aldi-tof масс-спектрометрический способ определения устойчивости микроорганизмов к антибактериальным препаратам

Изобретение относится к микробиологии. Предложен MALDI-TOF масс-спектрометрический способ определения устойчивости микроорганизмов к антибактериальным препаратам. Способ включает краткосрочное культивирование микроорганизма на плотной питательной среде с градиентом концентрации антибактериального препарата, образованного диффузией антибиотика из носителя, и нанесение интактных клеток на MALDI мишень. Масс-спектры получают в линейном положительном режиме спектрометра в диапазоне соотношения m/z=2000-10000 Da, в качестве матрицы используют α-циано-4-гидроксикоричную кислоту. Устойчивость микроорганизма к антибиотику определяется по наличию или отсутствию маркерного пика при m/z=9200-9700 Da в спектральных профилях, полученных от клеток, взятых с поверхности питательной среды на расстояниях, относительно носителя антибактериального препарата, равных пограничным значениям диаметра зоны подавления роста (мм) или минимальной концентрации антибиотика (мг/л), являющихся критериями чувствительности и устойчивости микроорганизма. Изобретение обеспечивает снижение сроков определения резистентности микроорганизмов, выделенных из биологического материала пациентов, к антимикробным препаратам, подбор адекватной схемы терапии. 4 ил., 4 пр.

 

Изобретение относится к области микробиологии и касается способа быстрого определения устойчивости микроорганизмов к антибактериальным препаратам с помощью матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации времяпролетной (MALDI-TOF) масс-спектрометрии. Бактериологическое исследование материала, полученного от пациента с подозрением на инфекцию, включает выделение чистой культуры возбудителя, его идентификацию, определение чувствительности изолированной культуры к антибактериальным препаратам путем обнаружения роста микроорганизмов или его отсутствия в присутствии конкретных антибиотиков. Общее время лабораторного исследования с применением стандартных методов идентификации микроорганизма и определения его чувствительности к антибактериальным препаратам требует не менее 48 часов. Уменьшение времени бактериологического анализа становится важным фактором, связанным с необходимостью проведения своевременной целенаправленной антибиотикотерапии, обусловленной растущими показателями устойчивости микроорганизмов к антибиотикам.

Традиционное определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам основано на их культивировании в среде, содержащей различные концентрации антибиотиков, с последующим визуальным или автоматическим определением признаков бактериального роста.

Современные стандартизованные методы определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам подразделяются на методы последовательных разведений антибиотика, диффузии антибиотика из диска или с полоски Е-теста и коротко-инкубационный метод с использованием автоматизированных систем [Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам: Методические указания МУК 4.2.1890-04. - М: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2004. - 91 с. Идентификация микроорганизмов и определение чувствительности их к антибиотикам с применением автоматизированной системы для биохимического анализа: Методические указания МУК 4.2.2886-11. - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2011. - 39 с. Клинические лабораторные исследования и диагностические тест-системы in vitro. Исследование чувствительности инфекционных агентов и оценка функциональных характеристик изделий для исследования чувствительности к антимикробным средствам. Часть 1. Референтный метод лабораторного исследования активности антимикробных агентов против быстрорастущих аэробных бактерий, вызывающих инфекционные болезни: Национальный стандарт российской федерации ГОСТ Р ИСО 20776-1-2010. - М.: Стандартинформ, 2011. - 23 с. Клинические лабораторные исследования и диагностические тест-системы in vitro. Исследование чувствительности инфекционных агентов и оценка функциональных характеристик изделий для исследования чувствительности к антимикробным средствам. Часть 2. Оценка функциональных характеристик изделий для испытания антимикробной чувствительности: Национальный стандарт российской федерации ГОСТ Р ИСО 20776-2-2010. - М.: Стандартинформ, 2011. - 16 с. Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам. Клинические рекомендации версия-2018-03. Минздрав России 2018].

Методами последовательных разведений микроорганизмы проверяют на их способность производить видимый рост в бульоне (разведение в бульоне) или на ряде агаровых пластин (разведение в агаре), содержащих последовательные разведения (чаще всего с 2-кратным шагом) антибактериального агента. Наиболее низкая концентрация антибактериального препарата (мкг/мл, мг/л), которая при определенных условиях in vitro предотвращает появление видимого роста микроорганизма в пределах определенного промежутка времени, известна как минимальная подавляющая концентрация (МПК).

