Способ получения биомассы метанокисляющих бактерий с добавлением формиата натрия

Авторы патента:

Семенова Виктория Александровна (RU)

C12N1/26 - способы, использующие, или питательные среды, содержащие углеводороды (очистка углеводородных масел с помощью микроорганизмов C10G 32/00)

C12N1/20 - бактерии; питательные среды для них

C12M1/36 - с контролем условий или времени, например автоматически управляемые ферментеры (управление или регулирование вообще G05)

Владельцы патента RU 2777669:

Общество с ограниченной ответственностью "Научно-исследовательский институт природных газов и газовых технологий-Газпром ВНИИГАЗ" (RU)

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ получения биомассы метанокисляющих бактерий, включающий выращивание метанокисляющих бактерий в ферментере в условиях аэрации на питательной среде, содержащей метан в качестве источника углерода, источники азота, фосфора, минеральные соли и микроэлементы с добавлением формиата натрия от 2 до 5 ммоль/л в качестве дополнительного источника восстановленного кофермента НАДН (никотинамидадениндинуклеотида). Изобретение обеспечивает увеличение выхода биомассы метанокисляющих бактерий для использования в кормовой, пищевой и химической промышленности. 6 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности, к способам получения биомассы метанокисляющих бактерий, и может быть использовано в кормовой, пищевой и химической промышленности.

Метанокисляющие бактерии осуществляют последовательное окисление метана до метанола, формальдегида, формиата и углекислого газа. В процессе утилизации метана происходит накопление биомассы метанокисляющих бактерий, которая может быть использована в виде белковой кормовой добавки.

Известен способ получения биомассы метанокисляющих бактерий (патент РФ №2699986, C12N 1/20, опубл. 11.09.2019), включающий в условиях аэрации выращивание указанных бактерий в ферментере на содержащей в качестве источника углерода метан питательной среде. При выращивании осуществляют рециркуляцию биомассы через контур рециркуляции из части ферментера с минимальным содержанием кислорода, представляющей собой зону деаэрации, в часть ферментера с максимальным содержанием растворенного кислорода, представляющей собой зону аэрации и подачи жидкой фазы, со скоростью прокачки 1/50-1/70 рабочего объема ферментера в минуту. Причем метан подают в контур рециркуляции жидкой фазы, а воздух в зону аэрации.

Недостатком известного изобретения является постоянный перевод метаболического аппарата бактерий Methylococcus capsulatus с аэробного на анаэробный путь, что увеличивает энергетические затраты бактерий (Roslev P., King G. M. Aerobic and anaerobic starvation metabolism in methanotrophic bacteria // Applied and environmental microbiology. 1995. V. 61. №.4. Стр. 1563-1570). Кроме того, в ферментер необходимо устанавливать два раздельных штуцера: один для подачи метана и один для воздуха, что увеличивает затраты на стерилизациию и материалы, а также требует дополнительных мер для поддержания асептики.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату (прототипом) является способ получения биомассы метанокисляющих бактерий (патент РФ №2699293, C12N 1/20, опубл. 04.09.2019), включающий выращивание бактерий в ферментере в условиях аэрации на питательной среде, выделение биомассы из культуральной жидкости, частичный возврат отработанной культуральной жидкости на стадию выращивания, обезвоживание и сушку биомассы. Причем выращивание биомассы проводят в режиме переменного аэрирования и с непрерывной подачей метана в максимально турбулентную аэрированную зону ферментера.

Недостатком данного изобретения является постоянный перевод метаболического аппарата клеток метанокисляющих бактерий с аэробного на анаэробный путь, что увеличивает энергетические затраты бактерий (Roslev P., King G. M. Aerobic and anaerobic starvation metabolism in methanotrophic bacteria // Applied and environmental microbiology. 1995. V. 61. №.4. Стр. 1563-1570). Кроме того, в ферментер необходимо устанавливать два раздельных штуцера: один для подачи метана и один для воздуха, что увеличивает затраты на стерилизациию и материалы, а также требует дополнительных мер для поддержания асептики.

Процесс окисления метана метанокисляющими микроорганизмами можно представить в виде цепочки реакций:

ММО - фермент метанмонооксигеназа, ФДГ - фермент формальдегид дегидрогеназа, НАД+ - окисленная форма никотинамидадениндинуклеотида, НАДН - восстановленная форма никотинамидадениндинуклеотида (восстановленный кофермент).

