Новые способы лечения рассеянного склероза

Группа изобретений относится к области медицины, а именно к неврологии, и предназначена для лечения таких демиелинизирующих заболеваний, как рассеянный склероз, боковой амиотрофический склероз и болезнь Альцгеймера. Для лечения указанных демиелинизирующих заболеваний вводят эффективное количество 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамида или его фармацевтически приемлемой соли субъекту, нуждающемуся в таком лечении. В одном воплощении, эффективное количество 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамида или его фармацевтически приемлемой соли составляет от 250 мг до 350 мг в день. В другом воплощении, эффективное количество 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамида или его фармацевтически приемлемой соли вводят в комбинации с другим терапевтическим средством. Использование группы изобретений позволяет усилить центральные восстановительные механизмы ремиелинизации путем модулирования нейровоспаления, обеспечивая тем самым эффективное лечение таких демиелинизирующих заболеваний, как рассеянный склероз, боковой амиотрофический склероз и болезнь Альцгеймера. 4 н. и 14 з.п. ф-лы, 11 ил., 3 пр.

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к способам лечения рассеянного склероза, бокового амиотрофического склероза (БАС) или болезни Альцгеймера (БА) у субъекта, нуждающегося в таком лечении, путем введения эффективного количества 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамида или его фармацевтически приемлемой соли.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Рассеянный склероз (РС) представляет собой хроническое иммуноопосредованное мультифокальное демиелинизирующее заболевание центральной нервной системы (ЦНС) с прогрессирующей нейродегенерацией. Боковой амиотрофический склероз (БАС) является нейродегенеративным заболеванием двигательных нейронов. Болезнь Альцгеймера (БА) является наиболее распространенной формой деменции и вызвана накоплением бета–амилоида, приводящим к нейропатологии, связанной с бета–амилоидом, и утрате когнитивных функций. Считается, что патология РС главным образом вызвана адаптивной иммунной системой и/или аутоиммунными механизмами, которые повреждают нейроны и олигодендроциты в ЦНС, приводя к дегенерации белого и серого вещества мозга. Роль врожденного иммунитета ЦНС в возникновении и прогрессировании заболевания широко еще не исследована. У пациентов с РС наблюдается активированная микроглия и астроциты одновременно с нейродегенерацией, и считается, что это нейровоспалительное состояние играет важную роль в повреждении серого вещества мозга (см. обзор в (Calabrese et al., 2015; Nylander and Hafler, 2012) (Calabrese et al., 2015 (DOI: 10.1038/nrn3900); Nylander and Hafler, 2012)). Хотя повреждения белого вещества являются классическими признаками РС, демиелинизирующие явления, наблюдаемые в сером веществе мозга, возможно имеют более значительный вклад в стойкую неврологическую дисфункцию, чем предполагалось ранее. У пациентов, страдающих БАС, также наблюдается микроглиальная активация и патологическая демиелинизация. (Oliveira Santos et al., 2017; Zhou et al., 2017) and AD (Nasrabady et al., 2018; Ropele et al., 2012).

Несмотря на то, что доступные в настоящее время методы лечения рассеянного склероза, которые в основном позволяют купировать периферическое воспаление и помогают пациентам с возвратно–ремиттирующим РС вновь обрести нормальную неврологическую функцию, значительное число пациентов с РС будет по–прежнему страдать от необратимого развития стойкой клинической нетрудоспособности. Считается, что эти прогрессирующие фазы РС являются следствием изменения центральной функции микроглии, астроцитов и олигодендроктидов. В этой нейровоспалительной среде олигодендроциты и клетки–предшественники олигодендроцитов, по–видимому, не способны нормально выполнять свою функцию, которая, главным образом, заключается в ремиелинизации, и поэтому происходят дальнейшие демиелинизирующие явления в сером и белом веществе мозга с последующим развитием аксональной патологии. Потребность пациентов с РС в лечении, которое позволило бы остановить демиелинизацию и усилить ремиелинизацию и предотвратить развитие необратимой аксональной патологии, по–прежнему в значительной степени не удовлетворена.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к новым способам лечения рассеянного склероза, бокового амиотрофического склероза, болезни Альцгеймера, которые включают введение эффективного количества соединения формулы (I):

или его фармацевтически приемлемой соли субъекту, нуждающемуся в таком лечении. В другом аспекте настоящего изобретения фармацевтически приемлемой солью является соль HCl.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На ФИГ. 1А–1D представлены графики, иллюстрирующие контраст магнитно–резонансной томографии (МРТ) в коре головного мозга (А), полосатом теле (В) и мозолистом теле (С) и отношение переноса намагниченности в мозолистом теле (D) для разных групп лечения.

На ФИГ. 2 представлены изображения примеров иммуногистологического окрашивания при определении основного миелинового белка (ОМБ) и зрелых олигодендроцитов, положительных по GST–π, в коре головного мозга для разных групп лечения.

На ФИГ. 3A–3B представлены результаты количественных иммуногистохимических анализов на MBP (окрашенная область) и GST–π (число положительных клеток) в коре (А) и полосатом теле (B) головного мозга, нормализованные по контролю с носителем.

На ФИГ. 4 представлены изображения примеров иммуногистологического окрашивания при определении миелин–олигодендроцитарного гликопротеина (МОГ) и зрелых олигодендроцитов, положительных по GST–π, в мозолистом теле (СС) для разных групп лечения.

На ФИГ. 5 представлен результат количественного иммуногистохимического анализа на МОГ (оптическая плотность) и GST–π (число положительных клеток), а также оптическая плотность с Luxol прочным синим (LFB) в мозолистом теле, нормализованный по контролю с носителем.

На ФИГ. 6 приведены изображения примеров иммуногистологических окрашиваний, обнаруживающих маркеры микроглии Iba1 и глио–фибриллярный кислый белок (GFAP) астроцитов в коре головного мозга для разных групп лечения.

На ФИГ. 7A–7C представлены результаты количественных иммуногистохимических анализов числа Iba1–положительной микроглии и окрашенной площади GFAP–положительных астроцитов в коре головного мозга (A), полосатом теле (В) и мозолистом теле (C), нормализованные по контролю с носителем.

На ФИГ. 8A–8C представлена оценка прогрессирования клинического заболевания после иммунизации пептидом миелин–олигодендроцитарного гликопротеина с выявлением сходных клинических показателей (A), появления/случаев заболевания (B) и изменения веса (C).

На ФИГ. 9A–9C показан контраст магнитно–резонансной томографии (МРТ) в коре головного мозга (Фигура 9A), полосатом теле (Фигура 9B) и мозолистом теле (Фигура 9C) для разных групп лечения.

На ФИГ. 10A–10B представлено дозозависимое уменьшение микроглии (число Iba1–положительной микроглии) в коре головного мозга мышей дикого типа через 5 дней после обработки BLZ945 (перорально, раз в день) (Фигура 10A) и дозозависимая активация микроглии (размер Iba1–положительной микроглии, нормализованный по удаленным микроглиальным процессам) в коре головного мозга мышей дикого типа через 5 дней после обработки BLZ945 (перорально, раз в день) (Фигура 10B).

На ФИГ. 11 представлен анализ фармакокинетики BLZ945 в крови и в мозге.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Рассеянный склероз (РС) – это хроническое воспалительное заболевание, поражающее центральную нервную систему (ЦНС). Боковой амиотрофический склероз (БАС) – это нейродегенеративное заболевание двигательных нейронов, а болезнь Альцгеймера (БА) характеризуется накоплением бета–амилоида, приводящим к нейропатологии и утрате когнитивных функций. Несмотря на то, что в настоящее время существует множество эффективных иммуномодулирующих методов лечения РС, они не могут содействовать восстановлению центральной нервной системы (ЦНС), в частности ремиелинизации. Клетки врожденной иммунной системы в головном мозге – микроглия – играют ключевую роль в регулировании процесса миелиназации, а сигнальный путь колониестимулирующего фактора (CSF–1) – это основной регулятор дифференцировки и выживания микроглии.

Купризоновая модель – это обобщенная мышиная модель, которая используется для проверки эффективности соединения в стимулировании миелинизации и, таким образом, используется для оценки потенциальных способов лечения демиелинизирующих заболеваний, таких как рассеянный склероз и боковой амиотрофический склероз, а также болезнь Альцгеймера.

Неожиданно было обнаружено, что 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамид – ингибитор киназного рецептора колониестимулирующего фактора (CSF–1) – усиливает центральные восстановительные механизмы ремиелинизации в купризоновой мышиной модели, и тем самым может быть эффективным лечением для субъектов с демиелинизирующими заболеваниями, такими как рассеянный склероз и боковой амиотрофический склероз, а также болезнь Альцгеймера.

Целью настоящего изобретения является предложить способ лечения рассеянного склероза, который заключается во введении эффективного количества соединения формулы (I)

или его фармацевтически приемлемой соли субъекту, нуждающемуся в таком лечении. В другом аспекте настоящего изобретения фармацевтически приемлемой солью является соль HCl. В другом аспекте настоящего изобретения соединение формулы (I) вводят в виде свободного основания.

Свободное основание и соли соединения формулы (I) могут быть получены, например, в соответствии с процедурами, приведенными в международной заявке на патент № PCT/US2007/066898, поданной 18 апреля 2007 г. и опубликованной за номером WO2007/121484 25 октября 2007 г. Химическое название соединения формулы (I): 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамид, и оно также известно как BLZ945.

В дополнительном аспекте настоящего изобретения предложено применение соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли при рассеянном склерозе.

В дополнительном аспекте настоящего изобретения предложено соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемая соль для применения при рассеянном склерозе.

В дополнительном аспекте настоящего изобретения предложено применение соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли для производства лекарственного средства для лечения рассеянного склероза.

Другим аспектом настоящего изобретения является предложить способ лечения бокового амиотрофического склероза, который заключается во введении эффективного количества соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли. Предпочтительно фармацевтически приемлемой солью является соль HCl.

В дополнительном аспекте настоящего изобретения предложено применение соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли при боковом амиотрофическом склерозе.

В дополнительном аспекте настоящего изобретения предложено соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли для применения в лечении бокового амиотрофического склероза.

В дополнительном аспекте настоящего изобретения предложено применение соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли для производства лекарственного средства для лечения болезни Альцгеймера.

Другим аспектом настоящего изобретения является предложить способ лечения болезни Альцгеймера, который заключается во введении эффективного количества соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли. Предпочтительно фармацевтически приемлемой солью является соль HCl.

В дополнительном аспекте настоящего изобретения предложено применение соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли при болезни Альцгеймера.

В дополнительном аспекте настоящего изобретения предложено соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли для применения в лечении болезни Альцгеймера.

В дополнительном аспекте настоящего изобретения предложено применение соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли для производства лекарственного средства для лечения болезни Альцгеймера.

Соединение формулы (I) может быть полезным для лечения всех фенотипов рассеянного склероза, включая клинически изолированный синдром, возвратно–ремиттирующий рассеянный склероз, прогрессирующий рассеянный склероз, который включает в себя постепенное развитие стойкой нетрудоспособности с момента начала (первичный прогрессирующий рассеянный склероз (PPMS)) и прогрессирующее развитие стойкой нетрудоспособности после начального рецидивирующего течения (вторичный прогрессирующий рассеянный склероз (SPMS)).

В способах лечения по настоящему изобретению возможно применение соединения формулы (I), а также его фармацевтически приемлемых солей, в виде неочищенного химического вещества, но также возможно применять соединение формулы (I) в виде фармацевтической композиции. Соответственно, изобретение дополнительно относится к фармацевтическим композициям, которые можно вводить в способах лечения настоящего изобретения.

Фармацевтические композиции настоящего изобретения могут быть в виде стандартной дозы, содержащей примерно 1–1000 мг активного(активных) ингредиента(ингредиентов) для субъекта весом примерно 50–70 кг, или примерно 1–500 мг, или примерно 1–250 мг, или примерно 1–150 мг, или примерно 0,5–100 мг, или примерно 1–50 мг активных ингредиентов. Терапевтически эффективная доза соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли, фармацевтической композиции зависит от конкретного субъекта, его веса, возраста и индивидуального состояния, нарушения или заболевания, лечение которого осуществляют, или его степени тяжести. Лечащий врач, клиницист или ветеринар обычной квалификации может легко определить эффективное количество каждого из активных ингредиентов, необходимое для предупреждения, лечения или подавления прогрессирования нарушения или заболевания.