Диффузионные методы определения чувствительности основаны на диффузии антибактериального препарата из носителя в плотную питательную среду и подавлении роста исследуемой культуры в той зоне, где концентрация антибиотика превосходит минимальную подавляющую концентрацию. В качестве носителя антибиотика в диско-диффузионном методе используют бумажный диск. Образование зоны подавления роста происходит в результате диффузии антибактериального препарата из носителя в питательную среду. В тесте градиентной диффузии (Е-тесте), в качестве носителя антибиотика, применяется узкая полоска полимера, на которую нанесен градиент концентраций антибактериального препарата, диффундирующего в питательную среду. Подавление роста микроорганизма вокруг полоски Е-теста происходит только в той зоне, где концентрация антибиотика выше МПК.

Коротко-инкубационный автоматизированный метод, являющийся модификацией метода последовательных микроразведений в бульоне, основан на использовании двойных концентраций антибиотика минимум в 3 разведениях. Результаты учитываются по изменению цвета или по наличию мутности среды, свидетельствующие о микробном росте. Оценка полученных результатов чувствительности к антибиотикам осуществляется с помощью компьютерных программ.

К недостаткам традиционных способов определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам следует отнести:

- значительную трудоемкость метода последовательных разведений для оценки чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам в агаре или бульоне;

- длительность культивирования микроорганизмов на плотных питательных средах и получение результатов исследования диффузионными методами через 18-24 часа инкубации чистой культуры;

- получение результатов определения чувствительности микроорганизмов к отдельным антибиотикам не ранее чем через 5 часов от момента начала исследования при использовании дорогостоящих расходных материалов для автоматизированных систем, таких как Phoenix (BD Diagnostic Systems, Германия), MicroScan (Siemens Healthcare Diagnostics GmbH, Германия) и Vitek 2 (bioMérieux, Франция);

- субъективность получаемых результатов при использовании ручных методик, в частности диско-диффузионного метода.

Альтернативно методам культивирования микроорганизма в присутствии антибиотика применяются молекулярно-генетические методы, направленные на выявление механизмов резистентности патогена и основанные на полимеразной цепной реакции (ПЦР) с электрофоретической детекцией результатов амлификации или его разновидностей, таких как ПЦР в режиме реального времени и ПЦР с гибридизацией на ДНК-чипах. При использовании данного метода идентификация генетических детерминант резистентности микроорганизмов осуществляется в течение 4-5 часов после выделения чистой культуры патогена.

Недостатками молекулярно-генетических методов являются:

- материалоемкость и высокая стоимость проводимого исследования;

- неоднозначность предоставляемой информации о наличии генов резистентности, поскольку она не всегда свидетельствует об экспрессии выявленных генов и поэтому не является абсолютным доказательством устойчивости микроорганизма к действию конкретного антибиотика.

В настоящее время простой, надежный и эффективный метод MALDI-TOF масс-спектрометрии стал в работе клинических микробиологических лабораторий настоящим стандартом идентификации бактерий на уровне видов [Bizzini А., Durussel С., Bille J., Greub G., Prod'hom G. 2010 Performance of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry for Identification of Bacterial Strains Routinely Isolated in a Clinical Microbiology Laboratory. J. Clin. Microbiol. 48:1549-54. doi:10.1128/JCM.01794-097. Seng P., Drancourt M., Gouriet F., La Scola B., Fournier PE., Rolain JM., Raoult D. 2009. Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin Infect Dis 49:543-551. doi: 10.1086/600885], (патенты US 6177266 B1, EP 0922295).

