Способ выявления энтероаггрегативных штаммов escherichia coli из толстой кишки у пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника
Изобретение относится к области биотехнологии. Способ реализуется тем, что в отличие от известных способов для обнаружения энтероаггрегативного штамма Escherichia coli используется набор из 4-х специфических праймеров к уникальному сочетанию SNP-полиморфизмов гена глутаматдекарбоксилазы (gad) штамма Escherichia coli ONT:H30 18-726; последовательности праймеров, используемых в первой реакционной смеси: F1: CGTCAGAACCTGGCCACTTTT; R1: TATCCGTTGGTTTGCCTGCA (размер ПЦР-продукта: 292 п.н.); последовательности праймеров второй реакционной смеси: F2: TCGACCTGCGTTGCGTAAAC; R2: CATCCCAGTAGCGGGCG (размер ПЦР-продукта: 240 п.н.), состав реакций: вода, пара праймеров - 0,4 мкМ каждого, 1х буфер для амплификации, концентрация Mg2+ - 2,5 мМ, 1х SybrGreen для детекции в режиме реального времени, 1х раствор полимеразы без экзонуклеазной активности, матрица ДНК - 5 мкл на 20 мкл реакционной среды, режим амплификации представлен следующим образом: 1) 95°С - 5 мин; 2) 95°С - 30 с (40 раз); 3) 65° - 20 с (40 раз); 4) 72°С - 20 мин; 5) 72°С - 5 мин; проведение детекции возможно как в режиме реального времени, так и методом гель-электрофореза. Изобретение позволяет улучшить диагностику осложнений, обусловленных EaggEC. 1 табл.
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области медицины, микробиологии и биохимии и может быть использовано при выполнении лабораторных анализов по выявлению энтероаггрегативных штаммов Escherichia coli.
Уровень техники
Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) являются многочисленной группой, включающей в свой состав такие заболевания как язвенный колит, болезнь Крона, синдром раздраженного кишечника. В отношении болезни Крона имеются литературные сведения о вкладе в патогенез адгезивно-инвазивных штаммов Escherichia coli [3; 4]. Также существует подход к изучению бактериома кишечника человека по образцам кала [6], а также биоптатам слизистой оболочки толстой кишки человека [1].
Тактика лабораторного исследования штаммов Escherichia coli заключается в выделении изолятов из клинического биоматериала, идентификации биохимическими и/или масс-спектрометрическими методами. Затем рекомендуется проводить специфическое типирование штаммов Escherichia coli по диареегенным группам (DEC - Diarrheagenic Escherichia coli).
Существует метод, описанный в исследовании Yun Ζ. с соавт.(2018), заключающийся в использовании комбинации одностадийной мультиплексной ПЦР и с обратной дот-блот-гибридицазией, который позволяет классифицировать 5 групп DEC при использовании 14 праймеров к генам: uidA, stx 1, stx 2, escV, ipaH, invE, estB, lt, pic, aggR, astA,bfpB, sth и stp [5].
Недостатком данного метода является необходимость создания специального микрожидкостного тонкопленочного чипа (АМТС) с адсорбцией на своей поверхности праймеров, что требует дополнительных материальных затрат и невозможность добавления праймеров к уже созданному чипу с 14 праймерами при необходимости скрининга на дополнительные гены у штаммов Escherichia coli.
Также известен метод, позволяющий выявить энтеротоксигенные кишечные палочки (ЕТЕС), которые продуцируют шига-токсин и соответственно обладают генами stx1 и stx2, метод основан на определении генов gadA и gadB, кодирующих глутаматдекарбоксилазу, которая присуща штаммам Escherichia coli и может являться референсной точкой в идентификации и группировки штаммов [2].
Недостатком предложенного варианта является невозможность выявления энтероаггрегативных штаммов Е. coli (EAggEC), а также он был апробирован на поиске специфических штаммов в природных объектах, на клиническом материале определение или прогноз эффективности выявления не проводился, метод требует дополнительных затрат на использование ДНК-зондов, что может быть существенным ограничивающим фактором на использование в лабораторной службе.
Раскрытие изобретения
Задачей изобретения является выявления энтероаггрегативных штаммов Escherichia coli (EaggEC) из толстой кишки у пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника для улучшения диагностики осложнений, обусловленных EaggEC.
