Последствия повреждения легких, индуцированного искусственным кровообращением

Изобретение относится к области медицины, а именно к пульмонологии, и предназначено для снижения частоты или степени тяжести повреждения легких, индуцированного искусственным кровообращением. Способ поддержания соединения эндотелиальной синтазы оксида азота (eNOS) для снижения частоты или степени тяжести повреждения легких, индуцированного искусственным кровообращением, вследствие образования свободных радикалов у пациента во время искусственного кровообращения, включает введение пациенту эффективного количества цитруллина до, во время и после хирургической операции. Цитруллин, вводимый в начале хирургической операции, составляет около 100–500 мг/кг цитруллина. Цитруллин, вводимый во время хирургической операции, добавляют к заместительной жидкости для гемоконцентрации во время хирургической операции. При этом эффективное количество цитруллина представляет собой количество, достаточное для уменьшения разъединения эндотелиальной синтазы оксида азота (eNOS). Использование изобретения позволяет предотвратить последствия повреждения легких, индуцированного искусственным кровообращением, путем уменьшения разъединения eNOS. 13 з.п. ф-лы, 33 ил., 17 табл., 10 пр.

 

Область техники

Данное изобретение относится, в целом, к области поддержания соединения эндотелиальной синтазы оксида азота (eNOS) для снижения частоты или степени тяжести повреждения легких, индуцированного искусственным кровообращением, вследствие образования свободных радикалов у пациента во время искусственного кровообращения, включающему введение пациенту эффективного количества цитруллина.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Последствия повреждения легких, индуцированного искусственным кровообращением

В ближайшем послеоперационном периоде дети, перенесшие операцию по восстановлению врожденного порока сердца, очень уязвимы к внезапному или длительному увеличению сопротивления легочных сосудов. После операции реактивность легочной сосудистой системы увеличивается, так что вазоспастические раздражители могут вызвать внезапное повышение легочного артериального давления и сопротивления. Это, в свою очередь, может привести к острой правосторонней сердечной недостаточности, трикуспидальной регургитации, системной гипотензии, ишемии миокарда и повышению сопротивления дыхательных путей. В полном объеме такие легочные гипертонические кризы могут быть смертельными. Более легкие стимулирующие явления могут вызвать более умеренные кризы, которые длятся дольше и усугубляются, что приводит к длительному пребыванию в отделении интенсивной терапии (ОИТ). Adatia & Beghetti (2009) Cardiol Young 19(4): 315–319.

Повреждение, индуцированное аппаратом искусственного кровообращения (АИК), является результатом преимущественно гуморального системного воспалительного ответа, индуцированного процессом искусственного кровообращения. Seghaye (2003) Cardiol Young 13(3): 228–239; Day & Taylor (2005) Int J Surg 3(2): 129–140; Jaggers & Lawson (2006) Ann Thorac Surg 81(6): S2360–2366; Kozik & Tweddell (2006) Ann Thorac Surg 81(6): S2347–2354; Warren et al. (2009) J Cardiothorac Vasc Anesth 23(2): 223–231; Warren et al. (2009) J Cardiothorac Vasc Anesth 23(3): 384–393. Повреждение, нанесенное легким и другим тканям, приводит к серьезному клиническому состоянию, описанному в данном документе.

Доля детей, перенесших применение АИК, у которых развиваются последствия повреждения легких от АИК

Приблизительно от одной пятой до одной трети несовершеннолетних пациентов, перенесших применение аппарата искусственного кровообращения, страдают от последствий повреждения легких, индуцированного искусственным кровообращением. Острая послеоперационная легочная гипертензия считается ключевым признаком, указывающим на последствия повреждения легких, индуцированного искусственным кровообращением. Рассел приводит критерии клинически значимой легочной гипертензии следующим образом: (A) если среднее легочное артериальное давление составляет > 50% от среднего системного артериального давления; или (B) если эхокардиографические данные свидетельствуют о сходной степени легочной гипертензии. Russell et al. (1998) Anesth Analg 87(1): 46-51. Это привело к тому, что 13 из 36, или 36% пациентов, перенесших врожденную операцию по восстановлению сердца, страдают от последствий легочного повреждения, индуцированного искусственным кровообращением.

В другом подходе Линдберг сосредоточился на тяжелой легочной гипертензии, определив тяжелую послеоперационную легочную гипертензию как среднее легочное артериальное давление, равное или превышающее уровень среднего системного артериального давления. Lindberg et al. (2002) J Thorac Cardiovasc Surg 123(6): 1155–1163. В целом, 2% из 1349 пациентов в их группе соответствовали этим строгим критериям. Линдберг обсуждает наличие умеренных случаев легочной гипертензии, но конкретно не определяет их количество. Тем не менее, пациенты, которым проводили полный анализ амбулаторных карт, имели легочный артериальный катетер в ОИТ, либо провели более четырех дней на искусственной вентиляции легких, либо умерли. Эти пациенты, которые, вероятно, имели клинически значимую легочную гипертензию, насчитывали 224 человека, что составляет 17% популяции. Id.

Ряд исследований приводят аналогичные цифры. Бандо упоминает около 30% процентов пациентов, у которых исторически развивалась легочная гипертензия, при этом отмечается более недавнее снижение, однако данные в статье предполагают примерно 17%. Bando et al. (1996) J Thorac Cardiovasc Surg 112(6): 1600–1607. Чеккия заявил, что точная частота легочной гипертонии у детей, перенесших операцию на сердце, остается неясной. Checchia et al. (2012) Pediatr Cardiol 33(4): 493–505. Чеккия отметил только одно исследование, в котором у 11 из 20 младенцев развилась послеоперационная легочная гипертензия; когда были также включены эпизодические случаи легочной гипертензии, доля возросла до 75%. Id.

Судьба детей, у которых развивается послеоперационная легочная гипертензия

Исследование, проведенное Брауном, изучило судьбу детей, у которых развилась послеоперационная легочная гипертензия, и сформулировало ее в клинически и экономически важных терминах. Все возможные факторы риска для продолжительности пребывания были рассмотрены в нескольких многофакторных моделях. Наиболее сильные факторы, включая легочную гипертензию, были объединены в показатель осложнений. Как в послеоперационной модели, так и в окончательной модели, как часть оценки осложнений, легочная гипертензия была надежным прогностическим параметром длительной продолжительности пребывания. Длительный срок пребывания имеет серьезные экономические последствия. Дети, которые попали в пределы 95–го процентиля по продолжительности пребывания, составляли 30% койко–суток с трехкратной смертностью детей ниже 95–го процентиля. В одном центре 7,1% пациентов использовали 50,1% от общего числа суток интенсивной терапии и 47,7% от общего объема технологических ресурсов. Примечательно, что 12% пациентов требовали пребывания в ОИТ, равное 14 суткам или дольше. Для всех пациентов медиана пребывания составила 3 суток. Напротив, среднее пребывание пациентов в ОИТ в пределах 95–го процентиля или выше составило 27 суток. В соответствии с этим средняя продолжительность искусственной вентиляции легких у пациентов в пределах 95–го процентиля или выше составляла 23 суток. Brown et al. (2003) Crit Care Med 31(1): 28–33.

Современные методы лечения последствий повреждения легких, индуцированного АИК

Лэндис представил научно обоснованный обзор различных стратегий, применяемых для лечения послеоперационной легочной гипертензии при искусственном кровообращении у взрослых, и пришел к выводу, что реальную ценность имеют только вдыхаемый оксид азота и, возможно, ингибиторы комплемента. Landis et al. (2014) J Extra Corpor Technol 46(3): 197–211. Другие исследования были сосредоточены на детской кардиохирургии. Apostolakis et al. (2010) J Cardiothorac Surg 5: 1; Barst et al. (2010) Pediatr Cardiol 31(5): 598–606; Fraisse & Wessel (2010) Pediatr Crit Care Med 11(2 Suppl): S37–40; Taylor and Laussen (2010) Pediatr Crit Care Med 11(2 Suppl): S27–29; Bronicki & Chang (2011) Crit Care Med 39(8): 1974–1984; Fraisse et al. (2011) Intensive Care Med 37(3): 502–509; Checchia et al. (2012) Pediatr Cardiol 33(4): 493–505; Brunner et al. (2014) Pulm Circ 4(1): 10–24. Основой современной терапии остается вдыхаемый оксид азота (iNO). Оксид азота, как и большинство других методов лечения, представляет собой реактивную терапию, которая сначала требует от пациента развития респираторных осложнений при искусственном кровообращении до начала терапии. Кроме того, вдыхаемый оксид азота имеет два основных недостатка; (A) вдыхаемый оксид азота имеет заметный симптом отдачи при прекращении; и (B) когда оксид азота образует комплексы с гемоглобином, это приводит к метгемоглобинемии. В то время как ингибиторы фосфодиэстеразы 5, такие как силденафил, использовались для подавления отдачи вдыхаемого оксида азота, результаты не были однородными.

Соответственно, в данной области существует потребность в более эффективном способе уменьшения последствий повреждения легких, индуцированного АИК, у пациента во время операции и после операции.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РАЗЛИЧНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение предоставляет способ поддержания соединения эндотелиальной синтазы оксида азота (eNOS) для снижения частоты или степени тяжести повреждения легких, индуцированного искусственным кровообращением, вследствие образования свободных радикалов у пациента во время искусственного кровообращения, включающий введение эффективного количества цитруллина пациенту. Эффективное количество цитруллина можно вводить пациенту во время или после операции. Эффективное количество цитруллина можно вводить пациенту во время и после операции. Эффективное количество цитруллина можно вводить пациенту до, во время и после операции.

Во многих вариантах осуществления эффективное количество цитруллина может представлять собой количество, достаточное для уменьшения разъединения эндотелиальной синтазы оксида азота (eNOS). Во многих вариантах осуществления эффективное количество цитруллина может представлять собой количество, достаточное для уменьшения образования свободных радикалов. Во многих вариантах осуществления эффективное количество цитруллина может представлять собой количество, достаточное для снижения частоты или тяжести повреждения легких, индуцированного искусственным кровообращением. Во многих вариантах осуществления цитруллин можно вводить пациенту до операции. Во многих вариантах осуществления цитруллин можно вводить примерно за 12 часов до операции. Во многих вариантах осуществления цитруллин можно вводить пациенту в начале операции. Во многих вариантах осуществления цитруллин можно вводить пациенту во время операции. Во многих вариантах осуществления цитруллин можно вводить пациенту после операции.

Этот способ может быть использован, когда операция может проходить для исправления порока сердца. Этот способ может использоваться, когда сердечный дефект может быть ассоциирован с избыточным легочным кровотоком. В конкретных вариантах осуществления дефект сердца может представлять собой дефект межпредсердной перегородки. В конкретных вариантах осуществления дефект межпредсердной перегородки может представлять собой большой дефект межпредсердной перегородки. В конкретных вариантах осуществления дефект сердца может представлять собой дефект межжелудочковой перегородки. В конкретных вариантах осуществления дефект межжелудочковой перегородки может представлять собой большой неограниченный дефект межжелудочковой перегородки (VSD). В конкретных вариантах осуществления дефект сердца может представлять собой поражение одного желудочка. В конкретных вариантах осуществления поражение одного желудочка может быть устранено с помощью процедур Гленна и Фонтена. Во многих вариантах осуществления сердечный дефект может представлять собой стеноз аортального клапана (AVS), дефект межпредсердной перегородки (ASD), коарктацию аорты (CoA), полный дефект атриовентрикулярного канала (CAVC), d–транспозицию магистральных сосудов, аномалию Эбштейна, I–транспозицию магистральных сосудов, открытый артериальный проток (PDA), стеноз легочного ствола, дефекты единственного желудочка, тетраду Фалло, тотальный аномальный дренаж легочных вен (TAPVC), Truncus Arteriosus или дефект межжелудочковой перегородки (VSD). В конкретных вариантах осуществления операция может представлять собой операцию артериального переключения. В конкретных вариантах осуществления искусственное кровообращение может применяться для восстановления частичного или полного дефекта атриовентрикулярной перегородки (AVSD). В конкретных вариантах осуществления искусственное кровообращение может применяться для восстановления дефекта первичной межпредсердной перегородки (первичный ASD).

Цитруллин в начале операции, можно вводить в количестве около 100–500 мг/кг цитруллина. Предпочтительно болюс цитруллина в начале операции может составлять около 100–300 мг/кг цитруллина. Предпочтительно болюс цитруллина в начале операции может составлять около 150 мг/кг цитруллина. Предпочтительно, цитруллин, вводимый в начале операции, может составлять около 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 или 500 мг/кг цитруллина. Предпочтительно цитруллин, вводимый во время операции, может быть добавлен к фильтрации. Более предпочтительно, цитруллин, вводимый во время операции, может быть добавлен к заместительной жидкости для гемоконцентрации.

Во многих вариантах осуществления цитруллин может быть добавлен в количестве около 100–500 мкмоль/л. Во многих вариантах осуществления цитруллин может быть добавлен в количестве около 100–300 мкмоль/л. Во многих вариантах осуществления цитруллин может быть добавлен в количестве около 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 или 500 мкмоль/л. Во многих вариантах осуществления цитруллин может быть добавлен в количестве около 200 мкмоль/л.

Цитруллиновый болюс можно вводить через около 5–60 минут после операции. Во многих вариантах осуществления цитруллиновый болюс можно вводить через около 15–45 минут после операции. Во многих вариантах осуществления цитруллиновый болюс можно вводить через около 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 или 60 минут после операции. Во многих вариантах осуществления цитруллиновый болюс можно вводить через около 30 минут после операции.

Во многих вариантах осуществления цитруллиновый болюс может составлять около 5–50 мг/кг цитруллина. Во многих вариантах осуществления цитруллиновый болюс может составлять около 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 мг/кг цитруллина. В конкретных вариантах осуществления цитруллиновый болюс может составлять около 20 мг/кг цитруллина.

Цитруллиновый болюс можно вводить через около 30 минут после деканюляции искусственного кровообращения.

Во многих вариантах осуществления цитруллин можно вводить пациенту в течение около 12–48 часов после операции. Во многих вариантах осуществления цитруллин можно вводить пациенту в течение около 12, 24, 36 или 48 часов после операции. Во многих вариантах осуществления после операции цитруллин можно вводить пациенту в течение около 48 часов. Во многих вариантах осуществления цитруллин можно вводить посредством инфузии в количестве около 3–12 мг/кг/час. Во многих вариантах осуществления цитруллин можно вводить посредством инфузии в количестве около 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 мг/кг/час. Во многих вариантах осуществления инфузия может составлять около 9 мг/кг/час.

Во многих вариантах осуществления цитруллин можно вводить внутривенно. Во многих вариантах осуществления цитруллин можно вводить периоперационно. Во многих вариантах осуществления болюс цитруллина может быть введен в начале хирургической процедуры.

Во многих вариантах осуществления цитруллин можно вводить перорально, внутривенно, путем ингаляции или их комбинацией.

Во многих вариантах осуществления цитруллиновый болюс может составлять около 150 мг/кг.

Во многих вариантах осуществления цитруллин может быть добавлен в концентрации около 200 мкмоль/л в жидкость для фильтрации и гемоконцентрации, используемую во время операции.

Во многих вариантах осуществления болюс, равный около 20 мг/кг цитруллина, может быть введен после деканюляции искусственного кровообращения.

Во многих вариантах осуществления после деканюляции искусственного кровообращения можно вводить непрерывную инфузию цитруллина, равную 9 мг/кг/час, необязательно в течение около 48 часов.

Во многих вариантах осуществления болюс, равный 150 мг/кг цитруллина, может быть введен в начале операции, после чего через 4 часа после операции проводят непрерывную инфузию, равную 9 мг/кг/час цитруллина.

Во многих вариантах осуществления пациент может иметь генотип T1405N в гене CPSI CC, AC, AA или их комбинации. В конкретных вариантах осуществления пациент может иметь генотип T1405N в гене CPSI CC.

Во многих вариантах осуществления уровень цитруллина в плазме пациента может быть повышен выше около 37, 50, 100, 150 или 200 мкмоль/л. Во многих вариантах осуществления уровень цитруллина в плазме пациента может быть повышен выше около 37, 50, 100, 150 или 200 мкмоль/л после операции. Во многих вариантах осуществления уровень цитруллина в плазме пациента может быть повышен выше около 100 мкмоль/л. Во многих вариантах осуществления уровень цитруллина в плазме пациента может быть повышен выше около 100 мкмоль/л после операции. Во многих вариантах осуществления уровень цитруллина в плазме пациента может быть повышен до около 37–200 мкмоль/л после операции, предпочтительно 100–200 мкмоль/л после операции. Во многих вариантах осуществления уровень цитруллина в плазме пациента может быть повышен от около 37 мкмоль/л до 2,5 мМ. Во многих вариантах осуществления уровень цитруллина в плазме пациента может быть повышен от около 37 мкмоль/л до 200 мкмоль/л, от 100 мкмоль/л до 1 мМ/л, от 150 мкмоль/л до 500 мкмоль/л.