Ключевым ферментом метаболизма метана является ММО, катализирующая окисление метана до метанола. Как видно из приведенной цепочки реакций для окисления одного моля метана в метанол необходим 1 моль НАДН. В свою очередь НАДН образуется при окислении формальдегида в формиат под действием ФДГ и формиата до СО₂. Цепочка превращений от метана к углекислому газу представляет собой энергетический путь утилизации метана, который конкурирует с цепочкой фиксации метана. Таким образом, для окисления метана метанокисляющим бактериям необходима энергия в виде НАДН, но бактерии тратят часть метана (не менее 30%) на образование НАДН, что снижает выход биомассы.

Известно, что для поддержания высокой активности ММО у метанокисляющих бактерий можно использовать примерно 2 ммоль/л формиата натрия (Palumbo, A.V.; Strong-Gunderson, M.; Carroll, S. Retaining and recovering enzyme activity during degradation of TCE by methanotrophs. Appl. Biochem. Biotechnol. 1997. Стр. 63-65, 789-796). Известно также, что формиат натрия можно использовать в качестве восстановителя для индукции активности растворимой ММО.

Установлено что фиксация углерода клетками происходит преимущественно на уровне формальдегида (Bengelsdorf, Frank R., and Peter "Biokatalytische Konversion." CO2 und CO-Nachhaltige Kohlenstoffquellen die Kreislaufwirtschaft. Springer Spektrum, Berlin, Heidelberg, 2020. Стр. 99-119). Из приведенной цепочки реакций следует, что если отсечь энергетический путь за счет репрессии фермента ФДГ, то почти весь метан будет фиксироваться клетками (do Valle Gomes M. Z., Palmqvist A. E. С Immobilization of formaldehyde dehydrogenase in tailored siliceous mesostructured cellular foams and evaluation of its activity for conversion of formate to formaldehyde // Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 2018. Стр. 41-46). Как известно, репрессия происходит под влиянием конечного продукта или добавленного в ростовую среду, или синтезируемого в клетке в достаточном количестве.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа, обеспечивающего наиболее полную ассимиляцию метана в биомассу метанокисляющих бактерий.

Техническим результатом, на достижение которого направлено предлагаемое изобретение, является увеличение выхода биомассы метанокисляющих бактерий за счет перераспределения метаболических потоков в клетках метанокисляющих бактерий.

Указанный технический результат достигается за счет того, что в способе получения биомассы метанокисляющих бактерий, включающем выращивание метанокисляющих бактерий в ферментере в условиях аэрации на питательной среде, содержащей метан в качестве источника углерода, источники азота, фосфора, минеральные соли и микроэлементы, отделение биомассы от культуральной жидкости, обезвоживание и сушку биомассы, в питательную среду добавляют формиат натрия в количестве от 2 до 5 ммоль/л. Формиат натрия используют в качестве дополнительного источника восстановленного кофермента НАДН (никотинамидадениндинуклеотида).

В ходе проведения экспериментов установили, что в результате увеличения скорости протока и подачи газовоздушной смеси в ферментер при непрерывном культивировании метанокисляющих бактерий не происходит накопления биомассы бактерий, а почти весь субстрат (метан) переходит в углекислый газ. Можно предположить, что при таком режиме культивирования вся энергия, образующаяся при окислении метана до CO₂, тратится на поддержание текущей оптической плотности в ферментере. Следовательно, для накопления биомассы при высоких скоростях протока необходимо введение дополнительного источника энергии. Добавление формиата натрия в питательную среду при культивировании метанокисляющих бактерий обеспечит образование НАДН за счет окисления формиата натрия до диоксида углерода, а большая часть метана пойдет на образование биомассы бактерий, что приведет к увеличению выхода биомассы метанокисляющих бактерий.

Введение формиата натрия в питательную среду целесообразно проводить в режиме непрерывного культивирования при высокой скорости протока и подачи газовоздушной смеси.

По предлагаемому способу процесс получения биомассы метанокисляющих бактерий осуществляют следующим образом:

Проводят выращивание метанокисляющих бактерий на питательной среде. В качестве источника углерода используют метан, а в качестве минерального питания - азот, фосфор, калий, магний, медь и другие, необходимые для питания метанокисляющих бактерий, элементы. При этом в питательную среду в качестве дополнительного источника питания вносят формиат натрия в количестве от 2 до 5 ммоль/л, который используют в качестве дополнительного источника восстановленного кофермента (НАДН) для активации ММО.

Процесс выращивания ведут при температуре 41-42°С, рН 5,6-5,8, удельной скорости роста метанокисляющих бактерий 0,27 ч^-1, при расходе природного газа и воздуха на 1 литр ферментационной среды 15 и 45 л/ч, соответственно. Со стадии выращивания суспензию метанокисляющих бактерий направляют на сгущение и сушку.

Осуществление предлагаемого изобретения подтверждается следующими примерами.

