продуцирующие шигаподобный токсин - 7 суток. Ежедневно 2 раза в сутки колбы встряхивали. Перед окончанием инкубирования из каждой колбы отобрали по 10 мл культуральной жидкости, центрифугировали при 10 тыс.об/мин в течение 30 мин и определяли методом биотестирования на инфузориях наличия токсинов.

При наличии токсинов в оставшиеся культуры добавили формалин до концентрации 0,3-0,4%. Инактивацию культур проводили в течение 14 суток при температуре 37°С с ежедневным двукратным перемешиванием. После завершения инактивации равные объемы культур объединяли, получив, таким образом, комплексный препарат, содержащий 3 вида антигенов. С помощью стерилизующей фильтрации отделили микробную массу от среды культивирования, получая, таким образом, бесклеточную культуральную среду Escherichia coli (эшерихиозный антигенный токсоидный компонент). Далее в бесклеточную культуральную среду Escherichia coli: вносили адъ-юванты: фармацевтический препарат пирогенал (липополисахарид, выделенный из микробных клеток Salmonella typhi, производитель ФГБУ НИЦЭМ им Н.Ф. Гамалеи Минздрава России) в 0,01% концентрации (раствор для внутримышечного введения 1 мл которого содержит 100 мкг действующего вещества)) и 3%>водный раствор полиакриловой кислоты (производства ООО Химдирект сервис, Москва) при следующем соотношении компонентов, мас. %:

пирогенал в 0,01%) концентрации	9-11
3%>водный раствор полиакриловой кислоты	9-11
бесклеточная культуральная среда, содержащая
инактивированные термолабильные,
термостабильные и шигаподобные токсины
Escherichia coli	до 100.

Эффективность анатоксин-вакцины против эшерихиоза зависит от свойств подобранных эпизоотических штаммов Escherichia coli, последовательности приготовления и процентного соотношения компонентов входящий в ее состав.

Количественные значения ввода адъювантов подобраны экспериментальным путем, при этом учитывалась иммуногенная активность анатоксин-вакцины. При вводе пирогенала и полиакриловой кислоты в объеме 8% иммуногенная активность повышалась, но все же была не достаточной для длительного сохранения поствакцинального иммунитета. При вводе адъювантов в объеме 12%, увеличения продукции специфических антител более значения, чем при их вводе в объеме 9-11% не происходило, а экономические затраты возрастали. Кроме того, вслед за повышением ввода полиакриловой кислоты возрастала опасность развития местной воспалительной реакции из-за раздражения тканей.

Полученную вакцину фасуют по 100 мл в стерильные флаконы, укупоривают и проверяют на стерильность и безвредность. По внешнему виду готовая вакцина представляет собой прозрачную жидкость светло-соломенного цвета без осадка и посторонних примесей. Срок хранения в сухом и темном помещении при температуре 4-10°С - 1 год.

Полученную анатоксин-вакцину проверяли на стерильность и безвредность.

При контрольных высевах анатоксина на МПА, МПБ, среду Китта-Тароцци, Сабуро, Эндо рост бактериальной и грибной флоры отсутствовал, что свидетельствовало о стерильности препарата.

При внутрибрюшинном введении анатоксина в дозе 0,3 мл белым мышам массой 20-22 г угнетения и гибели их в течение 10 дней не отмечали, что является показателем безвредности препарата.

Для доказательства эффективности предлагаемой анатоксин-вакцины, были проведены исследования на белых крысах, телятах и поросятах. Удовлетворительный результат был получен за счет оптимизации ввода пирогенала и полиакриловой кислоты, что демонстрируется следующими опытами.

Опыт 1 - в котором были представлены результаты исследований проведенных на белых крысах.

Было сформировано 4 группы белых крыс по 6 гол в каждой, которым внутримышечно однократно инъецировали по 0,15 мл препарата, в первой группе использовали эшерихиозный анатоксин без адъюванта (ЭА), во второй - эшерихиозный анатоксин с пирогеналом (ЭА+ЛПС), в третьей - эшерихиозный анатоксин с полиакриловой кислотой (ЭА+ПАК), в четверной -эшерихиозный анатоксин с пирогеналом и полиакриловой кислотой (ЭА+ЛПС+ПАК). Спустя 7, 14, 21, 60, 90 и 120 дней в реакции непрямой гемагглютинации определяли титр антител к токсинам Е. coli результаты опыта отражены в таблице 1.