Метод основан на мягкой ионизации и десорбции молекул исследуемых образцов микроорганизмов, нанесенных на MALDI пластину с добавлением матрицы, как источника ионов, при воздействии лазерного излучения и с последующим получением спектров состоящих из пиков белков в диапазоне масс от 2000 до 20000 дальтон. Метод масс-спектрометрии позволяет выявлять уникальный для каждого микроорганизма набор клеточных белков в виде спектральных профилей, являющихся своеобразным «отпечатком пальца» конкретного вида микроорганизма. Преобладающими пиками в масс-спектрах микробных клеток являются пики рибосомальных, структурных и регуляторных белков. Идентификация микроорганизма происходит путем сопоставления масс-спектров исследуемого образца с эталонными спектрами из таксономических баз данных, позволяя идентифицировать исследуемый организм на уровне семейства, рода и вида. Помимо идентификации микроорганизмов, метод MALDI-TOF масс-спектрометрии стал использоваться для выявления антимикробной активности.

В настоящее время существует три подхода применения MALDI-TOF масс-спектрометрии к определению устойчивости микробов к антибактериальным препаратам:

1) Определение устойчивости β-лактамных антибиотиков по изменению масс-спектра антибиотика происходящего, в результате гидролиза молекулы антибиотика, индуцированного бактериальными ферментами (MBT-STAR-BL Assay) [Sparbier K., Schubert S., Weller U., Boogen C., Kostrzewa M. Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry-based functional assay for rapid detection of resistance against β-lactam antibiotics J. Clin. Microbiol., 2012, 50, pp. 927-937. doi:10.1128/JCM.05737-11, Burckhardt I, Zimmermann S. Using matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry to detect carbapenem resistance within 1 to 2.5 hours. J Clin Microbiol. 2011, 49:3321-4 http://dx.doi.org/10.1128/JCM.00287-11].

Недостатком данной технологии является ограниченность применения ее только для анализа гидролиза карбапенемов, являющихся классом Р-лактамных антибиотиков, индуцированного энтеробактериями, продуцирующими карбапенемазы.

2) Количественное определение спектров меченных изотопами аминокислот, которые включаются в белки, синтезируемые в присутствии антибиотика (MBT-RESIST Assay) [Sparbier K, Lange С, Jung J, Wieser A., Schubert S., Kostrzewa M.. MALDI biotyper-based rapid resistance detection by stable-isotope labeling. J Clin Microbiol 2013; 51:3741-8. http://dx.doi.org/10.1128/JCM.01536-13].

Недостатками данной технологии являются:

- необходимость наличия меченых изотопами аминокислот для дополнительного введения их в инкубационную среду,

- сложность процедуры оценки полученных данных по визуальному сравнению масс-спектров с поиском сдвигов пиков белков за счет встраивание в них меченых аминокислот,

- увеличенная стоимость проводимых исследований за счет дополнительной аппаратуры для детекции белков с изотопными метками.

3) Анализ роста бактерий в присутствии и отсутствии антибиотиков с использованием дополнительного к бактериальным образцам внутреннего стандарта масс-спектрометрии [Sparbier K., Schubert S., Kostrzewa М. ММВТ-ASTRA: a suitable tool for fast antibiotic susceptibility testing? Methods 2016: 15; 104:48-54. doi:10.1016/j.ymeth.2016.01.008], (патенты US 008293496 http://www.freepatentsonline.com/8293496.html и US 10011860 http://www.freepatentsonline.com/10011860.html).

Данный подход применения MALDI-TOF масс-спектрометрии к определению устойчивости микробов к антибактериальным препаратам выбран за прототип

Эти способы имеют следующие характеристики:

- масс-спектры получают в положительном режиме MALDI-TOF спектрометра в диапазоне молекулярных масс 2000-15000 дальтон от образцов клеточных экстрактов микробов, выращенных в жидких средах в присутствие и отсутствие антибиотика

- в качестве матрицы используется α-циано-4-гидроксикоричная кислота

- полученные масс-спектры содержат сигналы контрольной массы эталонного вещества с массой от 10 до 20 kDa, предварительно добавленного в дозированном количестве в инкубационную жидкую среду или к образцам клеточных экстрактов микроорганизмов, в качестве стандарта масс-спектрометрии.

- учет результатов культивирования микроорганизма в среде с антибиотиком и без антибиотика, проводится по отношению интенсивности полученных масс-спектров микроорганизма к интенсивности сигналов эталонных веществ.