В конкретном варианте осуществления уровень цитруллина в плазме пациента может быть повышен в течение по меньшей мере 12–48 часов после операции. Во многих вариантах осуществления уровень цитруллина в плазме пациента может быть повышен в течение по меньшей мере 48 часов после операции.

В конкретных вариантах осуществления пациент может быть новорожденным, находится в предподростковом возрасте, может быть подростком или взрослым. Во многих вариантах осуществления пациент может быть в возрасте менее чем около 6 лет. Во многих вариантах осуществления пациент может быть в возрасте менее чем около 10 суток. Во многих вариантах осуществления пациент может представлять собой недоношенного ребенка.

Во многих вариантах осуществления пребывание пациента в отделении интенсивной терапии (ОИТ) может быть уменьшено, предпочтительно менее чем до 27 суток.

Во многих вариантах осуществления пациент может подвергаться риску острой правосторонней сердечной недостаточности, трикуспидальной регургитации, системной гипотензии, ишемии миокарда и повышенного сопротивления дыхательных путей.

Во многих вариантах осуществления пациент может подвергаться риску персистентной легочной гипертензии новорожденного (PPHN).

Во многих вариантах осуществления эффективное количество цитруллина может быть достаточным для предотвращения разъединения eNOS.

Во многих вариантах осуществления пациент может подвергаться риску острого повреждения легких. В конкретном варианте осуществления пациент может иметь острое повреждение легких.

Во многих вариантах осуществления пациент может подвергаться риску послеоперационной легочной гипертензии. В конкретном варианте осуществления пациент может иметь послеоперационную легочную гипертензию.

Во многих вариантах осуществления способ может снизить частоту последствий повреждения легких, индуцированного искусственным кровообращением, у пациентов во время операции с применением искусственного кровообращения и после операции.

Во многих вариантах осуществления способа по данному изобретению, способ может снизить тяжесть последствий повреждения легких, индуцированного искусственным кровообращением, у пациентов во время операции с применением искусственного кровообращения и после операции.

Краткое описание графических материалов

На фиг. 1 изображен цикл мочевины в печени.

На фиг. 2 показано влияние генотипа полиморфизмов CPSI (CC, AC и AA) на уровни аргинина и цитруллина в плазме. Это полиморфизмы CPSI, которые приводят к генотипу T1405N.

На фиг. 3 изображена блок–схема последовательности операций примерного протокола для лечения последствий легочного повреждения, индуцированной АИК, у пациента во время операции и после операции.

На фиг. 4 показано снижение NO и предшественников NO, аргинина и цитруллина, у пациентов с персистентной легочной гипертензией у новорожденных (PPHN).

На фиг. 5 изображено снижение уровня аргинина в плазме при искусственном кровообращении (АИК). АИК снижает уровень аргинина в плазме пациента.

На фиг. 6А–В изображено уменьшение уровней цитруллина в плазме (фиг. 6A) и в сыворотке (фиг. 6B) при искусственном кровообращении. АИК снижает уровень цитруллина в плазме и сыворотке пациента.

На фиг. 7 показано снижение уровня оксида азота (NO) в плазме крови в результате искусственного кровообращения. АИК снижает уровень NO в плазме.

На фиг. 8 показано снижение уровня аргинина у пациентов с повышенным тонусом легочных сосудов (PVT– и PVT+) и без него до, после и через 12, 24 и 48 часов после операции.

На фиг. 9А–С изображены уровни цитруллина в плазме у пациентов с и без введения болюса цитруллина. На фиг. 9A изображено среднее значение для пациентов 6 и 8. На фиг. 9B изображено среднее значение для пациентов 9 и 10. На фиг. 9C изображено среднее значение для пациентов 13–16. Пациенты получали дозу цитруллина (50, 100 или 150 мг/кг) до и после операции.

На фиг. 10A–B изображена модель ФК (фиг. 10A) и параметры ФК (фиг. 10B).

На фиг. 11A–B показаны средние уровни цитруллина и аргинина у детей с и без внутривенного введения цитруллина («в/в цитруллин») в течение 60 часов. На фиг. 11А показано снижение среднего уровня цитруллина у детей в течение 60 часов. На фиг. 11B показано снижение среднего уровня аргинина у детей в течение 60 часов.

На фиг. 12 показаны уровни цитруллина в плазме у пациентов, которым после операции вводили дозу цитруллина (50, 100 или 150 мг/кг) в течение 12 часов.

На фиг. 13 показаны уровни цитруллина в плазме у пациентов, которым после операции вводили дозу цитруллина (50, 100 или 150 мг/кг) в комбинации с внутривенным введением цитруллина (9 мг/кг/ч) в течение 16 часов.

На фиг. 14A–B показаны средние уровни цитруллина у детей в течение 60 часов (фиг. 14A) и средние уровни цитруллина у девяти отдельных детей в течение 60 часов (фиг. 14B).

На фиг. 15 изображена длительность послеоперационной вентиляции с различными дозами цитруллина.

На фиг. 16 изображено влияние цитруллина на респираторный исход при операции восстановлению врожденного порока сердца. Примечание: одна точка данных находится за пределами оси (плацебо, 672 часа). P=0,1911 t–критерий Статтертвейта, n=20 исследуемых пациентов.

На фиг. 17 изображен средний инотропный показатель у пациентов, получавших цитруллин (цитруллин) по сравнению с теми, кто не получал цитруллин (плацебо).

На фиг. 18 A–B изображено систолическое и диастолическое артериальное давление и среднее артериальное давление у пациентов, получающих цитруллин (цитруллин), по сравнению с теми, кто не получал цитруллин (плацебо). На фиг. 18А изображено систолическое и диастолическое артериальное давление. Нет значительного изменения систолического и диастолического артериального давления у пациентов, получающих цитруллин. На фиг. 18 B изображено среднее артериальное давление у пациентов, получающих цитруллин (цитруллин), по сравнению с теми, кто не получал цитруллин (плацебо). Нет значительного изменения среднего артериального давления у пациентов, получающих цитруллин.

На фиг. 19 показаны медианные уровни цитруллина в плазме у пациентов, получавших дооперационный болюс, периоперационный и послеоперационный цитруллин.

На фиг. 20 показан анализ выживаемости Каплана–Мейера продолжительности инвазивной искусственной вентиляции легких от завершения операции до последней экстубации. (Без реинтубации, цензурировано). Пациенты, получавшие цитруллин, продемонстрировали снижение длительности искусственной вентиляции легких. Различия в искусственной вентиляции легких были статистически значимы по критерию суммы рангов Уилкоксона (p=0,0222) и t–критерию ANOVA (p=0,0317).

На фиг. 21 изображен анализ выживаемости Каплана–Мейера на отрезок времени на инотропах. Однофакторный анализ (значение p): Критерий суммы рангов Уилкоксона (0,0727); T–критерий (0,097).

На фиг. 22 изображен анализ выживаемости Каплана–Мейера на отрезок времени на инотропах. Однофакторный анализ (значение p): Критерий суммы рангов Уилкоксона (0,0727); T–критерий (0,0987).

На фиг. 23 показано сравнение образования оксида азота (NO) в эндотелиальных клетках из аргинина, цитруллина и гистамина. Аргинин не эквивалентен цитруллину в образовании NO.

На фиг. 24A–B показаны средние уровни аргинина в плазме (фиг. 24A) и медианные уровни оксида азота в плазме (NO) (фиг. 24B) у пациентов, получающих плацебо и цитруллин

На фиг. 25A–B показана продолжительность инвазивной искусственной вентиляции легких у пациентов, получавших плацебо и цитруллин с включенным временем реинтубации. На фиг. 25A продолжительность послеоперационной искусственной вентиляции легких для этих пациентов была установлена равной нулю, и все пациенты с нулевым временем вентиляции были цензурированы. Как проиллюстрировано на Фиг. 25B, пациентов с нулевым временем вентиляции не цензурировали. Оба анализа показывают статистически значимое снижение времени при инвазивной искусственной вентиляции легких для пациентов, получающих цитруллин.

На фиг. 26A–B показана продолжительность инвазивной искусственной вентиляции легких (исключая время реинтубации) у одного пациента. Результаты подтверждают положительный эффект цитруллина по сравнению с плацебо–терапией при статистически значимом снижении времени при инвазивной искусственной вентиляции легких.

На фиг. 27A–B показаны графики выживаемости Каплана–Мейера, показывающие снижение потребности в респираторной поддержке у пациентов, получающих цитруллин, по сравнению с плацебо.

На фиг. 28A–B показан анализ Каплана–Мейера (без пациентов с нулевой продолжительностью внутривенного (в/в) применения инотропа). На фиг. 28А отсутствует дополнительное цензурирование, а на фиг. 28B установлено нулевое цензурирование. На фиг. 28A–B показано, что у пациентов, получающих цитруллин, инотропный показатель ниже, чем у пациентов, получающих плацебо.

На фиг. 29 показаны средние значения инотропных показателей с течением времени при сравнении пациентов, получавших плацебо, с цитруллином.

На фиг. 30A–B показаны графики Каплана–Мейера для общей продолжительности вазоактивных лекарственных средств для всех пациентов, подвергающихся цензурированию (фиг. 30A), и для пациентов без вазоактивных препаратов с применением цензурирования (фиг. 30B).

На фиг. 31 показана общая продолжительность пребывания в отделении интенсивной терапии для детей (ДОИТ) у пациентов, получающих цитруллин в сравнении с плацебо.

На фиг. 32A–B показана общая продолжительность пребывания в отделении интенсивной терапии (ОИТ) на основе самой большой продолжительности искусственной вентиляции легких, в/в использование инотропа или вазодилататора. На фиг. 32А изображены все пациенты без дополнительного цензурирования. На фиг. 32B изображены все пациенты, исключая реинтубацию и без дополнительного цензурирования.

На фиг. 33А–В изображена комплексная конечная точка максимальной величины продолжительности искусственной вентиляции и продолжительности использования инотропа. На фиг. 33A изображены все пациенты, включая реинтубации и без дополнительного цензурирования. На фиг. 33B изображены все пациенты, исключая получивших реинтубацию, без дополнительного цензурирования. Комплексное значение подвергалось цензурированию, если продолжительность использования инотропа составляла 48 часов, а искусственная вентиляция легких была короче 48 часов.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение обеспечивает снижение последствий повреждения легких, индуцированного искусственным кровообращением, у пациентов во время операции с искусственным кровообращением и после операции путем поддержания уровней цитруллина в плазме. Способы, описанные в данном документе, могут обеспечивать устойчивый уровень цитруллина в плазме в периоперационном периоде > 37 мкмоль/л в течение до 48 часов после операции. Предпочтительно, способы, описанные в данном документе, могут обеспечивать устойчивый уровень цитруллина в плазме в периоперационном периоде > 100 мкмоль/л в течение до 48 часов после операции. Это может снизить частоту и/или тяжесть осложнений при повреждении легких, индуцированного искусственным кровообращением, у пациентов во время операции с применением искусственного кровообращения и после операции.

Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что внутривенное введение цитруллина повышает уровни аргинина в плазме после операции и предотвращает последствия повреждения легких, индуцированного искусственным кровообращением, путем уменьшения разъединения eNOS. Снижение частоты и/или тяжести повреждения легких, индуцированного искусственным кровообращением, у пациентов во время операции с искусственным кровообращением и в послеоперационном периоде снижает затраты и освобождает персонал и оборудование для других целей. Описанные в данном документе способы используют внутривенное введение цитруллина для профилактики последствий повреждения легких, индуцированного искусственным кровообращением, у детей, перенесших операцию по восстановлению врожденных пороков сердца.

Искусственное кровообращение вызывает системный воспалительный ответ, который клинически характеризуется острым нарушением сердечно–сосудистой и легочной функции. Apostolakis et al. (2010) Journal of Cardiac Surgery 25(1): 47-55; Huffmyer & Groves (2015) “Pulmonary Complications of Cardiopulmonary Bypass.” Best Practice & Research Clinical Anesthesiology. Однако, по ряду медицинских и физиологических причин, пациенты детского возраста, подвергнутые АИК во время хирургического восстановления врожденных пороков сердца, более восприимчивы к этому каскаду и имеют больший медицинский риск, чем взрослые пациенты. Kozik & Tweddell (2006) The Annals of Thoracic Surgery 81(6): S2347-S2354; Shekerdemian (2009) Heart 95(15): 1286-1296; Schure (2010) Southern African Journal of Anesthesia and Analgesia 16(1): 46-51. Снижение основных проявлений острого повреждения легких, индуцированного АИК, а именно послеоперационная потребность в искусственной вентиляции легких и в инотропной терапии, может использоваться для измерения клинической эффективности.

Окислительный ущерб из–за разъединения eNOS

Автор изобретения обнаружил, что, когда пациент подвергается искусственному кровообращению (АИК), индуцируется системный воспалительный ответ из–за падения уровней цитруллина в плазме. Это снижение цитруллина в плазме приводит к разъединению eNOS и образованию радикальных форм кислорода. Результирующее окислительное повреждение приводит к легочному повреждению, ассоциированному с АИК.

Многочисленные наблюдения и клинические исследования показали, что уровни цитруллина и аргинина в плазме резко падают и не восстанавливаются в течение 48 часов после искусственного кровообращения при операции на сердце из–за врожденных дефектов. Благодаря внутриклеточным транспортным механизмам и внутриклеточной обработке цитруллин является основным субстратом для эндогенного продуцирование оксида азота. Barr et al. (2003) The Journal of Pediatrics 142(1): 26-30; Smith et al. (2006) The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery 132(1): 58-65; Barr et al. (2007) The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery 134(2): 319-326.

Эндотелиальная синтаза оксида азота (eNOS) представляет собой димер с полной функциональностью, например, при превращении аргинина в оксид азота (NO) и цитруллин. Поддержание димерной формы eNOS требует эффективного уровня цитруллина. Когда цитруллин падает ниже порогового уровня, димер eNOS разъединяется. Разъединенная eNOS все еще связывает субстрат, но производит свободные радикалы, а не NO. Свободные радикалы способствуют повреждению воспаления, что приводит к последствиям повреждения при искусственном кровообращении. Плохое продуцирование NO разъединенной eNOS приводит к повышению легочного сосудистого сопротивления, что способствует легочной гипертонии.

Патофизиология последствий повреждения легких после восстановления множества врожденных пороков сердца включает в себя снижение уровней цитруллина в плазме (ниже, например, 37 мкмоль/л), что, в свою очередь, приводит к разъединению фермента eNOS. Разъединенный фермент eNOS продуцирует радикалы кислорода, которые вызывают окислительное повреждение, лежащее в основе повреждения легких, которое может быть частью последствий после искусственного кровообращения. Парадокс аргинина является клинически значимым, потому что аргинин не может служить в роли предотвращения разъединения eNOS и, следовательно, предотвращения окислительного повреждения вследствие разъединенного eNOS.

Парадокс аргинина

Ранние исследования с использованием бесклеточных систем показали, что оксид азота (NO) вырабатывается из аргинина. В начале 1990–х годов ученые полагали, что продуцирование оксида азота зависит от свободного аргинина, перерабатываемого ферментом NO–синтазой. В это время считалось, что цитруллин является побочным продуктом процесса, а не движущей силой. Фактически, в это время цитруллин использовался в качестве индикатора продуцирования NO, поскольку ошибочно считалось, что он является побочным продуктом продуцирования NO. См., например, Moncada & Higgs N. Engl. J. Med. 329 (27) 2002–2012 (1993) и Stamler, et al. Science 258 (5090) 1898-1902 (1992). Это раннее понимание, однако, противоречило исследованиям, проведенным в физиологических условиях и опубликованным позже, эти более поздние исследования описывают «парадокс аргинина». «Парадокс аргинина» проявляется в увеличении продуцирования NO при неизменных уровнях аргинина в плазме.

Исследования показывают, что половинная насыщающая концентрация аргинина для eNOS составляет менее 10 мкМ. В журналах также сообщалось, что внутриклеточные концентрации аргинина находятся в диапазоне от 0,1 до 0,8 мМ в культурах эндотелиальных клеток. Соответственно, ожидается, что активный центр eNOS будет насыщен внутриклеточным аргинином в этих клетках, и увеличение внеклеточного аргинина не приведет к увеличению выработки NO. Это наблюдение было сообщено Fike et al. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 274: L517-L526 (1998).