Пример 1

Осуществляли культивирование штамма Methylococcus capsulatus ВКПМ В-13479 в непрерывном режиме в ферментере с механическим перемешиванием объемом 50 литров (рабочий объем - 30 литров) с непрерывной подачей питательной среды, содержащей следующие минеральные компоненты (на 1 литр воды): (NH₄)₂SO₄ - 0,56 г; MgSO₄x7H₂O - 0,02 г; KCl- 0,025 г; (NH₄)₂HPO₄ - 0,04 г; (NH₄)H₂PO₄ - 0,04 г; ZnSO₄x7H₂O - 0,3 мг; MnSO₄x5H₂O - 0,54 мг; CuSO₄x5H₂O - 0,54 мг; H₃BO₃ - 0,6 мг; FeSO₄x7H₂O - 2,0 мг; Na₂MoO₄x2H₂O - 0,045 мг; CoSO₄x7H₂O - 0,048 мг; Трилон Б - 5,0 мг.

Процесс проводили в нестерильных условиях:

- при температуре 42°С;

- при рН среды от 5,6 до 5,8;

- при атмосферном давлении;

- при расходе природного газа и воздуха на 1 литр ферментационной среды 15 и 45 л/ч, соответственно;

- при скорости протока питательной среды 0,27 ч^-1.

При продолжительном поддержании такого режима культивирования, при непрерывном протоке 0,27 ч^-1 питательной среды указанного состава, концентрация биомассы в ферментационной среде оставалась постоянной и составила 10,2-11,3 г/л.

Пример 2

Состав питательной среды и условия культивирования аналогичны примеру 1, но в питательную среду добавляли формиат натрия в количестве 1 ммоль/л.

В результате концентрация биомассы в ферментационной среде оставалась постоянной и составила 11,6-12,3 г/л.

Пример 3

Состав питательной среды и условия культивирования аналогичны примеру 1, но в питательную среду добавляли формиат натрия в количестве 2 ммоль/л.

В результате концентрация биомассы в ферментационной среде оставалась постоянной и составила 13,5-13,8 г/л.

Пример 4

Состав питательной среды и условия культивирования аналогичны примеру 1, но в питательную среду добавляли формиат натрия в количестве 3 ммоль/л.

В результате концентрация биомассы в ферментационной среде оставалась постоянной и составила 13,7-13,8 г/л.

Пример 5

Состав питательной среды и условия культивирования аналогичны примеру 1, но в питательную среду добавляли формиат натрия в количестве 5 ммоль/л.

В результате концентрация биомассы в ферментационной среде оставалась постоянной и составила 13,6-13,8 г/л.

Пример 6

Состав питательной среды и условия культивирования аналогичны примеру 1, но в питательную среду добавляли формиат натрия в количестве 7 ммоль/л формиата натрия.

В результате концентрация биомассы в ферментационной среде оставалась постоянной и составила 12,2-13,2 г/л.

Таким образом, добавление формиата натрия в питательную среду в эффективной концентрации от 2 до 5 ммоль/л увеличивает выход биомассы метанокисляющих бактерий на 26-28%. Добавление формиата натрия в большей концентрации не приводит к значительному увеличению биомассы.

Способ получения биомассы метанокисляющих бактерий, включающий выращивание метанокисляющих бактерий в ферментере в условиях аэрации на питательной среде, содержащей метан в качестве источника углерода, источники азота, фосфора, минеральные соли и микроэлементы, отделение биомассы от культуральной жидкости, обезвоживание и сушку биомассы, отличающийся тем, что в питательную среду добавляют формиат натрия в количестве от 2 до 5 ммоль/л, который используют в качестве дополнительного источника восстановленного кофермента НАДН (никотинамидадениндинуклеотида).

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложены биопрепарат для утилизации нефтесодержащих отходов, содержащий нефтеокисляющие микроорганизмы Rhodococcus degradans VS-16.1 BKM Ac-2730D, Microbacterium aerolatum VS-16.2 BKM Ac-2731D, Pseudomonas meridiana TS-9 BKM B-3040D, Rhodococcus jialingiae SVS-5 BKM Ac-2732D, Rhodococcus jialingiae TRV-8 BKM Ac-2733D, смешанных в равном соотношении с титром клеток не менее 10-15×107 КОЕ/мл, способ его получения и способ утилизации нефтесодержащих отходов, включающий послойное внесение очищаемых отходов слоем 18 см, минерального удобрения в количестве 10-20 г/м2, биопрепарата из расчета 4 л/м2, повторение этих слоев 5 раз с последующим ежедневным рыхлением и периодическим увлажнением грунта до 2 раз в неделю.