Данные способы являются модификацией стандартных методов серийных разведений и позволяют с помощью масс-спектрометрии и использованием эталонного вещества определить рост микробов, происходящий во время кратковременного культивирования в жидких средах с антибиотиком и без антибиотика. Микроорганизм считается устойчивым к антибиотику, если рост микробов в среде с антибиотиком практически не изменяется по сравнению с ростом микробов в отсутствии антибиотика, определяемым по коэффициентам относительной интенсивности сигналов масс-спектров микробов к сигналам контрольных пиков внутреннего стандарта.

К недостаткам прототипов следует отнести:

- прототипы основаны на методе разведений в жидкой питательной среде, требующего приготовления серийных разведений антибиотиков, что усложняет процедуру выполнения анализа,

- для приготовления основного раствора требуется наличие и проведение расчета навески химически чистой субстанции антибиотика с известной активностью, при этом готовые лекарственные формы антибиотиков не пригодны.

- дополнительно необходимо наличие химически чистых эталонных веществ, таких как лизоцим и/или рибонуклеаза, и добавление их в среду для инкубации или в образцы клеточных экстрактов с целью получения сигналов контрольных пиков в масс-спектрах микроорганизмов.

Настоящее изобретение относится к методам определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам, более конкретно к выявлению устойчивых к антибиотикам штаммов осуществляемым методом MALDI-TOF масс-спектрометрии, схожим с методом идентификации бактерий на уровне видов, с проведением анализа масс-спектров, полученных от образцов микроорганизмов кратковременно культивированных на плотной питательной среде с градиентом концентрации антибактериального препарата. Взятие клеточных образцов осуществляется на расстояниях от носителя антибактериального препарата соответствующих значениям диаметров зон подавления роста при использовании дискового носителя, или в соответствии со значениями минимальной подавляющей концентрации антибиотика при использовании градуированной полоски Е-теста. Оценка устойчивости микроорганизма к антибиотику определяется по наличию биомаркерного пика в полученном масс-спектре.

Применение данного изобретения позволит расширить круг задач в области микробиологии, решаемых с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии, а именно быстрого определения наличия резистентности к антимикробным препаратам у штаммов бактерий, выделенных из биологического материала пациентов с тяжелыми инфекциями. Снижение сроков определения резистентности будет приводить к более раннему подбору адекватной схемы терапии и применению наиболее эффективных антибактериальных препаратов.

Сущность изобретения заключается в получении и анализе спектральных профилей микроорганизмов с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии образцов клеток микроорганизмов, культивированных в течение 3,5-4 часов на плотной питательной среде с антибиотиком, имеющим градиентную концентрацию. Образцы получают взятием клеток микробов с поверхности питательной среды, которые затем наносятся на MALDI пластину и покрываются раствором матрицы, в качестве которой используется α-циано-4-гидроксикоричная кислота, являющаяся источником протонов.

Масс-спектрометрия проводится в линейном положительном режиме работы спектрометра в диапазоне соотношения масса/заряд 2000-10000 Da. Анализ полученных масс-спектров осуществляется визуальным установлением наличия или отсутствия биомаркерного пика регуляторного белка микроорганизмов, расположенного в диапазоне соотношения масса/заряд 9200-9700 Da.

Заявляемое изобретение отличается от прототипов тем, что предусматривает применение готовых форм носителей антибактериальных препаратов в виде дисков и полосок Е-теста, не требующих процедуры разведения субстанции антибиотика. Кроме того, данный способ не требует дополнительного введения эталонных веществ в инкубационную среду или в образцы клеточных экстрактов для получения контрольных пиков, так как оценка метода осуществляется по наличию и интенсивности маркерного пика в масс-спектрах микроорганизмов.

Методика определения устойчивости микроорганизмов к антибиотикам с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии заключается в следующем:

- культивирование исследуемого микроорганизма осуществляется на плотной питательной среде в чашке Петри в течение 3,5-4 часов в соответствии с этапами постановки диффузионных тестов;

- после инкубации получают образцы путем взятия бактериальных клеток с поверхности плотной питательной среды на двух разных расстояниях относительно носителей антибактериального препарата:

1 - соответствующих диаметру зоны подавления роста для диско-диффузионного теста (мм) или минимальной подавляющей концентрации для варианта Е-теста (мг/л) и равных пограничным значениям категории резистентности (С1) к исследуемому антибиотику,