Вышеупомянутые параметры дозировки являются очевидными в тестах in vitro и in vivo с применением преимущественно млекопитающих, например мышей, крыс, собак, нечеловекообразных обезьян или выделенных органов, тканей и их препаратов. Соединения по настоящему изобретению можно применять in vitro в виде растворов, например водных растворов, и in vivo либо энтерально, либо парентерально, преимущественно внутривенно, например, в виде суспензии или водного раствора. Дозировка in vitro, выражаемая в виде молярной концентрации, может быть в пределах от примерно 10^–3 до 10^–9. Терапевтически эффективное количество in vivo в зависимости от пути введения может находиться в диапазоне приблизительно 0,1–500 мг/кг или приблизительно 1–100 мг/кг.

Рассеянный склероз (РС) – это хроническое воспалительное заболевание, поражающее центральную нервную систему (ЦНС). Несмотря на то, что в настоящее время существует множество эффективных иммуномодулирующих методов лечения РС, они не могут содействовать восстановлению центральной нервной системы (ЦНС), в частности ремиелинизации. При РС неправильно функционирующая иммунная система и возникающее хроническое (нейро)воспалительное состояние вызывают демиелинизацию аксонов. Демиелинизация является результатом повреждения олигодендроцитов – миелинобразующих клеток ЦНС. На основании результатов, полученных на мышиной модели индуцированной купризоном демиелинизации, описанной в приведенном ниже разделе «Биологические анализы и данные», введение 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамида или его фармацевтически приемлемой соли может вызывать ремиелинизацию демиелинизированных аксонов у пациентов с рассеянным склерозом. Данные, полученные на купризоновых мышиных моделях, показывают, что измененная морфология микроглии, наблюдаемая у исходных животных при введении 60 мг/кг BLZ945, может привести к усиленному фагоцитозу и клиренсу миелиновых остатков, а также к увеличению количества олигодендроцитов за счет высвобождения факторов, усиливающих дифференцировку клеток–предшественников олигодендроцитов. Кроме того, слегка уменьшенные числа микроглии при дозе BLZ945 60 мг/кг в сочетании с измененным фенотипом микроглии могут защитить нейроны/аксоны от повреждения в воспалительной среде, такой как при рассеянном склерозе. Эта доза, равная 60 мг/кг, у людей соответствует дозе примерно 300 мг.

Для лечения рассеянного склероза 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамид или его фармацевтически приемлемую соль вводят пациенту, нуждающемуся в этом, в дозе, равной от примерно 250 мг до примерно 350 мг в день. В другом варианте осуществления доза составляет от примерно 275 мг до примерно 325 мг в день. В другом варианте осуществления доза составляет примерно 300 мг. В другом варианте осуществления дозу 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамида или его фармацевтически приемлемой соли вводят в течение 4–6 последовательных дней, а затем введение 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамида или его фармацевтически приемлемой соли прекращают. В другом варианте осуществления 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамид или фармацевтически приемлемую соль вводят в течение 4 последовательных дней, а затем введение 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамида или его фармацевтически приемлемой соли прекращают. В другом варианте осуществления лечение начинают при первом диагностировании рассеянного склероза или при диагностировании рецидива заболевания.

Фармацевтические композиции включают соединение формулы (I) или его соль и один или несколько фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей или формообразующих. В другом аспекте в настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция, содержащая соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемую соль и фармацевтически приемлемый носитель. В дополнительном варианте осуществления композиция содержит по меньшей мере два фармацевтически приемлемых носителя, таких как описанные в данном документе. Фармацевтическая композиция может быть составлена для конкретных путей введения, таких как пероральное введение, парентеральное введение (например, путем инъекции, вливания, трансдермального или местного введения), и ректальное введение. Местное введение может также относиться к ингаляционному или интраназальному применению. Фармацевтические композиции настоящего изобретения можно изготовлять в твердой форме (включая без ограничения капсулы, таблетки, пилюли, гранулы, порошки или суппозитории) или в жидкой форме (включающей без ограничения растворы, суспензии или эмульсии). Таблетки могут быть либо покрыты оболочкой, либо покрыты энтеросолюбильным покрытием в соответствии со способами, известными из уровня техники. Как правило, фармацевтические композиции представляют собой таблетки или желатиновые капсулы, содержащие активный ингредиент вместе с одним или несколькими из

a) разбавителей, например, лактозы, декстрозы, сахарозы, маннита, сорбита, целлюлозы и/или глицина;

b) смазочных средств, например, диоксида кремния, талька, стеариновой кислоты, ее магниевой или кальциевой соли и/или полиэтиленгликоля; в случае таблеток также

c) связующих средств, например, алюмосиликата магния, крахмальной пасты, желатина, трагаканта, метилцеллюлозы, карбоксиметилцеллюлозы натрия и/или поливинилпирролидона; при необходимости

d) разрыхлителей, например, видов крахмала, агара, альгиновой кислоты или ее натриевой соли или шипучих смесей; и

e) абсорбентов, красителей, ароматизаторов и подсластителей.

Используемый здесь термин «терапевтически эффективное количество» относится к количеству лекарственного средства или фармацевтического агента, которое вызывает биологический или медицинский ответ у субъекта, например, снижение или подавление активности фермента или белка, или улучшение симптомов, облегчение состояний, замедление или задержку прогрессирования заболевания или предотвращение заболевания и т.д. В одном неограничивающем варианте осуществления термин «терапевтически эффективное количество» относится к количеству лекарственного средства или фармацевтического агента, которое при введении субъекту эффективно для (1) по меньшей мере частичного облегчения, подавления, предотвращения и/или улучшения состояния, или расстройства или заболевания (i), опосредованного рецептором CSF–1, или (ii) связанного с активностью рецептора CSF–1, или ( iii) характеризуется активностью (нормальной или аномальной) рецептора CSF–1; или (2) снижения или подавления активности рецептора CSF–1; или (3) уменьшения или подавления экспрессии рецептора CSF–1. В другом неограничивающем варианте осуществления термин "терапевтически эффективное количество" означает количество лекарственного средства или фармацевтической субстанции, которое при введении в клетку, или в ткань, или в неклеточный биологический материал, или в среду является эффективным в отношении по меньшей мере частичного снижения или подавления активности рецептора CSF–1; или по меньшей мере частичного снижения или подавления экспрессии рецептора CSF–1.

Используемый здесь термин «субъект» относится к приматам (например, людям – мужчинам или женщинам), собакам, кроликам, морским свинкам, свиньям, крысам и мышам. В определенных вариантах осуществления субъектом является примат. В других вариантах осуществления субъектом является человек.

Применяемый в данном документе термин "подавлять", "подавление" или "подавляющий" относится к снижению или ослаблению данного состояния, симптома, или нарушения, или заболевания или значительному снижению исходной активности биологической активности или процесса.

Применяемый в данном документе термин "лечить", "осуществление лечения" или "лечение" любого заболевания или нарушения относится к облегчению или снижению тяжести заболевания или нарушения (т.е. замедлению или остановке развития заболевания или по меньшей мере одного из его клинических симптомов); или облегчению или уменьшению по меньшей мере одного физического параметра или биомаркера, ассоциированного с заболеванием или нарушением, включая такие, которые могут быть неочевидны для пациента.

Используемый в данном документе термин "предупреждать", "предупреждающий" или "предупреждение" любого заболевания или нарушения относится к профилактическому лечению заболевания или нарушения или замедлению начала или прогрессирования заболевания или нарушения.

Термин "фармацевтически приемлемые соли" относится к солям, которые сохраняют биологическую эффективность и свойства соединения формулы (I) и которые, как правило, не являются биологически или иным образом нежелательными. Во многих случаях соединения настоящего изобретения способны образовывать кислотные и/или основные соли вследствие наличия в них амино– и/или карбоксильных групп или подобных им групп.

Фармацевтически приемлемые соли присоединения кислоты могут быть образованы с помощью неорганических кислот и органических кислот.

Неорганические кислоты, из которых могут быть получены соли, включают, например, хлористоводородную кислоту, бромистоводородную кислоту, серную кислоту, азотную кислоту, фосфорную кислоту и т. п.

Органические кислоты, из которых могут быть получены соли, включают, например, уксусную кислоту, пропионовую кислоту, гликолевую кислоту, щавелевую кислоту, малеиновую кислоту, малоновую кислоту, янтарную кислоту, фумаровую кислоту, винную кислоту, лимонную кислоту, бензойную кислоту, миндальную кислоту, метансульфоновую кислоту, этансульфоновую кислоту, толуолсульфоновую кислоту, сульфосалициловую кислоту и т. п.

Фармацевтически приемлемые соли присоединения основания могут быть образованы взаимодействием с неорганическими и органическими основаниями.

Неорганические основания, из которых могут быть получены соли, включают, например, соли аммония и металлов групп I–XII периодической таблицы элементов Менделеева. В определенных вариантах осуществления получены соли натрия, калия, аммония, кальция, магния, железа, серебра, цинка и меди; в частности, подходящие соли включают аммониевые, калиевые, натриевые, кальциевые и магниевые соли.

Органические основания, из которых могут быть получены соли, включают, например, первичные, вторичные и третичные амины, замещенные амины, включая встречающиеся в природе замещенные амины, циклические амины, основные ионообменные смолы и т.п. Определенные органические амины включают изопропиламин, бензатин, холинат, диэтаноламин, диэтиламин, лизин, меглюмин, пиперазин и трометамин.

В другом аспекте настоящего изобретения предложены соединения формулы (I) в форме соли, представляющей собой ацетат, аскорбат, адипат, аспартат, бензоат, безилат, бромид/гидробромид, бикарбонат/карбонат, бисульфат/сульфат, соль камфорсульфоновой кислоты, соль каприновой кислоты, хлорид/гидрохлорид, хлортеофиллонат, цитрат, этандисульфонат, фумарат, глюцептат, глюконат, глюкуронат, глутамат, глутарат, гликолят, гиппурат, гидройодид/йодид, изетионат, лактат, лактобионат, лаурилсульфат, соль яблочной кислоты, соль малеиновой кислоты, малонат, соль миндальной кислоты, мезилат, метилсульфат, соль муциновой кислоты, соль нафтойной кислоты, напсилат, никотинaт, нитрат, октадеканоат, олеат, оксалат, пальмитат, памоат, фосфат/гидрофосфат/дигидрофосфат, полигалактуронат, пропионaт, себацинат, стеарат, сукцинат, сульфосалицилат, сульфат, тартрат, тозилат трифенатат, трифторацетат или ксинафоат.

4–(2–(1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамид или его фармацевтически приемлемую соль можно вводить либо одновременно, либо до или после одного или нескольких других терапевтических средств. 4–(2–(1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамид или его фармацевтически приемлемую соль можно вводить отдельно или тем же или другим путем введения, что и друге средства. Терапевтическое средство представляет собой, например, химическое соединение, пептид, антитело, фрагмент антитела или нуклеиновую кислоту, которые проявляют собственную терапевтическую активность или повышают терапевтическую активность при введении пациенту в комбинации с соединением настоящего изобретения.

В одном варианте осуществления изобретение относится к продукту, содержащему 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамид или его фармацевтически приемлемой соли и по меньшей мере одному другому терапевтическому средству в виде комбинированного препарата для одновременного, раздельного или последовательного применения в лечении рассеянного склероза. Продукты в виде комбинированного препарата включают композицию, содержащую 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамид или его фармацевтически приемлемую соль и другое терапевтическое средство(а) в одной фармацевтической композиции, или 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамид или его фармацевтически приемлемую соль и другое(ие) терапевтическое(ие) средство(а) по отдельности, например, в наборе.

В одном варианте осуществления изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамид или его фармацевтически приемлемую соль и другое(ие) терапевтическое(ие) средство(а). Необязательно фармацевтическая композиция может содержать фармацевтически приемлемый носитель, описанный выше.