Способ культивирования аэробных метанассимилирующих микроорганизмов // 2768401

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ культивирования аэробных метанассимилирующих микроорганизмов Methylococcus capsulatus ВКПМ В-13554 в проточном режиме с постоянной скоростью отбора культуральной жидкости и скоростью протока минеральной среды от 0,25 до 0,35 ч-1 при 41-44 °С, рН 5,4-5,8 и скорости потока газовоздушной смеси метан:воздух - 1:3, причем в состав питательной среды дополнительно вводят никель и до 10% воды заменяют на фугат культуральной жидкости; концентрацию компонентов минерального питания устанавливают в зависимости от заданной скорости протока среды D и планируемой продуктивности процесса культивирования Y по формуле.

Способ очистки почв криолитозоны от нефтезагрязнений // 2755687

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам очистки почв криолитозоны от нефтезагрязнений. Способ очистки почв криолитозоны от нефтезагрязнений предусматривает выделение накопительной культуры аборигенных микроорганизмов-нефтедеструкторов из мерзлотной почвы, взятой с места загрязнения.

Микробный препарат для защиты растений, произрастающих на нефтезагрязненных почвах // 2744094

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен микробный препарат для защиты растений, произрастающих на нефтезагрязненных почвах, содержащий суспензию клеток микроорганизма Rhodococcus erythropolis BKM Ac-2784D, не менее 1×107 КОЕ/мл среды роста следующего состава (г/л): NaNO3 - 3.0; K2HPO4⋅3Н2О - 1.0; MgSO4⋅7H2O - 0.5; KCl - 0.5; FeSO4⋅7H2O - 0.01; нефть или гексадекан в концентрации 2% в качестве источника углерода.

Способ выделения микроорганизмов для очистки и восстановления нефтезагрязненных почв и грунтов методом фитобиоремедиации // 2735870

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ выделения микроорганизмов для очистки и восстановления нефтезагрязненных почв и грунтов методом фитобиоремедиации, включающий посев суспензии нефтезагрязненной почвы на минеральную агаризованную среду с парами нафталина, выросшие колонии микроорганизмов инокулируют на стерильные проростки растений-сидератов, которые затем высаживают в песок.

Штамм rhodococcus erythropolis ho-ks22, обладающий высокой уреазной активностью, способный к генерации в нефтяном пласте нефтевытесняющего агента биопав // 2717025

Изобретение относится к нефтедобывающей промышленности и может быть использовано в методах повышения нефтеизвлечения с использованием бактериальных штаммов. Штамм Rhodococcus erythropolis HO-KS22, депонированный в ВКМ как Ac-2807D, способный к генерации непосредственно в нефтяном пласте нефтевытесняющего агента (биоПАВ) за счет использования углеводородов нефти, обладающий высокой уреазной активностью, что приводит к сильному подщелачиванию среды при использовании мочевины в качестве источника азота.

Микробный препарат для биоремедиации почвы, загрязненной нефтью и нефтепродуктами // 2705290

Изобретение относится к биотехнологии. Микробный препарат содержит смесь предварительно высушенных до влажности не более 10% штаммов Rhodococcus erythropolis BKM Ас-2784D, Acinetobacter guillouiae B-3216D, Acinetobacter guillouiae B-3217D в равных объемах с содержанием каждого компонента не менее 1×107 KOE/г.

Нефтеокисляющий биопрепарат, биосорбент на его основе и способ его приготовления // 2703500

Группа изобретений относится к очистке грунтов, воды от нефти и нефтепродуктов с помощью биотехнологии. Предложены нефтеокисляющий биопрепарат, биосорбент на его основе и способ его приготовления.

Штамм yarrowia lipolytica arc 49 вкпм y-4348 деструктор нефти и нефтепродуктов // 2700078

Изобретение относится к биотехнологии, микробиологии. Предложен штамм Yarrowia lipolytica ARC 49, обладающий способностью к деструкции нефти и нефтепродуктов.

Штамм arthrobacter psychrochitiniphilus arc 42 вкпм ас-2076 - деструктор нефти и нефтепродуктов // 2699990

Изобретение относится к биотехнологии, микробиологии. Предложен штамм бактерий Arthrobacter psychrochitiniphilus ARC 42, обладающий способностью к деструкции нефти и нефтепродуктов и депонированный во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ Ac-2076.

Композиции и способы для борьбы с фузариозом // 2777606

Группа изобретений относится к биотехнологии и сельскому хозяйству. Предложены выделенный штамм Bacillus amyloliquefaciens NRRL B-50760, обладающий подавляющей активностью в отношении фузариоза, композиции и способы с использованием указанного штамма.