Из данных таблицы видно, что у животных всех групп после ввода им анатоксина в течение 7 дней вырабатываются антитела. Однако, в группах 2 и 3 где он вводился с адъювантами, уровень антител был в 1,7 раза выше, чем у животных, которым анатоксин вводился без пирогенала и полиакриловой кислоты, а у животных группы 4 уровень антител был в 2 раза более высоким. В последующие дни у животных 1 группы уровень антител снижался, а вот у животных 2, 3 и 4 групп он повышался до 14 дня, превысив показатели 1 группы в 1,9, 1,8 и 2,4 раза соответственно. В последующем во всех группах установили постепенное снижение антител к 120 дню до значения 1,2±0,7, 2,0±0,6, 1,8±0,7 и 3,6±0,4 log2 соответственно. У животных 4 группы уровень антитоксических антител оставался самым высоким даже спустя 120 дней после иммунизации и был достаточным для защитного действия от токсинов Е. coli.

Опыт 2 - представлены результаты исследований проведенных на телятах и поросятах.

Для проведения исследований анатоксин-вакцину прививали стельным коровам и нетелям дважды подкожно. Первый раз за 30, а второй раз за 15 дней до отела в дозе 5 и 10 мл соответственно. Телят также прививали дважды, первый раз в возрасте 15-20 дней, а второй через 10-14 дней в дозе 1 и 2 мл соответственно.

Супоросным свиноматкам анатоксин-вакцину вводили внутримышечно дважды, первый раз за 30 дней, а второй раз за 20 дней до опороса в дозе 5 мл; поросят прививали первый раз в возрасте 15-17 дней, а второй - в возрасте 28-30 дней в дозе 0,25 и 0,5 мл соответственно.

Использование анатоксин-вакцины позволяет обеспечить защиту телят и поросят от эшерихиозной инфекции продолжительностью не менее 6 месяцев (срок наблюдения).

Приведено пять примеров (1-5) зависимости эффективности анатоксин-вакцины против эшерихиоза телят и поросят от соотношения заявленных компонентов из расчета на 100 мл вакцины и два примера (6, 7) демонстрирующие эффективность использования заявляемого изобретения.

Для примеров 1-5 использовали эпизоотические штаммы Escherichia coli, обладающие генами термолабильного, термостабильного и шигаподобного токсинов, проводили их культивирование на питательном бульоне при температуре 37°С в течение 6-7 дней с ежедневным двукратным перемешиванием, затем их инактивировали формалином до его конечной концентрации 0,4% в течение 14 суток с ежедневным двукратным перемешиванием, после чего отбирали и смешивали культуры в равных соотношениях, отделяли бактериальную массу с помощью стерилизующей фильтрации, для получения бесклеточной культуральной среды, в которую поочередно с последующим перемешиванием вносили адъюванты со следующими объемными количествами и процентным соотношением:

Пример 1. При следующем соотношении компонентов, масс. %:

пирогенал в 0,01% концентрации	8
3%>водный раствор полиакриловой кислоты	8
бесклеточная культуральная среда, содержащая
токсины Escherichia coli	до 100.

При данном соотношении компонентов анатоксин-вакцина обладает слабой протективной активностью и защищает от эшерихиозной инфекции, обусловленной патогенными Escherichia coli телят в 75%, а поросят в 72% случаев.

Пример 2. При следующем соотношении компонентов, масс. %:

пирогенал в 0,01%) концентрации	9
3%>водный раствор полиакриловой кислоты	9
бесклеточная культуральная среда, содержащая
токсины Escherichia coli	до 100.

При данном соотношении компонентов анатоксин-вакцина защищает от эшерихиозной инфекции, обусловленной патогенными Escherichia coli, в 86%, а поросят в 82% случаев.

Пример 3. При следующем соотношении компонентов, масс. %:

пирогенал в 0,01% концентрации	10
3% водный раствор полиакриловой кислоты	10
бесклеточная культуральная среда, содержащая
токсины Escherichia coli	до 100.

При данном соотношении компонентов анатоксин-вакцина защищает от эшерихиозной инфекции, обусловленной патогенными Escherichia coli, в 92%, а поросят в 87% случаев.

Пример 4. При следующем соотношении компонентов, масс. %:

пирогенал в 0,01% концентрации	11
3% водный раствор полиакриловой кислоты	11
бесклеточная культуральная среда, содержащая
токсины Escherichia coli	до 100.

При данном соотношении компонентов анатоксин-вакцина защищает от эшерихиозной инфекции, обусловленной патогенными Escherichia coli, в 94%, а поросят в 90% случаев.

Пример 5. При следующем соотношении компонентов, масс. %:

пирогенал в 0,01% концентрации	12
3% водный раствор полиакриловой кислоты	12
бесклеточная культуральная среда, содержащая
токсины Escherichia coli	до 100.

При данном соотношении компонентов анатоксин-вакцина защищает от эшерихиозной инфекции, обусловленной патогенными Escherichia coli, в 84%, а поросят в 80% случаев. На месте введения у отдельных животных, особенно из числа поросят развились плотные болезненные припухлости и повышение температуры тела.

Подтверждение эффективности использования анатоксин-вакцины для профилактики эшерихиоза у телят и поросят приведены в примерах 6 и 7.