В одном варианте осуществления изобретение относится к набору, включающему две или более отдельные фармацевтические композиции, по меньшей мере одна из которых содержит 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамид или его фармацевтически приемлемую соль. В одном варианте осуществления набор содержит средства для раздельного вмещения указанных композиций, такие как контейнер, разделенная бутылка или разделенный пакет из фольги. Примером такого набора является блистерная упаковка, как правило, применяемая для упаковки таблеток, капсул и т. п.

Набор согласно настоящему изобретению можно применять для введения различных лекарственных форм, например, перорально и парентерально, для введения отдельных композиций с различными интервалами между приемами доз или для титрования отдельных композиций относительно друг друга. В целях содействия соблюдению режима приема препарата набор настоящего изобретения, как правило, содержит инструкции по применению.

Используемые в комбинированной терапии данного изобретения 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамид или его фармацевтически приемлемая соль и другой терапевтический агент могут быть изготовлены и/или составлены одним или разными производителями. Кроме того, 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамид или его фармацевтически приемлемая соль и другое терапевтическое средство могут быть объединены при комбинированной терапии: (i) до того, как комбинированный продукт попадает к лечащим врачам (например, в случае набора, содержащего соединение настоящего изобретения и другое терапевтическое средство); (ii) самими лечащими врачами (или под наблюдением лечащего врача) незадолго до введения; (iii) в самих пациентах, например, во время последовательного введения соединения настоящего изобретения и другого терапевтического средства.

Другое терапевтическое средство представляет собой:

(1) Кортикостероид, такой как пероральный преднизон и внутривенный метилпреднизолон

(2) Бета–интерферон, такой как Авонекс®, Бетаферон®, Экставиа®, Плегриди® или Ребиф®

(3) Окрелизумаб (Ocrevus ® ).

(4) Глатирамера ацетат (Копаксон®)

(5) Диметилфумарат (Текфидера®)

(6) Финголимод (Гиленя®).

(7) Терифлуномид (Абаджио®).

(8) Натализумаб (Тисабри®).

(9) Алемтузумаб (Лемтрада®) или

(10) Митоксантрон.

Вариант осуществления 1: Способ лечения рассеянного склероза, включающий введение эффективного количества 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамида или его фармацевтически приемлемой соли субъекту, нуждающемуся в этом.

Вариант осуществления 2: Способ согласно варианту осуществления 1, где рассеянный склероз представляет собой клинически изолированный синдром.

Вариант осуществления 3: Способ согласно варианту осуществления 1, где рассеянный склероз представляет собой возвратно–ремиттирующий рассеянный склероз.

Вариант осуществления 4: Способ согласно варианту осуществления 1, где рассеянный склероз представляет собой прогрессирующий рассеянный склероз.

Вариант осуществления 5: Способ согласно варианту осуществления 1, где рассеянный склероз представляет собой первичный прогрессирующий рассеянный склероз.

Вариант осуществления 6: Способ согласно варианту осуществления 1, где рассеянный склероз представляет собой вторичный прогрессирующий рассеянный склероз.

Вариант осуществления 7: Способ согласно любому из вариантов осуществления 1–6, где фармацевтически приемлемой солью является соль HCl.

Вариант осуществления 8: Способ согласно любому из вариантов осуществления 1–6, где 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамид или его фармацевтически приемлемую соль вводят перорально.

Вариант осуществления 9: Способ согласно варианту осуществления 8, где фармацевтически приемлемой солью является соль HCl.

Вариант осуществления 10: Способ согласно любому из вариантов осуществления 1–9, где субъектом является человек.

Вариант осуществления 11: Способ лечения рассеянного склероза, включающий введение 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамида или его фармацевтически приемлемой соли нуждающемуся в лечении человеку, где доза вводимого 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамида или его фармацевтически приемлемой соли составляет от примерно 250 до примерно 350 мг в день.

Вариант осуществления 12: Способ согласно варианту осуществления 11, где доза составляет от примерно 275 мг до примерно 325 мг в день.

Вариант осуществления 13: Способ согласно варианту осуществления 12, где доза составляет примерно 300 мг в день.

Вариант осуществления 14: Способ согласно любому из вариантов осуществления 11–13, где 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамид или фармацевтически приемлемую соль вводят в течение 4–6 последовательных дней, а затем введение 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамида или его фармацевтически приемлемой соли прекращают.

Вариант осуществления 15: Способ согласно варианту осуществления 14, где 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамид или фармацевтически приемлемую соль вводят в течение 4 последовательных дней, а затем введение 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамида или его фармацевтически приемлемой соли прекращают.

Вариант осуществления 16: Способ согласно варианту осуществления 14 или 15, где введение 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамида или его фармацевтически приемлемой соли начинают, когда лицу впервые поставлен диагноз «рассеянный склероз».

Вариант осуществления 17: Способ лечения рассеянного склероза у субъекта, нуждающегося в таком лечении, включающий введение фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамида или его фармацевтически приемлемой соли и фармацевтически приемлемое формообразующее.

Вариант осуществления 18: Способ согласно варианту осуществления 17, где рассеянный склероз представляет собой клинически изолированный синдром.

Вариант осуществления 19: Способ согласно варианту осуществления 17, где рассеянный склероз представляет собой возвратно–ремиттирующий рассеянный склероз.

Вариант осуществления 20: Способ согласно варианту осуществления 17, где рассеянный склероз представляет собой прогрессирующий рассеянный склероз.

Вариант осуществления 21: Способ согласно варианту осуществления 17, где рассеянный склероз представляет собой первичный прогрессирующий рассеянный склероз.

Вариант осуществления 22: Способ согласно варианту осуществления 17, где рассеянный склероз представляет собой вторичный прогрессирующий рассеянный склероз.

Вариант осуществления 23: Способ согласно любому из вариантов осуществления 17–22, где фармацевтически приемлемой солью является соль HCl.

Вариант осуществления 24: Способ согласно любому из вариантов осуществления 17–22, где 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамид или его фармацевтически приемлемую соль вводят перорально.

Вариант осуществления 25: Способ согласно варианту осуществления 24, где фармацевтически приемлемой солью является соль HCl.

Вариант осуществления 26: Способ согласно любому из вариантов осуществления 17–25, где субъектом является человек.

Вариант осуществления 27: 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамид или его фармацевтически приемлемая соль для применения в лечении рассеянного склероза.

Вариант осуществления 28: 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамид или его фармацевтически приемлемая соль для применения в соответствии с вариантом осуществления 27, где рассеянный склероз представляет собой клинически изолированный синдром.

Вариант осуществления 29: 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамид или его фармацевтически приемлемая соль для применения в соответствии с вариантом осуществления 27, где рассеянный склероз представляет собой возвратно–ремиттирующий рассеянный склероз.

Вариант осуществления 30: 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамид или его фармацевтически приемлемая соль для применения в соответствии с вариантом осуществления 27, где рассеянный склероз представляет собой прогрессирующий рассеянный склероз.

Вариант осуществления 31: 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамид или его фармацевтически приемлемая соль для применения в соответствии с вариантом осуществления 27, где рассеянный склероз представляет собой первичный прогрессирующий рассеянный склероз.

Вариант осуществления 32: 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамид или его фармацевтически приемлемая соль для применения в соответствии с вариантом осуществления 27, где рассеянный склероз представляет собой вторичный прогрессирующий рассеянный склероз.

Вариант осуществления 33: 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамид или его фармацевтически приемлемая соль для применения согласно любому из вариантов осуществления 27–32, где фармацевтически приемлемая соль представляет собой соль HCl.

Вариант осуществления 34: 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамид или его фармацевтически приемлемая соль для применения в соответствии с любым из вариантов осуществления 27–32, где 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамид или его фармацевтически приемлемую соль вводят перорально.

Вариант осуществления 35: 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамид или его фармацевтически приемлемая соль для применения согласно варианту осуществления 34, где фармацевтически приемлемая соль представляет собой соль HCl.

Вариант осуществления 36: 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамид или его фармацевтически приемлемая соль для применения в лечении рассеянного склероза, где доза вводимого человеку 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамида или его фармацевтически приемлемой соли составляет от примерно 250 мг до примерно 350 мг в день.

Вариант осуществления 37: 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамид или его фармацевтически приемлемая соль для применения в соответствии с вариантом осуществления 36, где доза составляет от примерно 275 до примерно 325 мг в день.

Вариант осуществления 38. 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамид или его фармацевтически приемлемая соль для применения в соответствии с вариантом осуществления 37, где доза составляет примерно 300 мг в день.

Вариант осуществления 39: 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамид или его фармацевтически приемлемая соль для применения согласно любому из вариантов осуществления 36–38, где 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамид или фармацевтически приемлемую соль вводят в течение 4–6 последовательных дней, а затем введение 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамида или его фармацевтически приемлемой соли прекращают.

Вариант осуществления 40. 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамид или его фармацевтически приемлемая соль для применения согласно варианту осуществления 39, где 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамид или фармацевтически приемлемую соль вводят в течение 4 последовательных дней, а затем введение 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамида или его фармацевтически приемлемой соли прекращают.

Вариант осуществления 41: 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамид или его фармацевтически приемлемая соль для применения согласно варианту осуществления 39, где введение 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамида или его фармацевтически приемлемой соли начинают, когда лицу впервые поставлен диагноз «рассеянный склероз».

Вариант осуществления 42: Фармацевтическая композиция, содержащая 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамид или его фармацевтически приемлемую соль и по меньшей мере одно фармацевтически приемлемое формообразующее для применения в лечении множественного склероза.

Вариант осуществления 43: Фармацевтическая композиция, содержащая 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси) –N–метилпиколинамид или его фармацевтически приемлемую соль и по меньшей мере одно фармацевтически приемлемое формообразующее для применения в соответствии с вариантом осуществления 42, где рассеянный склероз представляет собой клинически изолированный синдром.

Вариант осуществления 44: Фармацевтическая композиция, содержащая 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси) –N–метилпиколинамид или его фармацевтически приемлемую соль и по меньшей мере одно фармацевтически приемлемое формообразующее для применения в соответствии с вариантом осуществления 42, где рассеянный склероз представляет собой возвратно–ремиттирующий рассеянный склероз.

Вариант осуществления 45: Фармацевтическая композиция, содержащая 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси) –N–метилпиколинамид или его фармацевтически приемлемую соль и по меньшей мере одно фармацевтически приемлемое формообразующее для применения в соответствии с вариантом осуществления 42, где рассеянный склероз представляет собой прогрессирующий рассеянный склероз.

Вариант осуществления 46: Фармацевтическая композиция, содержащая 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси) –N–метилпиколинамид или его фармацевтически приемлемую соль и по меньшей мере одно фармацевтически приемлемое формообразующее для применения в соответствии с вариантом осуществления 42, где рассеянный склероз представляет собой первичный прогрессирующий рассеянный склероз.

Вариант осуществления 47: Фармацевтическая композиция, содержащая 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси) –N–метилпиколинамид или его фармацевтически приемлемую соль и по меньшей мере одно фармацевтически приемлемое формообразующее для применения в соответствии с вариантом осуществления 42, где рассеянный склероз представляет собой вторичный прогрессирующий рассеянный склероз.

Вариант осуществления 48: Фармацевтическая композиция, содержащая 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси) –N–метилпиколинамид или его фармацевтически приемлемую соль и по меньшей мере одно фармацевтически приемлемое формообразующее для применения в соответствии с любым из вариантов осуществления 42–47, где фармацевтически приемлемая соль представляет собой соль HCl.

Вариант осуществления 49: Фармацевтическая композиция, содержащая 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси) –N–метилпиколинамид или его фармацевтически приемлемую соль и по меньшей мере одно фармацевтически приемлемое формообразующее для применения в соответствии с любым из вариантов осуществления 42–47, где композицию вводят перорально.

Вариант осуществления 50: Фармацевтическая композиция, содержащая 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси) –N–метилпиколинамид или его фармацевтически приемлемую соль и по меньшей мере одно фармацевтически приемлемое формообразующее для применения в соответствии с вариантом осуществления 49, где фармацевтически приемлемая соль представляет собой соль HCl.

Вариант осуществления 51: Применение 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамида или его фармацевтически приемлемой соли для лечения рассеянного склероза.