2 - превышающих диаметр зоны подавления роста для диско-диффузионного теста или снижающих минимальную подавляющую концентрацию для варианта Е-теста и равных двукратному изменению пограничных значений категории чувствительности (С2) к исследуемому антибиотику

- полученные целые бактериальные клетки или пробы клеточных экстрактов исследуемого микроорганизма наносят на MALDI мишень, с последующим наслоением поверх проб матрицы, представляющей собой насыщенный раствор α-циано-4-гидроксикоричная кислоты в водном растворе 50% ацетонитрила и 2,5% трифторуксусной кислоты;

- образец подвергается спектрометрии в линейном положительном режиме работы MALDI-TOF масс-спектрометра, оснащенного ультрафиолетовым азотным лазером, в диапазоне соотношения масса/заряд 2000-10000 Da, который соответствует сигналам, получаемым от ионизированных молекул белков микроорганизма;

- перед каждым измерением масс-спектрометр калибруют с помощью бактериального тест-стандарта;

- суммарный масс-спектр образца, представляющего собой сумму ионов, полученных от 500-1000 лазерных вспышек, выполненных в разных местах одной и той же лунки MALDI мишени, импортируют в программу, позволяющую проводить предварительную обработку сырых данных спектра, и проводят сглаживание, вычитание базовой линии масс-спектров. Пики масс-спектров с соотношением сигнал/шум S/N<3 и с относительной интенсивностью RI<5 исключают из дальнейшего анализа;

- полученный масс-спектр визуально анализируют для установления наличия или отсутствия маркерного пика расположенного в диапазоне соотношения масса/заряд 9200-9700 Da, предположительно представляющего собой сигнал от субъединицы гистон-подобного ДНК-связывающего белка, молекула которого у всех бактерий состоит из 90 аминокислот;

- штамм считается устойчивым к антибиотику, если масс-спектры, полученные от образцов, взятых с поверхности питательной среды на расстояниях С1 равных пограничным значениям категории резистентности, если содержат пики маркерного белка. Отсутствие маркерного пика в С1 масс-спектре интерпретируется как прогноз наличия чувствительности к антибиотику;

- тест считается правильно выполненным, если масс-спектры, полученные от образцов, взятых с поверхности питательной среды на расстояниях С2 равных двукратно измененным пограничным значениям категории чувствительности (не менее 30 мм), содержат маркерный пик в диапазоне m/z 9200-9700 Da.

Изобретение описывается примерами со ссылкой к фигурам, в которых:

на Фиг. 1 представлены масс-спектры референтного чувствительного штамма Escherichia coli, после инкубации на плотной питательной среде с диском меропенемом в течение 4-х часов;

на Фиг. 2 представлены масс-спектры устойчивого к меропенему штамма Klebsiella pneumoniae, после инкубации на среде с градуированной полоской Е-теста в течение 3,5 часов;

на Фиг. 3 представлены масс-спектры чувствительного к оксациллину штамма Staphyloccocus aureus после инкубации с диском в течение 4-х часов;

Фиг. 4 демонстрирует сравнение масс-спектров чувствительного (А) и устойчивого (Б) к имипенему штаммов Klebsiella pneumonia, после инкубации с диском в течение 3,5-х часов.

Примеры вариантов осуществления заявляемого способа.

Пример 1. Определение наличия устойчивости к меропенему у штамма Escherichia coli АТСС 25922