Это достигается тем, что для обнаружения энтероаггрегативного штамма Escherichia coli используется набор из 4-х специфических праймеров к уникальному сочетанию SNP-полиморфизмов гена глутаматдекарбоксилазы (gad) штамма Escherichia coli ONT:H30 18-726; последовательности праймеров, используемых в первой реакционной смеси: F1:CGTCAGAACCTGGCCACTTTT; R1:TATCCGTTGGTTTGCCTGCA (размер ПЦР-продукта: 292 п.н.); последовательности праймеров второй реакционной смеси: F2:TCGACCTGCGTTGCGTAAAC; R2:CATCCCAGTAGCGGGCG (размер ПЦР-продукта: 240 п.н.), состав реакций: вода, пара праймеров - 0,4 мкМ каждого, 1х буфер для амплификации, концентрация Mg2+ - 2,5 мМ, lx SybrGreen для детекции в «режиме реального времени», 1х раствор полимеразы без экзонуклеазной активности, матрица ДНК - 5 мкл на 20 мкл реакционной среды, режим амплификации представлен следующим образом: 1. 95°С - 5 мин.; 2. 95°С - 30 сек (40 раз); 3. 65°С - 20 сек (40 раз); 4. 72°С - 20 мин; 5. 72°С - 5 мин; проведение детекции возможно как в режиме «реального времени», так и методом гель-электрофореза.
Осуществление изобретения
При создании изобретения использовалась полинуклеотидная последовательность авторского штамма Escherichia coli ONT:H30 18-726, депонированный в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» 18 ноября 2019 года (регистрационный номер штамма - В-8857, свидетельство о депонировании №193 от 25.11.2019 г.). Способ основывается на выявлении уникального сочетания SNP-полиморфизмов гена глутаматдекарбоксилазы (gad) (на англ. - glutamate decarboxylase) расположенных в диапазоне - NZ_GL896790.1:2763405-2763726.
На приведенном фрагменте гена указаны места гибридизации праймеров (F1 и R1 - подчеркивание прямой линией, F2 и R2 - подчеркивание волнистой линией):
Данные полиморфизмы могут быть выявлены с помощью системы специфических праймеров двух реакционных смесей: Праймеры первой реакционной смеси: F1:CGTCAGAACCTGGCCACTTTT R1:TATCCGTTGGTTTGCCTGCA Размер ПЦР-продукта: 292 п.н. Праймеры второй реакционной смеси: F2:TCGACCTGCGTTGCGTAAAC R2:CATCCCAGTAGCGGGCG Размер ПЦР-продукта: 240 п.н.
Реакции с обеими парами праймеров проводятся отдельно друг от друга.
Состав реакций: вода, пара праймеров - 0,4 мкМ каждого, 1х буфер для амплификации, концентрация Mg2+ - 2,5 мМ, lx SybrGreen для детекции в режиме «реального времени», 1х раствор полимеразы с отсутствующей экзонуклеазной активностью, матрица ДНК - 5 мкл на 20 мкл реакционной среды. Условия проведения реакции:
Используемый тип детекции специфического ПЦР-продукта: электрофоретический или в режиме «реального времени» (ПЦР-РВ) с применением интеркалирующих красителей. При гель-электрофоретической детекции о наличии энтероаггрегативного штамма Escherichia coli можно судить по наличию продуктов амплификации специфических длин в обеих реакционных смесях одновременно: для первой реакции - 292 п.н., для второй - 240 п.н. При детекции в режиме «реального времени» о наличии энтероаггрегативного штамма Escherichia coli свидетельствует повышение интенсивности флуоресценции по каналу FAM в обеих реакционных смесях одновременно, при этом пороговое значение цикла (Ct) - 35.
Изобретение позволяет расширить возможности выявления в биологическом материале и определения групповой принадлежности штаммов Escherichia coli, относящихся к DEC-группе, идентифицировать энтероаггрегативные штаммы Escherichia coli, по уникальному сочетанию SNP-полиморфизмов гена глутаматдекарбоксилазы штамма Escherichia coli ONT-H30 18-726.
Кроме того, изобретение позволяет накопить коллекцию штаммов EaggEC, изолированных из биоматериала пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника, в частности язвенного колита.
ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ:
1. Mirsepasi-Lauridsen Н.С., Vallance В.А., Krogfelt К.А., Petersen A.M. Escherichia coli Pathobionts Associated with Inflammatory Bowel Disease. Clin Microbiol Rev. 2019 Jan 30; 32(2): e00060-18.
2. Rakitina D.V., Manolov Α.Ι., Kanygina A.V., Garushyants S.K., Baikova J.P., Alexeev D.G. & Karpova I.Y. (2017). Genome analysis of E.coli isolated from Crohn's disease patients. BMC Genomics, 18(1), 1-17.
3. Zhgun E.S., Kislun Y.V., Kalachniuk T.N., Veselovsky V.A., Urban A.S., Tikhonova P.O., Pavlenko A.V., Ilchenko G.N., Ilina E.N. (2020) Evaluation of metabolites levels in feces of patients with inflammatory bowel diseases Biomedical Chemistry, 2020 66(3) p.p. 233-240.