Пример 6 - приведены результаты исследований использования анатоксин-вакцины для профилактики эшерихиоза у телят.

В хозяйстве Краснодарского края, неблагополучном по эшерихиозу телят, провели производственное испытание заявляемой анатоксин-вакцины. По данным ветеринарной лаборатории диарею у молодняка крупного рогатого скота в данном хозяйстве вызывают патогенные штаммы кишечной палочки. Эффективность вакцины, изготовленной по заявляемому способу, сравнивали с эффективностью прототипа, для этого было сформировано 3 группы стельных коров по 25 голов в каждой.

Первую группу коров иммунизировали заявляемой анатоксин-вакциной 1-й раз за 30 дней до отела в дозе 5 мл, 2-й раз за 15 дней до отела в дозе 10 мл. Полученных от этих коров телят, также иммунизировали заявляемой анатоксин-вакциной 1-й раз в возрасте 15-20 дней в дозе 1 мл, а 2-й - через 10-15 дней в дозе 2 мл. Вакцину вводили подкожно в область верхней трети шеи.

Вторую группу коров и полученных от них телят иммунизировали эшерихиозным анатоксином с пирогеналом по схеме и в дозах аналогичных в первой группе.

Третью группу коров и полученных от них телят иммунизировали эшерихиозным анатоксином с полиакриловой кислотой по схеме и в дозах аналогичных в первой группе.

Четвертую группу коров и полученных от них телят иммунизировали эшерихиозным анатоксином без адъювантов по схеме и в дозах аналогичных в первой группе.

Пятая группа коров была контрольной, они и полученные от них телята не иммунизировались.

Эффективность вакцин оценивали по достижении телятами 3-месячного возраста и перевода их другой корпус на групповое содержание. Критериями оценки служили показатели заболеваемости и летальности.

Результаты опыта отражены в таблице 2, из материалов которой, видно, что в первой группе эшерихиозная инфекция была зарегистрирована у 2 телят, при этом диарею у них удалось купировать в течение 3 дней, а на 5 день телята полностью выздоровели. Таким образом, профилактическая эффективность заявляемой вакцины составила 92%.

Во 2-й группе эшерихиозная инфекция была зарегистрирована у 5 телят, причем у одного теленка она протекала очень тяжело и закончилась гибелью животного. Профилактическая эффективность аналога составила 80%.

В третьей группе эшерихиозная инфекция была зарегистрирована у 6 телят, у двоих телят она протекала очень тяжело и закончилась гибелью животных. Профилактическая эффективность аналога составила 76%.

В четвертой группе эшерихиозная инфекция была зарегистрирована у 8 телят, из них у троих телят она протекала очень тяжело и закончилась гибелью животных. Профилактическая эффективность прототипа составила 68%.

В пятой группе из 25 телят заболело 18 животных, из которых 5 пали. Таким образом, в 3 группе заболеваемость составила 72%, а летальность - 27,8%, что свидетельствует о значительной тяжести болезни.

Следовательно, применение анатоксин-вакцины против эшерихиоза, полученной по заявляемому способу позволило более эффективно профилактировать заболевание телят эшерихиозной инфекцией. Заболеваемость телят привитых заявляемой вакциной составила 8%, а сохранность 100%, тогда как при использовании прототипа 1 заболеваемость телят составила 20%, а сохранность 96%, прототипа 2 - заболеваемость 24%, сохранность 92%, прототипа 3 - заболеваемость 32%, сохранность 88%. В контрольной группе заболеваемость телят острой кишечной инфекцией составила 12%, а сохранность 80%.

Иммуногенные свойства эшерихиозного анатоксина изучали у телят, полученных от вакцинированных стельных коров. Сыворотку крови для определения наличия антитоксических антител в реакции диффузной преципитации отбирали через 7, 14, 28 и 56 дней после последней их вакцинации.

Влияние применения анатоксин-вакцин на титр антител у телят представлены в таблице 3.

Из материалов таблицы 3 видно, что иммунизация коров и телят заявляемым способом обеспечивает более напряженный и продолжительный специфический иммунитет против эшерихиозной инфекции. Об этом свидетельствуют количество антител к токсинам кишечной палочки у телят, которых у животных первой группы в 2-16 раз больше, чем у животных из второй и третьей группы, и 8-32 раза больше, чем у животных четвертой и пятой групп.

Пример 7. Обоснование эффективности использования анатоксин-вакцины для профилактики эшерихиоза у поросят.

В хозяйстве длительно неблагополучном по эшерихиозу поросят сформировали 5 групп супоросных свиноматок по 5 животных в каждой.