Референтный штамм Escherichia coli АТСС 25922 получен из ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России 17.11.2017 г. При определении чувствительности к антибиотикам стандартными методами было установлено, что штамм E.coli 25922 соответствовал заявленным характеристикам чувствительности, приведенным в Клинических рекомендациях [Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам. Клинические рекомендации версия-2018-03. Минздрав России 2018. http://www.antibiotic.ru/minzdrav/files/docs/clrec-dsma2018] и имеет следующие характеристики: значение МПК меропенема составляет 0.016 мг/л, значение диаметра зоны подавления роста при использовании диска, содержащего 10 мкг меропенема, равно 29 мм. Инкубацию клеток в присутствии имипенема проводили при использовании диска с имипенемом (10 мкг/диск) (Mast Group, Великобритания) на агаре Мюллера-Хинтона (HiMedia Laboratories Pvt. Limited, Индия) в соответствии с требованиями раздела №3 Клинических рекомендаций, в течение 4-х часов при 37°С. Образцы получали путем взятия бактериальных клеток с поверхности плотной питательной среды по периметрам диаметров зон подавления роста С1=13 мм, равного пограничному значению категории резистентности к меропенему и С2=32 мм, равного двукратному пограничному значению категории чувствительности к меропенему. Полученные образцы клеток наносили на поверхность лунок 96-ти местной стальной MALDI мишени (Bruker Daltonik, Германия) и поверх проб наслаивали по 1 мкл матрицы. Масс-спектры образцов были получены в режиме положительных ионов спектрометра "Microflex LRF" (Bruker Daltonik, Германия) в диапазоне m/z от 2000 до 10000 Da с помощью программного обеспечения "FlexControl" 3.3 (Bruker Daltonik, Германия). Предварительную обработку и анализ полученных масс-спектров осуществляли с помощью программного обеспечения "FlexAnalysis" 3.3. (Bruker Daltonik, Германия). Пики масс-спектров с соотношением сигнал - шум S/N<3 и с относительной интенсивностью RI<5 были исключены из анализа. На представленной Фигуре 1 видно, что в масс-спектре образца, взятого на расстоянии С1=13 мм, отсутствуют пики в диапазоне m/z от 9200 до 9800 Da. Спектр образца взятого на расстоянии С2=32 мм содержит пик m/z=9551 Da, имеющий показатели относительной интенсивности RI=23 и соотношение сигнал/шум S/N=11,2. Полученный результат свидетельствует о правильности проведения теста и об отсутствии у данного штамма устойчивости к меропенему, что согласуется с оценкой штамма как чувствительного по результатам стандартного диско-диффузионного метода.

Пример 2. Определение наличия устойчивости к меропенему у штамма Klebsiella pneumoniae 13-95

Штамм Klebsiella pneumoniae 13-95 из коллекции ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера был выделен в 2013 г. из мочи пациента с инфекцией мочевыводящих путей. При определении чувствительности к антибиотикам стандартными методами было установлено, что штамм является устойчивым к карбапенемам и имеет следующие характеристики: значение МПК меропенема составляет 8 мг/л, значение диаметра зоны подавления роста при использовании диска, содержащего 10 мкг меропенема, равно 19 мм. Инкубацию клеток в присутствии меропенема проводили с использованием градуированной M.I.C.E. полоски с меропенемом (Oxoid/ThermoFhisherScientific, Великобритания) на агаре Мюллера-Хинтона (HiMedia Laboratories Pvt. Limited, Индия) в соответствии с инструкцией производителя, в течение 4-х часов при 37°С. Образцы получали путем взятия бактериальных клеток с поверхности плотной питательной среды вдоль полоски Е-теста с меропенемом на расстояниях зон диффузии градиентных концентраций антибиотика вдоль полоски, равных пограничному значению категории резистентности С1=16 мг/л и двукратно сниженному пограничному значению категории чувствительности С2=2 мг/л.

Масс-спектрометрию образцов и анализ полученных тестов осуществляли по методике, изложенной в Примере 1. На представленной Фигуре 2 видно, что в масс-спектрах образцов, взятых как на расстояниях С1=16 мг/л, так и С2=2 мг/л относительно значений концентраций антибиотика в полоске, имеют одинаковые пики с молекулярной массой m/z=9537 Da. При этом пик образца С1 имеет показатели относительной интенсивности RI=8, а пик образца С2, имеет показатель относительной интенсивности RI=22 при одинаковых значениях соотношения сигнал/шум S/N=3. Полученный результат масс-спектрометрического определения резистентности штамма Klebsiella pneumoniae 13-95 согласуется с оценкой его как устойчивого, по результатам стандартных диффузионных методов.