Вариант осуществления 52: Применение 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамида или его фармацевтически приемлемой соли для производства лекарственного средства для лечения рассеянного склероза.

Вариант осуществления 53: Применение 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамид или его фармацевтически приемлемая соль для применения в соответствии с вариантом осуществления 51 или 52, где рассеянный склероз представляет собой клинически изолированный синдром.

Вариант осуществления 54: Применение 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамид или его фармацевтически приемлемая соль для применения в соответствии с вариантом осуществления 51 или 52, где рассеянный склероз представляет собой возвратно–ремиттирующий рассеянный склероз.

Вариант осуществления 55: Применение 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамид или его фармацевтически приемлемая соль для применения в соответствии с вариантом осуществления 51 или 52, где рассеянный склероз представляет собой прогрессирующий рассеянный склероз.

Вариант осуществления 56: Применение 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамид или его фармацевтически приемлемая соль для применения в соответствии с вариантом осуществления 51 или 52, где рассеянный склероз представляет собой первичный прогрессирующий рассеянный склероз.

Вариант осуществления 57: Применение 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамид или его фармацевтически приемлемая соль для применения в соответствии с вариантом осуществления 51 или 52, где рассеянный склероз представляет собой вторичный прогрессирующий рассеянный склероз.

Вариант осуществления 58: Применение 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамида или его фармацевтически приемлемой соли согласно любому из вариантов осуществления 51–57, где фармацевтически приемлемая соль представляет собой соль HCl.

Вариант осуществления 59: Применение 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамида или его фармацевтически приемлемой соли в соответствии с любым из вариантов осуществления 51–57, где 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамид вводят перорально.

Вариант осуществления 60: Применение 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамида или его фармацевтически приемлемой соли в лечении рассеянного склероза, где доза вводимого человеку 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамида или его фармацевтически приемлемой соли составляет от примерно 250 до примерно 350 мг в день.

Вариант осуществления 61: Применение согласно варианту осуществления 60, где доза составляет от примерно 275 мг до примерно 325 мг в день.

Вариант осуществления 62: Применение согласно варианту осуществления 61, где доза составляет примерно 300 мг в день.

Вариант осуществления 63: Применение согласно любому из вариантов осуществления 60–62, где человеку вводят 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамид или фармацевтически приемлемую соль в течение 4–6 последовательных дней, а затем введение 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамида или его фармацевтически приемлемой соли прекращают.

Вариант осуществления 64: Применение согласно варианту осуществления 65, где человеку вводят 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамид или фармацевтически приемлемую соль в течение 4 последовательных дней, а затем введение 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамида или его фармацевтически приемлемой соли прекращают.

Вариант осуществления 65: Применение согласно варианту осуществления 63 или 64, где введение 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамида или его фармацевтически приемлемой соли начинают, когда лицу впервые поставлен диагноз «рассеянный склероз».

Вариант осуществления 66: 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамид или его фармацевтически приемлемая соль согласно варианту осуществления 65, где фармацевтически приемлемая соль представляет собой соль HCl.

Вариант осуществления 67: Применение фармацевтической композиции, содержащей 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамид или его фармацевтически приемлемую соль и по меньшей мере одно фармацевтически приемлемое формообразующее, в лечении множественного склероза.

Вариант осуществления 68: Применение фармацевтической композиции, содержащей 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамид или его фармацевтически приемлемую соль и по меньшей мере одно фармацевтически приемлемое формообразующее, в соответствии с вариантом осуществления 67, где рассеянный склероз представляет собой клинически изолированный синдром.

Вариант осуществления 69: Применение фармацевтической композиции, содержащей 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамид или его фармацевтически приемлемую соль и по меньшей мере одно фармацевтически приемлемое формообразующее, в соответствии с вариантом осуществления 67, где рассеянный склероз представляет собой возвратно–ремиттирующий рассеянный склероз.

Вариант осуществления 70: Применение фармацевтической композиции, содержащей 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамид или его фармацевтически приемлемую соль и по меньшей мере одно фармацевтически приемлемое формообразующее, в соответствии с вариантом осуществления 67, где рассеянный склероз представляет собой прогрессирующий рассеянный склероз.

Вариант осуществления 71: Применение фармацевтической композиции, содержащей 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамид или его фармацевтически приемлемую соль и по меньшей мере одно фармацевтически приемлемое формообразующее, в соответствии с вариантом осуществления 67, где рассеянный склероз представляет собой первичный прогрессирующий рассеянный склероз.

Вариант осуществления 72: Применение фармацевтической композиции, содержащей 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамид или его фармацевтически приемлемую соль и по меньшей мере одно фармацевтически приемлемое формообразующее, в соответствии с вариантом осуществления 67, где рассеянный склероз представляет собой вторичный прогрессирующий рассеянный склероз.

Вариант осуществления 73: Применение фармацевтической композиции, содержащей 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамид или его фармацевтически приемлемую соль и по меньшей мере одно фармацевтически приемлемое формообразующее в соответствии с любым из вариантов осуществления 67–72, где фармацевтически приемлемая соль представляет собой соль HCl.

Вариант осуществления 74: Применение фармацевтической композиции, содержащей 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамид или его фармацевтически приемлемую соль и по меньшей мере одно фармацевтически приемлемое формообразующее в соответствии с любым из вариантов осуществления 67–72, где фармацевтическую композицию вводят перорально.

Вариант осуществления 75: Применение фармацевтической композиции, содержащей 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамид или его фармацевтически приемлемую соль и по меньшей мере одно фармацевтически приемлемое формообразующее в соответствии с вариантом осуществления 74, где фармацевтически приемлемая соль представляет собой соль HCl.

Вариант осуществления 76: Способ лечения рассеянного склероза, включающий введение эффективного количества 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамида или его фармацевтически приемлемой соли в комбинации с другим терапевтическим средством субъекту, нуждающемуся в этом.

Вариант осуществления 77: Способ согласно варианту осуществления 76, где 4–(2– (1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамид или его фармацевтически приемлемую соль вводят отдельно или тем же или другим путем введения, что и другое средство.

Вариант осуществления 78: Способ согласно варианту осуществления 77, где другое терапевтическое средство представляет собой кортикостероид, бета–интерферон, окрелизумаб, глатирамера ацетат, диметилфумарат, финголимод, терифлуномид, натализумаб, алемтузумаб или митоксантрон.

Вариант осуществления 79: Способ согласно любому из вариантов осуществления 76–78, где рассеянный склероз представляет собой клинически изолированный синдром.

Вариант осуществления 80: Способ согласно любому из вариантов осуществления 76–78, где рассеянный склероз представляет собой возвратно–ремиттирующий рассеянный склероз.

Вариант осуществления 81: Способ согласно любому из вариантов осуществления 76–78, где рассеянный склероз представляет собой прогрессирующий рассеянный склероз.

Вариант осуществления 82: Способ согласно любому из вариантов осуществления 76–78, где рассеянный склероз представляет собой первичный прогрессирующий рассеянный склероз.

Вариант осуществления 83: Способ согласно любому из вариантов осуществления 76–78, где рассеянный склероз представляет собой вторичный прогрессирующий рассеянный склероз.

Вариант осуществления 84: Способ согласно любому из вариантов осуществления 76–83, где фармацевтически приемлемой солью является соль HCl.

Вариант осуществления 85: 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамид или его фармацевтически приемлемая соль в сочетании с другим терапевтическим средством для применения в лечении рассеянного склероза.

Вариант осуществления 86: 4–(2– (1R,2R)–2–Гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамид или его фармацевтически приемлемая соль согласно варианту осуществления 85, где 4–(2– (1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамид или его фармацевтически приемлемую соль вводят отдельно или тем же или другим путем введения, что и другое средство.

Вариант осуществления 87: 4–(2–((1R,2R)–2–Гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамид или его фармацевтически приемлемая соль для применения в соответствии с вариантом осуществления 85 или 86, где другим терапевтическим средством является кортикостероид, бета–интерферон, окрелизумаб, глатирамера ацетат, диметилфумарат, финголимод, терифлуномид, натализумаб, алемтузумаб или митоксантрон.

Вариант осуществления 88: 4–(2–((1R,2R)–2–Гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамид или его фармацевтически приемлемая соль для применения в соответствии с любым из вариантов осуществления 85–87, где рассеянный склероз представляет собой клинически изолированный синдром.

Вариант осуществления 89: 4–(2–((1R,2R)–2–Гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамид или его фармацевтически приемлемая соль для применения в соответствии с любым из вариантов осуществления 85–87, где рассеянный склероз представляет собой возвратно–ремиттирующий рассеянный склероз.

Вариант осуществления 90: 4–(2–((1R,2R)–2–Гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамид или его фармацевтически приемлемая соль для применения в соответствии с любым из вариантов осуществления 85–87, где рассеянный склероз представляет собой прогрессирующий рассеянный склероз.

Вариант осуществления 91: 4–(2–((1R,2R)–2–Гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамид или его фармацевтически приемлемая соль для применения в соответствии с любым из вариантов осуществления 85–87, где рассеянный склероз представляет собой первичный прогрессирующий рассеянный склероз.

Вариант осуществления 92: 4–(2–((1R,2R)–2–Гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамид или его фармацевтически приемлемая соль для применения в соответствии с любым из вариантов осуществления 85–87, где рассеянный склероз представляет собой вторичный прогрессирующий рассеянный склероз.

Вариант осуществления 93: 4–(2–((1R,2R)–2–Гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамид или его фармацевтически приемлемая соль для применения согласно любому из вариантов осуществления 85–92, где фармацевтически приемлемая соль представляет собой соль HCl.

Вариант осуществления 94: Применение 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамида или его фармацевтически приемлемой соли в сочетании с другим терапевтическим средством в лечении рассеянного склероза.

Вариант осуществления 95: Применение согласно варианту осуществления 94, где 4–(2– (1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамид или его фармацевтически приемлемую соль вводят отдельно или тем же или другим путем введения, что и другое средство.

Вариант осуществления 96: Применение согласно варианту осуществления 94 или 95, где другое терапевтическое средство представляет собой кортикостероид, бета–интерферон, окрелизумаб, глатирамера ацетат, диметилфумарат, финголимод, терифлуномид, натализумаб, алемтузумаб или митоксантрон.

Вариант осуществления 97: Применение 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамида или его фармацевтически приемлемой соли в соответствии с любым из вариантов осуществления 94–96, где рассеянный склероз представляет собой клинически изолированный синдром.

Вариант осуществления 98: Применение 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамида или его фармацевтически приемлемой соли в соответствии с любым из вариантов осуществления 94–96, где рассеянный склероз представляет собой возвратно–ремиттирующий рассеянный склероз.

Вариант осуществления 99: Применение 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамида или его фармацевтически приемлемой соли в соответствии с любым из вариантов осуществления 94–96, где рассеянный склероз представляет собой прогрессирующий рассеянный склероз.

Вариант осуществления 100: Применение 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамида или его фармацевтически приемлемой соли в соответствии с любым из вариантов осуществления 94–96, где рассеянный склероз представляет собой первичный прогрессирующий рассеянный склероз.

Вариант осуществления 101: Применение 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамида или его фармацевтически приемлемой соли в соответствии с любым из вариантов осуществления 94–96, где рассеянный склероз представляет собой вторичный прогрессирующий рассеянный склероз.

Вариант осуществления 102: Применение 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамида или его фармацевтически приемлемой соли согласно любому из вариантов осуществления 94–101, где фармацевтически приемлемая соль представляет собой соль HCl.

Вариант осуществления 103: Способ лечения бокового амиотрофического склероза, включающий введение эффективного количества 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамида или его фармацевтически приемлемой соли субъекту, нуждающемуся в этом.

Вариант осуществления 104: Способ согласно варианту осуществления 103, где субъект является приматом.

Вариант осуществления 105: Способ согласно варианту осуществления 104, где субъект является человеком.

Вариант осуществления 106: Способ согласно любому из вариантов осуществления 103–105, где 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамид вводят в виде свободного основания.

Вариант осуществления 107: Способ согласно любому из вариантов осуществления 103–105, где фармацевтически приемлемой солью является соль HCl.