Однако исследования in vitro и in vivo демонстрируют, что продуцирование NO эндотелиальными клетками в физиологических условиях может быть увеличено внеклеточным аргинином, несмотря на насыщающую концентрацию внутриклеточного аргинина. С другой стороны, внутриклеточная концентрация аргинина в эндотелиальных клетках может изменяться более чем в 100 раз без изменения продуцирования оксида азота (NO). Это наблюдение, то есть то, что введение внеклеточного аргинина вызывает продуцирование NO, даже когда внутриклеточный аргинин доступен в избытке, называется «парадокс аргинина». McDonald, et al. (1997) The Journal of Biological Chemistry 272(50): 31213-31216, 31213. Кроме того, за это время было обнаружено, что экзогенный аргинин не увеличивает продуцирование NO в физиологических системах. См., например, Blum, et al. Circulation 101(18): 2160-2164 (2000) и Chin–Dusting, et al. J.Am.Coll.Cardiol: 27(5): 1207-1213 (1996).

Теперь понятно, что цитруллин может стимулировать выработку оксида азота (NO) даже в присутствии насыщающих уровней аргинина. Кроме того, внеклеточный цитруллин не влияет на уровень внутриклеточного аргинина. Следовательно, продуцирование NO на самом деле зависит от использования цитруллина, образующегося в цикле мочевины, или рециркулируемого цитруллина, входящего в ферментативный комплекс с аргининосукцинатом и аргинином в качестве внутренних промежуточных соединений, а не от экзогенного запаса аргинина. Dioguardi (2011) J Nutrigenet Nutrigenomics 4: 90-98. Соответственно, адекватные уровни цитруллина в плазме уменьшат тяжесть и частоту осложнений повреждения легких, индуцированного искусственным кровообращением.

Последствия повреждения легких, индуцированного искусственным кровообращением

Ряд факторов подвергают легкие риску получения повреждения во время АИК. Главным среди них, среди прочего, является поверхностная активация нейтрофилов и других лейкоцитов, комплемента и цитокинов (про– и противовоспалительных) и связанный системный воспалительный каскад. Apostolakis et al. (2010) Journal of Cardiac Surgery 25(1): 47-55; Schure (2010) Southern African Journal of Anesthesia and Analgesia 16(1): 46-51. Степень повреждения легких из–за воспалительной реакции, опосредованной контактной активацией лейкоцитов во время экстракорпорального кровообращения, может варьировать по степени тяжести: от микроскопических изменений без клинических последствий до синдрома капиллярной утечки или, в худшем случае, до острой дыхательной недостаточности.

Повреждение легких проявляется несколькими способами и может затрагивать как паренхиматозные, так и сосудистые ткани легких. Паренхиматозные эффекты АИК отражаются в изменениях податливости легких, чаще всего связанных с увеличением количества воды в легких. Влияние этого на пациента является требованием для увеличения вентиляционной поддержки и снижения способности легких выполнять свою функцию в газообмене. Сосудистые эффекты проявляются изменениями легочного сосудистого сопротивления, которые, в свою очередь, влияют на функцию правого желудочка. Это условие представляет собой легочную артериальную гипертензию. Легкие находятся в уникальном положении в кровообращении и поэтому могут быть уязвимы для различных механизмов повреждения. Циркулирующие лейкоциты, которые вырабатывают медиаторы воспаления после контакта с поверхностями в АИК или при прямом повреждении АИК, составляют только часть воспалительного повреждения, которое может возникнуть в легком. Clark (2006) Perfusion 21(4): 225-228. Легкие также являются важным источником воспалительных клеток, а также мишенью для повреждения этими же клетками. Последствиями механического и воспалительного воздействия на легкие является снижение функциональной остаточной емкости, снижение эластичности и нарушение газообмена. Эти изменения в конечном итоге связаны с повышением сопротивления легочных сосудов и давлением в легочной артерии.

Острое АИК–индуцированное повреждение легких приводит к значительным сердечно–легочным проблемам. Воспалительный ответ приводит к сужению легочной и системной сосудистой сети. Сужение приводит к увеличению нагрузки на правый желудочек и левый желудочек. Воспалительный ответ также приводит к отеку легких и ухудшению податливости легких и послеоперационной функции легких. Стандартные способы лечения этих послеоперационных осложнений включают в себя искусственную вентиляцию легких до тех пор, пока функция легкого не вернется к норме, и инотропную поддержку, пока легочный и системный тонус сосудов не вернется к норме, что в конечном итоге приведет к снижению нагрузки на правый и левый желудочки. Искусственная вентиляция и инотропная поддержка представляют собой способы лечения, которые могут служить эффективными биомаркерами острого повреждения легких, индуцированного АИК. Кроме того, длительная искусственная вентиляция может, в свою очередь, часто приводить к другим заболеваниям, включая повреждение легких, ассоциированное с вентиляцией, пневмонию, ассоциированную с вентиляцией (VAP), инфекции кровотока, ассоциированные с центральным катетером (CLABSI), и даже более длительное пребывание в отделении интенсивной терапии. Поэтому предотвращение последствий повреждения легких, индуцированного искусственным кровообращением, является поэтому желательной терапевтической целью.

Пациенты–дети с врожденным пороком сердца (CHD)

Дети, перенесшие операцию по причине врожденных пороков сердца, особенно чувствительны к развитию острого повреждения легких, индуцированного АИК, из–за возрастных различий в воспалительной реакции и повышенной чувствительности их незрелых систем органов к повреждению, а также четких различий между детской и взрослой АИК. Kozik & Tweddell (2006) The Annals of Thoracic Surgery 81(6): S2347-S2354. Особенно страдают новорожденные и младенцы, так как относительно большой размер экстракорпорального контура, заполнение кровью и потребность в увеличенном расходе крови приводят к большему воздействию крови на инородную поверхность. Schure (2010) Southern African Journal of Anesthesia and Analgesia 16(1): 46-51.

Для кардиохирургических вмешательств из–за врожденных дефектов экстракорпоральный контур должен быть приспособлен к широкому диапазону возрастных групп и размеров: от 1,5 кг недоношенных детей до > 100 кг подростков или взрослых. Младенцы и дети имеют меньшие объемы циркулирующей крови, более высокие показатели потребления кислорода и, часто, высоко реактивные легочные сосудистые русла. Кроме того, у новорожденных и детей раннего возраста наблюдается лабильная терморегуляция и незрелые системы органов с множественными последствиями для ишемической толерантности и воспалительного ответа. Многие сложные коррекции требуют бескровного операционного поля, которого может быть трудно достичь при наличии внутрисердечных или дополнительных сердечных шунтов, аорто–легочных коллатералей или иным образом увеличенного легочного венозного возврата. Schure (2010) Southern African Journal of Anesthesia and Analgesia 16(1): 46-51.

Различия между взрослым и детским АИК приведены в таблице 1.

Таблица 1. Табличный обзор различий между взрослым и детским АИК (Schure 2010)

Параметр	Взрослый пациент	Пациент–ребенок
Расчетный объем крови	65 мл/кг (4–5 литров на 70 кг)	< 10 кг: 85 мл/кг (285 мл на 3 кг)
Влияние разбавления на объем крови	25–33%	100–200%
Добавление цельной крови или эритроцитарной массы к первичному заполнению	Редко	Обычно
Потребление кислорода	2–3 мл/кг/мин	6–8 мл/кг/мин
Полный поток АИК	50–75 мл/кг/мин	150–200 мл/кг/мин для < 3 кг
Минимальная температура АИК	Редко < 25–32 °C	Обычно 15–20 °C
Использование полной остановки кровообращения или регионарной перфузии со слабым потоком	Редко	Часто
Перфузионное давление	50–80 мм рт. ст.	20–50 мм рт. ст.
Кислотно–основное управление	В основном Альфа–стат	Альфа–стат и/или рН–стат
Измеренный PaCO2	30–45 мм рт. ст.	20–80 мм рт. ст.
Регуляция глюкозы гипогликемия гипергликемия	Редко (серьезное повреждение печени); Обычно, лечение инсулином	Обычно, истощение запасов Менее распространенный риск гипогликемического отскока

Функциональное и структурное состояние легочного сосудистого русла играет ключевую роль в представлении и исходе у детей с врожденным сердечно–сосудистым заболеванием. Тем не менее, именно в ближайшем послеоперационном периоде эти педиатрические пациенты наиболее уязвимы к последствиям легочного повреждения, индуцированного искусственным кровообращением. Последствия повреждения легких, индуцированного искусственным кровообращением, представляют собой сложную взаимосвязь между предоперационным состоянием пациента (особенно возрастом на момент восстановления, типом поражения и наличием синдрома) и неизбежным нарушением эндокринной и вазоактивной пептидной среды, возникающим в результате кардиохирургического вмешательства. Важными факторами, приводящими к усилению вазоконстрикции, являются искусственное кровообращение, гипотермия и остановка кровообращения с некоторой степенью ассоциированной ишемии. Остаточные поражения сердца и последствия реакции на стресс, гипоксии, метаболического и респираторного ацидоза могут вносить дополнительный дисбаланс в пользу легочной вазоконстрикции. Многие из проявлений острого повреждения легких, ассоциированного с АИК, могут быть полностью или частично объяснены эндотелиальной дисфункцией, которая сразу дает возможную объединяющую гипотезу, а также потенциальную терапевтическую мишень. Острое повреждение легких, ассоциированное с АИК, может также привести к серьезным неблагоприятным осложнениям со стороны сердца. Воспалительная реакция после операции при врожденном пороке сердца (CHD) обычно связана с аномальным желудочково–сосудистым взаимодействием, системной вазоконстрикцией и повышенной постнагрузкой, а также с повреждением миокарда с нарушением систолической и диастолической функции. У части пациентов эти гемодинамические проявления могут привести к серьезным последствиям низкого сердечного выброса. Shekerdemian (2009) Heart 95(15): 1286-1296.

Серьезные последствия повреждения легких клинически важны для исхода. Эти последствия являются факторами риска для длительного пребывания в реанимации и смерти. Потеря легочного тонуса сосудов часто встречается у новорожденных и детей после операции при CHD. Это может быть наиболее проблематичным после бивентрикулярного восстановления у пациентов, у которых был предоперационный неограниченный легочный поток (большие дефекты перегородки, общий артериальный ствол) или легочная венозная гипертензия (затрудненный аномальный легочный венозный дренаж). Нестабильность легочного сосудистого сопротивления также часто встречается после паллиативной хирургии у пациентов с функционально одножелудочковым кровообращением, включая операции типа Норвуда, системно–легочное шунтирование артерий или бандаж легочной артерии. В то время как многие терапевтические вмешательства оптимизируют системную доставку кислорода посредством их непосредственного влияния на миокард и системную сосудистую сеть, манипуляции с тонусом легочных сосудов могут сыграть важную роль в оптимизации циркуляции крови у детей, перенесших операцию из–за сердечно–сосудистых заболеваний. Shekerdemian (2009) Heart 95(15): 1286-1296.

Цитруллин с его механизмом действия предназначен для профилактического лечения с целью снижения риска развития осложнений повреждения легких, индуцированного искусственным кровообращением, и, таким образом, для оказания положительного влияния на послеоперационное восстановление детей, перенесших операцию из–за врожденных пороков сердца.

Пороки сердца, включая врожденные пороки сердца, включают, но не ограничиваются ими, пороки сердца, ассоциированные с избыточным легочным кровотоком. Порок сердца может быть дефектом межпредсердной перегородки, например дефектом большой перегородки артерии. Порок сердца может быть дефектом межпредсердной перегородки, например, большим дефектом межпредсердной перегородки (VSD). Дефект сердца может представлять собой поражение одного желудочка. Поражение одного желудочка может быть устранено с помощью процедур Гленна и Фонтена. Сердечный дефект может представлять собой стеноз аортального клапана (AVS), дефект межпредсердной перегородки (ASD), коарктацию аорты (CoA), полный дефект атриовентрикулярного канала (CAVC), d–транспозицию магистральных сосудов, аномалию Эбштейна, I–транспозицию магистральных сосудов, открытый артериальный проток (PDA), стеноз легочного ствола, дефекты единственного желудочка, тетраду Фалло, тотальный аномальный дренаж легочных вен (TAPVC), Truncus Arteriosus или дефект межжелудочковой перегородки (VSD). Пациент может быть новорожденным, находится в предподростковом возрасте, может быть подростком или взрослым.

Цитруллин и аргинин различны по механизму и действию

Аргинин и цитруллин оба являются продуктами цикла мочевины, но на разных стадиях цикла. В клетках, выводящих азот, аргинин перерабатывается аргиназой в мочевину, в то время как в клетках, продуцирующих оксид азота, аргинин перерабатывается синтазой оксида азота (NOS) с образованием оксида азота и цитруллина. Внеклеточный аргинин неэффективен для создания значительного увеличения стимулированного или нестимулированного продуцирования оксида азота в эндотелиальных клетках сосудов. См. также Surdacki, et al. Wien Klin Wochenschr. (1994) 106(16): 521–6. Цитруллин, напротив, является мощным стимулятором выработки NO.

На фиг. 23 показан эксперимент по измерению продуцирования оксида азота эндотелиальными клетками сосудов человека, не подвергавшимися воздействию агента (отрицательный контроль), подвергавшимися воздействию аргинина, цитруллина и гистамина (положительный контроль). Эти агенты вводили в культивируемые эндотелиальные клетки сосудов человека, стимулированные ацетилхолином. Измерение оксида азота проводилось с помощью системы нитратов/нитритов Seiver. Эксперимент ясно демонстрирует, что аргинин не влияет на выработку оксида азота эндотелиальными клетками сосудов человека. Аргинин, непосредственно применяемый к эндотелиальной клетке, создает незначительные признаки увеличения продуцирования NO даже при очень высоких концентрациях (10 мМ). С другой стороны, внеклеточное добавление цитруллина к эндотелиальным клеткам увеличивает продуцирование NO этими клетками. Кроме того, авторы изобретения обнаружили, что блокирование транспорта цитруллина (через транспортер SNAT1) значительно снижает выработку оксида азота в нормальных и гипоксических условиях.

Это наблюдение частично связано с комплексообразованием участвующих ферментов, создающих субстратный туннель, в который может попасть только цитруллин. Помимо каналирования субстрата, существует также слабый транспорт аргинина в клетки. Это основополагающий принцип парадокса аргинина, в котором аргинин не способен действовать как прямой эффектор продуцирования оксида азота во всей клеточной системе. См., например, Summar et al., Mol.Genet. Metab. 2004; 81 Suppl 1:S12–9.

В физиологических условиях цитруллин может стимулировать выработку оксида азота (NO) даже в присутствии насыщающих уровней аргинина. Кроме того, внеклеточный цитруллин не влияет на уровень внутриклеточного аргинина. Следовательно, продуцирование NO на самом деле зависит от использования цитруллина, образующегося в цикле мочевины, или рециркулируемого цитруллина, входящего в ферментативный комплекс с аргининосукцинатом и аргинином в качестве внутренних промежуточных соединений, а не от экзогенного запаса аргинина. Dioguardi (2011) J Nutrigenet Nutrigenomics 4: 90–98.

Молекулы аргинина и цитруллина отличаются, например, выработкой оксида азота. Нет никаких доказательств или причин полагать, что цитруллин может заменить все роли аргинина в организме, включая такие роли, как продуцирование белка de novo. Аргинин и цитруллин не являются биологическими эквивалентами.

Аргинин является субстратом синтазы оксида азота (NOS) для образования оксида азота (NO) с цитруллином в качестве побочного продукта. Цитруллин рециркулируется обратно в аргинин с помощью аргиносукциновой синтетазы (ASS) и аргиносукциновой лизазы (ASL), образуя цикл цитруллина–NO. Аргинин вырабатывается in situ ферментами этого цикла, а внеклеточные и экзогенные источники аргинина не восполняют дефицит аргинина. См., например, Erez, et al. (2011) Nature Medicine 17(12): 1619–1626. Кроме того, eNOS образует димер фермента, который требует достаточного количества аргинина, чтобы оставаться в (активной) форме димера. Как отмечает Эрез, цитруллин необходим для продуцирования аргинина in situ, а экзогенные источники аргинина недостаточны для обеспечения аргинина, необходимого NOS для продуцирования NO. Когда уровень аргинина падает, как во время гипоксии, димер разъединяется и начинает вырабатывать свободнорадикальный кислород и пероксинитриты. Было продемонстрировано, что высокий уровень циркулирующего цитруллина обеспечивает некоторую защиту от окислительного повреждения в тканях. См., например, Grisafi et al. Lung (2012) 190(4): 419–30.

Авторы изобретения обнаружили, что экзогенный аргинин в физиологических системах не увеличивает продуцирование NO. См., например, Chin–Dusting, et al. J. Am. Coll. Cardiol: 27(5): 1207–1213 (1996). Когда уровни аргинина падают, как во время сердечно–легочной хирургии и послеоперационного периода после этого, димер NOS, то есть фермент, разъединяется и начинает продуцировать свободнорадикальные кислородные радикалы (O^•). Кроме того, продуцирование супероксида может увеличиваться из ферментных источников, отличных от eNOS, таких как НАДФH оксидаза. Liu, et al. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol (2006) 290: L2-L10. Это избыточное продуцирование супероксида могло напрямую взаимодействовать с NO, чтобы уменьшить его локальное продуцирование. Здесь поддержание адекватного уровня цитруллина в плазме позволяет производить достаточное количество NO, чтобы поддерживать фермент eNOS в качестве димера и предотвращать выработку кислородных радикалов.