4. Суворова Г.Н., Мякишева Ю.В., Каторкин C.E., Андреев П.С., Давыдова О.Е., Лямин А.В., Круглое Е.Е., Сухачев П.А. Гистологическая картина и микробный пейзаж при язвенном колите. Вестник новых медицинских технологий. 2018; 25 (4): 170-175.
5. Yun Ζ., Zeng L., Huang W., Wu Q., Fan Y., Zheng S., Peng L., Han J., Huang Y., Zhou H., Chen H. Detection and Categorization of Diarrheagenic Escherichia coli with Auto-microfluidic Thin-film Chip Method. Sci Rep. 2018 Aug27; 8(l):12926.
6. Grant M.A., Weagant S.D., Feng P. Glutamate decarboxylase genes as a prescreening marker for detection of pathogenic Escherichia coli groups. Appl Environ Microbiol. 2001 Jul; 67(7):3110-4.
--->
Перечень последовательностей
<110> Егор Евгеньевич Круглов (Egor Evgenievich Kruglov)
<120> СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ЭНТЕРОАГГРЕГАТИВНЫХ ШТАММОВ ESCHERICHIA COLI ИЗ
ТОЛСТОЙ КИШКИ У ПАЦИЕНТОВ С ВОСПАЛИТЕЛЬНЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ КИШЕЧНИКА
<140> 20201400059/20(074522)
<141> 2020-12-04
<160> 4
<210> 1
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<222> (2763405)…(2763726)
<220> (2763405)…(2763726)
<223> праймер первой реакционной смеси, F1. Целевой участок gad NZ_GL896790.1:
2763405-2763726.
<400> 1
cgtcagaacc tggccacttt t 21
<210> 2
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220> (2763405)…(2763726)
<222> (2763405)…(2763726)
<223> праймер первой реакционной смеси, R1. Целевой участок gad NZ_GL896790.1:
2763405-2763726.
<400> 2
tatccgttgg tttgcctgca 20
<210> 3
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220> (2763405)…(2763726)
<222> (2763405)…(2763726)
<223> праймер второй реакционной смеси, F2. Целевой участок gad NZ_GL896790.1:
2763405-2763726.
<400> 3
tcgacctgcg ttgcgtaaac 20
<210> 4
<211> 17
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220> (2763405)…(2763726)
<222> (2763405)…(2763726)
<223> праймер второй реакционной смеси, R2. Целевой участок gad NZ_GL896790.1:
2763405-2763726.
<400> 4
catcccagta gcgggcg 17
<---
Способ выявления энтероаггрегативных штаммов Escherichia coli из толстой кишки у пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника, отличающийся тем, что для обнаружения энтероаггрегативного штамма Escherichia coli используется набор из 4-х специфических праймеров к уникальному сочетанию SNP-полиморфизмов гена глутаматдекарбоксилазы (gad) штамма Escherichia coli ONT:H30 18-726; последовательности праймеров, используемых в первой реакционной смеси: F1:CGTCAGAACCTGGCCACTTTT; R1:TATCCGTTGGTTTGCCTGCA (размер ПЦР-продукта: 292 п.н.); последовательности праймеров второй реакционной смеси: F2:TCGACCTGCGTTGCGTAAAC; R2:CATCCCAGTAGCGGGCG (размер ПЦР-продукта: 240 п.н.), состав реакций: вода, пара праймеров - 0,4 мкМ каждого, 1х буфер для амплификации, концентрация Mg2+ - 2,5 мМ, 1x SybrGreen для детекции в режиме реального времени, 1х раствор полимеразы без экзонуклеазной активности, матрица ДНК - 5 мкл на 20 мкл реакционной среды, режим амплификации представлен следующим образом: 1) 95°С - 5 мин; 2) 95°С - 30 с (40 раз); 3) 65°С - 20 с (40 раз); 4) 72°С - 20 мин; 5) 72°С - 5 мин; проведение детекции возможно как в режиме «реального времени», так и методом гель-электрофореза; при гель-электрофоретической детекции о наличии энтероаггрегативного штамма Escherichia coli можно судить по наличию продуктов амплификации специфических длин в обеих реакционных смесях одновременно: для первой реакции - 292 п.н., для второй - 240 п.н., при детекции в режиме реального времени о наличии энтероаггрегативного штамма Escherichia coli свидетельствует повышение интенсивности флуоресценции по каналу FAM в обеих реакционных смесях одновременно, при этом пороговое значение цикла (Ct) - 35.