Вариант осуществления 108: Применение 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамида или его фармацевтически приемлемой соли при боковом амиотрофическом склерозе.

Вариант осуществления 109: 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамид или его фармацевтически приемлемая соль для применения в лечении бокового амиотрофического склероза.

Вариант осуществления 110: Применение 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамид или его фармацевтически приемлемая соль для производства лекарственного средства для лечения бокового амиотрофического склероза.

Вариант осуществления 111: Способ лечения болезни Альцгеймера, включающий введение эффективного количества 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамида или его фармацевтически приемлемой соли субъекту, нуждающемуся в этом.

Вариант осуществления 112: Способ согласно варианту осуществления 111, где субъект является приматом.

Вариант осуществления 113: Способ согласно варианту осуществления 112, где субъект является человеком.

Вариант осуществления 114: Способ согласно любому из вариантов осуществления 111–113, где 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамид вводят в виде свободного основания.

Вариант осуществления 115: Способ согласно любому из вариантов осуществления 111–113, где фармацевтически приемлемой солью является соль HCl.

Вариант осуществления 116: Применение 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамида или его фармацевтически приемлемой соли при болезни Альцгеймера.

Вариант осуществления 117: 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамид или его фармацевтически приемлемая соль для применения в лечении болезни Альцгеймера.

Вариант осуществления 118: Применение 4–(2–((1R,2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамид или его фармацевтически приемлемая соль для производства лекарственного средства для лечения болезни Альцгеймера.

Биологические анализы и данные

В описанных ниже примерах HCl соль 4–(2–((1R, 2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамида синтезировали с использованием известных в данной области методов. В приведенных ниже примерах HCl соль 4–(2–((1R, 2R)–2–гидроксициклогексиламино)бензотиазол–6–илокси)–N–метилпиколинамида обозначается или маркируется как BLZ945.

Пример 1. Демиелинизация, индуцированная купризоном у мышей, лечение и аутопсия.

Исследования, описанные ниже, были одобрены Швейцарской кантональной ветеринарной службой г. Базеля, Швейцария, лицензия за № 2711. Мышей (C57BL/6J) приобретали в Charles River Laboratories, Германия или получали из племенных колоний Novartis Pharma AG (8–9 недель, самки). Всем животным давали возможность адаптироваться в течение 7 дней до начала эксперимента и помещали в клетки с индивидуальной вентиляцией (IVC), размещенные в стеллажах (макс. 4 мыши/клетка типа XJ). Животным обеспечивали свободный доступ к пище и воде. Животных обрабатывали купризоном в течение 5 недель. Купризон (бис(циклогексанон)оксалдигидразон, Sigma–Aldrich) смешивали с пищевыми гранулами для грызунов (0,2% вес/вес) от Provimi Kliba AG, Швейцария. Терапевтическое лечение животных после купризона проводили в течение 2 недель на нормальном корме при 169 мг/кг BLZ945 в сутки, перорально. 10 мл/кг BLZ945 готовили в носителе, состоящем из 0,5% метилцеллюлозы в воде и 0,1% Твин–80. Перед умерщвлением через 3 часа после последнего введения дозы BLZ945 животных перфузировали транскардиально фосфатно–солевым буфером (PBS), мозг иссекали и фиксировали в 4% параформальдегиде (PFA) в течение 48 часов при 4°C.

МР томография (МРТ)

Измерения проводили на спектрометре Biospec 70/30 (Bruker Medical Systems, Эттлинген, Германия), работающем при 7 Тл. Операционным программным обеспечением сканера было Paravision 5.1 (Bruker). Изображения были получены от анестезированных, самопроизвольно дышащих животных с использованием циркулярно поляризованной катушки для головного мозга мыши (Bruker, модель 1P T20063V3; внутренний диаметр 23 мм) для возбуждения и обнаружения радиочастот; ни сердечное, ни респираторное стимулирование не применялось. После короткого периода ознакомления с коробкой животных содержали под наркозом с 1,5% изофлураном (Abbott, Cham, Швейцария) в кислороде, вводимым через носовой обтекатель. Во время получения сигнала МРТ животных помещали в положение лежа в раме из оргстекла, температуру тела поддерживали на уровне 37 ± 1°C с помощью электрогрелки, и дыхание контролировали.

Для определения анатомической ориентации и оценки интенсивности сигнала использовали T₂–взвешенную двумерную многослойную последовательность RARE (Rapid Acquisition with Relaxation Enhancement) (Hennig et al., 1986). За этим последовало получение двумерного многослойного градиент–восстановленного FLASH (Fast Low–Angle Shot) (Haase et al., 1986) для оценки отношения переноса намагниченности (MTR). Поскольку обе последовательности имели одинаковые анатомические параметры, выбор интересующих областей для оценок был выполнен на RARE–изображениях, а затем перенесен во FLASH–изображения. Параметры при съеме данных были следующими: (a) Последовательность RARE: эффективное время эхо–сигнала 80 мс, время повторения 3280 мс, коэффициент RARE 16, 12 средних значений, поле зрения 20×18 мм², размер матрицы 213×192, размер пикселя 0,094×0,094 мм², толщина слоя 0,5 мм, 15 смежных слоев. Для возбуждения радиочастоты и перефокусировки использовали импульсы Эрмита с длительностью/шириной полосы 1 мс/5400 Гц и 0,64 мс/5344 Гц, соответственно. Подавление сигнала от жира осуществляли импульсом Гаусса 512 длительностью/полосой пропускания 2,61 мс/1051 Гц с последующим градиентным спойлером продолжительностью 2 мс. Общее время съема данных составило 7 мин 52,3 с; (b) последовательность FLASH: время эхо–сигнала 2,8 мс, время повторения 252,8 мс, 4 средних значения, поле обзора 20×18 мм², размер матрицы 213×192, размер пикселя 0,094×0,094 мм², толщина слоя 0,5 мм, 15 смежных слоев. Для радиочастотного возбуждения использовали импульс Эрмита с длительностью/шириной полосы 0,9 мс/6000 Гц и углом поворотов спинов 30°. MTR контраст был введен с помощью импульса Гаусса длительностью/шириной полосы 15 мс/182,7 Гц, примененного с амплитудой пика радиочастоты 7,5 мкТл и смещением излучения 2500 Гц. Затем съем данных повторяли с теми же параметрами, но без введения контраста MTR. MTR затем вычисляли, используя формулу MTR = (S ₀–S _MTR)/S₀, где S ₀ и S _MTR представляют соответственно интенсивности сигналов при съеме данных FLASH без и с введением контраста MTR. Общее время съема данных для обоих наборов данных составило 6 мин 31,6 с.

Гистология срезов мозга

После фиксации мозг обрабатывали для заливки в парафин путем постепенного обезвоживания этанолом. Автоматический иммуногистохимический анализ парафиновых срезов проводилась на 3 мкм парафиновых срезах, размещенных на предметных стеклах SuperFrost+, которые автоматически иммунологически окрашивали с использованием технологии Discovery XT (Ventana/Roche Diagnostics). Вкратце, срезы депарафинизировали, повторно гидратировали, подвергали извлечению антигена нагреванием с буфером для кондиционирования клеток CC1, инкубировали в течение 1–3 часов при комнатной температуре с первичным антителом, разведенным разбавителем антитела, инкубировали с соответствующим биотинилированным вторичным антителом, разведенным разбавителем антитела, подвергали реакции, используя набор DABMab, и докрашивали гематоксилином II и реагентом Bluing Agent (Ventana/Roche Diagnostics). Стекла промывали мылом в горячей водопроводной воде и ополаскивали в холодной проточной водопроводной воде для удаления мыла, затем обезвоживали и заливали в Pertex.

Иммунофлуоресцентное окрашивание парафиновых срезов проводили вручную на 3 мкм парафиновых срезах. Парафин удаляли и извлекали антиген (исключение: GST–π), обрабатывая в микроволновой печи в течение 15–20 минут при 98°С в 0,1 М цитратном буфере с рН 6,0 (квартет 400300692), банку с предметными стеклами охлаждали до комнатной температуры в течение 20–25 мин и промывали в 1xTBS (сигнальная система клети 12498S) дважды по 3 мин. Эндогенную пероксидазу гасили с помощью Perox Block (Dako S2023) в течение 10 минут, срезы затем промывали в 1xTBS дважды по 3 минуты и блокировали 10%–ной нормальной козьей сывороткой (Dako X0907) в 1xTBS в течение 20 минут. Затем срезы инкубировали без промывки первичным антителом в течение 60 мин (MBP) или в течение ночи (GST–pi, МОГ) при комнатной температуре. Затем срезы промывали в 1xTBS дважды в течение 3 минут, а затем инкубировали со вторичным антителом в течение 30 минут при комнатной температуре. Затем срезы промывали 1xTBS дважды по 3 минуты и инкубировали, используя набор Vectastain ABC Elite Kit (Vector PK6100), в течение 30 минут при комнатной температуре, промывали 1xTBS дважды по 3 минуты, инкубировали с раствором DAB (Dako K3468) в течение 1–5 минут. Затем срезы промывали дважды по 2 минуты дистиллированной водой, окрашивали гематоксилином (Dako S2020) в течение 3 минут, снова промывали проточной водопроводной водой в течение 5 минут, обезвоживали и заливали в Pertex.

Антитела

Первичные антитела и разведения антител: Кроличье антитело к мышиному основному миелиновому белку (MBP, Dako A0623), 1: 1000 в разбавителе антител Вентана, 1: 1500 в разбавителе Dako (Dako S2022); антитело кролика к мышиному GST–π (MBL 312), 1: 500 в разбавителе антител Вентана, 1: 1000 в разбавителе Dako (Dako S2022); Кроличьи антитела к Iba1 (Wako 019–19741, 50 мкг/100 мкл), 1: 500 в разбавителе Ventana для антител; Кроличьи антитела к GFAP (Dako Z0334), 1: 5000 в разбавителе антител Ventana; Кроличьи антитела к гликопротеину миелинового олигодендроцита мыши (MOG, abcam ab32760), 1: 100 в разбавителе антител Ventana, 1: 600 в разбавителе Dako (Dako S2022)

Вторичное обнаружение антител: Биотинилированное козье антитело к IgG кролика (Jackson ImmunoResearch 111–065–144), 1: 1000 в разбавителе антител Ventana, 1: 500 в разбавителе Dako; биотинилированное козье антитело к IgG кролика (Vector BA–1000), 1: 200 в Dako Diluent; биотинилированное козье антитело к IgG мыши (Vector BA–9200), 1: 1000 в разбавителе Ventana для антител, 1: 200 в разбавителе Dako.

Анализ изображений

Для количественной оценки числа микроглии/астроцитов путем анализа изображений гистологических окрашенных срезов мозга была разработана собственная платформа анализа изображений (ASTORIA, автоматический анализ сохраненных изображений) на основе MS Visual Studio 2010 и многих функций из библиотек Matrox MIL V9 (Matrox). Inc, Квебек, Канада).

Для обнаружения и анализа сомы была выполнена следующая последовательность шагов: 1. Стекла со срезами мозга для оценки окрашенной (коричневым) IHC микроглии (Iba1) или астроцита (GFAP) сканировали с помощью Aperio's Scanscope при 20–кратном увеличении. 2. Запускали разработанный в лаборатории модуль ImageScope (V12.1.0.5029, Aperio Inc., США) для создания и экспорта фрагментов изображения в формате 3×8–bit RGB tif (при 20–м увеличении) для каждого среза. 3. Обработка изображений (для каждого tif–изображения): A: Выполняли цветовую деконволюцию для каждого изображения tif, чтобы получить изображение, окрашенное коричневым без синего. B: Сегментация значимого образца (ткани головного мозга) от белого фона посредством порогового формирования, морфологического закрытия, заполнения отверстий, открытия и удаления слишком маленьких объектов, что приводит к двоичной маске значимой ткани и области образца для текущего изображения. C: Применяли метод адаптивного определения порога для индивидуальной сегментации сомы, основанный на среднем значении пикселя синего канала полученного цветовой деконволюцией коричневого изображения в достаточно темных областях (показательно для сомы). Вычисленный порог использовали для бинаризации и после фильтрации по размеру получали отображение маски сомы (в пределах допустимой области выборки).