Пример 3. Определение наличия устойчивости штамма Staphyloccocu aureus к оксациллину

Staphyloccocus aureus 6670/5 из коллекции ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера был выделен в 2019 году из мокроты пациента с муковисцидозом. Результат диско-диффузионного теста с диском, содержащим 1 мкг оксациллина, показал, что значение диаметра зоны подавления роста равно 26 мм и штамм является чувствительным к оксациллину. Инкубацию клеток с антибиотиком, масс-спектрометрию образцов и анализ полученных спектров осуществляли по методике, изложенной в Примере 1. На представленной Фигуре 3 видно, что в масс-спектре образца, взятого на расстоянии С1=10 мм отсутствует пик в диапазоне m/z от 9200 до 9700 Da. Спектр образца, взятого на расстоянии С2=30 мм, содержит пик m/z=9620 Da, при показателях RI=14 и соотношение S/N=7,6. Полученный результат свидетельствует об отсутствии у данного штамма устойчивости к оксациллину, что согласуется с оценкой штамма как чувствительного по результатам стандартного диско-диффузионного метода.

Пример 4. Сравнение двух штаммов Klebsiella pneumoniae 3642 и Klebsiella pneumonia 621 по наличию устойчивости к имипенему.

Штамм Klebsiella pneumoniae 3642 выделен в 2013 году из мочи пациента с инфекцией мочевыводящих путей, и при определении чувствительности к антибиотикам диско-диффузионным методом было установлено, что штамм является чувствительным к карбапенемам, а значение диаметра зоны подавления роста вокруг диска с имипенемом (10 мкг/диск) равно 23 мм. Штамм Klebsiella pneumoniae 621 выделен в 2017 году из бронхоальвеолярного лаважа пациента с бактериальной пневмонией. При определении чувствительности к антибиотикам диско-диффузионным методом было установлено, что штамм является устойчивым к карбапенемам. Инкубацию клеток на среде с антибиотиком, масс-спектрометрию образцов и анализ полученных спектров осуществляли по методике, изложенной в Примере 1. На представленной Фигуре 3 видно, что масс-спектры штамма Klebsiella pneumoniae 3642 (А) и штамма Klebsiella pneumoniae 621 (Б) отличаются между собой только по масс-спектрам образцов, взятых на расстоянии С1=13 мм. У штамма 3642 отсутствует пик в диапазоне m/z от 9200 до 9800 Da, при наличии маркерного пика m/z=9476 Da в масс-спектре образца взятого на расстоянии С2=32 мм. Это свидетельствует об отсутствии у данного штамма устойчивости к имипенему и согласуется с оценкой штамма как чувствительного по результатам стандартного диско-диффузионного метода. Масс-спектры штамма Klebsiella pneumoniae 621 имеют маркерные пики m/z=9476 Da, полученные от образцов как С1, так и С2, что свидетельствует о наличии у данного штамма устойчивости к имипенему.

MALDI-TOF масс-спектрометрический способ определения устойчивости микроорганизмов к антибактериальным препаратам, включающий культивирование микроорганизма с последующим взятием образцов клеток исследуемого штамма микроорганизма, получением и анализом спектральных профилей клеток микроорганизма, отличающийся тем, что культивирование микроорганизма проводят на плотной питательной среде с градиентом концентрации антибактериального препарата, образованного диффузией антибиотика из носителя, в течение 3,5-4 часов, взятие образцов бактериальных клеток осуществляют с поверхности среды на расстояниях, относительно носителя антибактериального препарата, соответствующих диаметрам зон подавления роста или зон диффузии градиентных концентраций антибиотика, равных пограничному значению категории резистентности С1, и двукратному изменению пограничных значений категории чувствительности С2 к исследуемому антибиотику, но не менее 30 мм, клеточные образцы наносят на MALDI мишень, с последующим наслоением раствора 2,5-дигидробензойной кислоты, проводят спектрометрию в линейном положительном режиме работы MALDI-TOF масс-спектрометра в диапазоне молекулярных масс m/z=2000-10000 Da, полученные масс-спектры обрабатывают для исключения пиков, имеющих низкие показатели относительной интенсивности и соотношения сигнал-шум, визуально определяют наличие или отсутствие маркерного пика, расположенного в диапазоне молекулярных масс m/z=9200-9700 Da, правильность выполнения теста контролируют по обязательному наличию маркерного пика в масс-спектре образца, взятого с поверхности питательной среды на расстоянии С2, а определение устойчивости микроорганизма к антибиотику осуществляют путем нахождения маркерного пика в масс-спектре клеточного образца, взятого с поверхности питательной среды на расстоянии С1.