Способ снижения количества прегнан х рецептора

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу снижения количества прегнан Х рецептора. Способ включает культивирование линии клеток аденокарциномы ободочной кишки человека и предусматривает добавление в среду S-нитрозоглутатиона до достижения его концентрации в среде 1, 10, 50, 100, 500 мкМ с последующей инкубацией в течение 3 часов. Изобретение эффективно в качестве доступного способа снижения количества прегнан Х рецептора в эксперименте in vitro. 1 ил.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии и клинической фармакологии, и предназначено для ингибирования прегнан Х рецептора (PXR).

Прегнан Х рецептор (PXR) - ядерный рецептор, регулирующий экспрессию ряда ферментов I (CYP3A, CYP2B) и II фазы биотрансформации (UDP-глюкуронозилтрансферазы 1A1, сульфотрансферазы), а также транспортеров лекарственных веществ MDR1 и MRP2. Изменение количества PXR в эксперименте in vitro может применяться для исследования роли данного рецептора в фармакокинетике лекарственных средств.

Известно, что кетоконазол оказывает ингибирующее действие на PXR [Wang J., Bwayi M., Gee F.R.R., Chen T. 2019. PXR-mediated idiosyncratic drug-induced liver injury: mechanistic insights and targeting approaches. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology  18 (8), 711-722.].

Техническим результатом настоящего изобретения является разработка доступного и экономичного способа снижения количества прегнан Х рецептора в эксперименте in vitro.

Для разработки способа был проведен эксперимент на линии клеток аденокарциномы ободочной кишки человека (Caco-2) (ЦКП «Коллекция культур клеток позвоночных», Санкт-Петербург, Россия). Клетки культивировали при 37°С и 5% содержании СО₂ в инкубаторе WS-189C («World Science», Корея) в Дульбекко модифицированной среде Игла (DMEM) с высоким содержанием глюкозы (4500 мг/л) (Sigma-Aldrich, CША), с добавлением L-глутамина (4 мМ) (Sigma-Aldrich), 15% эмбриональной бычьей сыворотки (Sigma-Aldrich), 100 ЕД/мл и 100 мкг/мл пенициллина и стрептомицина (Sigma-Aldrich) соответственно.

Клетки культивировали в течение 21 сут, поскольку при данном сроке происходит их спонтанная дифференцировка в энтероцитоподобные клетки, экспрессирующие PXR [Garg A., Zhao A., Erickson S.L., Mukherjee S., Lau A.J., Alston L., Chang T.K., Mani S., Hirota S.A. 2016. Pregnane X Receptor Activation Attenuates Inflammation-Associated Intestinal Epithelial Barrier Dysfunction by Inhibiting Cytokine-Induced Myosin Light-Chain Kinase Expression and c-Jun N-Terminal Kinase 1/2 Activation. J Pharmacol Exp Ther. 359 (1), 91-101. http://doi.org/: 10.1124/jpet.116.234096].

После чего для активации PXR в культуральную среду добавляли S-нитрозоглутатион (GSNO, Sigma Aldrich) до достижения его конечной концентрации 1; 10; 50; 100 и 500 мкМ и инкубировали 3 и 24 ч. На каждый эксперимент было выполнено по 3 повторения. Контрольным клеткам в эквивалентном объеме в культуральную среду добавляли воду для инъекций.

После окончания экспозиции клетки снимали с лунок раствором трипсин-ЭДТА (Sigma-Aldrich), трижды промывали раствором фосфатного буфера (BioRad, США) и лизировали в NP40 Cell Lysis Buffer Thermo (Thermo Fisher Scientific, США) c добавлением смеси ингибиторов протеиназ (Sigma-Aldrich) в течение 30 минут при +4⁰С и постоянном перемешивании из расчета 10⁷ клеток на 100 мкл буфера. Полученный лизат центрифугировали при 13000 об/мин в течение 10 минут (AvantiJXN-3, Beckmancoulter, США).

В супернатанте определяли относительного количество PXR с помощью метода вестерн-блот.

Полученные результаты анализировали с помощью программ «StatSoft Statistica 13.0» (США, номер лицензии JPZ811I521319AR25ACD-W) и Microsoft Excel for MAC ver. 16.24 (ID02984-001-000001). Результаты представлены в виде M±SD. Для оценки статистической значимости различий использовали дисперсионный анализ (ANOVA), попарные сравнения выполняли с помощью критерия Ньюмена-Кейлса. Статистически значимыми считали различия при p<0.05.

В настоящем исследовании было показано, что инкубирование клеток линии Сaco-2 с GSNO в концентрациях 1, 10, 50, 100 и 500 мкМ в течение 3 ч приводило к снижению количества PXR по сравнению с показателями контроля на 30.4% (p = 0.0005), 45.5% (р = 0.002), 57.0% (р = 0.0002), 12.5% (р = 0.03) и 32.2% (р = 0.0003) соответственно.

Увеличение длительности экспозиции до 24 ч сопровождалось повышением количества транскрипционного фактора при концентрации S-нитрозоглутатиона 1 мкМ на 154.9 % (р = 0.0002), 10 мкМ – на 110.3% (р = 0.01), 50 мкМ – на 32.8% (р = 0.001). При концентрации GSNO 100 мкМ уровень PXR достоверно не отличался от показателей контроля, а в концентрации 500 мкМ был его ниже на 14.0% (р = 0.004).

Краткое описание чертежей

Фиг. 1. Относительное количество PXR в клетках линии Сасо-2 при индукции нитрозативного стресса S-нитрозоглутатионом в концентрациях 1-500 мкМ в течение 3 и 24 ч (M ± SD, n = 3).

Таким образом, для снижения количества PXR в клетках аденокарциномы ободочной кишки человека необходимо добавление в Дульбекко модифицированную среду Игла S-нитрозоглутатиона до достижения его концентрации в среде 1, 10, 50, 100, 500 мкМ с последующей инкубацией в течение 3 часов.

Способ был использован при изучении фармакокинетики лекарственных веществ – субстратов MDR1 в трех экспериментах.

Способ снижения количества прегнан Х рецептора, включающий культивирование линии клеток аденокарциномы ободочной кишки человека в Дульбекко модифицированной среде Игла с содержанием глюкозы 4500 мг/л, содержащей L-глутамин 4 мМ, 15% бычьей сыворотки, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина в течение 21 суток, отличающийся последующим добавлением в среду S-нитрозоглутатиона до достижения его концентрации в среде 1, 10, 50, 100, 500 мкМ с последующей инкубацией в течение 3 часов.