Результаты

Фигура 1. Двухнедельное терапевтическое лечение с использованием BLZ945 после интоксикации купризоном снижает контраст МРТ в коре и полосатом теле, но не в мозолистом теле, по сравнению с контролем носителями, что свидетельствует об увеличении миелинизации. Контраст при магнитно–резонансной томографии (МРТ) в коре головного мозга (Фигура 1A), полосатом теле (Фигура 1B) и мозолистом теле (Фигура 1C) для разных групп лечения. МРТ контраст нормализован по абсолютным значениям группы контроля носителем (нормальный корм). Группы состояли из мышей, получавших в течение 5 недель нормальный корм или корм с купризоном (0,2%), а затем их переводили на обычный корм в ходе 2–недельного терапевтического лечения (носитель или BLZ945 перорально, раз в день, 169 мг/кг). Отношение переноса намагниченности (MTR), измеренный в мозолистом теле с помощью МРТ для различных групп лечения (Фигура 1D). Показаны (серым и черным) результаты двух разных экспериментов. Статистический анализ. Критерий множественных сравнений Тьюки (**: p<0,01, ***: p<0,001, ****: p<0,0001, н.с.: несущественно).

Фигуры 2–5: Двухнедельное терапевтическое лечение BLZ945 после интоксикации купризоном усиливает ремиелинизацию и увеличивает количество олигодендроцитов в коре головного мозга и полосатом теле, но не в мозолистом теле по сравнению с носителем. Изображения примеров иммуногистологического окрашивания при определении основного миелинового белка (ОМБ) и зрелых олигодендроцитов, положительных по GST–π, в коре головного мозга (Фигура 2) для разных групп лечения. Группы состояли из мышей, получавших в течение 5 недель нормальный корм или корм с купризоном (0,2%), а затем их переводили на обычный корм в ходе 2–недельного терапевтического лечения (носитель или BLZ945 перорально, раз в день, 169 мг/кг). Количественный иммуногистохимический анализ на MBP (окрашенная область) и GST–π (число положительных клеток) в коре (Фигура 3А) и полосатом теле (Фигура 3B) головного мозга, нормализованные по контролю с носителем. Изображения примеров иммуногистологического окрашивания при определении миелин–олигодендроцитарного гликопротеина (МОГ) и зрелых олигодендроцитов, положительных по GST–π, в мозолистом теле (Фигура 4) для разных групп лечения. Количественный иммуногистохимический анализ на МОГ (оптическая плотность) и GST–π (число положительных клеток), а также оптическая плотность с Luxol прочным синим (LFB) в мозолистом теле (Фигура 5), нормализованный по контролю с носителем. На Фигурах 3А, 3В и Фигуре 5 показаны (серым и черным) результаты двух разных экспериментов. Статистический анализ. Критерий множественных сравнений Тьюки (*: p<0,05, **: p<0,01, ***: p<0,001, ****: p<0,0001, нс: несущественно).

Фигуры 6 и 7: Двухнедельное терапевтическое лечение с применением BLZ945 после интоксикации купризоном снижает количество микроглии, но усиливает астроциты. Изображения примеров иммуногистологических окрашиваний, обнаруживающих маркеры микроглии Iba1 и глио–фибриллярный кислый белок (GFAP) астроцитов в коре головного мозга (Фигура 6) для разных групп лечения. Группы состояли из мышей, получавших в течение 5 недель нормальный корм или корм с купризоном (0,2%), а затем их переводили на обычный корм в ходе 2–недельного терапевтического лечения (носитель или BLZ945 перорально, раз в день, 169 мг/кг). Количественный иммуногистохимический анализ числа Iba1–положительной микроглии и окрашенной площади GFAP–положительных астроцитов в коре головного мозга (Фигура 7A), полосатом теле (Фигура 7В) и мозолистом теле (Фигура 7C), нормализованные по контролю с носителем. Статистический анализ. Критерий множественных сравнений Тьюки (**: p<0,01, ***: p<0,001, ****: p<0,0001, нс: несущественно).

Купризоновая модель идеально подходит для анализа случаев ремиелинизации. Чтобы вызвать сильную демиелинизацию вместе с массивным вовлечением микроглии и астроцитов, мы использовали 0,2% купризона в корме для грызунов в течение 5 недель. Мы применяли метод продольной неинвазивной магнитно–резонансной томографии (МРТ) для непосредственного измерения миелинизации в головном мозге и коррелировали параметры МРТ с количественными гистологическими данными в головном мозге. В этой модели мы исследовали ингибитор киназы CSF1R – BLZ945 – в высокой пероральной дозе 169 мг/кг один раз в день, что у исходных животных почти полностью истощает микроглию через 5 дней во всех областях мозга.

Обработка с использованием BLZ945 в течение 2 недель, получаемым с нормальным кормом, после индукции демиелинизации в течение 5 недель 0,2% купризоновым кормом показала значительный положительный эффект в контрасте МРТ в коре и полосатом теле головного мозга в двух независимых экспериментах (Фигуры 1А, 1В). Контраст МРТ почти нормализовался до уровней контрольных мышей, тогда как контраст МРТ мышей, получавших купризон, все еще показал значимое отличие контраста МРТ от контроля. Этот эффект был очень значительным после 2 недель лечения. Никакого положительного эффекта BLZ945 не наблюдалось в мозолистом теле в двух независимых экспериментах (Фигура 1C), как для МРТ–контраста, так и для отношения переноса намагниченности (MTR). Положительный эффект, наблюдаемый на МРТ после 2 недель лечения BLZ945, можно подтвердить иммуногистохимическим анализом залитых в парафин срезов головного мозга и количественным анализом изображений. Количества основного миелинового белка (ОМБ) и олигодендроцитов (GST–π) значительно увеличились после обработки BLZ945 по сравнению с контролем носителем в коре головного мозга (Фигура 2, Фигура 3А) и полосатом теле (Фигура 3В). Однако уровень MBP–положительной ремиелинизации и число GST–π–положительных олигодендроцитов не достигли контрольных уровней после 2 недель лечения. Кроме того, отсутствие какого–либо усиления ремиелинизации в мозолистом теле, наблюдаемое на МРТ, можно подтвердить гистологическим анализом. Наблюдалось заметное снижение миелин–олигодендроцитарного гликопротеина (МОГ), олигодендроцитов (GST–π), а также Luxol прочного синего (LFB) после обработки купризоном по сравнению с контролем, но отличия от результатов после 2–недельного лечения BLZ945 не наблюдалось (Фигура 4, Фигура 5) ,

Микроглия и астроциты сильно активируются и увеличиваются после 5–недельной индуцированной купризоном демиелинизации (Фигура 6) во всех отделах головного мозга. В коре головного мозга и полосатом теле количество микроглии Iba1+ в 1,5–2 раза выше, чем у контрольных мышей (Фигуры 7А, 7В), тогда как в мозолистом теле оно возрастает в 6 раз (Фигура 7С). BLZ945 значительно снижает это увеличение по сравнению с животными, получавшими носитель, во всех анализируемых отделах головного мозга (Фигуры 7А, 7В, 7С). Кроме того, у мышей, получавших BLZ945, найдено меньшее количество микроглии Iba1+ в коре головного мозга и полосатом теле по сравнению с контролем (Фигуры 7A, 7B), но не в мозолистом теле (Фигура 7C). В коре головного мозга и полосатом теле количество GFAP–положительных астроцитов увеличилось в 5–6 раз выше, по сравнению с контрольными мышами (Фигуры 7А, 7В), тогда как в мозолистом теле оно возросло только в 2–2,5 раза (Фигура 7С). Интересно отметить, что уровень увеличения микроглии и астроцитов в коре головного мозга, полосатом теле и мозолистом теле, по–видимому, происходит в зависимой друг от друга манере. В коре головного мозга и полосатом теле увеличение микроглии (в 1,5–2 раза) не столь велико, как увеличение астроцитов (в 4–6 раз), тогда как в мозолистом теле, наоборот, увеличение Iba–положительной микроглии значительно выше (в 6 раз) по сравнению с астроцитами (в 2,5 раза). Тем не менее, лечение с применением BLZ945 в течение 2 недель еще больше увеличивает количество астроцитов во всех областях мозга по сравнению с носителем (Фигура 6 и Фигуры 7A–C). Это увеличение астроцитов значительно выше в коре головного мозга и полосатом теле по сравнению с мозолистым телом.

Пример 2 EAE, индуцированный МОГ–пептидом

Исследования, описанные ниже, были одобрены Швейцарской кантональной ветеринарной службой г. Базеля, Швейцария, лицензия за № 2119.

Мыши (C57BL/6J OlaHsd) приобретали у Harlan Laboratories BV (возраст 9 недель, самки). Всем животным давали возможность адаптироваться в течение 7 дней до начала эксперимента и помещали в клетки с индивидуальной вентиляцией (IVC), размещенные в стеллажах (макс. 4 мыши/клетка типа XJ). Животным обеспечивали свободный доступ к пище и воде.

Мышей иммунизировали путем подкожной инъекции в нижнюю часть спины пептида миелин–олигодендроцитарного гликопротеина (МОГ1–125; собственного производства; 200 мкг/100 мкл), эмульгированного в 4 мг/мл полного адъюванта Фрейнда (CFA, Sigma). Токсин коклюша (Fluka; 200 нг на мышь) вводили внутрибрюшинно в день 0 и день 2. Оценка EAE: За мышами наблюдали и взвешивали их ежедневно. Их оценивали по клиническим признакам по шкале от 0 до 5 с градацией 0,5 для промежуточных баллов. 0: клинических признаков нет, 1: вялый хвост/полная потеря тонуса хвоста; 2: явная слабость задних конечностей; 3: полный двусторонний паралич задних конечностей; 4: паралич передних и задних конечностей; 5: смерть. Дополнительную пищу и желеобразную пищу обеспечивали внутри клетки при появлении первых клинических признаков.

Животных лечили в течение 14 дней, дозируя перорально по 100 и 150 мг/кг BLZ945, один раз в день по 10 мл/кг с 14 по 28 день после иммунизации. BLZ945 готовили в 0,5%–ной метилцеллюлозе в воде и 0,1% Твин–80.

Результаты

Фигура 8. Терапевтическое лечение с применением BLZ945 у экспериментальных мышей с аутоиммунным энцефаломиелитом (EAE) не изменяло прогрессирование заболевания. Оценка клинических показателей после иммунизации пептидом миелин–олигодендроцитарного гликопротеина выявила сходное прогрессирование заболевания (Фигура 8А), начало заболевания/число случаев (Фигура 8В) и изменения веса (Фигура 8В) для всех групп лечения. Лечение с применением BLZ945 начали через 14 дней после иммунизации, и клинические показатели были почти максимальными до 14 дней (серая заштрихованная область). Эксперимент завершили на 28 день после иммунизации.

Чтобы исследовать значение микроглии в модели аутоиммунного заболевания, мы проводили терапевтическое лечение экспериментальных мышей с аутоиммунным энцефаломиелитом (EAE) – модель рассеянного склероза человека. Мышей лечили двумя различными дозами (100 и 150 мг/кг, перорально, раз в день), начиная практически с пика заболевания через 14 дней после иммунизации. Лечение продолжалось до его завершения на 28 день после иммунизации. Никакой разницы в клинических показателях в обеих группах лечения по сравнению с носителем не наблюдалось (Фигура 8А). Дебют клинической патологии EAE примерно через 11–12 дней после иммунизации (Фигура 8B), как и изменение веса (Фигура 8C), были одинаковыми у групп лечения и контроля носителем. В совокупности ингибирование киназы CSF1R не изменяет прогрессирование заболевания в модели EAE – модели идущего из периферии нейровоспаления.