В первой группе свиноматок и полученных от них поросят иммунизировали предлагаемой вакциной. Свиноматок иммунизировали первый раз за 30 дней до опороса в дозе 5 мл, второй раз - за 20 дней в дозе 5 мл внутримышечно в область основания ушной раковины. Поросят иммунизировали дважды первый раз в возрасте 15-17 дней в дозе 0,25 мл, а второй в возрасте 28-30 дней в дозе 0,5 дней внутримышечно в области внутренней поверхности бедра.

Вторую группу свиноматок и полученных от них поросят иммунизировали эшерихиозным анатоксином с пирогеналом по схеме и в дозах аналогичных в первой группе.

Третью группу свиноматок и полученных от них поросят иммунизировали эшерихиозным анатоксином с полиакриловой кислотой по схеме и в дозах аналогичных в первой группе.

Четвертую группу свиноматок и полученных от них поросят иммунизировали эшерихиозным анатоксином без адъювантов по схеме и в дозах аналогичных в первой группе.

Пятая группа свиноматок была контрольной, они и полученные от них поросята не иммунизировались.

За поросятами в течение 90 дней вели клиническое наблюдение, учитывали количество заболевших и павших животных. Результаты проведенного исследования представлены в таблице 3. Из материалов таблицы видно, что в 1-й группе от 5 свиноматок было получено 53 поросят, из которых заболело 8 голов и пало 2. Заболеваемость по группе составила 15,1%, смертность 3,8%. Следовательно, профилактическая эффективность заявляемого способа составила 84,9% при сохранности поросят в группе 96,2%.

Во 2-й группе, где свиноматки иммунизировались анатоксином с пирогеналом, родилось 52 поросенка, из которых 12 заболело и 4 пало. Заболеваемость по этой группе составила 23,1%, смертность 7,7%, профилактическая эффективность 78,9%, при сохранности 92,3%.

В 3-й группе было получено 54 поросенка, из них 14 заболело, 6 пало. Заболеваемость составила 25,9%, смертность 11,1%, профилактическая эффективность 74,1%, а сохранность 88,8%о.

В четвертой группе, где свиноматки вакцинировались анатоксином без адъювантов, родилось 53 поросенка, из них 20 заболело, 8 пало. Заболеваемость составила 37,7%, смертность 15,1%, профилактическая эффективность 62,3%, а сохранность 84,9%.

В 5-й группе было получено 53 поросенка, из них 28 заболело, 9 пало. Заболеваемость составила 52,8%, смертность 17%, сохранность 83%.

Следовательно, применение анатоксин-вакцины против эшерихиоза, полученной по заявляемому способу позволило более эффективно профилактировать заболевание поросят эшерихиозной инфекцией. При этом заболеваемость снизилась по сравнению с прототипом 1 на 8%, прототипом 2 на 10,8%, прототипом 3 на 22,6%, а в сравнении с труппой отрицательного контроля на 37,7%, при этом падеж сократился в 2-4,5 раза, что свидетельствует о высокой эффективности заявляемой анатоксин-вакцины.

Иммуногенные свойства эшерихиозного анатоксина изучали у поросят, полученных от вакцинированных супоросных свиноматок. Сыворотку крови для определения наличия антитоксических антител в реакции диффузной преципитации отбирали через 7, 14, 28 и 56 дней после последней их вакцинации.

Влияние применения анатоксин-вакцин на титр антител у поросят представлены в таблице 5.

Из материалов таблицы 5 видно, что иммунизация свиноматок и поросят заявляемым способом обеспечивает более напряженный и продолжительный специфический иммунитет против эшерихиозной инфекции. Об этом свидетельствуют количество антител к токсинам кишечной палочки у поросят, которых у животных первой группы в 2-32 раза больше, чем у животных из остальных групп.

Способ получения вакцины против эшерихиоза животных, включающий отбор эпизоотических штаммов Escherichia coli, обладающих генами термолабильного, термостабильного и шигаподобного токсинов, их культивирование на питательном бульоне при температуре 37°С в течение 6-7 дней с ежедневным двукратным перемешиванием, затем их инактивирование формалином до его конечной концентрации 0,4% в течение 14 суток с последующим смешиванием в равных объемах и отделением бактериальной массы с помощью стерилизующей фильтрации, отличающийся тем, что добавляют адъюванты, в качестве которых используют раствор пирогенала, содержащий 100 мкг/мл действующего вещества, и 3% водный раствор полиакриловой кислоты, которые вносят в бесклеточную культуральную среду, содержащую термолабильные, термостабильные и шигаподобные токсины Escherichia coli, поочередно с последующим перемешиванием до получения однородной смеси и при следующем соотношении компонентов, мас.%:

раствор пирогенала, содержащий 100 мкг/мл
действующего вещества	9-11
3% водный раствор полиакриловой кислоты	9-11
бесклеточная культуральиая среда, содержащая
термолабильные, термостабильные и шигаподобные
токсины Escherichia coli	до 100