Цитруллин может быть непреднамеренно удален гемофильтрацией и диализом

В большом проспективном обзорном исследовании детей, перенесших врожденную операцию на сердце, уровни цитруллина и аргинина в плазме были значительно снижены после операции и не возвращались к предоперационным исходным уровням в течение до 48 часов.

Повышенный тонус легочных сосудов (PVT) может быть важной периоперационной проблемой у детей, перенесших врожденные кардиохирургические операции, даже у пациентов, которые, как считается, до операции не подвергаются значительному риску тяжелой гипертонии легочной артерии. Были проведены клинические исследования безопасности и фармакокинетические исследования, которые показали, что и перорально и внутривенно введенный цитруллин хорошо переносится и не имеет побочных эффектов у младенцев и детей, подвергающихся восстановлению врожденных пороков сердца. Последующее небольшое рандомизированное плацебо–контролируемое исследование цитруллина показало, что цитруллин хорошо переносится без нежелательных явлений; однако у некоторых пациентов значительное удаление цитруллина происходило во время гемофильтрации и диализа, выполняемых во время искусственного кровообращения. В предыдущих исследованиях потенциальных генетических факторов риска для увеличения PVT было отмечено, что генотип важного полиморфизма в ключевом ферменте цикла мочевины карбамоилфосфат–синтетазе 1 (CPSI T1405N) влияет на риск повышения тонуса легочных сосудов у младенцев и детей, подвергающихся хирургическому вмешательству. восстановление врожденных пороков сердца и у новорожденных с риском послеоперационной легочной гипертонии (PPHN). Кроме того, было отмечено, что у всех пациентов, независимо от генотипа полиморфизма, наблюдалось значительное снижение уровней основных интермедиатов цикла мочевины в плазме, включая цитруллин и аргинин. Эти ассоциации побудили авторов изобретения исследовать периоперационную добавку цитруллина.

[0101] В начальных испытаниях добавок использовался пероральный цитруллин в дозе 1,9 г/кг до искусственного кровообращения, сразу после операции и каждые 12 часов, продолжаясь в течение 48 часов после операции. Пероральный цитруллин хорошо переносился без каких–либо признаков значительных побочных эффектов (таких как системная гипотензия). Кроме того, было отмечено, что у пациентов с 12–часовым уровнем цитруллина в плазме > 37 мкмоль/л (верхний диапазон нормальных уровней) не развивалось повышение PVT.

К сожалению, не все пациенты, получавшие пероральный цитруллин, достигли этих уровней. Эти результаты помогли в разработке последующих исследований с внутривенным введением цитруллина. В исследовании по увеличению дозы, нацеленном на устойчивый уровень в плазме около 100 мкмоль/л, авторы изобретения отметили, что внутривенный цитруллин имеет довольно короткий период полужизни. Для решения этой проблемы авторы изобретения разработали комбинированный протокол доставки лекарственных средств из болюса и непрерывной инфузии. Комбинированный протокол из болюса, равного 150 мг/кг в начале операции, с последующим послеоперационным вмешательством через 4 часа с непрерывной инфузией, равной 9 мг/кг/час привел к устойчивым уровням цитруллина в плазме, равным приблизительно 100 мкмоль/л. Неблагоприятных побочных эффектов отмечено не было.

В больнице им. Вандербильта 77 пациентов прошли лечение по этому протоколу. Исследование было остановлено для подготовки к более крупному многоцентровому рандомизированному плацебо–контролируемому исследованию. Анализ данных этих 77 пациентов показал, что большинство из них, которые получали цитруллин, не достигали целевого терапевтического уровня цитруллина в плазме, равного около 100 мкмоль/л, главным образом из–за ранее неизвестного удаления цитруллина посредством фильтрации и гемоконцентрации, происходящей во время искусственного кровообращения.

Цитруллин и искусственное кровообращение

Внутривенное периоперационное введение цитруллина повышает уровень аргинина в плазме после операции и позволяет избежать разъединения eNOS, что приводит к снижению последствий повреждения, индуцированного искусственным кровообращением. Авторы изобретения разработали улучшенный протокол для поддержания легочного сосудистого тонуса во время и после операции, который включает внутривенное введение болюса цитруллина, равного 150 мг/кг при инициации искусственного кровообращения (АИК), добавление L–цитруллина в концентрации 200 мкмоль/л к заместительной жидкости для фильтрации и гемоконцентрации, используемой во время искусственного кровообращения, цитруллиновый болюс, равный 20 мг/кг через 30 минут после деканюляции АИК, сразу после чего начинается непрерывная инфузия, равная 9 мг/кг/ч в течение 48 часов. Вдыхаемый оксид азота (NO), как и большинство других методов лечения, представляет собой реактивную терапию, которая сначала требует от пациента развития респираторных осложнений при искусственном кровообращении до начала терапии. Это резко отличается от цитруллина, который, по–видимому, предотвращает возникновение последствий повреждения легких, индуцированного искусственным кровообращением.

Этот пересмотренный протокол предназначен для поддержания устойчивого терапевтического уровня цитруллина в плазме выше целевого порогового значения, равного около 100–200 мкмоль/л от начала искусственного кровообращения, в течение всей операции и в течение до около 48 часов после операции.

Отдельный в/в доступ для введения цитруллина не требуется. Препарат цитруллина является изотоническим и может поступать через периферический в/в или центральный венозный катетер. Цитруллин является аминокислотой и, следовательно, для целей совместимости может рассматриваться как парентеральное питание. Кроме того, цитруллин совместим с жидкостями, используемыми для фильтрации или гемоконцентрации во время искусственного кровообращения.

Рассматривая фиг. 3, примерная блок–схема показывает способ поддержания адекватных уровней цитруллина в плазме, включающий введение цитруллина пациенту во время и после операции.

При рассмотрении фиг. 3, на предоперационном этапе пациенту 100 может быть введен цитруллиновый болюс, равный 150 мг/кг. Во время операции цитруллин можно вводить в концентрации, равной 200 мкмоль/л в заместительную жидкость для фильтрации или гемоконцентрации, используемую во время операции 200. Во время послеоперационной стадии можно вводить 300 болюс цитруллина в дозе 20 мг/кг, а затем непрерывную инфузию, равную 9 мг/кг/ч в течение 48 часов 400.

Препараты цитруллина

Цитруллин (2–амино–5–(карбамоиламино)пентановая кислота) [C₆H₁₃N₃O₃] представляет собой аминокислоту. Раствор цитруллина для в/в введения может быть изготовлен способами, известными в данной области техники. См., например, Kakimoto, et al. (1971) Appl Microbiol 22(6): 992–999.

Способы применения

Цитруллин можно вводить до хирургического вмешательства. Подходящая дозировка может включать внутривенное болюсное введение цитруллина в дозе 150 мг/кг в начале искусственного кровообращения. Цитруллин можно вводить во время хирургического вмешательства. Подходящей дозировкой может быть добавление цитруллина в концентрации, равной 200 мкмоль/л, к жидкости для фильтрации и гемоконцентрации, используемой во время искусственного кровообращения. Цитруллин можно вводить после хирургического вмешательства. Болюс, равный 20 мг/кг цитруллина, следует через 30 минут после деканюляции из искусственного кровообращения, сразу после чего проходит непрерывная инфузия, равная 9 мг/кг/час в течение 48 часов. Способы, описанные в данном документе, могут использоваться для поддержания уровня цитруллина в плазме пациента выше около 37 мкмоль/л. Заместительная жидкость для фильтрации или гемоконцентрации может быть предоставлена в виде стандартной жидкости, например Plasmalyte® (стерильный непирогенный изотонический раствор), с добавлением цитруллина для достижения концентрации цитруллина, равной 200 мкмоль/л. Дозы могут вводиться центральным внутривенным катетером, который будет помещен после индукции анестезии или через контур искусственного кровообращения.

Цитруллин может быть введен пациенту внутривенным способом для поддержания уровня цитруллина в плазме. Протокол для поддержания адекватного запаса цитруллина в плазме во время операции может включать в себя введение внутривенного цитруллинового болюса (например, 150 мг/кг) при инициации искусственного кровообращения (АИК), добавление цитруллина (например, в концентрации 200 мкмоль/л) в заместительную жидкость для фильтрации или гемоконцентрации, используемую во время операции, необязательно искусственном кровообращении, болюс цитруллина (например, 20 мг/кг) через 30 минут после деканюляции АИК, сразу после чего начинается непрерывная инфузия (например, 9 мг/кг/ч) в течение 48 часов.

Внутривенный цитруллиновый болюс при инициации искусственного кровообращения (АИК) может составлять около 100–300 мг/кг. Внутривенный цитруллиновый болюс при инициации искусственного кровообращения (АИК) может составлять около 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275 или 300 мг/кг. В предпочтительном режиме внутривенный цитруллиновый болюс при инициации искусственного кровообращения (АИК) может составлять около 150 мг/кг.

Цитруллин можно добавлять в концентрации около 100–300 ммколь/л в заместительную жидкость для фильтрации или гемоконцентрации, используемую во время операции, необязательно включая искусственное кровообращение. Цитруллин можно добавлять в концентрации около 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275 или 300 моль/л в заместительную жидкость для фильтрации или гемоконцентрации, используемую во время операции, необязательно во время искусственного кровообращения. В предпочтительном режиме цитруллин можно добавлять в концентрации около 200 ммколь/л в заместительную жидкость для фильтрации или гемоконцентрации, используемую во время операции, необязательно во время искусственного кровообращения. Например, любые жидкости, добавленные или удаленные во время операции, должны быть приняты во внимание, чтобы поддерживать концентрацию цитруллина, равную около 200 моль/л в течение всего курса операции.

Цитруллиновый болюс, вводимый через 30 минут после деканюляции, обычно после искусственного кровообращения, может составлять около 10–30 мг/кг. Цитруллиновый болюс, равный около 10, 15, 20, 25 или 30 мг/кг может быть введен вскоре после завершения искусственного кровообращения, обычно через 30 минут после деканюляции. В предпочтительном режиме цитруллиновый болюс, равный около 20 мг/кг можно вводить обычно через 30 минут после деканюляции после искусственного кровообращения.

Непрерывная инфузия может составлять около 5–15 мг/кг/час цитруллина: около 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 мг/кг/час цитруллина. Непрерывная инфузия может составлять около 9 мг/кг/час цитруллина.

Цитруллин можно вводить перорально в дозировке, равной около 5–15 г/кг, т. е. около 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 г/кг цитруллина. Пероральная дозировка цитруллина может составлять около 9 г/кг цитруллина.

Целевой уровень для цитруллина в плазме может поддерживаться на уровне от 37 мкмоль/л до 2,5 мМ. Например, уровень цитруллина в плазме пациента может поддерживаться выше около 37, 40, 45, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250 или300 мкмоль/л. Уровень цитруллина в плазме пациента может поддерживаться выше около 37, 100 или 200 моль/л. Описанные в данном документе способы могут быть использованы для поддержания уровня цитруллина в плазме пациента от около 37 мкмоль/л до 200 мкмоль/л, от 100 мкмоль/л до 1 мМ/л, от 150 мкмоль/л до 500 мкмоль/л цитруллина.

Цитруллин может быть предоставлен в форме единичной дозы. Например, цитруллин может быть предоставлен в контейнере, содержащем 300 мг стерильного цитруллина, приготовленного для инъекций. Это может быть восстановлено для применения с использованием 6 мл стерильной воды и дополнительно разбавлено приблизительно 5,9 мл стерильного раствора NaCl 0,9% европейская фармокопея до общего объема, равного 12 мл и концентрации 300 мг/12 мл (т.е. 25 мг/мл). Цитруллин может быть приготовлен для инъекций, например, в концентрации 10–40 мг/мл, например 10, 15, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35 или 40 мг/мл. Цитруллин может быть предоставлен в виде лекарственного препарата – 500 мг стерильного цитруллина для инъекций в 10 мл стерильной воды. Он может быть использован для инфузии пациентам с использованием хлорида натрия 0,9% Евр. Фарм.

В одном варианте осуществления в день операции пациенту вводят болюс 150 мг/кг цитруллина, добавляя цитруллин в концентрации 200 мкмоль/л к жидкостям для фильтрации и гемоконцентрации. Примерно через 30 минут после операции вводят болюс с 20 мг/кг цитруллина и после болюса начинают непрерывную внутривенную инфузию цитруллина, равную 9 мг/кг/ч (например, в течение 5–10 минут, предпочтительно сразу после введения болюса) и поддерживают ее в течение 6–48 часов, предпочтительно в течение 48 часов.

Например, L–цитруллиновый болюс 150 мг/кг может быть введен в начале искусственного кровообращения (АИК) с цитруллином в концентрации 200 мкмоль/л, добавленным к жидкости для фильтрации и гемоконцентрации, используемой во время АИК; болюс 20 мг/кг L–цитруллина можно вводить через 30 минут после деканюляции от АИК, после чего немедленно следует непрерывная инфузия L–цитруллина с 9 мг/кг/ч в течение 48 часов. Дозы могут вводиться центральным внутривенным катетером, который может быть введен после индукции анестезии или через контур искусственного кровообращения. Отдельный в/в доступ не требуется для введения данного лекарсвтенного средства. Цитруллин является изотоническим и может поступать через периферический в/в или центральный венозный катетер. Цитруллин (L–цитруллин) представляет собой аминокислоту, и, таким образом, для целей совместимости лекарственный препарат рассматривается как парентеральное питание. Кроме того, он совместим с жидкостями, используемыми для фильтрации или гемоконцентрации во время АИК.

Послеоперационные параметры

Клинический исход пациентов, получавших внутривенное введение цитруллина, может быть оценен по: необходимости и продолжительности послеоперационной искусственной вентиляции легких, частоте увеличения послеоперационной PVT с помощью эхокардиограмм, уровня креатинина в сыворотке крови и уровня ферментов печени, инотропному показателю, длительности пребывания плевральной трубки и объему дренажа с ее помощью, продолжительности пребывания в ОИТ, продолжительности госпитализации и/или коэффициенту выживаемости.

Послеоперационная искусственная вентиляция. Продолжительность послеоперационной инвазивной искусственной вентиляции легких представляет собой время в часах от отделения от искусственного кровообращения до эндотрахеальной экстубации. Уменьшение времени, затрачиваемого на послеоперационную инвазивную искусственную вентиляцию легких, является положительным послеоперационным результатом.

Частота увеличения послеоперационного PVT на эхокардиограммах. Увеличение PVT определяется как давление в правом желудочке (RV) > ½ системного артериального давления. Если послеоперационный PVT остается неизменным по сравнению с контрольной группой, это является положительным послеоперационным результатом.

Креатинин сыворотки и ферменты печени. Уровни электролитов, креатинина и CBC в сыворотке могут регистрироваться ежедневно с момента поступления в детскую палату интенсивной терапии (ДПИТ) до момента выхода из ДПИТ. Кроме того, ферменты печени могут быть получены на исходном уровне, в течение 24–часового и 28–суточного периодов. Если уровни электролитов, креатинина и CBC в сыворотке крови сопоставимы с контрольной группой, это будет положительным послеоперационным результатом.

Инотропный показатель. Доза инотропа должна контролироваться после операции с момента поступления в ДПИТ с использованием следующей системы подсчета:

Дофамин (мкг/кг/мин) х 1

плюс добутамин (мкг/кг/мин) х 1

плюс милринон (мкг/кг/мин) x 10

плюс эпинефрин (адреналин) (мкг/кг/мин) х 100

плюс фенилэфрин (мкг/кг/мин) х 100

плюс норэпинефрин (норадреналин) (мкг/кг/мин) х 100

= общий инотропный показатель

См., например, Hoffman, et al. Circulation (2003) 107: 996–1002. Снижение инотропного показателя будет положительным послеоперационным результатом.

Продолжительность использования плевральной дренажной трубки. Общая послеоперационная длительность в часах и общий объем дренирования в куб. см плевральной трубкой до прекращения применения плевральной дренажной трубки могут быть записаны хирургической бригадой. Уменьшение продолжительности послеоперационного периода и/или общего объема дренирования плевральной трубкой по сравнению с группой сравнения будет положительным послеоперационным результатом.

Продолжительность пребывания в отделении интенсивной терапии (ОИТ). Продолжительность пребывания в ОИТ можно рассчитать двумя способами: (1) как общее количество послеоперационных суток, проведенных в ОИТ или в койке ОИТ, до тех пор, пока группа врачей не освободит пациента для подготовки к переводу в зону, не относящуюся к ОИТ; и (2) как общее количество часов после операции, когда пациент нуждался либо в устройстве искусственной вентиляции легких, либо в непрерывной внутривенной поддержке инотропа или вазодилататора. Уменьшение продолжительности пребывания в ОИТ с помощью любой из этих мер будет положительным послеоперационным результатом.