Приведенные выше данные Примеров 1 и 2 позволяют предположить, что подавление сигнального пути рецептора CSF–1 при терапевтическом лечении усиливает центральные восстановительные механизмы ремиелинизации путем модулирования нейровоспаления и, таким образом, полезно для лечения демиелинизирующих и нейровоспалительных заболеваний, таких как рассеянный склероз, боковой амиотрофический склероз и болезнь Альцгеймера. Сигнальный путь рецептора колониестимулирующего фактора 1 (CSF1R) важен для выживания микроглии – фагоцитов, присущих головному мозгу. Микроглия играет важную роль в моделировании синаптической схемы ЦНС и удалении патогенных микроорганизмов и клеточного дебриса, последний из которых необходим для сигнала к началу восстановления путем ремиелинизации. Таким образом, для изобретателей явилось неожиданным то, что путем подавления сигнального пути рецептора CSF–1 можно добиться положительного эффекта в купризоновой модели, поскольку этих фагоцитов нет для удаления остатков миелина. Другие группы показали, что подавление сигнального пути CSF1R также является нейропротекторным при таких заболеваниях, как боковой амиотрофический склероз и болезнь Альцгеймера, благодаря уменьшению хронического нейровоспаления. Однако постоянно активированная микроглия, по–видимому, является нейротоксичной, тогда как в условиях интоксикации купризоном микроглия активируется на короткое время для выполнения определенной направленной функции, такой как фагоцитоз. Тем не менее, возможно, что микроглия в купризоновой модели, по–видимому, дополнительно имеет нейротоксический компонент, и что путем удаления микроглии с помощью BLZ945 эта микроглиальная токсичность устраняется в фазе разрешения. Кроме того, после лечения с применением BLZ945 активируются астроциты и, по–видимому, принимают на себя фагоцитарную активность и оказывают некое трофическое влияние на олигодендроциты без нейротоксического компонента микроглии. Кроме того, микроглия, по–видимому, участвует в процессах дифференцировки клеток–предшественников олигодендроцитов (OPC) в олигодендроциты (OD) (Hagemeyer et al., 2017). Удаление микроглии, по–видимому, инициирует быстрые процессы дифференцировки, которые облегчают NG2–положительным OPC дифференцировку в OD, тем самым усиливая ремиелинизацию.

Пример 3. Индуцированная купризоном в дозе 20 и 60 мг/кг демиелинизация у мышей.

Исследования, описанные ниже, были одобрены Швейцарской кантональной ветеринарной службой г. Базеля, Швейцария, лицензия за № 2711. Мышей (C57BL/6J) приобретали в Charles River Laboratories, Германия или получали из племенных колоний Novartis Pharma AG (8–9 недель, самки). Всем животным давали возможность адаптироваться в течение 7 дней до начала эксперимента и помещали в клетки с индивидуальной вентиляцией (IVC), размещенные в стеллажах (макс. 4 мыши/клетка типа XJ). Животным обеспечивали свободный доступ к пище и воде. Животных обрабатывали купризоном в течение 5 недель. Купризон (бис(циклогексанон)оксалдигидразон, Sigma–Aldrich) смешивали с пищевыми гранулами для грызунов (0,2% вес./вес) от Provimi Kliba AG, Швейцария. Терапевтическое лечение животных после купризона проводили в течение 2 недель на нормальном корме при 20 и 60 мг/кг BLZ945 в сутки, перорально 10 мл/кг. BLZ945 готовили в носителе, состоящем из 0,5% метилцеллюлозы в воде и 0,1% Твин–80. Перед умерщвлением через 3 часа после последнего введения дозы BLZ945 животных перфузировали транскардиально фосфатно–солевым буфером (PBS), мозг иссекали и фиксировали в 4% параформальдегиде (PFA) в течение 48 часов при 4°C.

МР томография (МРТ)

Измерения проводили на спектрометре Biospec 70/30 (Bruker Medical Systems, Эттлинген, Германия), работающем при 7 Тл. Операционным программным обеспечением сканера было Paravision 5.1 (Bruker). Изображения были получены от анестезированных, самопроизвольно дышащих животных с использованием циркулярно поляризованной катушки для головного мозга мыши (Bruker, модель 1P T20063V3; внутренний диаметр 23 мм) для возбуждения и обнаружения радиочастот; ни сердечное, ни респираторное стимулирование не применялось. После короткого периода ознакомления с коробкой животных содержали под наркозом с 1,5% изофлураном (Abbott, Cham, Швейцария) в кислороде, вводимым через носовой обтекатель. Во время получения сигнала МРТ животных помещали в положение лежа в раме из оргстекла, температуру тела поддерживали на уровне 37 ± 1°C с помощью электрогрелки, и дыхание контролировали.

Для определения анатомической ориентации и оценки интенсивности сигнала использовали T₂–взвешенную двумерную многослойную последовательность RARE (Rapid Acquisition with Relaxation Enhancement) (Hennig et al., 1986). За этим последовало получение двумерного многослойного градиент–восстановленного FLASH (Fast Low–Angle Shot) (Haase et al., 1986) для оценки MTR. Поскольку обе последовательности имели одинаковые анатомические параметры, выбор интересующих областей для оценок был выполнен на RARE–изображениях, а затем перенесен во FLASH–изображения. Параметры при съеме данных были следующими: (a) Последовательность RARE: эффективное время эхо–сигнала 80 мс, время повторения 3280 мс, коэффициент RARE 16, 12 средних значений, поле зрения 20×18 мм², размер матрицы 213×192, размер пикселя 0,094×0,094 мм², толщина слоя 0,5 мм, 15 смежных слоев. Для возбуждения радиочастоты и перефокусировки использовали импульсы Эрмита с длительностью/шириной полосы 1 мс/5400 Гц и 0,64 мс/5344 Гц, соответственно. Подавление сигнала от жира осуществляли импульсом Гаусса 512 длительностью/полосой пропускания 2,61 мс/1051 Гц с последующим градиентным спойлером продолжительностью 2 мс. Общее время съема данных составило 7 мин 52,3 с; (b) последовательность FLASH: время эхо–сигнала 2,8 мс, время повторения 252,8 мс, 4 средних значения, поле обзора 20×18 мм², размер матрицы 213×192, размер пикселя 0,094×0,094 мм², толщина слоя 0,5 мм, 15 смежных слоев. Для радиочастотного возбуждения использовали импульс Эрмита с длительностью/шириной полосы 0,9 мс/6000 Гц и углом поворотов спинов 30°. MTR контраст был введен с помощью импульса Гаусса длительностью/шириной полосы 15 мс/182,7 Гц, примененного с амплитудой пика радиочастоты 7,5 мкТл и смещением излучения 2500 Гц. Затем съем данных повторяли с теми же параметрами, но без введения контраста MTR. MTR затем вычисляли, используя формулу MTR = (S ₀–S _MTR)/S₀, где S ₀ и S _MTR представляют соответственно интенсивности сигналов при съеме данных FLASH без и с введением контраста MTR. Общее время съема данных для обоих наборов данных составило 6 мин 31,6 секунды.

Количественное определение BLZ945 в крови и головном мозге

Подготовка и анализ образца для исследования основывались на модифицированной процедуре осаждения белка с последующим разделением жидкостной хроматографией в сочетании с масс–спектрометрией. Мозжечки гомогенизировали в диссоциаторе gentleMACS ™ (Milteniy Biotec, № 130–093–235) путем добавления 20% CH₃OH до конечной концентрации 0,20 г/мл. Образцы крови–ЭДТА сразу использовали для дальнейшей подготовки. Образцы для калибровки, контроля качества и контроля извлечения готовили путем введения известных количеств BLZ945 (от 0,02 до 62,5 мкг/мл) в чистую кровь и чистый гомогенат мозга. Для исследования анализируемого образца в качестве общего внутреннего стандарта (IS) использовали гидрохлорид лабеталола (Sigma–Aldrich, № L1011). Аликвоты 10 мкл калибровочного стандарта, контроля качества, контроля извлечения и неизвестных образцов переносили в 0,75 мл 96–луночный держатель Loborack (Vitaris AG, № 51004BC–MIC), и в каждую пробирку добавляли 3 мкл смеси IS (2,5 мкг/мл в 50% СН₃CN). Для осаждения белка и извлечения его из матрикса крови и головного мозга добавляли 200 мкл CH₃CN. После встряхивания в течение 10 минут образцы центрифугировали при 3220 g в течение 15 минут при 4°С. 50 мкл верхнего слоя переносили в 96–луночный планшет с глубокими 1,2 мл лунками (Thermo Scientific, № AB–0787).

Анализ ЖХ–МС–МС: Для количественного анализа аликвоту по 1,5 мкл каждого образца, включая образцы для калибровки, контроля качества и контроля извлечения, вводили с помощью охлаждаемого диспетчера образцов Waters^TM Acquity Urbinary и системы ВЭЖХ. Испытуемый объект и его внутренний стандарт разделяли с помощью колонки ACE C18–PFP (внутренний диаметр 50×2,1 мм, размер пор 3,0 мкм; № ACE–1110–0502) в качестве колонки при 40°C. Для разделения применяли линейный градиент от 5 до 65% B за 1,7 мин при расходе 0,400 мл/мин. Суммарное время цикла составляло 3,5 мин. В качестве подвижной фазы использовали А: воду с 0,1% муравьиной кислоты и В: CH₃CN с 0,1 % муравьиной кислоты. Для анализа поток из колонки сразу направляли в масс–спектрометр AB Sciex API5500 Triple Quad, оснащенный интерфейсом TurboIonSpray^TM. Анализ проводили в режиме регистрирования положительных ионов с мониторингом множественных реакций (MRM). Количественная оценка была основана на отношении соединение/IS для экстрагированных ионных хроматограмм выбранных массовых переходов 399 масса/заряд → 242 масса/заряд для BLZ945 и 329 масса/заряд → 162 масса/заряд для лабеталола (IS). Неизвестную концентрацию образца рассчитывалась с использованием внешних калибровочных кривых. Нижний предел количественного определения (LLOQ) метода был установлен равным 20 нг/мл для крови и 100 нг/мл для образцов мозга, а восстановление из матрицы составляло 95 ± 2%. Все расчеты выполнены с использованием программного обеспечения AB Sciex Analyst 1.6.2.

Гистология головного мозга

После фиксации мозг обрабатывали для заливки в парафин путем постепенного обезвоживания этанолом. Автоматический иммуногистохимический анализ парафиновых срезов проводилась на 3 мкм парафиновых срезах, размещенных на предметных стеклах SuperFrost+ (Thermo Fisher Scientific), которые автоматически иммунологически окрашивали с использованием технологии Discovery XT (Ventana/Roche Diagnostics). Срезы депарафинизировали, повторно гидратировали, подвергали извлечению антигена нагреванием с буфером для кондиционирования клеток CC1 в течение 28–68 мин в соответствии с антителом, инкубировали 1–3 часа в зависимости от антитела при комнатной температуре с первичным антителом, разведенным разбавителем антитела (Ventana), инкубировали с соответствующим биотинилированным вторичным антителом, разведенным разбавителем антитела, подвергали реакции, используя набор DABMab, и докрашивали гематоксилином II и реагентом Bluing (Ventana). Стекла промывали мылом в горячей водопроводной воде и ополаскивали в холодной проточной водопроводной воде для удаления мыла, затем обезвоживали и заливали в Pertex.

Антитела

Использовали первичные антитела: Кроличьи антитела к Iba1 (Wako 019–19741, 50 мкг/100 мкл) 1: 500; кроличьи антитела к GFAP (Dako Z0334) 1: 5000

Вторичные детектирующие антитела: Биотинилированное козье антитело к IgG кролика (Jackson ImmunoResearch 111–065–144) 1: 1000; биотинилированные козлиные антитела к IgG кролика (Vector BA–1000) 1: 200 или 1: 1000

Анализ изображений

Для количественной оценки числа микроглии/астроцитов путем анализа изображений гистологических окрашенных срезов мозга была разработана собственная платформа анализа изображений (ASTORIA, автоматический анализ сохраненных изображений) на основе MS Visual Studio 2010 и многих функций из библиотек Matrox MIL V9 (Matrox). Inc, Квебек, Канада).