Продолжительность госпитализации. Продолжительность госпитализации может быть рассчитана как общее количество суток после операции до выписки из больницы. Уменьшение продолжительности госпитализации было бы положительным послеоперационным результатом.

Выживаемость. Можно записать как 28–суточную послеоперационную выживаемость, так и выживаемость до выписки из больницы домой. Увеличение выживаемости через 28 суток после операции будет положительным послеоперационным результатом.

Улучшение гемодинамики. Гемодинамические данные, включая частоту сердечных сокращений, системное артериальное давление, O₂Sat, CVP (центральное венозное давление) и PAP (положительное давление в дыхательных путях), можно отслеживать как показатель тяжести или частоты повреждения легких, индуцированного искусственным кровообращением, вследствие разъединения eNOS из–за снижения уровня цитруллина в плазме.

Кроме того, улучшение гемодинамики и послеоперационный тонус легочных сосудов (PVT) могут быть использованы в качестве индикаторов улучшения состояния пациента, например снижения тяжести или частоты возникновения повреждения легких, индуцированного искусственным кровообращением, вследствие разъединения eNOS из–за падения в плазме крови уровни цитруллина. Конечные продукты перодиксации липидов и карбонильные группы белков могут быть использованы в качестве показателей окислительного повреждения. Кроме того, пероксид водорода в жидкостях организма, включая мочу, также может быть использован для обнаружения окислительного повреждения. См., например, Halliwell & Whiteman British Journal of Pharmacology (2004) 142: 231–255.

Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что внутривенная доставка цитруллина смягчает последствия повреждения легких, индуцированного искусственным кровообращением, что подтверждается снижением послеоперационной потребности в искусственной вентиляции легких и инотропной терапии у детей, перенесших восстановление врожденных пороков сердца.

Например, продолжительность искусственной вентиляции легких была уменьшена, продолжительность использования инотропов для поддержки сердечного выброса была сокращена, продолжительность лечения сопутствующими вазоактивными препаратами была короче, а общая потребность в респираторной поддержке была ниже у пациентов, получавших цитруллин, по сравнению с пациентом, получающим плацебо. Пациенты, которые получали цитруллин в соответствии с описанными в данном документе способами, имели меньшую суммарную длительность вентиляции с положительным давлением и инотропную терапию, чем пациенты, получавшие плацебо. Пациенты, получавшие цитруллин в соответствии с описанными в данном документе способами, были готовы к выписке из отделения интенсивной терапии (ОИТ) раньше, чем пациенты, получавшие плацебо. Кроме того, общая продолжительность пребывания в стационаре была меньше у пациентов, получавших цитруллин, по сравнению с пациентами, получавшими плацебо.

Хотя изобретение было описано более подробно с помощью иллюстрации и примера для ясности понимания, следует понимать, что определенные изменения и модификации могут быть осуществлены в рамках объема прилагаемой формулы изобретения. Предполагается, что модификации вышеописанных способов осуществления изобретения, которые будут понятны с учетом вышеприведенного раскрытия или станут очевидными при обычной практике или реализации изобретения специалистам в области хирургии, биохимии, медицины, физиологии и/или связанных с ними областей, находятся в пределах объема следующей формулы изобретения.

Все публикации (например, непатентная литература), патенты, публикации патентных заявок и заявки на патент, упомянутые в данном описании, характеризуют уровень квалификации специалистов в области, к которой относится данное изобретение. Все публикации (например, непатентная литература), патенты, публикации патентных заявок и заявки на патент, упомянутые в данной заявке, включены в данный документ посредством ссылки в той же мере, как если бы каждая отдельная публикация, патент, публикации патентной заявки или заявка на патент были конкретно и отдельно указаны для включения посредством ссылки.

Приведенные в данном документе примеры предлагаются в качестве иллюстраций, а не для ограничения.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1

Уровни аргинина, цитруллина и нитрата в плазме и риск развития PPHN

У новорожденных, у которых развился PPHN, были более низкие уровни аргинина, цитруллина и нитрата в плазме по сравнению с младенцами без PPHN. У десяти новорожденных содержание метаболитов NO (NOx) в плазме измерялось с использованием модифицированной реакции Грисса; 5 были PPHN+ и 5 были PPHN–. У пациентов с PPHN+ средний уровень NOx был значительно ниже (р=0,006) (фиг. 4). У новорожденных с PPHN были значительно более низкие уровни аргинина и цитруллина в плазме при аминокислотном анализе (фиг. 4). Не было никаких значимых различий в уровнях любых других отдельных аминокислот между двумя группами. Количество субъектов было слишком мало, чтобы оценить взаимосвязь между NOx, уровнями аминокислот и генотипом. Эти данные показывают, что у младенцев с PPHN уменьшилось количество промежуточных продуктов и продуктов цикла мочевины.

ПРИМЕР 2

Функция цикла мочевины у младенцев и детей

Использование искусственного кровообращения для коррекции врожденных пороков сердца

Изучена распространенность повышения послеоперационного тонуса легочных сосудов и состояния функции мочевинного цикла у детей грудного и раннего возраста, перенесших операцию на сердце. За 20–месячный период были проспективно исследованы 169 младенцев и детей, которым потребовалась одна из 6 специальных хирургических процедур для коррекции их врожденных пороков сердца. См. таблицу 1. После согласия родителей у всех пациентов брали кровь на исследование генотипа перед операцией и собирали кровь для аминокислотного анализа в 5 разных временных точках (до операции, сразу после операции, через 12 часов, 24 часа и 48 часов после операции). Все пациенты, за исключением пациентов, перенесших норвудскую стадию I, были подвергнуты мониторингу на повышение послеоперационного тонуса легочных сосудов (PVT+), определяемого как среднее давление ЛА > 20 мм рт. ст. Младенцы, проходящие стадию I Норвуд, были определены как PVT+, если у них была клиническая потребность во вдыхаемом NO, используемом для насыщения артерий <60% при адекватном системном давлении.

В таблице 2 показан средний возраст для каждой из шести процедур и продолжительность воздействия искусственного кровообращения. Из 169 пациентов у 56 (33,1%) появились клинические признаки повышения послеоперационного тонуса легочных сосудов (PVT+). Многим из этих пациентов потребовалось клиническое вмешательство, включая седативный эффект, паралич и гипервентиляцию. Тридцать три пациента лечились вдыхаемым NO (NO+).

Таблица 2. Тип хирургического вмешательства в изучаемой популяции

Процедура	№	Возраст (месяцы)	АИК (мин)	PVT+	NO+
Двунаправленная процедура Гленна	42	6,4 ± 2,5	84 ± 36	18 (42,9%)	10 (23,8%)
Норвуд Стадия I	33	0,8 ± 0,8	112 ± 32	14 (42,4%)	9 (27,3%)
Закрытие VSD	36	8,5 ± 11,9	91 ± 21	15 (41,7%)	1 (2,8%)
Устранение AVSD	24	5,2 ± 2,5	111 ± 27	12 (50%)	3 (12,5%)
Артериальное переключение	18	0,6 ± 1,3	157 ± 38	6 (33,3%)	2 (11,1%)
Модифицированная операция Фонтена	16	24,8 ± 18,8	94 ± 25	4 (25%)	3 (18,8%)
Общее количество пациентов	169	6,8 ± 10,6	104 ± 37	56 (33,1%)	33 (19,5%)

Младенцы и дети, перенесшие операцию на сердце, показали повышенный послеоперационный тонус легочных сосудов и состояние функции цикла мочевины.

Влияние искусственного кровообращения на функционирование цикла мочевины

Чтобы проверить, будет ли искусственное кровообращение снижать функцию цикла мочевины и доступность NO, были проанализированы промежуточные интероперационные циклы мочевины и метаболиты оксида азота в плазме. Образцы плазмы отбирали у каждого из 169 пациентов в 5 периоперационных временных точках и анализировали с помощью катионообменной хроматографии с использованием аминокислотного анализатора Beckmann 7300 (Beckmann, г. Пало–Алто, штат Калифорния). Аргинин и цитруллин использовали в качестве основных маркеров потока мочевинного цикла. Уровни метаболитов оксида азота в плазме использовали в качестве косвенной меры доступности NO с использованием колориметрического анализа с модифицированными реагентами Грисса и измеряли при поглощении 540 нм. Все пациенты нуждались в искусственном кровообращении для исправления их сердечных дефектов. Внутри исследуемой популяции искусственное кровообращение вызывало значительное снижение средних уровней аргинина во все послеоперационные моменты времени по сравнению с дооперационными уровнями (фиг. 5). Аналогичное снижение было отмечено в средних уровнях цитруллина (фиг. 6А–В). Уровни метаболитов NO в плазме также были снижены сразу после операции, но показали частичный отскок через 12 и 24 часа до возвращения к предоперационному уровню через 48 часов (фиг. 7). Напротив, не было никакого влияния искусственного кровообращения на общее количество аминокислот, не участвующих в цикле мочевины. Поскольку аминокислоты, не участвующие в цикле мочевины, не были затронуты, эти данные свидетельствуют о том, что влияние на функцию цикла мочевины и синтез субстрата NO может длиться до около 48 часов после операции.

У пациентов, у которых впоследствии развился повышенный послеоперационный PVT (PVT+), было отмечено снижение уровня аргинина в плазме по сравнению с пациентами без повышенного PVT (PVT–). Фиг. 8. Аналогичные наблюдения не были отмечены для цитруллина и метаболитов NO.

Используя линейную регрессию, длительность сердечно–легочного шунтирования не показала какого–либо влияния на уровень цитруллина и аргинина в плазме и уровень метаболита NO в любой послеоперационный момент времени.

Краткое изложение клинических результатов

Это исследование показывает, что искусственное кровообращение, используемое для коррекции врожденных пороков сердца, вызывает значительное снижение функционирования цикла мочевины с большим уменьшением доступности предшественников для синтеза оксида азота. Искусственное кровообращение, используемое для хирургической коррекции врожденных пороков сердца, вызвало довольно значительное снижение доступности предшественников оксида азота в цикле мочевины и уровней оксида азота, измеренных косвенно по метаболитам NO в плазме. Поскольку аминокислоты, не участвующие в цикле мочевины, не были затронуты, влияние на функцию цикла мочевины и синтез субстрата NO может длиться до 48 часов после операции. У пациентов с повышенным послеоперационным тонусом легочных сосудов было более значительное снижение уровня аргинина, чем у пациентов с нормальным тонусом.

Отдельное исследование показало, что риск повышения послеоперационного легочного тонуса сосудов зависит от генотипа CPSI T1405N. Уровни аргинина значительно различались между генотипами CPSI T1405N через 48 часов после операции.

ПРИМЕР 3

Внутривенное введение цитруллина

увеличивает уровень аргинина в плазме

Цель заключалась в оценке безопасности внутривенного введения цитруллина и его влияния на уровень аргинина в сыворотке у поросят. Всего было использовано 9 свиней Дюрок в возрасте 5–21 суток с целевой минимальной массой 4 кг. Все поросята прошли индукцию анестетика и трахеостомию. Центральные катетеры были расположены в бедренной артерии и бедренной вене, и гемодинамика контролировалась непрерывно. Цитруллин (600 мг/кг в/в) вводили 5 поросятам. Физиологический раствор давали контрольным животным. Аминокислоты сыворотки отбирали до и каждый час после введения цитруллина.

Уровни сывороточного аргинина достигли максимума через 1–2 часа после внутривенного введения цитруллина и оставались стабильными выше базового уровня через три часа, достигая значимости во всех временных точках по сравнению с контролем (р < 0,001). Гемодинамическая нестабильность не наблюдалась. См. таблицу 3–4.

Таблица 3. Уровни аргинина (мкмоль/л) после внутривенного введения цитруллина

Группа лечения (n=5)	Исходный уровень	Спустя 1 час	Спустя 2 часа	Спустя 3 часа
L–цитруллин (600 мг/кг)	131,5	535,0	559,8	498,4
Контроль (физраствор)	89,6	103,0	118,1	136,7
р–значение	0,1582	<0,001	<0,001	<0,001

Таблица 4. Среднее артериальное кровяное давление (мм рт. ст.) после внутривенного введения цитруллина

Группа лечения (n=4)	Предварительная доза	Спустя 1 час	Спустя 2 часа	Спустя 3 часа
L–цитруллин (600 мг/кг)	67,0	67,4	64,8	62,2
Контроль (физраствор)	53,2	58,7	55,7	54,7

p > 0,05 во всех временных точках

Следовательно, внутривенное введение цитруллина приводит к устойчивому повышению уровней цитруллина и аргинина в плазме. Это было бы полезно для предотвращения развития осложнений, индуцированных искусственным кровообращением.

ПРИМЕР 4

Периоперационное пероральное введение цитруллина у детей,

которым проводят врожденную кардиохирургию

Целью данного исследования было оценить абсорбцию и продемонстрировать безопасность перорального цитруллина в качестве потенциальной альтернативы в/в введению цитруллина. Были рандомизированы 40 пациентов с одним из 5 вышеописанных хирургических диагнозов для получения 5 доз перорального цитруллина (1,9 г/кг) в сравнении с плацебо. Первую дозу вводили непосредственно перед операцией, а вторую дозу сразу по прибытии в педиатрическое ОИТ после операции, с последующими 3 дозами каждые 12 часов. Уровни цитруллина в плазме были значительно выше в группе цитруллина (36 против 26 мкмоль/л, р=0,013), демонстрируя адекватную абсорбцию.

Таблица 5. Уровни в сыворотке через 12 часов после операции с и без PHTN

Уровень цитруллина в сыворотке 12 часов после операции	Без PHTN	+ PHTN
<37 мкмоль/л	18 пациентов	9 пациентов
>37 мкмоль/л	12 пациентов	0 пациентов
Значение p=0,036 (Точный критерий Фишера)

Исследование не имело достаточных возможностей для выявления влияния на частоту возникновения послеоперационной легочной гипертензии (PHTN), однако у пациентов с уровнем цитруллина в плазме > 37 мкмоль/л не развивалась легочная гипертензия. Это было бы полезно для предотвращения развития осложнений, индуцированных искусственным кровообращением.

ПРИМЕР 5

ВВЕДЕНИЕ ЦИТРУЛЛИНА ВО ВРЕМЯ ОПЕРАЦИИ

Первоначальной целью было проверить безопасность и фармакокинетику трех доз внутривенного введения цитруллина у детей, перенесших хирургическое восстановление специфических врожденных пороков сердца. Внутривенное введение цитруллина имело теоретический риск системной артериальной гипотензии. Неблагоприятное падение среднего артериального давления было определено как снижение более чем на двадцать процентов от исходного уровня. Исходное среднее послеоперационное артериальное давление рассчитывали как среднее значение средних измерений артериального давления, собираемых каждые 5 минут в течение 30 минут, непосредственно предшествующих введению послеоперационной дозы или инфузии. Прикроватный монитор затем был установлен на тревогу, если в любое время в течение 48–часового периода исследования было достигнуто падение в 20%.

Исходные выбранные дозы составляли 200, 400 и 600 мг/кг на основании данных предыдущих исследований на животных. Первоначальный дизайн исследования представлял собой исследование с 4 группами с использованием 3 доз и плацебо–контроля. В исследование были включены пять пациентов, и Совет по безопасности и мониторингу данных (монитор DSMB оперативно отметил, что уровни в плазме, достигнутые с помощью этих доз, были очень высокими, хотя никаких побочных эффектов отмечено не было). Впоследствии дизайн исследования был изменен на открытое исследование по увеличению дозы, начиная с 50 мг/кг, с увеличением дозы с интервалами 50 мг/кг. Каждый пациент получил 2 дозы, 1 дозу – в операционной после начала искусственного кровообращения и одну – 4 часа спустя в отделении интенсивной терапии. Данные приведены на фиг. 9A–C.

Пациенты 6 и 8 получали 50 мг/кг цитруллина внутривенно и имели пиковый уровень цитруллина, равный приблизительно 220 мкмоль/л и 4–часовой остаточный уровень, равный 40 мкмоль/л. Неблагоприятных побочных эффектов отмечено не было. Этот остаточный уровень был ниже целевого диапазона 80–100 мкмоль/л, и доза была впоследствии увеличена. Пациенты 9 и 10 получали 100 мг/кг цитруллина внутривенно и имели пиковый уровень цитруллина, равный 375 мкмоль/л, и 4–часовой остаточный уровень, равный 50 мкмоль/л. Побочных эффектов снова отмечено не было. Этот остаточный уровень также был ниже целевого диапазона 80–100 мкмоль/л, и доза была впоследствии увеличена. Пациенты 13–16 получали 150 мг/кг цитруллина внутривенно и имели пиковый уровень цитруллина, равный 660 мкмоль/л и 4–часовой остаточный уровень, равный 80 мкмоль/л. Этот остаточный уровень на 4–й час был ниже целевого диапазона 80–100 мкмоль/л, и доза была впоследствии увеличена. Фармакокинетический профиль этих 3 доз цитруллина представлен на фиг. 10.

Период полувыведения рассчитывался как приблизительно 85 минут, что было слишком мало для прерывистого введения. После фармакокинетического моделирования дизайн исследования был изменен на болюсную дозу 150 мг/кг, введенную в операционной (ОП) при искусственном кровообращении, с последующей непрерывной инфузией 9 мг/кг/час через 4 часа в течение 48 часов. Еще 9 пациентов были включены в исследование. Средние уровни в плазме как цитруллина, так и аргинина у исследуемых пациентов (+IV цитруллин) по сравнению с пациентами в наблюдаемой когорте (–IV цитруллин) изображены на фиг. 11A–B.

Было одно серьезное нежелательное явление, но оно не было связано с применением внутривенного цитруллина. У пациента развился брадикардический приступ примерно через 8 часов после восстановления AVSD, которому не предшествовала системная гипотензия. Пациенту потребовалась неотложная поддержка ЭКМО (экстракорпоральная мембранная оксигенация) в течение 48 часов, а затем он полностью выздоровел и был выписан домой на 22–й сутки госпитализации DSMB рассмотрел случай и определил, что значимое нежелательное явление вряд ли связано с введением цитруллина.

На основании этих данных было определено, что внутривенный цитруллин безопасен и что комбинация болюса 150 мг/кг, вводимого при искусственном кровообращении в начале операции, с последующей непрерывной инфузией 9 мг/кг/час через 4 часа может поддерживать послеоперационный тонус легочных сосудов и адекватный запас цитруллина в плазме.

ПРИМЕР 6

Периоперационная фармакокинетика внутривенного L–цитруллина

у детей, перенесших кардиохирургию из–за врожденных дефектов

Чтобы определить клиренс для одной болюсной дозы в/в введения цитруллина и оптимальную частоту введения дозы, необходимо разработать схему увеличения дозы с использованием трех концентраций внутривенного введения цитруллина: были использованы 50, 100 и 150 мг/кг. Дозу цитруллина вводили в операционной сразу же после канюлирования и начала искусственного кровообращения. Общая цель состояла в том, чтобы достичь устойчивого уровня цитруллина 100 мкмоль/л или более в течение четырех часов после начальной дозы. Четырехчасовой момент времени был выбран, чтобы позволить завершить хирургическую процедуру и пациенту после операции вернуться в отделение интенсивной терапии (ОИТ) до последующего введения доз. Сводные данные цитруллина показаны на фиг. 12.

На основании этих данных было определено, что оптимальной дозой было 150 мг/кг, поскольку в результате четырехчасовой уровень оказался близок к 100 мкмоль/л. Не было отмечено никаких побочных эффектов, включая гипотензию от введения какой–либо из концентраций цитруллина в/в.

Однако из приведенных выше данных также было определено, что ½ период выведения болюсных доз в/в цитруллина составлял приблизительно 60–90 минут и потребовал бы по меньшей мере 4–часового дозирования, что нецелесообразно даже в условиях интенсивной терапии. Фармакокинетическое моделирование показало, что устойчивый уровень цитруллина приблизительно 100 мкмоль/л может быть достигнут при болюсной дозе 150 мг/кг в/в цитруллина, введенного в начале операции после начала искусственного кровообращения, а затем через 4 часа непрерывной инфузией 9 мг/кг/ч. ФК моделирование данного режима показано на фиг. 13.

Затем были приняты пациенты с использованием этого пересмотренного протокола комбинации болюсной дозы 150 мг/кг в ОП на АИК и непрерывной инфузии 9 мг/кг/ч, начатой после операции в ДОИТ через 4 часа после начальной болюсной дозы. Данные по цитруллину доступны для 9 пациентов и представлены на фиг. 14A–B. Они свидетельствуют о поддержании адекватного запаса цитруллина в плазме.

ПРИМЕР 7

ИССЛЕДОВАНИЕ ВНУТРИВЕННОГО ЦИТРУЛЛИНА

Проведенное внутривенное исследование цитруллина было рандомизированным, плацебо–контролируемым, двойным слепым исследованием, основным клиническим результатом которого была продолжительность искусственной вентиляции легких в послеоперационном периоде и вторичная частота послеоперационной легочной гипертензии между 2–мя группами лечения (цитруллин против плацебо).

В общей сложности 77 пациентов были зарегистрированы в детской больнице им. Вандербильта. Пациенты были обследованы на основе хирургического графика. На основании этого графика были обследованы пациенты, перенесшие одну из 5 запланированных кардиохирургических операций, включенных в это исследование(пациенты, проходящие процедуру Норвуд, в настоящее время исключены по рекомендации DSMB).

Исследование было остановлено для подготовки к более крупному многоцентровому рандомизированному плацебо–контролируемому исследованию. Анализ данных этих 77 пациентов показал, что большинство из них, которые получали цитруллин, не достигали целевого терапевтического уровня цитруллина в плазме, равного 100 мкмоль/л, главным образом из–за удаления цитруллина гемофильтрацией, происходящей во время искусственного кровообращения. Эти методы гемофильтрации изменились во время исследования, и исследователи не знали об этих изменениях.

ПРИМЕР 8

Протокол по применению цитруллина для кардиохирургии

Первоначальная фармакокинетическая модель предполагала замкнутую систему. При отсутствии значительного метаболизма и выделения мочи во время операции, модель предполагала, что терапевтические уровни, достигнутые исходным цитруллиновым болюсом, будут поддерживаться на протяжении всей операции. Однако в неизвестный момент в начале исследования практика перфузии изменилась, включив агрессивную ультрафильтрацию и кристаллоидный обмен на протяжении всей операции. Это означало, что ультрафильтрация эффективно удаляла цитруллин из кровообращения, так что после анализа уровней цитруллина практически ни один пациент не достиг терапевтических уровней лекарственного средства.

Исследование в этом примере было предпринято для проверки пересмотренного протокола дозирования, предназначенного для достижения и поддержания терапевтических уровней цитруллина в условиях ультрафильтрации и замены кристаллоидов. Хотя эта фармакокинетическая конечная точка была, очевидно, достигнута, основное внимание в этом представлении данных уделяется параметрам эффективности, которые были оценены как вторичные конечные точки. В исследование были включены 22 пациента, рандомизированных в равных количествах по 11 пациентов в плацебо и цитруллин.

Результаты

В начале исследования было признано, что один из двух участвующих центров в установленном порядке экстубировал всех пациентов в операционной сразу же после прекращения искусственного кровообращения. Это исключало использование продолжительности искусственной вентиляции в качестве конечной точки. Вместо этого был применен последующий анализ с использованием продолжительности всех форм вентиляционной поддержки в качестве возможной конечной точки. На фиг. 15 показана контрольная группа плацебо с примерно бимодальным распределением времен применения искусственной вентиляции, при этом некоторые дети остаются на респираторной поддержке в течение длительных периодов времени. Напротив, у детей, получавших цитруллин, за исключением одного выброса, наблюдалось одномодальное распределение с уменьшенной продолжительностью респираторной поддержки. Различия между группами, получавшими плацебо и цитруллин, не достигли значимости, но показали сильную тенденцию при применении критерия Саттертвейта. Напротив, анализ таблицы сопряженности, показанной на фиг. 16, достиг пограничной значимости. В целом, результаты считаются сильной тенденцией.

Таблица 6. Анализ таблицы сопряженности влияния цитруллина на продолжительность респираторной поддержки

Продолжительность респираторной поддержки	Плацебо	Цитруллин
≤ 50 часов	3	7
> 50 часов	8	2

Сердечно–сосудистые параметры обеспечивают дополнительное понимание. На фиг. 17 показано, что у пациентов с цитруллином неожиданно отмечались значительно лучшие инотропные показатели, особенно через 15–18 часов после поступления в ОИТ. Систолическое артериальное давление показало умеренное кратковременное повышение в группе цитруллина, начинающееся примерно через 20 часов после прекращения искусственного кровообращения, в то время как диастолическое давление было по существу одинаковым в обеих группах. Фиг. 18A. Среднее артериальное давление показало небольшое кратковременное увеличение в группе цитруллина, как показано на фиг. 18B, отражающее изменение систолического давления. Учитывая временный характер повышения систолического артериального давления и повышения артериального давления, повышение систолического давления предполагает возможную меньшую потребность в инотропах, чем можно было бы ожидать.

Продолжительность общей респираторной поддержки, по–видимому, является целесообразной конечной точкой для исследования цитруллина для предотвращения острой легочной гипертензии, осложняющей врожденное хирургическое вмешательство на сердце. Побочных эффектов на гемодинамические показатели не наблюдалось.

ПРИМЕР 9

ПРЕПАРАТ ЦИТРУЛЛИНА

Сначала стерильный цитруллин может быть получен в виде нестерильного порошка–субстанции с использованием процесса бактериальной (Streptococcus faecalis) ферментации аргинина с последующими этапами разделения и экстракции. Нестерильный сыпучий порошок затем восстанавливают и подвергают этапам восстановления эндотоксина и стерильной фильтрации с последующей кристаллизацией, сушкой и микронизацией в асептической среде. Стерильный порошок–субстанция затем используется в качестве «сырья» для асептического розлива в стеклянные флаконы для получения готового лекарственного продукта, который перед использованием восстанавливают стерильным разбавителем.

Каждый стерильный флакон цитруллина для инъекций может содержать около 300 мг стерильного порошка цитруллина. Каждый флакон можно развести 6 мл стерильной воды для инъекций Фарм. США, и дополнительно разбавить примерно 5,9 мл хлорида натрия 0,9% Фарм. США до объема 12 мл и концентрации 300 мг/ 12 мл=25 мг/ 1 мл. Примерные инфузии пациента могут быть в хлориде натрия 0,9% Фарм. США для введения в концентрации около 25 мг/мл.

ПРИМЕР 10

ФАРМАКОКИНЕТИКА (ФК) И БЕЗОПАСНОСТЬ В/В ВВЕДЕНИЯ L–ЦИТРУЛЛИНА ДЛЯ ДЕТЕЙ И МЛАДЕНЦЕВ, ПОДВЕРГАЮЩИХСЯ ИСКУССТВЕННОМУ КРОВООБРАЩЕНИЮ (АИК) ДЛЯ

ХИРУРГИЧЕСКОГО ВОССТАНОВЛЕНИЯ ВРОЖДЕННЫХ ПОРОКОВ СЕРДЦА

Было проведено многоцентровое, слепое, рандомизированное, плацебо–контролируемое исследование фазы IB для определения фармакокинетики (ФК) и безопасности в/в введения L–цитруллина детям и младенцам, перенесшим искусственное кровообращение (АИК), для хирургического восстановления врожденных пороков сердца.

Основная цель исследования состояла в том, чтобы определить, достиг ли пересмотренный протокол внутривенной (в/в) доставки L–цитруллина, введенный во время операции, уровня цитруллина в плазме > 100 мкмоль/л в группе, получавшей цитруллин, и сравнить это с уровнями цитруллина в группе плацебо во время наблюдения у детей, подвергающихся хирургическому восстановлению дефекта межпредсердной перегородки (ASD) и/или дефекта межжелудочковой перегородки (VSD) или частичного или полного дефекта атриовентрикулярной перегородки (AVSD).

Цели безопасности заключались в дальнейшем анализе профиля безопасности цитруллина, а вторичными задачами было установить влияние цитруллина на послеоперационные клинические исходы.

Двадцать два (22) пациента были включены в курс лечения. Пациенты получали исследуемое лекарственное средство или инфузию плацебо в соответствии с фиксированным протоколом дозирования, начиная с начала АИК до 48 часов после операции или до удаления внутривенного катетера. Участие в исследовании заканчивалось при выписке или на 28–е сутки в зависимости от того, что наступило раньше. Режим дозирования был разработан для поддержания уровня цитруллина в плазме при длительной гемофильтрации.

Двадцать два (22) пациента были включены в курс лечения. Пациенты получали внутривенное введение цитруллина в виде болюса 150 мг/кг или плацебо в начале АИК, с последующим добавлением L–цитруллина в концентрации 200 мкмоль/л или плацебо к заместительной жидкости для фильтрации или гемоконцентрации, используемой во время АИК. Цитруллиновый болюс 20 мг/кг вводили через 30 минут после деканюляции из АИК, после чего немедленно следовала непрерывная инфузия цитруллина или плацебо в дозе 9 мг/кг/ч в течение 48 часов. Участие в исследовании заканчивалось при выписке или на 28–е сутки в зависимости от того, что наступило раньше.

Уровни концентрации цитруллина в плазме были первичной переменной ФК; они были оценены в образцах крови, собранных в 7 периоперационных временных точках. Вторичными переменными ФК были концентрации метаболитов аргинина и оксида азота (NO) в одном и том же наборе образцов. Значения ФК сравнивались между группами.

Субъекты получали в/в введение цитруллина в виде болюса 150 мг/кг или плацебо в начале АИК с последующим добавлением L–цитруллина в концентрации 200 мкмоль/л или плацебо к заместительной жидкости для фильтрации или гемоконцентрации, используемой во время АИК. Цитруллиновый болюс 20 мг/кг вводили через 30 минут после деканюляции из АИК, после чего немедленно следовала непрерывная инфузия цитруллина или плацебо в дозе 9 мг/кг/ч в течение 48 часов.

Первичные оценки безопасности включали гемодинамический мониторинг для выявления клинически значимой гипотензии с использованием возрастных пределов. Была собрана информация о побочных эффектах, и было зарегистрировано послеоперационное кровотечение.

Дальнейшая безопасность, лабораторные и клинические оценки были выполнены от исходного уровня до выписки, вторичные клинические переменные включали: послеоперационную искусственную вентиляцию легких, продолжительность общей респираторной поддержки, улучшение гемодинамики, послеоперационный PVT с помощью эхокардиограммы, сывороточные креатинин и ферменты печени, инотропный показатель, продолжительность использования плевральной дренажной трубки, продолжительность пребывания в отделении интенсивной терапии, продолжительность госпитализации и выживания.

Анализ результатов исследования в настоящее время находится на заключительной стадии, но не весь контроль качества еще завершен, а это означает, что приведенные ниже данные могут подвергнуться незначительным изменениям.

Несмотря на то, что анализы, подробно описанные ниже, показали, что в качестве замены продолжительности пребывания в отделении интенсивной терапии предпочтительнее использовать составную переменную, состоящую из большей продолжительности каждого из этих параметров. Причина этого предпочтения заключается в том, что фактическая продолжительность пребывания в ОИТ может зависеть от несвязанных переменных, таких как, среди прочего, время суток и доступность койки. Пациенты, получавшие исследуемое лекарственное средство, показали меньшую суммарную продолжительность искусственной вентиляции легких и инотропной терапии, чем пациенты, получавшие плацебо. Таким образом, согласно оценке переменной суррогатного маркера, пациенты, получавшие исследуемое лекарственное средство, были готовы к выписке из ОИТ раньше, чем пациенты, получавшие плацебо. Пересмотренный протокол дозирования позволил достичь уровня цитруллина в плазме, постоянно превышающего целевой уровень 100 мкмоль/л, как показано ниже на фиг. 19. Пациенты, получавшие цитруллин, показали уменьшенную продолжительность искусственной вентиляции легких, как показано на фиг. 20.

Некоторые различия были отмечены в клинической практике среди центров исследования в отношении искусственной вентиляции легких. Один центр проявил тенденцию к экстубации пациентов в операционной без регистрации времени экстубации для таких пациентов. Для целей анализа продолжительность послеоперационной искусственной вентиляции легких была установлена равной нулю для таких пациентов. Когда эти пациенты были стратифицированы лечением, было показано, что все 6 пациентов (100%), получающих в/в L–цитруллин, была экстубирована в операционной, по сравнению только с 2 из 6 пациентов (33%) в группе плацебо.

Как и в случае длительности искусственной вентиляции легких, продолжительность инотропной терапии показала заметные различия между двумя группами лечения, как показано на фиг. 21.

На фиг. 21 данные определены как время между временем начала и окончания использования инотропа. Все отсутствующие или 0–е суммарные показатели по инотропу до первого измеренного показателя устанавливаются на 0 и, следовательно, не считаются находящимися на инотропах. Рассматривается общий инотропный показатель, который рассчитывается на основе дофамина, добутамина, милринона, эпинефрина, фенилэфрина и норэпинефрина. Продолжительность приема инотропов у пациентов без применения инотропов установлена на 0 часов (без цензурирования).