Для обнаружения и анализа сомы была выполнена следующая последовательность шагов: 1. Стекла со срезами мозга для оценки окрашенной (коричневым) IHC микроглии (Iba1) или астроцита (GFAP) сканировали с помощью Aperio's Scanscope при 20–кратном увеличении. 2. Запускали разработанный в лаборатории модуль ImageScope (V12.1.0.5029, Aperio Inc., США) для создания и экспорта фрагментов изображения в формате 3×8–bit RGB tif (при 20–м увеличении) для каждого среза. 3. Обработка изображений (для каждого tif–изображения): A: Выполняли цветовую деконволюцию для каждого изображения tif, чтобы получить изображение, окрашенное коричневым без синего. B: Сегментация значимого образца (ткани головного мозга) от белого фона посредством порогового формирования, морфологического закрытия, заполнения отверстий, открытия и удаления слишком маленьких объектов, что приводит к двоичной маске значимой ткани и области образца для текущего изображения. C: Применяли метод адаптивного определения порога для индивидуальной сегментации сомы, основанный на среднем значении пикселя синего канала полученного цветовой деконволюцией коричневого изображения в достаточно темных областях (показательно для сомы). Вычисленный порог использовали для бинаризации и после фильтрации по размеру получали отображение маски сомы (в пределах допустимой области выборки).

Результаты

Фигура 9. Двухнедельное терапевтическое лечение с использованием BLZ945 после интоксикации купризоном снижает контраст МРТ в коре и полосатом теле, но не в мозолистом теле, по сравнению с контролем носителями, что свидетельствует об увеличении миелинизации. Контраст при магнитно–резонансной томографии (МРТ) в коре головного мозга (Фигура 9A), полосатом теле (Фигура 9B) и мозолистом теле (Фигура 9C) для разных групп лечения. МРТ контраст нормализован по абсолютным значениям группы контроля носителем (нормальный корм). Группы состояли из мышей, получавших в течение 5 недель нормальный корм или корм с купризоном (0,2%), а затем их переводили на обычный корм в ходе 2–недельного терапевтического лечения (носитель или BLZ945 перорально, раз в день, 20 и 60 мг/кг). Среднее ± SEM Статистический анализ. Критерий множественных сравнений Холма Сидака (**: р <0,01, **: р <0,005).

Фигура 10. Лечение с применением BLZ945 приводит к уменьшению количества микроглии и активации микроглии дозозависимым образом. Дозозависимое уменьшение количества микроглии (числа Iba1–положительной микроглии) в коре головного мозга мышей дикого типа после 5 дней лечения BLZ945 (перорально, раз в день) (Фигура 10A). Доза 60 мг/кг BLZ945 показала лишь незначительное снижение, менее чем на 50%, тогда как доза 20 мг/кг BLZ945 не продемонстрировала уменьшения микроглии. Дозозависимое уменьшение активации микроглии (размер Iba1–положительной микроглии, нормализованный по удаленным микроглиальным процессам) в коре головного мозга мышей дикого типа после 5 дней лечения BLZ945 (перорально, раз в день) (Фигура 10B). Доза 60 мг/кг BLZ945 вызывала сильную активацию микроглии, тогда как 20 мг/кг BLZ945 имели лишь незначительный эффект. Указаны индивидуальные точки съема данных. Среднее ± SEM

Фигура 11. Анализ фармакокинетики BLZ945 в крови и в головном мозге. Уровни BLZ945 в крови и головном мозге зависели от дозы и показали соотношение мозг/кровь, равное 0,3–0,6, как указано над соответствующими графиками. Размеры групп: n=2–3. Данные приведены как среднее ± SEM.

Использовали 0,2% купризона в корме для грызунов в течение 5 недель, чтобы вызвать сильную демиелинизацию вместе с массивным вовлечением микроглии и астроцитов. Для прямого измерения миелинизации в головном мозге использовали продольный неинвазивный метод магнитно–резонансной томографии (МРТ). Ранее было показано, что данные МРТ коррелировали с количественными гистологическими показателями в мозге. В этой модели испытывали ингибитор киназы CSF1R – BLZ945, в дозах 20 и 60 мг/кг один раз в день, перорально. У исходных животных более низкая доза BLZ945 после 5 дней приема не вызвала уменьшение микроглии, но, согласно морфологическим измерениям, отмечалось небольшое повышение статуса активации. Доза BLZ945 60 мг/кг после 5–дневного лечения у исходных животных снижала микроглию примерно на 30–40%, но также значительно усиливала морфологический статус активации микроглии. Эти изменения в микроглии очень отличались от тех, которые наблюдались при 169 мг/кг BLZ945 после 5–дневного лечения, так как при высокой дозе можно наблюдать почти полное истощение микроглии. Поэтому на купризоновой модели в терапевтическом режиме испытывали дозы BLZ945, равные 20 и 60 мг/кг. Кратковременное лечение более низкими дозами BLZ945 в течение только 1 недели показало положительное влияние на ремиелинизацию у грызунов в 5–недельной купризоновой модели, как было обнаружено с помощью МРТ. Доза BLZ945, равная 60 мг/кг, показала значительное усиление ремиелинизации в мозолистом теле/наружной капсуле и в коре головного мозга, в то время как в полосатом теле наблюдалась только тенденция. Эти данные показывают, что измененная морфология микроглии, наблюдаемая у исходных животных при введении 60 мг/кг BLZ945, может привести к усиленному фагоцитозу (поглощению твердых частиц/остатков/мертвых клеток) и клиренсу миелиновых остатков, а также к увеличению количества олигодендроцитов за счет высвобождения факторов, усиливающих дифференцировку клеток–предшественников олигодендроцитов. Кроме того, слегка уменьшенные числа микроглии при дозе BLZ945, равной 60 мг/кг, в сочетании с измененным фенотипом микроглии могут защитить нейроны/аксоны от повреждения в воспалительной среде, такой как при РС.

Ингибиторы киназы CSF1R также воздействуют на клетки Купфера в печени и тем самым изменяют ферменты печени. Этот желаемое целевое действие должно тщательно контролироваться в условиях клиники, а также это ограничивает дозу и схему лечения. Таким образом, наблюдаемый положительный эффект при более низких дозах BLZ945 и применение только краткосрочных схем лечения в доклинических моделях, является весьма полезным. Кроме того, аналогичное по своему уровню воздействие соединения при выбранных дозах ожидается в клинических условиях и в доклинических моделях.

Calabrese, M., Magliozzi, R., Ciccarelli, O., Geurts, J.J.G., Reynolds, R., and Martin, R. (2015). Exploring the origins of grey matter damage in multiple sclerosis. Nat. Rev. Neurosci. 16, 147–158.

Haase, A., Matthaei, D., Hanicke, W., and Frahm, J. (1986). Dynamic digital subtraction imaging using fast low–angle shot MR movie sequences. Radiology 160, 537–541.

Hagemeyer, N., Hanft, K.–M., Akriditou, M.–A., Unger, N., Park, E.S., Stanley, E.R., Staszewski, O., Dimou, L., and Prinz, M. (2017). Microglia contribute to normal myelinogenesis and to oligodendrocyte progenitor maintenance during adulthood. Acta Neuropathol.

Hennig, J., Nauerth, A., and Friedburg, H. (1986). RARE imaging: A fast imaging method for clinical MR. Magn. Reson. Med. 3, 823–833.

Nasrabady, S.E., Rizvi, B., Goldman, J.E., and Brickman, A.M. (2018). White matter changes in Alzheimer ' s disease : a focus on myelin and oligodendrocytes. 1–10.

Nylander, A., and Hafler, D.A. (2012). Multiple sclerosis. J. Clin. Invest. 122, 1180–1188.

Oliveira Santos, M., Caldeira, I., Gromicho, M., Pronto–Laborinho, A., and de Carvalho, M. (2017). Brain white matter demyelinating lesions and amyotrophic lateral sclerosis in a patient with C9orf72 hexanucleotide repeat expansion. Mult. Scler. Relat. Disord. 17, 1–4.

Ropele, S., Schmidt, R., Enzinger, C., Windisch, M., Martinez, N.P., and Fazekas, F. (2012). Longitudinal magnetization transfer imaging in mild to severe Alzheimer disease. AJNR Am J Neuroradiol 33, 570–575.

Zhou, T., Ahmad, T.K., Gozda, K., Truong, J., Kong, J., and Namaka, M. (2017). Implications of white matter damage in amyotrophic lateral sclerosis (review). Mol. Med. Rep. 16, 4379–4392.

1. Способ лечения демиелинизирующих заболеваний, выбранных из рассеянного склероза, болезни Альцгеймера и бокового амиотрофического склероза, включающий введение эффективного количества соединения формулы (I)

или его фармацевтически приемлемой соли субъекту, нуждающемуся в таком лечении.

2. Способ согласно п. 1, где субъект является приматом.

3. Способ согласно п. 2, где субъект является человеком.

4. Способ согласно любому из пп. 1-3, где соединение формулы (I) вводят в виде свободного основания.

5. Способ согласно любому из пп. 1-3, где фармацевтически приемлемой солью является соль HCl.

6. Способ согласно любому из пп. 1-3, где рассеянный склероз представляет собой клинически изолированный синдром.

7. Способ согласно любому из пп. 1-3, где рассеянный склероз представляет собой возвратно-ремиттирующий рассеянный склероз.

8. Способ согласно любому из пп. 1-3, где рассеянный склероз представляет собой первичный прогрессирующий рассеянный склероз или вторичный прогрессирующий рассеянный склероз.

9. Способ лечения демиелинизирующих заболеваний, выбранных из рассеянного склероза, болезни Альцгеймера и бокового амиотрофического склероза, включающий введение 4-(2-((1R,2R)-2-гидроксициклогексиламино)бензотиазол-6-илокси)-N-метилпиколинамида или его фармацевтически приемлемой соли нуждающемуся в лечении человеку, где доза вводимого 4-(2-((1R,2R)-2-гидроксициклогексиламино)бензотиазол-6-илокси)-N-метилпиколинамида или его фармацевтически приемлемой соли составляет от примерно 250 мг до примерно 350 мг в день.

10. Способ согласно п. 9, где доза составляет от примерно 275 мг до примерно 325 мг в день.

11. Способ согласно п. 10, где доза составляет примерно 300 мг в день.

12. Способ согласно любому из пп. 9-11, где 4-(2-((1R,2R)-2-гидроксициклогексиламино)бензотиазол-6-илокси)-N-метилпиколинамид или фармацевтически приемлемую соль вводят в течение 4-6 последовательных дней, а затем введение 4-(2-((1R,2R)-2-гидроксициклогексиламино)бензотиазол-6-илокси)-N-метилпиколинамида или его фармацевтически приемлемой соли прекращают.

13. Способ согласно п. 12, где 4-(2-((1R,2R)-2-гидроксициклогексиламино)бензотиазол-6-илокси)-N-метилпиколинамид или фармацевтически приемлемую соль вводят в течение 4 последовательных дней, а затем введение 4-(2-((1R,2R)-2-гидроксициклогексиламино)бензотиазол-6-илокси)-N-метилпиколинамида или его фармацевтически приемлемой соли прекращают.

14. Способ согласно п. 12 или 13, где введение 4-(2-((1R,2R)-2-гидроксициклогексиламино)бензотиазол-6-илокси)-N-метилпиколинамида или его фармацевтически приемлемой соли начинают, когда лицу впервые поставлен диагноз «рассеянный склероз».

15. Способ лечения демиелинизирующих заболеваний, выбранных из рассеянного склероза, болезни Альцгеймера и бокового амиотрофического склероза, включающий введение эффективного количества 4-(2-((1R,2R)-2-гидроксициклогексиламино)бензотиазол-6-илокси)-N-метилпиколинамида или его фармацевтически приемлемой соли в комбинации с другим терапевтическим средством субъекту, нуждающемуся в этом.

16. Способ согласно п. 15, где 4-(2-(1R,2R)-2-гидроксициклогексиламино)бензотиазол-6-илокси)-N-метилпиколинамид или его фармацевтически приемлемую соль вводят отдельно или тем же или другим путем введения, что и другое средство.

17. Способ согласно п. 16, где другое терапевтическое средство представляет собой кортикостероид, бета-интерферон, окрелизумаб, глатирамера ацетат, диметилфумарат, финголимод, терифлуномид, натализумаб, алемтузумаб или митоксантрон.

18. Применение соединения формулы (I)

или его фармацевтически приемлемой соли для лечения демиелинизирующих заболеваний, выбранных из рассеянного склероза, болезни Альцгеймера и бокового амиотрофического склероза.