Как упоминалось ранее, прекращение искусственной вентиляции легких и инотропной терапии являются двумя основными факторами готовности к выписке из отделения интенсивной терапии. Составная переменная, включающая (для каждого субъекта) более продолжительный из двух параметров – продолжительность искусственной вентиляции легких или инотропной терапии, может служить эффективным и точным заменителем продолжительности пребывания в отделении интенсивной терапии. На фиг. 22 показаны различия в составной переменной при сравнении групп цитруллина и плацебо. Пациенты, получавшие исследуемое лекарственное средство, показали меньшую суммарную продолжительность искусственной вентиляции легких и инотропной терапии, чем пациенты, получавшие плацебо. Таким образом, согласно оценке переменной заменяющего маркера, получавшие исследуемое лекарственное средство пациенты, были готовы к выписке из ДОИТ раньше, чем пациенты, получавшие плацебо. Помимо указания более короткого времени ДОИТ, более короткое время искусственной вентиляции снижает дополнительный риск получения травмы.

В дополнение к достижению целевых уровней цитруллина в плазме, это исследование также дало статистически значимые и практически значимые результаты, демонстрирующие зависящие от лечения цитруллином различия в продолжительности искусственной вентиляции легких и инотропной терапии между леченой и контрольной группами в небольшой группе из 22 субъектов.

Продолжительность послеоперационной инвазивной искусственной вентиляции легких представляла собой время в часах от отделения от системы искусственного кровообращения до эндотрахеальной экстубации. Если пациенту потребовалась реинтубация в течение 24 часов после экстубации, в основной анализ было добавлено время реинтубации. Во втором анализе время реинтубации не было включено.

С учетом времени реинтубации средняя продолжительность инвазивной искусственной вентиляции легких была явно больше в группе плацебо, чем в группе, получавшей цитруллин, при этом пациентам, получавшим цитруллин, требовалось в среднем всего 5 часов инвазивной вентиляции, тогда как пациентам, получавшим плацебо, требовалось 37 часов (таблица 8). Разница не достигла статистической значимости в тесте ANOVA, скорее всего из–за большой вариации длительности в группе плацебо. Однако, когда время реинтубации было исключено, различие между группами все еще было значительным, и была достигнута статистическая значимость в ANOVA (p=0,0317). Статистическая значимость для обоих анализов была показана с помощью критерия суммы рангов Уилкоксона.

Прекращение принудительной искусственной вентиляции легких и инотропной терапии являются двумя основными факторами готовности к выписке из отделения интенсивной терапии. Вместе, как составная переменная, состоящая из большей продолжительности дыхательной поддержки с положительным давлением или инотропной терапии, они могут служить эффективным заменителем продолжительности пребывания в отделении интенсивной терапии. Эта последняя переменная подвержена влиянию искажающих факторов, которые могут непреднамеренно продлить ее, таких как отсутствие свободных койко–мест.

Таким образом, данные этого исследования показывают, что введенный режим дозирования достиг фармакокинетической конечной точки. Кроме того, несмотря на размер выборки исследования, это исследование продемонстрировало четкие зависимые от лечения различия в пользу цитруллина в отношении длительности искусственной вентиляции легких и инотропной терапии между леченой и контрольной группами. Объединенные в составную переменную результаты показывают клинически значимую терапевтическую эффективность цитруллина в течение времени, необходимого для выписки из отделения интенсивной терапии. Таким образом, результаты этого исследования указывают на то, что внутривенное введение цитруллина может играть полезную роль в предотвращении клинических последствий легочного повреждения, индуцированного искусственным кровообращением.

ПРИМЕР 10A

ФАРМАКОКИНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ

Уровни концентрации цитруллина во время и после процедуры АИК были интересующим параметром ФК в этом исследовании. Целевым уровнем у пациентов, получавших внутривенное введение цитруллина, был уровень цитруллина в плазме > 100 мкмоль/л в течение периода немедленного наблюдения после АИК. Сбор плазмы крови проводили в 7 периоперационных временных точках: на исходном уровне до операции, во время АИК (после болюса 1) и после операции/АИК в моменты времени 0 часов (до болюса 2), 6 часов, 12 часов, 24 часа и 48 часов.

Средние и медианные концентрации цитруллина в соответствующие моменты времени суммированы по группам лечения в таблице 7. Во всех периодах отбора проб с имеющимися данными средняя концентрация цитруллина в группе лечения цитруллином превышала установленный нижний предел в 100 мкмоль/л, тогда как средние концентрации цитруллина в группе плацебо были ниже этого порога во всех проанализированных временных точках. Следует отметить высокое среднее базовое значение в группе цитруллина (200,9 мкмоль/л). Один пациент (02–004) в этой группе имел исходный уровень цитруллина, равный 1919 мкмоль/л, т. е. до в/в лечения цитруллином. Нет доступной информации о том, почему исходный уровень цитруллина был таким высоким для этого пациента. Имеющиеся данные указывают на то, что исходный образец был взят до первого лечения цитруллином. Исходные значения цитруллина у всех остальных пациентов этой группы были заметно ниже, в пределах от 8 до 42 мкмоль/л.

Таблица 7. Концентрации цитруллина [мкмоль/л] с течением времени

Временная точка образца	Плацебо (N=11)	Цитруллин (N=11)
	n	Среднее ± СО	Медиана	n	Среднее ± СО	Медиана
Исходный уровень	11	34,1 ± 7,50	34,0	11	200,9 ± 569,89	32,0
После болюса 1	11	29,5 ± 5,96	28,0	11	2405,9 ± 1517,4	2577,0
До болюса 2	11	30,6 ± 10,46	28,0	11	890,9 ± 1077,5	573,0
6 ч	11	24,1 ± 7,76	24,0	10	167,8 ± 117,67	138,0
12 ч	9	19,9 ± 7,01	18,0	10	127,1 ± 16,18	125,0
24 ч	9	12,9 ± 2,89	12,0	10	125,3 ± 38,74	114,0
48 ч	4	12,3 ± 3,40	11,5	0a	–	–

^aДля пациентов, получавших цитруллин, нет данных отбора проб на 48 часов. Один пациент (01–007) имел пробу, собранную в 46 часов, но не был включен в 48–часовой анализ, поскольку проба считалась внеплановой оценкой. Другой пациент (02–010) получал непрерывную инфузию в течение 47,5 часов, но нет данных для 48 часовой временной точки.

СО=стандартное отклонение, N=количество пациентов, n=количество пациентов с доступными данными.

Поэтому медианные значения цитруллина являются более подходящими для отображения изменений концентрации цитруллина с течением времени. Медианные значения цитруллина во время процедуры АИК и на исходном уровне по сравнению с послеоперационным периодом показаны графически на фиг. 19. Заметное увеличение средних уровней цитруллина в группе, получавшей цитруллин, по сравнению с группой, получавшей плацебо, можно наблюдать во все последующие моменты времени после АИК.

Только 5 из всех 59 образцов, взятых в группе лечения цитруллином (исключая исходные образцы), показали уровни цитруллина в плазме ≤100 мкмоль/л (таблица 8). Для сравнения, все образцы, взятые у пациентов, получавших плацебо, имели уровни цитруллина ≤ 100 мкмоль/л. Это различие в концентрациях цитруллина было высоко статистически значимым (р=0,0006).

Таблица 8. Образцы с концентрациями цитруллина ≥ 100 мкмоль/л

	Количество образцов с	Плацебо (N=11)	Цитруллин (N=11)
Группа 01	Цитруллин ≤ 100 мкмоль/л	27	2
Цитруллин >100 мкмоль/л	0	25
Группа 02	Цитруллин ≤ 100 мкмоль/л	32	3
Цитруллин >100 мкмоль/л	0	29
Значение p CMH		0,0006

Примечание: Все образцы, за исключением образца на исходном уровне, были использованы для анализа. Критерий Кохрана–Мантеля–Хензеля, основанный на том, имел ли пациент какие–либо уровни цитруллина выше 100 мкмоль/л.

Цитруллин является предшественником аргинина и оксида азота. Сводка значений аргинина и оксида азота в каждый момент времени отбора проб представлена в таблице 9.

Таблица 9. Концентрации аргинина и оксида азота с течением времени

Временная точка образца	Плацебо (N=11)	Цитруллин (N=11)
	n	Среднее ± СО	Медиана	n	Среднее ± СО	Медиана
Аргинин [мкмоль/л]
Исходный уровень	11	58,7 ± 12,37	55,0	11	49,6 ± 15,72	50,0
После болюса 1	11	47,7 ± 7,43	46,0	11	72,6 ± 30,02	60,0
До болюса 2	11	67,1 ± 11,66	66,0	11	145,1 ± 47,94	141,0
6 ч	11	47,3 ± 12,29	47,0	10	67,0 ± 22,66	66,5
12 ч	9	39,0 ± 12,04	35,0	10	61,5 ± 17,37	57,5
24 ч	9	28,1 ± 12,56	30,0	10	65,8 ± 18,80	64,0
48 ч	4	34,5 ± 15,33	29,5	0	–	–
Оксид азота [мкмоль/л]
Исходный уровень	11	69,5 ± 41,34	56,7	11	31,6 ± 13,51	36,6
После болюса 1	11	51,3 ± 38,83	44,1	11	25,3 ± 12,76	25,0
До болюса 2	11	48,8 ± 29,16	38,4	11	30,7 ± 12,64	31,0
6 ч	11	59,9 ± 45,59	37,5	10	32,0 ± 16,97	26,0
12 ч	9	62,0 ± 42,89	51,5	10	26,6 ± 13,43	23,6
24 ч	9	51,1 ± 42,58	46,8	10	29,1 ± 12,14	32,2
48 ч	4	42,5 ± 17,48	48,9	0	–	–

СО=стандартное отклонение, N=количество пациентов, n=количество пациентов с доступными данными.

Медианные значения также показаны графически на фиг. 24А и фиг. 24В. В отличие от цитруллина, аргинин в плазме у пациентов, получавших цитруллин, был лишь незначительно повышен сразу после первого введения цитруллина. Это отставание в повышении уровня аргинина, вероятно, отражает время, необходимое для того, чтобы цитруллин стал доступен для синтеза аргинина. Следовательно, заметный рост аргинина у пациентов, получавших цитруллин, по сравнению с пациентами, получавшими плацебо, показан в момент времени, предшествующий болюсной инъекции 2. После операции уровни аргинина в группе цитруллина оставались повышенными примерно до 60 мкмоль/л, в то время как в группе плацебо они снижались до примерно 30 мкмоль/л.

Уровни оксида азота в плазме оставались более или менее неизменными во время отбора проб в каждой из групп лечения. Этот результат не может быть удивительным, поскольку выработка оксида азота является локальным явлением. Ожидается, что добавление цитруллина улучшит местное, строго регулируемое продуцирование NO; тем не менее, увеличение, вероятно, не будет проявляться в молярной зависимости в кровотоке.

ПРИМЕР 10B

ПОСТОПЕРАТИВНАЯ ИНВАЗИВНАЯ ИСКУССТВЕННАЯ ВЕНТИЛЯЦИЯ

Продолжительность послеоперационной инвазивной искусственной вентиляции легких представляла собой время в часах от отделения от системы искусственного кровообращения до эндотрахеальной экстубации. Если пациенту потребовалась реинтубация в течение 24 часов после экстубации, в основной анализ было добавлено время реинтубации. Во втором анализе время реинтубации не было включено.

Только одному пациенту в группе плацебо потребовалась реинтубация. Пациент (02–011) был впервые экстубирован на 4–е сутки после окончания АИК, но был реинтубирован на следующий сутки и оставался интубированным еще 6 суток.

С учетом времени реинтубации средняя продолжительность инвазивной искусственной вентиляции легких была явно больше в группе плацебо, чем в группе, получавшей цитруллин, при этом пациентам, получавшим цитруллин, требовалось в среднем всего 5 часов инвазивной вентиляции, тогда как пациентам, получавшим плацебо, требовалось 37 часов (таблица 10). Разница не достигла статистической значимости в тесте ANOVA, скорее всего из–за большой вариации длительности в группе плацебо. Однако, когда время реинтубации было исключено, различие между группами все еще было значительным, и была достигнута статистическая значимость в ANOVA (p=0,0317). Статистическая значимость для обоих анализов была показана с помощью критерия суммы рангов Уилкоксона.

Таблица 10. Продолжительность инвазивной искусственной вентиляции [часы]

	Плацебо (N=11)	Цитруллин (N=11)	Различие (ДИ) значение p t–критерий
Критерий суммы рангов Уилкоксона значение p
Время реинтубации включено		32,0	(–9,5, 73,4) 0,1233
Среднее ± СО	37,1 ± 65,41	5,1 ± 8,15
Медиана	21,7		0,0		0,0222
Диапазон	0,0–229,3	0,0–22,5
Время реинтубации не включено		19,5	(1,9, 37,2) 0,0317
Среднее ± СО	24,7 ± 26,83	5,1 ± 8,15
Медиана	21,7		0,0		0,0222
Диапазон	0,0–92,3	0,0–22,5

Анализ выживаемости Каплана–Мейера подтвердил сокращение продолжительности инвазивной искусственной вентиляции легких в группе цитруллина по сравнению с группой плацебо. На фиг. 25A–B показана продолжительность искусственной вентиляции легких для двух групп лечения с учетом времени реинтубации. Группа 02 имела тенденцию экстубировать пациентов в операционной (ОП) и обычно не регистрировала время экстубации для этих пациентов. Интересно, что из 8 пациентов, перенесших экстубацию в ОП в группе 02, 6 получали лечение цитруллином и только 2 получали плацебо. В первом анализе продолжительность послеоперационной искусственной вентиляции легких для этих пациентов была установлена на ноль, и все пациенты с нулевым временем вентиляции были подвергнуты цензурированию (фиг. 25А). Во втором анализе пациенты с нулевым временем вентиляции не подвергались цензурированию (фиг. 25B). Оба анализа показали статистически значимые различия между группами лечения на основе критерия логарифмического ранга (р=0,0498 и р=0,0089, соответственно).

Кривые Каплана–Мейера для продолжительности инвазивной искусственной вентиляции легких, исключая время реинтубации у одного пациента, показаны на фиг. 26A–B. Результаты подтвердили преимущество цитруллина над плацебо и показали статистическую значимость в пользу цитруллина в обоих анализах.

ПРИМЕР 10C

ОБЩАЯ РЕСПИРАТОРНАЯ ПОДДЕРЖКА

Анализ общей респираторной поддержки включает любую инвазивную и неинвазивную респираторную поддержку, необходимую в течение периода исследования. Средняя общая продолжительность респираторной поддержки в группе, получавшей цитруллин, составляла менее половины продолжительности в группе, получавшей плацебо; разница была статистически значимой (таблица 11).

Таблица 11. Общая продолжительность респираторной поддержки [часы]

	Плацебо (N=11)	Цитруллин (N=11)	Различие (ДИ) значение p t–критерий
			Критерий суммы рангов Уилкоксона значение p
n	11	11	50,7 (5,4, 96,0)
Среднее ± СО	81,9 ± 66,23	31,2 ± 28,27	0,0301
Медиана	73,1	23,6
Диапазон	4,0–229,3	0,0–100,1	0,0418

n=пациенты с доступными данными.

Графики выживаемости Каплана–Мейера, подтверждающие преимущество цитруллина по сравнению с плацебо–терапией, показаны для всех пациентов (без цензурирования) и для пациентов без респираторной поддержки, подвергнутых цензурированию на фиг. 27A–B.

ПРИМЕР 10D

ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТЬ ВРЕМЕНИ НА ИНОТРОПАХ И ИНОТРОПНЫЙ ПОКАЗАТЕЛЬ

Продолжительность в/в приема инотропов была задокументирована с момента первого применения после операции до завершения исследования лекарственного средства через 48 часов, то есть продолжительность использования инотропа составляла максимально 48 часов в текущем анализе. Пациенты, все еще получавшие инотропы через 48 часов после операции, подвергались цензурированию. Средняя продолжительность внутривенного (в/в) применения инотропа была явно ниже в группе цитруллина, чем в группе плацебо (таблица 12). Тем не менее, статистическая значимость разницы между лечениями не была достигнута.

Таблица 12. Внутривенная продолжительность на инотропе [часы]

	Плацебо (N=11)	Цитруллин (N=11)	Различие (ДИ) значение p t–критерий
			Критерий суммы рангов Уилкоксона значение p
Продолжительность времени на в/в инотропах	12,7 (–2,6, 28,1)
Среднее ± СО	26,1 ± 19,38	13,4 ± 14,78	0,0987
Медиана	23,0	16,0
Диапазон	0,0–48,0	0,0–47,0	0,0727

Графики анализа выживаемости в течение длительного времени на внутривенных (в/в) инотропах представлены на фиг. 28A–B. Первичный анализ Каплана–Мейера подверг цензурированию пациентов, все еще использующих инотропы на 48–й час, но не применял дополнительного цензурирования (фиг. 27А). Второй анализ также подвергал цензурированию пациентов без применения инотропа, то есть время инотропа=0 (фиг. 27В). Оба анализа показали заметные различия в продолжительности применения инотропа между группами цитруллина и плацебо. Преимущество лечения цитруллином по сравнению с лечением плацебо было статистически значимым в основном анализе без какого–либо дополнительного цензурирования (p=0,0351, логарифмический критерий).

Третий анализ Каплана–Мейера был проведен без пациентов с нулевой продолжительностью в/в использования инотропа. Результаты были идентичны таковым для всей популяции с цензурированием времени=0. Общий инотропный показатель, суммирующий использование всех внутривенных (в/в) инотропов после операции, был заметно ниже в группе цитруллина по сравнению с группой плацебо (таблица 13). Разница по инотропному показателю была очевидна в течение всего проанализированного времени после операции (фиг. 29). Преимущество цитруллина при использовании инотропа, основано на общем инотропном показателе, было статистически значимым при повторных измерениях ANOVA (р=0,0438).

Таблица 13. Инотропный показатель

	Плацебо (N=11)	Цитруллин (N=11)	Различие (ДИ) значение p t–критерий
Критерий суммы рангов Уилкоксона значение p
Общий инотропный показатель	559,8 (–193,5, 1313,2) 0,1368
Среднее ± СО	1162,6 ± 951,31	602,7 ± 727,86
Медиана	1000,0	650,0	0,1271
Диапазон	0,0–2617,1	0,0–2351,0

ПРИМЕР 10E

ВАЗОАКТИВНЫЕ ПРЕПАРАТЫ

Общее количество часов приема вазоактивных препаратов, включая нитроглицерин, нитропруссид и вазопрессин, рассчитывали с момента окончания операции до прекращения приема вазоактивных препаратов или до окончания исследования (час 48), в зависимости от того, что наступило раньше. Таблица 14 сравнивает продолжительность приема вазоактивных препаратов для групп лечения цитруллином и плацебо. Общая продолжительность сопутствующего вазоактивного лечения была короче у пациентов, получавших цитруллин, чем у плацебо, но различие не было статистически значимым. Аналогичные результаты показаны для общего вазоактивного показателя. Тем не менее, пациент, получавший цитруллин, действительно показал более короткую общую продолжительность вазоактивного лечения, как показано на фиг. 30.

Таблица 14. Применение вазоактивных препаратов

	Плацебо (N=11)	Цитруллин (N=11)	Различие (ДИ) значение p t–критерий
Критерий суммы рангов Уилкоксона значение p
Продолжительность приема вазоактивных препаратов [часы]	3,5 (–7,0, 14,1) 0,4898
Среднее ± СО	9,8 ± 15,09	6,3 ± 7,18
Медиана	0,0	1,0	0,9720
Диапазон	0,0–48,0	0,0–17,0
Общий вазоактивный показатель	5,2 (–7,7, 18,0) 0,4125
Среднее ± СО	10,6 ± 17,42	5,5 ± 10,62
Медиана	0,0	1,1	0,8884
Диапазон	0,0–56,0	0,0–35,5

ПРИМЕР 10F

Продолжительность пребывания в ОИТ

Длительность пребывания в ОИТ анализировали один раз как общее количество послеоперационных часов, проведенных в ОИТ, и один раз как общее количество послеоперационных часов, в течение которых пациенту требовалась послеоперационная искусственная вентиляция или непрерывная внутривенная поддержка инотропом или вазодилататором. Последняя комбинация параметров представляет собой другую заместительную конечную точку для пребывания в отделении интенсивной терапии.

Используя любое определение, продолжительность пребывания в ОИТ была явно больше у пациентов, получавших плацебо, чем у пациентов, получавших цитруллин (таблица 15). Исключая время реинтубации для одного пациента в группе плацебо, продолжительность пребывания в ОИТ у пациентов, получавших цитруллин, по–прежнему составляла лишь половину от продолжительности лечения пациентов, получавших плацебо. Статистическая значимость разницы между обработками была показана в тесте Уилкоксона.

Таблица 15. Продолжительность пребывания в ОИТ

	Плацебо (N=11)	Цитруллин (N=11)	Различие (ДИ) значение p t–критерий
Критерий суммы рангов Уилкоксона значение p
Продолжительность пребывания в ДОИТ [часы]	69,14 (–49,39, 187,67) 0,2379
Среднее ± СО	105,08 ± 187,762	35,94 ± 16,150
Медиана	48,77	28,52	0,1891
Диапазон	20,1–666,2	20,8–72,0
Наибольшая продолжительность искусственной вентиляции, в/в использование инотропа или вазодилататора – реинтубация включена [часы]	29,9 (–11,0, 70,9) 0,1430
Среднее ± СО	44,4 ± 63,62	14,5 ± 13,99
Медиана	23,0	15,0	0,0479
Диапазон	0,0–229,3	0,0–47,0
Наибольшая продолжительность искусственной вентиляции, в/в использование инотропа или вазодилататора – реинтубация исключена [часы]	17,5 (–1,2, 36,2) 0,0653
Среднее ± СО	32,0 ± 26,26	14,5 ± 13,99
Медиана	23,0	15,0	0,0479
Диапазон	0,0–92,3	0,0–47,0

Графики Каплана–Мейера общей продолжительности пребывания в ДОИТ, а также продолжительность пребывания в ОИТ в соответствии с определением самой большой продолжительности показаны на фиг. 31 и фиг. 32A–B. В частности, анализ выживаемости определения наибольшего срока пребывания в ОИТ подтвердил преимущество цитруллина над плацебо, статистическая значимость показана в обоих анализах.

ПРИМЕР 10G

КОМПЛЕКСНАЯ КОНЕЧНАЯ ТОЧКА

Прекращение принудительной искусственной вентиляции легких и инотропной терапии являются двумя основными факторами, определяющими готовность к выписке из отделения интенсивной терапии. Они были объединены в комплексную переменную, чтобы служить дополнительной эффективной суррогатной конечной точкой на время пребывания в ОИТ.

Комплексная конечная точка включала в себя более длительную продолжительность дыхательной поддержки с положительным давлением или инотропной терапии. Поскольку применение инотропа было задокументировано только до 48–го часа после операции (завершение исследования лечения препаратом), пациенты с применением инотропа, продолжающимся до 48–го часа и продолжительностью искусственной вентиляции ≤48 ч, были подвергнуты цензурированию в этот момент времени. Если искусственная вентиляция продолжалась после момента времени 48 часов, то в анализе использовалась продолжительность искусственной вентиляции.

В таблице 16 представлены результаты для комплексной конечной точки, включая и исключая время реинтубации для одного пациента в группе плацебо, требующей реинтубации для дополнительной искусственной вентиляции легких. Кроме того, для комбинации инвазивной искусственной вентиляции и потребности в инотропе было очевидное преимущество цитруллина по сравнению с плацебо. Различия между лечением были статистически значимыми по критерию суммы рангов Уилкоксона.

Таблица 16. Композитный анализ продолжительности инвазивной искусственной вентиляции легких или использования инотропа [часы]

	Плацебо (N=11)	Цитруллин (N=11)	Различие (ДИ) значение p t–критерий
Критерий суммы рангов Уилкоксона значение p
Время реинтубации включено	30,2 (–10,8, 71,1) 0,1403
Среднее ± СО	44,4 ± 63,62	14,3 ± 14,06
Медиана	23,0	15,0	0,0479
Диапазон	0,0–229,3	0,0–47,0
Время реинтубации не включено	17,7 (–1,0, 36,4) 0,0625
Среднее ± СО	32,0 ± 26,26	14,3 ± 14,06
Медиана	23,0	15,0	0,0479
Диапазон	0,0–92,3	0,0–47,0

Графики Каплана–Мейера комплексной конечной точки представлены с временами реинтубации, включенными и исключенными на фиг. 33. В обоих анализах все пациенты с использованием инотропа оставались в исследовании в течение 48 часов и подвергались искусственной вентиляции менее 48 часов. В обоих анализах пациентам, получавшим цитруллин, требовалось статистически значительно меньший объем искусственной вентиляции легких или инотропов, чем пациентам, получавшим плацебо.

ПРИМЕР 10H

ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТЬ ГОСПИТАЛИЗАЦИИ

Продолжительность госпитализации была рассчитана как общее количество суток после операции до выписки из больницы. Средняя продолжительность госпитализации была ниже в группе цитруллина, чем в группе, получавшей плацебо, однако разница не была статистически значимой (Таблица 17).

Таблица 17. Продолжительность госпитализации

	Плацебо (N=11)	Цитруллин (N=11)	Различие (ДИ) значение p t–критерий
Критерий суммы рангов Уилкоксона значение p
Продолжительность госпитализации [сутки]	3,7 (–2,2, 9,7)
Среднее ± СО	8,4 ± 9,38	4,6 ± 1,21	0,2062
Медиана	5,0	5,0
Диапазон	4,0–36,0	3,0–7,0	0,2637

ФАРМАКОКИНЕТИКА И КЛИНИЧЕСКИЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

ДЛЯ ПРИМЕРОВ 10А–10Н

Результаты анализа ФК и клинического исхода в примерах 10A–10H показали либо статистически значимые результаты, либо как сильные тенденции, подтверждающие, что протоколы, описанные в данном документе, могут использоваться для поддержания уровней цитруллина в плазме и, следовательно, снижения частоты и повреждения легких, индуцированного искусственным кровообращением. В способах, описанных в данном документе, достигаются целевые уровни цитруллина в плазме > 100 мкмоль/л у пациентов, получающих цитруллин. Длительность искусственной вентиляции легких была снижена у пациентов, получавших цитруллин, по сравнению с пациентами, получавшими плацебо. Длительность применения инотропов для поддержки сердечного выброса была снижена у пациентов, получавших цитруллин, по сравнению с пациентами, получавшими плацебо. Общая продолжительность лечения сопутствующими вазоактивными препаратами была меньше у пациентов, получавших цитруллин, чем у получавших плацебо. Общая потребность в респираторной поддержке была ниже у группы, получавшей цитруллин, по сравнению с группой, получавшей плацебо. Пациенты, получавшие исследуемое лекарственное средство, имели меньшую суммарную продолжительность вентиляции с положительным давлением и инотропную терапию, чем пациенты, получавшие плацебо. Таким образом, согласно оценке переменной заместительного маркера, пациенты, получавшие цитруллин, были готовы к выписке из ОИТ раньше, чем пациенты, получавшие плацебо. Это также было показано в анализе продолжительности пребывания в ОИТ и в анализе самой длительной продолжительности искусственной вентиляции легких, т. е. использование инотропа или вазодилататора. Аналогично, общая продолжительность госпитализации была меньше у пациентов, получавших цитруллин, по сравнению с пациентами, получавшими плацебо.

Способы, описанные в данном документе, включающие в/в доставку L–цитруллина, вводимого периоперационно, достигают уровня цитруллина в плазме > 100 мкмоль/л во время наблюдения у детей, подвергающихся хирургическому восстановлению дефекта межпредсердной перегородки (ASD) и/или дефекта межжелудочковой перегородки (VSD) или частичного или полного дефекта атриовентрикулярной перегородки (AVSD). Кроме того, лечение цитруллином приводит к неожиданному снижению PVT и, как следствие, необходимости длительной послеоперационной инвазивной искусственной вентиляции легких, ассоциированной с хирургическим восстановлением врожденных поражений сердца.

Результаты показывают, что введенные дозы (болюс и инфузия) в/в цитруллина обеспечило достижение устойчивых, высоких уровней цитруллина в плазме выше целевого уровня. Во всех временных точках отбора проб с проанализированными данными средняя концентрация цитруллина в группе лечения цитруллином превышала установленный нижний предел в 100 мкмоль/л, тогда как средние концентрации цитруллина в группе плацебо были ниже этого порога во всех проанализированных временных точках. Разница в количестве образцов с концентрациями цитруллина выше целевого уровня была сильно статистически значимой (р=0,0006) в пользу лечения цитруллином.

Пациенты, получавшие цитруллин в соответствии с описанными в данном документе способами, также показали меньшую суммарную продолжительность искусственной вентиляции легких и инотропной терапии, чем пациенты, получавшие плацебо. Таким образом, согласно оценке переменной суррогатного маркера, пациенты, получавшие исследуемое лекарственное средство, были готовы к выписке из ОИТ раньше, чем пациенты, получавшие плацебо.

Уровни оксида азота (NO) заметно не изменились во время лечения цитруллином или плацебо. Этот вывод можно объяснить очень локальным продуцированием оксида азота. Ожидается, что лечение цитруллином улучшит местную строго регулируемую выработку NO, но изменения в NO могут не регистрироваться в кровотоке.

Данные по безопасности, собранные в ходе исследования, показали, что введение L–цитруллина было безопасным, и при этом лечении не возникало неожиданных НЯ (нежелательных явлений) и/или СНЯ (серьезных нежелательных явлений). Все пациенты (100%) в группе цитруллина и 73% пациентов в группе плацебо испытывали по меньшей мере одно возникающее при лечении НЯ. У пациентов, получавших цитруллин, наиболее частыми НЯ были плевральный выпот (36%), тахипноэ (27%), гипертония (27%) и гипотония (27%). Наиболее частыми НЯ в группе плацебо были плевральный выпот (45%), гипертония (36%), узловой ритм (27%) и рвота (27%). Не сообщалось ни об НЯ, ведущим к смерти, ни о СНЯ, ни о НЯ, ведущим к прекращению.

Не было различий в послеоперационном кровотечении между 2–мя группами лечения, о чем свидетельствуют длительность и объем дренажа, выполняемого плевральной трубкой. Исследуемое лечение не оказывало заметного влияния на большинство лабораторных параметров, исследованных по соображениям безопасности. До 24 часов после начала лечения уровни AST, а также общая концентрация билирубина по меньшей мере удвоились в обеих группах лечения, в то время как средние ALKP находились на одном уровне. BUN оставались стабильным в группе плацебо, в то время как в группе цитруллина оно увеличивалось от исходного уровня до 2–х суток (р=0,0111).

Частота сердечных сокращений была постоянно выше в группе плацебо, чем в группе цитруллина. Не было заметного влияния лечения на насыщение кислородом или системное артериальное давление. В целом, результаты этого исследования показывают, что внутривенное введение цитруллина в соответствии со способами, описанными в данном документе, может играть полезную роль в предотвращении клинических последствий АИК–индуцированного повреждения легких, предотвращая разъединение фермента eNOS во время операции.

Хотя вышеупомянутое изобретение было описано в связи с этим предпочтительным вариантом осуществления, оно не должно быть ограничено этим, но должно быть ограничено исключительно объемом формулы изобретения, которая следует ниже.

1. Способ поддержания соединения эндотелиальной синтазы оксида азота (eNOS) для снижения частоты или степени тяжести повреждения легких, индуцированного искусственным кровообращением, вследствие образования свободных радикалов у пациента во время искусственного кровообращения, включающий введение пациенту эффективного количества цитруллина до, во время и после хирургической операции,

где цитруллин, вводимый в начале хирургической операции, составляет около 100–500 мг/кг цитруллина,

где цитруллин, вводимый во время хирургической операции, добавляют к заместительной жидкости для гемоконцентрации во время хирургической операции,

где эффективное количество цитруллина представляет собой количество, достаточное для уменьшения разъединения эндотелиальной синтазы оксида азота (eNOS).

2. Способ по п. 1, в котором эффективное количество цитруллина дополнительно представляет собой количество, достаточное для уменьшения образования свободных радикалов.

3. Способ по п. 1, в котором эффективное количество цитруллина дополнительно представляет собой количество, достаточное для снижения частоты или тяжести повреждения легких, индуцированного искусственным кровообращением.

4. Способ по п. 1, в котором, при введении цитруллина до хирургической операции, цитруллин вводят за около 12 часов до хирургической операции.

5. Способ по п. 1, в котором хирургическая операция направлена на исправление порока сердца.

6. Способ по п. 1, в котором цитруллин добавляют во время хирургической операции в количестве около 100–500 мкмоль/л.

7. Способ по п. 1, в котором, при введении цитруллина после хирургической операции, цитруллин вводят пациенту в течение около 12–48 часов после хирургической операции в количестве 3–12 мг/кг/ч.

8. Способ по п. 1, в котором цитруллин вводят перорально, внутривенно, путем ингаляции или их комбинации.

9. Способ по п. 1, в котором уровень цитруллина в плазме пациента повышают выше около 100 мкмоль/л.

10. Способ по п. 1, в котором уровень цитруллина в плазме пациента повышают выше около 100 мкмоль/л после операции.

11. Способ по п. 1, в котором пациент представляет собой новорожденного, находится в предподростковом возрасте, может быть подростком или взрослым.

12. Способ по п. 1, в котором пациент представляет собой недоношенного новорожденного.

13. Способ по п. 1, в котором продолжительность пребывания пациента в отделении интенсивной терапии (ОИТ) уменьшается.

14. Способ по п. 1, в котором продолжительность пребывания пациента в отделении интенсивной терапии (ОИТ) уменьшается до менее чем 27 суток.